MXPA06003553A - Un proceso para producir proteina exogena en la leche de mamiferos transgenicos y un proceso para purificar proteinas de la leche. - Google Patents

Abstract

La invencion se relaciona con un metodo para producir una proteina de interes, que comprende hacer un mamifero transgenico no humano que produzca tal proteina en su leche, obtener la leche del mamifero transgenico no humano y purificar la proteina de interes de la leche. Se generaron animales bovinos transgenicos, los cuales fueron capaces de producir hormona humana del crecimiento en glandulas mamarias. El metodo implica la clonacion de una construccion genetica que codifica el gene hGH y un promotor de beta-caseina convenientemente en un vector de expresion. Tambien incluye procedimientos de transfeccion en celulas somaticas de bovinos fetales, generalmente fibroblastos y la transferencia nuclear en oocitos sin nucleo de bovinos, generando asi embriones transgenicos. El metodo tambien incluye otros procedimientos para generar embriones transgenicos para la expansion posterior de la manada transgenica, tal como la subclonacion de bovinos femeninos transgenicos, la sobreovulacion de vacas transgenicas y su inseminacion con semen proveniente de bovinos masculinos no transgenicos o transgenicos, y la sobreovulacion de vacas no transgenicas y su inseminacion con semen proveniente de bovinos masculinos transgenicos. Posteriormente, los embriones transgenicos dan lugar a ganado transgenico que produce en su leche, hormona humana del crecimiento en grandes cantidades, a partir de la leche, la hormona se purifica y se analiza totalmente para satisfacer todos los requisitos para la fabricacion de un producto biofarmaceutico puro.

Description

UN PROCESO PARA PRODUCIR PRQTEINA EXOGENA EN LA LECHE DE MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS Y UN PROCESO PARA PURIFICAR PROTEÍNAS DE LA LECHE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los factores de las proteína y hormonas involucrados en el cuidado de la salud humana, han sido producidos actualmente por la industria farmacéutica, por la extracción por medio de la tecnología recombinante en las últimas décadas. La expresión de constructores genéticos, que implican los genes deseados, se expresaron exitosamente en bacterias, levaduras y líneas de células de mamíferos. Sin embargo, el uso de cultivos de células de mamíferos, para obtener proteínas complejas, tal como aquellas que requieren un patrón de glicosilación propio, implica altos costos de la producción. La tecnología del ADN reconibinante se ha usado crecientemente en la pasada década para la producción de materiales biológicos, importantes comercialmente. Para este fin, las secuencias del ADN que codifican una variedad de proteínas humanas, importantes médicamente, se han clonado. Ellas incluyen la insulina, activador del plasminógeno, alfa-1-antitripsina y los factores VIII y IX de coagulación. En el presente, aún con las técnicas del ADN recombinante emergente, estas proteínas son usualmente purificadas de la sangre y tejidos, un proceso costoso y que consume tiempo, el cual puede llevar el riesgo de transmitir agentes de infección, tal como aquellos que causan el SIDA y la hepatitis . Aunque la expresión de las secuencias del ADN en bacterias, para producir la proteína deseada, importante médicamente, se ven como una proposición atractiva, en la práctica, las bacterias a menudo probaron ser insatisfactorias como huéspedes, debido a que las proteínas ajenas de células bacteriales son inestables y no se procesan correctamente. Reconociendo este problema, la expresión de genes clonados en cultivos de tejidos de mamíferos ha sido intentada y, en algunos casos, ha probado una estrategia viable. Sin embargo, la fermentación en lotes de células de animales es un proceso costoso y de demanda técnica. Por lo tanto, existe la necesidad para un proceso de alto rendimiento, de bajo costo, para la producción de sustancias biológicas, tal como los polipéptidos eucarióticos, modificados correctamente. La ausencia de agentes que sean infecciosos a los humanos sería una ventaja en tal proceso. La posibilidad de obtener animales transgénicos, como el ganado, para un gene deseado, con el objeto de conseguir grandes cantidades de una proteína humana en la leche, ha sido de gran interés en la industria. Varios grupos en la literatura, reportan su éxito en la producción de albúmina de suero humana, alfa anti-tripsina y algunos otros ejemplos en vacas o cabras transgénicas. Se han realizado previamente muchos experimentos en ratones o ratas, y la expresión de transgenes fue siempre preferida para ser confinada a las glándulas mamarias, puesto que son empleados los promotores de la beta-caseína o de la lactalbúmina, los cuales responden solamente a los factores de transcripción de la glándula mamaria en hembras lactantes. La expresión de una proteína heteróloga exclusivamente en la leche, significa evitar la influencia indeseada en la salud del animal huésped y la provisión de cualquier método fácil para la purificación. Investigadores se han dedicado ahora a establecer varios sistemas para mejorar el rendimiento de la transfección o selección de células, y escogieron la fuente de células somáticas fetales homologas, para mejorar las condiciones de supervivencia e inmunidad de los animales clonados. Por otra parte, hay un enorme interés en la transferencia nuclear de células somáticas, principalmente para hacer posible la propagación de animales domésticos seleccionados y la ingeniería de los animales transgénicos, para fines de la agricultura y biomédicos, En breve, la transferencia nuclear (NT) implica la enucleación de un oocito receptor, seguido por la transferencia de la célula donadora al espacio perivitelino en aposición cercana al citoplasto receptor y su fusión. El desarrollo es inducido artificialmente por la activación química o física. La producción de descendientes clonados por la transferencia nuclear de células somáticas, se ha obtenido exitosamente en ovejas (Campbell, K.H. et al. Nature 38:64-66 (1966), 1996; Wells, D. N. et al., Biol Reprod. 57:385-393 (1997); Wilmut, I., et al., Nature 385:810-813 (1997); cabra (Baguisi, A. et al., Nat Biotechnol 18:456-461 (1999) y en vacas (Cibelli, J. B. et al., Science 280:1256-1258 (1998); Kato Y., et al., Science 82:2095-2096 (1998); Wells, D. N. et al., Reprod Fértil Dev 10:369-376(1998)) . Existen varios factores que tienen influencia en los resultados de la NT, que incluyen los métodos de enucleación, fusión, activación y sincronía del ciclo de células donador-receptor . Se han logrado altas eficiencias en la enucleación de oocitos receptores usando los tintes vitales específicos del ADN para visualizar la cromatina (Stice, S.. L., y Keefer, C.. L. Biol. Reprod 48:715-719 (1993); Westhusin, M. E. et al., J- Reprod Fértil 95:475-480 (1993)). La fusión de la célula donadora con el oocito receptor depende de la exactitud del alineamiento celular en el campo de pulso, contacto de la célula donadora con el oocito receptor y tamaño de las células donadoras (Collas, P., et al . , Anal Biochem 208 :1 . 9 (1993)). La activación de la NT de embriones reconstruidos se ha reinado y regímenes de desarrollo en los blastocistos son equivalentes a los oocitos fertilizados in vitro (Liu. L., et al., Mol. Reprod. Dev 49:298-307 (1998)). El desarrollo exitoso de los embriones de NT se ha logrado usando oocitos maduros (Willadsen, S. M. Nature 320 : 63-65 (1986)), zigotes (McGrath J., y Solter., D., Dev. Biol . . N. Y. 4 :37-55 (1985)), y embriones de la etapa de desdoblamiento (Tsunoda, ?. et al., J. Reprod 96:27555-281 (1992)) como citoplastos receptores; sin embargo, esto es dependiente de la fuente del núcleo donador. La compatibilidad del ciclo de célula entre el citoplasto receptor y las células donadoras es uno de los factores importantes que tienen influencia en el desarrollo de los embriones de NT. La sincronización apropiada es necesaria para preservar el ploide de los embriones reconstituidos . El ciclo de células mitóticas tiene las siguientes fases consecutivas: hueco de pre-replicación (G ) , síntesis del ADN (8) , hueco pre-mitótico (G2) y mitosis (M) . Durante un ciclo celular sencillo, todas las réplicas del ADN genómico una vez antes de la mitosis. Un núcleo del donador de interfase, transferido en un oocito maduro de enucleato (metafase II) se somete a varios cambios morfológicos.

Después de la fusión, pero antes de la interrupción de la envoltura nuclear del donador (NEBD) , el cromosoma condensa (PCC) . Estos cambios son inducidos por la actividad del factor promotor de maduración/mitosis (MPF) y la cinasa de proteína activada por el mitógeno (MAPK) (Collas, P., y Robl, J. M. y Robi, J. M. Biol . Reprod 45 : 455-465 (1991) ) . Las actividades de MPF y MAPK se encuentran en todas las células meióticas y mitóticas y son mayores en la metafase y en oocitos de mamíferos, estos altos niveles también inducen la detención en la metafase II. La reducción de MPF y MAPK por la fertilización o activación con el ionófero de calcio es la señal para completar la meiosis, segunda emisión del cuerpo polar, descondensación del núcleo de esperma y formación pronuclear. El efecto directo de NEBD y PCC en la cromatina del donador es dependiente del ciclo celular del núcleo donador en el momento de la transferencia. El núcleo diploide G0 / G condensa para formar cromátidos sencillos, pero el núcleo tetraploide G2 condensa para formar cromátidos dobles. Sin embargo, los núcleos en la fase S, en el momento de la transferencia, muestra características de apariencia "pulverizada" ; el PCC produce un daño extenso al ADN. Por lo tanto, el ploide correcto se puede producir por la transferencia a los núcleos Gx o G2 en los oocitos de la metafase II, al mismo tiempo de la activación o antes. Un segundo método es transferir los núcleos en el oocito previamente activado, en la fase S, en este caso, es posible usar una célula donadora en Gi, G0 o fase S. Debido a que MPFy MAPK son bajos; la cromatina descondensa y se somete a una replícación del ADN sin PCC y NEBD. Un tercer esquema de sincronización se ha • reportado en ratones, donde el desarrollo de un descendiente vivo se produjo por la reconstrucción de embriones, usando un G2 o una célula donadora de metafase y un oocito de metafase 2 endonucleado (Cheong, H. T. et al., Biol . Reprod 48 :958-963 (1993); Kwon, O. Y. y Kono, T., Proc Nati . Acad. Sci . USA 93 :13010-13013 (1996)). La extrusión de un cuerpo polar del embrión reconstruido NT se reportó, que resultó en un embrión diploide sencillo y un cuerpo polar diploide (Kwon, 0. Y. y Kono,T., Proc. Nati . acad. . Sci . USA 93 : 13010-13014 (1996)). Sin embargo, no hay reporte de la formación del cuerpo polar después de la NT en los oocitos Mil enucleados en el ganado, ovejas o cerdos, lo que sugiere diferencias entre especies en la formación de control mecánica de ejes intactos y la extrusión de cuerpos polares. Las etapas del ciclo celular de la célula donadora y el receptor, se han sugerido son también importantes en reprogramar los núcleos de células donadoras . Aumentando el tiempo entre la trnsferencia de núcleos donadores y la transcripción zigótica, puede mejorar la reprogramación del núcleo. Por esta razón, varios autores activaron el oocito varias horas después de la fusión (Cibelli, J. B. et al . , Science 280 : 1256-1257 (1998); Wakayama T., et al . , Nature 394 :369-374 (1998)); Wells, D.N. , et al., Biol. Reprod 60:996-1005 (1999)). Otros reportes aplicaron la transferencia nuclear en secuencia (Stic, S. L., Keefer, C. L. Bol . Reprod. 48 : 715- 719 (1993) ) . Un procedimiento no explorado para aumentar el tiempo del núcleo donador reprogramado es por la transferencia nuclear antes de la metafase II. Después de romper la vesícula germinal (GGVBD) , todos los eventos del núcleo se regularon por un aumento sustancial en el oocito cistósólico MPF y MAPK, que previene la reconstrucción de la envoltura nuclear y la entrada en la fase S hasta la fertilización o activación. Por lo tanto, un oocito maduro puede ser un receptor universal para la metafase o la célula donadora G2. Aún G o G2 pueden ser usados como células donadoras si la activación induce una fase S antes de la división celular. Cuando se usan blastómeros en G2 o M, como células donadoras, la reprogramación nuclear es posible (Cheong. H. T. et al . , Biol Reprod 65 :958-961 (1992); Kwon O. Y. y Kono, T., Proc. Nati. Acad. Sci USA 93:13010-13013 (1996): Lim, et al . , Mol . Reprod . Dev 49 : 255-264 (1997)). Una explicación es que algunos factores se desplazan de la cromatina, como resultado de la condensación del cromosoma. De hecho, para la transferencia nuclear, NEBD y PCC, se han considerado signos morfológicos de la reprogramación del núcleo. Adicionalmente, en el momento de la fertilización, la cromatina de esperma está extremadamente condensada, y su volumen es considerablemente menor de aquél de los núcleos de células somáticas, y el oocito tiene la habilidad de remover la proteína nuclear del esperma. Las cromosomas del oocito, durante la fusión de esperma - oocito, son también condensados. Es posible que la conformación de la cromatina condensada pueda tener alguna relevancia biológica. Consecuentemente, simulando esta situación por la transferencia nuclear de metafase, un receptor de metafase -enucleado pueda mejorar el resultado de la NT. Sin embargo, pocos investigadores han usado este acercamiento en animales domésticos y usan blastómeros como las células donadoras (Lin. L., et al . . Mol Repro . Dev 47 : 255-264 (1997)). Una meta de esta invención es caracterizar y refinar la transferencia nuclear de células somáticas existentes a una técnica confiable y económica, para producir terneras idénticas genéticamente a partir de células donadoras adultas .

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un mamífero transgénico no humano, caracterizado por la producción de, inesperadamente, altos niveles de una hormona recombinante del crecimiento en su leche. Esta hormona recombinante del crecimiento puede ser, pero no se limita a, la hormona del crecimiento humano. El mamífero transgénico no humano puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos . La invención, asimismo, se refiere a una plasmida que proporciona la expresión de una proteína de interés en las células de mamíferos, mamíferos en las cuales la expresión se regula por el promotor de la beta-caseína. La proteína de interés puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. La invención también se refiere a diferentes métodos de obtener un mamífero transgénico humano, que produzca una hormona de crecimiento recombinante en su leche. Esta hormona de crecimiento recombinante puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. El mamífero transgénico no humano puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos. La invención también se refiere a un método de producir una proteína de interés, que comprende obtener un mamífero transgénico no humano, que produzca dicha proteína en su leche, obtener dicha leche desde el mamífero transgénico no humano y purificar dicha proteína de interés de la leche. La proteína de interés puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. Este mamífero transgénico no humano puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos. La invención también se refiere a un método para producir y purificar una hormona de crecimiento recombinante a partir de la leche de un mamífero trasguéenlo. Esta hormona de crecimiento recombinante puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. El mamífero transgénico puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras 1A-1B muestran el volumen de la leche recogido diariamente de una vaca transgénica, obtenida por la fusión de un oocito enucleado y un fibroblasto previamente transfectado con una plasmida que contiene el gene, el cual codifica la hormona del crecimiento humana (hGH) y un promotor que dirige su expresión a las células de mamíferos . Las Figuras 2A-2C muestran el conteo de bacterias encontrado en la leche recogida de la misma vaca transgénica.

Las Figuras 3A-3B muestran la actividad biológica de la hGH contenida en la leche de la misma vaca transgénica. La Figura 4A muestra la masa diaria de la hGH producida en la leche de la misma vaca transgénica. La magnitud y el volumen diario de la leche recogida de la vaca transgénica se proyectan juntos en la Figura 4B. La Figura 5A muestra la concentración de la hGH y el factor-1 (IGF-1) del crecimiento de tipo insulina, en el suero de la misma vaca transgénica, y la masa diaria de la hGH producida en la leche de la misma vaca transgénica. La concentración de la hGH en el suero de la vaca transgénica y la masa diaria de la hGH producida en la leche de la vaca transgénica se proyectan juntos en la Figura 5B. En la Figura 5C los perfiles de tiempo de las concentraciones del suero de la vaca transgénica de la hGH y el IGF-1 son también proyectados juntos. Las Figuras 6A y 6B muestran la concentración del suero de la hGH y el factor 1 del cocimiento de tipo insulina (IGF-1) en dos terneras transgénicas, obtenidas por subclonación de una vaca, la cual es transgénica, para la producción de la hGH en su leche. En las Figuras 6C y 6D, , los perfiles de tiempo de las concentraciones de suero de la hGH y el IGF-1 se proyectan juntos para cada una de estas terneras transgénicas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a un mamífero transgénico no humano, caracterizado por la producción de, inesperadamente, niveles altos de la hormona de crecimiento recombinante en su leche. El mamífero puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos. Otras especies de mamíferos transgénicos pueden ser, pero no se limitan a, especies porcinas, especies ovinas, especies caprinas o especies roedoras. La hormona recombinante del crecimiento puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. Esta molécula, también conocida como somatotropina, es una proteína que consiste de 191 aminoácidos, con un peso molecular de alrededor de 22 kD. Es esencial para el crecimiento lineal y sus aplicaciones están bien establecidas . La invención también se refiere a un mamífero transgénico, caracterizado por el hecho que la hormona recombinante del crecimiento, producida en su leche, auto-estimula a las glándulas mamarias del animal, con el fin de producir más leche que contenga dicha hormona. La invención asimismo se refiere a una plasmida, que comprende un gene que codifica una proteína de interés, enlazada operablemente a un promotor de la beta-caseína y un gene de ß-lactamasa. Esta proteína de interés puede ser la pRßhGH. En otra modalidad, la plasmida incluye adicionalmente un gene de resistencia a la neomicina, para la selección de células resistentes a la geneticina. Un ej emplo de tal plasmida es la pRNeo . En aún otra modalidad, la plasmida incluye un gene que codifica para una proteína fluorescente verde, tal como GFP, la cual está bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV) . Un ejemplo de tal plasmida es la pRNeoGrren. La invención igualmente se refiere a una plasmida, tal como la descrita anteriormente, la cual se ha linealizado por la digestión de restricción. En particular, se emplea el uso de la enzima de restricción ApaLI y se extirpa el gene de la ß-lactamasa. El procedimiento de depósito, según el Tratado de Budapest de las plasmidas, mencionadas anteriormente, es como sigue: El nombre y dirección del depositario son DSMZ -Deutsche Sammhung von Microorganismen und Zelkulturen GMBH, Mascheroder Weg Ib, 37124, Barunschweg, Alemania. Los números de acceso correspondientes serán provistos en el curso debido. La invención asimismo se refiere a una plasmida construida con base en una plasmida que contiene un gene de Neo-resistencia, en la cual una región promotora de la beta-caseína más corta, modificada, se insertó corriente arriba de una región que codifica la hGH, tal como la pVEßcashGH. Un fragmento lineal puede ser obtenido de la plasmida pVEßcashGH, extirpando el gene de la beta-lactamasa. La invención también se refiere a un método para la transfección de constructores genéticos que usan una combinación de lípidos catiónicos para la utilización de la liposoma. Métodos de selección de las células resistentes a la neomicina en medios apropiados son también descritas, como métodos de selección de las células transgénicas fluorescentes verdes . Estas células son tomadas cuidadosamente para así evitar daño a las mismas. La invención igualmente se refiere a un método para la transferencia nuclear de las células detenidas en G0 o en diferentes momentos del ciclo de la célula, en los oocitos bovinos enucleados . La invención se refiere además a un método de transferir embriones transgénicos dentro de hormonas estimuladas en el útero de la vaca. De acuerdo con la invención, se describe un método para determinar parámetros de la saluda de animales . Los análisis se realizaron en tanto el suero como la leche del animal, con el fin de determinar estos parámetros. La invención asimismo se refiere a un método de obtener un mamífero transgénico no humano, que comprende obtener un gene, el cual codifica una hormona del crecimiento, clonar el gene en una plasmida, , por lo cual este gene se enlaza operativamente a un promotor que dirigirá la expresión del gene en células mamarias que resulta en una plasmida de expresión, transfectar las células somáticas con la plasmida de expresión, sí que la plasmida se incorpore en el genoma de las células, lo que resulta en células somáticas transgénicas, enuclear un oocito maduro, que resulta en un oocito enucleado, fundir una célula somática transgénica con el oocito enucleado, que resulta en un embrión monocelular, implantar el embrión en el útero de un mamífero receptor y vigilar el embarazo hasta ocurrir el nacimiento del mamífero transgénico. La invención asimismo se refiere a un método para obtener un mamífero transgénico humano, que comprende extraer células somáticas desde un mamífero hembra, el cual es transgénico, para la producción de una hormona recombinante de crecimiento en su leche, opcionalmente fibroblastos, enuclear un oocito maduro, que resulta en un oocito enucleado, fundir la célula somática transgénica con el oocito enucleado, que resulta en un embrión monocelular, implantar el embrión en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico. La invención además se refiere a un método para obtener un mamífero transgénico no humano, que comprende superovular un mamífero no humano, hembra, el cual es transgénico, para la producción de una hormona recombinante del crecimiento en su leche, inseminar artificialmente el mamífero con el semen obtenido de un mamífero no transgénico, no humano, macho, para producir embriones, recoger los embriones, implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento de un mamífero transgénico. La invención además se refiere a un método de obtener un mamífero transgénico no humano, que comprende superovular un mamífero no humano, hembra, el cual es transgénico, para la producción de una hormona recombinante del crecimiento en su leche, inseminar artificialmente el mamífero con el semen obtenido de un mamífero no humano macho, el cual es transgénico, para la producción de dicha hormona recombinante del crecimiento, para producir embriones, recoger los embriones, implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico.

La invención asimismo se refiere a un método de obtener un mamífero transgénico no humano, que comprende superovular un mamífero no transgénico, no humano, hembra, inseminar artificialmente este mamífero con el semen obtenido de un mamífero no humano macho, el cual es transgénico para la producción de una hormona recombinante del crecimiento, para producir embriones, recoger los embriones , implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico. La hormona recombinante del crecimiento puede ser, pero no se limita a, la hormona de crecimiento humana. El mamífero transgénico no humano puede ser, pero no se limita a, un animal de la especie de bovinos. La invención además se refiere a un método para producir una proteína, que comprende obtener un mamífero transgénico no humano que produzca una proteína de interés con rendimientos inesperadamente altos, en su leche, obtener la leche del mamífero transgénico no humano y purificar la proteína de interés desde la leche. La invención también se refiere a producir una proteína de interés en un mamífero transgénico no humano, por medio de un proceso que comprende obtener un gene que codifique dicha proteína de interés, clonar el gene en una plasmida, por lo cual el gene se enlaza operablemente a un promotor el cual dirige la expresión del gene en células mamarias, que resulta en una plasmida de expresión, transfectar las células somáticas, opcionalmente fibroblastos, con la plasmida, de manera que la plasmida se incorpore en el genoma de dichas células somáticas, que resulta en células somáticas transgénicas, enuclear un oocito maduro, que resulta en un oocito enucleado, fundir una célula somática transgénica con el oocito enucleado, lo cual resulta en un embrión monocelular, implantar este embrión en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico. La invención además se refiere a un método para producir una proteína de interés en un mamífero transgénico no humano, obtenida por un proceso que comprende extraer las células somáticas de un mamífero hembra, el cual es transgénico para la producción de dicha proteína de interés en su leche, opcionalmente fibroblastos, enuclear un oocito maduro, que resulta en un oocito enucleado, fundir una célula somática transgénica con el oocito enucleado, que resulta en un embrión monocelular, implantar el embrión en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico. La invención asimismo se refiere a un método para producir una proteína de interés en un mamífero transgénico no humano, por un proceso que comprende superovular un mamífero no humano hembra, el cual es transgénico, para la producción de dicha proteína de interés en su leche, inseminar artificialmente el mamífero con el semen obtenido desde un mamífero no transgénico, no humano, para producir embriones, recoger los embriones, implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del animal transgénico. La invención asimismo se refiere a un método para producir una proteína de interés en un mamífero transgénico no humano, por un proceso que comprende superovular un mamífero no humano hembra, el cual es transgénico, para la producción de dicha proteína de interés en su leche, inseminar artificialmente el mamífero con el semen obtenido desde un mamífero no humano, macho, el cual es transgénico, para producir de dicha proteína de interés, para producir embriones , recoger los embriones , implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del animal transgénico. La invención asimismo se refiere a un método para producir una proteína de interés en un mamífero transgénico no humano, por un proceso que comprende superovular un mamífero no transgénico, no humano, hembra, inseminar artificialmente el mamífero con el semen obtenido desde un mamífero, no humano, macho, el cual es transgénico, para producir dicha proteína de interés, para producir embriones, recoger los embriones, implantar estos embriones en el útero de un mamífero receptor, y vigilar el embarazo hasta el nacimiento del animal transgénico. Los mamíferos transgénicos, caracterizados por la producción de, inesperadamente, altos niveles de una proteína de interés en su leche, pueden ser, pero no se limitan a, animales de la especies del bovinos. Otras especies de mamíferos transgénicos pueden ser, pero no se limitan a, especies de porcinos, especies de ovinos, especies de caprinos o especies de roedores. La proteína de interés puede ser, pero no se limita a, la hormona del crecimiento humano. La invención además se refiere a un mamífero transgénico no humano de las especies de bovinos, que produce la hormona recombinante el crecimiento humano en su leche, cuyo genoma comprende una plasmida integrada, dicha plasmida comprende el gene de la hormona del crecimiento humano y un promotor de beta-caseína, que dirige la expresión de dicho gene en células mamarias del mamífero. La invención además se refiere a un mamífero transgénico, que produce la hGH en niveles, inesperadamente, altos, que aun no muestra el crecimiento físico esperado con tal nivel elevado de la producción de la hGH. Puesto que los bovinos transgénicos son afectados por la presencia de hormonas del crecimiento humanas, se esperaría que los animales crecerían más allá de los regímenes de crecimiento no transgénico, y sufrirían de condiciones, tal como la diabetes mellitus, hipertensión, riesgo aumentado de enfermedades cardiovascular y agrandamiento de los órganos del cuerpo, que incluyen el hígado, bazo, ríñones y corazón. Tales altos niveles de la hGH harían al animal, teóricamente, no viable. Sin embargo, este no es el caso. Un mamífero, tal como una vaca, con niveles alarmantes elevados de una hormona ajena en su cuerpo, pero la cual es perfectamente saludable y proporciona una productividad sobresaliente de una proteína recombinante, constituye una contribución innovadora e inesperada. La hormona del crecimiento humana recombinante de la invención se produce en niveles inesperadamente altos . El nivel de la hormona del crecimiento humano, producida es mayor de alrededor de 1.0 g/1 de leche. El nivel de la hGH puede ser mayor de alrededor de 2.0 g/1 de leche. El nivel de la hGH producida puede también ser mayor de aproximadamente 3.0 g/1 de leche. En otra modalidad, el nivel de la hGH producida puede ser mayor de aproximadamente 4.0 g/1 de leche. En aún otra modalidad, el nivel de la hGH producida puede ser mayor de aproximadamente 5.0 g/1 de leche. En una modalidad más, el nivel de la hGH producida puede ser mayor de aproximadamente 6.0 g/1 de leche. En aún otra modalidad, el nivel de la hGH producida puede ser mayor de aproximadamente 7.0 g/1 de leche. En una modalidad más, el nivel de la hGH producida es de alrededor de 2.0 g/1 de leche hasta alrededor de 6.0 g/1 de leche. En todavía otra modalidad, el nivel de la hGH producida es de alrededor de 2.0 g/1 de leche hasta alrededor de 5.0 g/1 de leche. Adicionalmente, la invención se refiere a un método para purificar una hormona de crecimiento recombinante con la leche de un mamífero transgénico, al igual que ensayos de dicha hormona. Los métodos de purificación pueden incluir las etapas de cromatografía y concentración. Diferentes tipos de cromatografía se pueden emplear, e incluyen la cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión molecular, o cromatografía de afinidad. La cromatografía de intercambio de iones puede ser la cromatografía de intercambio de aniones . La cromatografía de afinidad, puede ser la cromatografía de inmuno-afinidad. Además, las etapas de cromatografía múltiples pueden ser realizadas . La invención asimismo se refiere a un método de purificar una hormona de crecimiento recombinante procedente de la leche de un mamífero transgénico no humano, que produce una hormona recombinante del crecimiento, este método comprende clarificar la leche de un mamífero transgénico humano, lo que resulta en la leche clarificada, y someter esta leche clarificada a cromatografía, lo cual resulta en una hormona recombinante del crecimiento purificada. La invención además se refiere a un método de purificar una hormona recombinante del crecimiento de la leche de un mamífero transgénico no humano, que produce esta hormona recombinante del crecimiento, el cual comprende clarificar la leche de un mamífero transgénico no humano, que resulta en una leche' clarificada, someter esta leche clarificada a la cromatografía de intercambio de aniones, de lecho expandido, lo cual resulta en u material cromatografiado de intercambio de aniones, someter este material a la cromatografía de fase inversa, lo cual resulta en un material cromatografiado de se inversa, someter este material a la cromatografía de intercambio de aniones, lo que resulta en un material cromatografiado de intercambio de iones, someter este material a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en un material cromatografiado de exclusión molecular, , concentrar este material, lo cual resulta en un material concentrado y someter este material a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en una hormona recombinante pura del crecimiento. La invención también se refiere a un método de purificar una hormona recombinante del crecimiento de la leche de un mamífero transgénico no humano que produce esta hormona recombinante del crecimiento, el cual comprende clarificar la leche de un mamífero transgénico, lo que resulta en una leche clarificada, someter esta leche clarificada a la cromatografía de inmunoafinidad, lo cual resulta en un material cromatografiado de inmunoafinidad someter este material a la cromatografía de fase inversa, lo cual resulta en un material cromatografiado de se inversa, someter este material a la cromatografía de intercambio de aniones, lo que resulta en un material cromatografiado de intercambio de iones, someter este material a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en un material cromatografiado de exclusión molecular, concentrar este material, lo cual resulta en un material concentrado y someter este material a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en una hormona recombinante pura del crecimiento. La hormona recombinante del crecimiento de los métodos de purificación, antes descritos, pueden ser, pero no se limitan a, la hormona de crecimiento humana. El mamífero transgénico puede ser, pero no se limita a, un mamífero de la especie de bovinos. Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitativos, del método y las composiciones de la presente invención. Otras modificaciones adecuadas y adaptaciones de la variedad de condiciones y parámetros encontrados normalmente en la producción enzimática de los productos químicos y los procedimientos de purificación de proteínas, que son obvios a los expertos en la técnica, se encuentran dentro del espíritu y ámbito de la invención.

EJEMPLO 1 Construcción de plasmidas de expresión Generamos un constructor que lleva una gran porción del promotor de gene de la ß-caseína del bovino, que incluye un fragmento corto de la región del gene de la ß-caseína 5' que no codifica, fundido a la secuencia de codificación del gene de la hormona de crecimiento humana. La región de la beta-caseína empleada en diferentes constructores disminuyó de 3.8 kbp a alrededor de 1.3 kbp. El gene de la hGH abarca alrededor de 2 hasta 2.2 kbp, dependiendo de si se incluye la señal intrínseca de poli A. El cásete de expresión se acomodó en el polienlazador de un vector de clonación usual de tipo pUC o pBS. Este promotor asegura el tejido específico y la expresión regulada en el desarrollo de genes bajo su control, como la beta-caseína, y la hGH heteróloga en este caso. La plasmida más representativa es la pRBhGH, la cual lleva el promotor de la beta-caseína del bovino de longitud completa, fundido a la secuencia de codificación del gene de la hormona de crecimiento humano. Otros constructores descritos se derivan principalmente de uno original, como se ilustra, para mejorar la selección celular tranfectada o eficiencia de integración del ADN en el genoma celular del bovino. En el primer período, la co-transfección con una plasmida que contiene un gene resistente a la geneticina, se realizó para ayudar a la selección, pero, en seguida, se usaron otros constructores, que llevan el gene NPT para la resistencia a la neomicina en el mismo vector que contiene el cásete de expresión de la hGH. Un ejemplo de tal plasmida es la pRNeo. Otra plasmida para la expresión constitutiva de la proteína fluorescente verde se obtuvo, la cual incluye el promotor de MV, un agente aumentador de origen vegetal (alfalfa) y el gene de proteína fluorescente verde de la medusa A . victoria . Un ejemplo de tal plasmida es la pRNeoGreen . Además, otra plasmida se genera . Esta se construyó con base de una plasmida que contiene un gene de Neo-resistencia, en la cual una región del promotor de beta-caseína más corta modificada se insertó corriente arriba de una región codificador de la hGH. Esta plasmida es la pVEßcashGH.

Otros constructores se generaron, en los cuales la región de la ß-lactamasa se extirpó por la restricción ApaLI y el fragmento lineal que contiene el cásete de expresión total se purificó después de la electroforesis de gel de agarosa y la extracción del gel . Los constructores se analizaron por las enzimas de restricción y la secuencia del ADN y su habilidad para conducir la expresión de la hGH se probó previamente en una línea de célula de la glándula mamaria por el reconocimiento del anticuerpo fluorescente. La preparación de la plasmida pVBßcashGH se describirá en detalle como un ejemplo de esta parte que involucra constructores genéticos .

Preparación de la plasmida pVEßcashGH ?l objeto de este constructor es proporcionar la extensión mínima de la región del promotor de la beta-caseína para dirigir la transcripción regulada específica directa del gene hGH fundido inmediatamente corriente abajo, junto con la señal Poli A en un organismo huésped, El uso de pVEX como el vector original permite el uso del gene de resistencia a la neomicina, regulado por un promotor tk, ya presente en esta plasmida. El promotor SV40 temprano, que comprende 554 bp, se eliminó por la restricción con Stul y Ndel, y el último sitio llenado con Klenow, y el auto-ligado del vector resultante.

El promotor corto de la beta-caseína se obtuvo después de la amplificación de la PCR de un fragmento de 1.3 kbp, de la región promotora del gene original usando lo siguientes oligómeros como aprestos: PBl 5' TCTACTCGAGGATCATCTATCTGTCCCAAAG (SEQ ID NO:l) y PB2 5' CTAGGATCCAATGATCTGATTTTGTGG(SEQIDNO: 2) Este fragmento abarca 1230 bp del promotor canónico de más 49 bp del primer exon no codificador del gene de beta-caseína. El fragmento del gene de la hGH se obtuvo por técnicas de la PCR en la clona de hGH genómica del bovino, original, usando los siguientes oligómeros como aprestos: PB4 5'CTAGGATCCATGGCTACAGGTAAGCGCC (SEQ ID NO: 3) y GHTE 5'ATGCTGTGTCTGGACGTCCT (SEQIDNO: 4) El fragmento del promotor de la beta-caseína se mezcló con la enzima Klenow y se insertó en el sitio relleno BamHl de pVEX. Después de seleccionar las clonas recombinantes, escogimos una cierta dirección apropiada para el uso del sitio HindIII único ubicado corriente abajo en pVEX para insertar la región codificadora de la hGH.

Para este objeto, el fragmento de la hGH fue también obtuso y el sitio HindIII de plasmida se rellenó igualmente. Las clonas se seleccionaron, las cuales contenían el promotor de beta-caseína y la hGH fundida apropiadamente para expresar la hGH solamente bajo el control de este promotor. El tamaño de esta plasmida fue de aproximadamente 8.5 kbp.

Transfección de las células somáticas Las plasmidas pRßhGH (junto con otra plasmida con el gene -de resistencia a la geneticina), pRNeo, pRNeoGreen o pVEßcashGH fueron luego usadas para transfectar un cultivo primario de células aromáticas, que usan el fosfito de calcio o el método de liposoma. Los fibroblastos de la ternera fetal se emplearon generalmente para ser transfectados . Las células transfectadas se seleccionaron agregando la geneticina al cultivo. Después de un período de 2 a 8 semanas, las células que fueron resistentes a la geneticina fueron adecuadas para ser usadas como células donadoras para obtener clonas transgénicas . Las células seleccionadas transfectadas se analizaron por la PCR para contener el cásete de expresión, y asegurar la transferencia de núcleos apropiados para generar embriones transgénicos .

EJEMPLO 2 Enucleación de oocitos y transferencia nuclear de metafase en oocitos enucleados naturales Recolección y Maduración in vi tro de los oocitos del bovino Se aspiraron los oocitos del bovino de los ovarios en el matadero y se maduraron en TCM-199 +5% de FCS a 29°C durante 24 horas . El medio de maduración se equilibró con C02 durante al menos 2 horas antes de usar. Los oocitos maduros desnudaron por vórtice durante 2 minutos en TL-HEPS caliente, con 1 mg/ml de hialuronidasa de testículos del bovino .

Transferencia Nuclear con Células Acumuladas Enucleación Los oocitos se enuclearon mecánicamente usando micromanipuladores hidráulicos Narishige y la micrscopía Nikon DIsphot . La enucleación se realizó con pipetas biseladas y agudas de 20 µm. Los oocitos se tiñeron previamente con 5 µg/ml de tinte de bisbencimidina (Hoechst 333421) durante 20 minutos. Las metafases se enuclearon por visualización de los cromosomas teñidos bajo luz 1 Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA ultravioleta. Los cromosomas de metafase se evaluaron después de la aspiración dentro de la pipeta. Una célula somática transgéníca se transfirió dentro del espacio de perivitelina y opuesto herméticamente al oocito enucleado.

Fusión Una célula somática transgénica y un oocito enucleado se alinearon manualmente en la cámara de fusión, de modo que las membranas, que se van a fundir, fueran paralelas a los electrodos . Esto se hizo usando una pipeta de vidrio para el manejo de embriones.

Fusión por Medios Eléctricos La fusión se realizó usando un pulso eléctrico de 180 voltios/cm durante 15 µs (BIX Electro Cell Manipulator 200) 2 y se vigiló con BTX Optimizer-Graphc Pulse Analyzer. La cámara para pulsar embriones consistió de dos electrodos de alambre de acero inoxidable de 0.5 mm, montados separados por 0.5 mm sobre un cursor de vidrio de un microscopio. Los zigotes presuntos se vigilaron ara la función, lisis y fragmentación.

Evaluación de la Competencia de Desarrollo 2 BIX Inc., San Diego, Ca. USA Los zigotes se evaluaron 48 horas después de la fertilización para el desdoblamiento y después de 7 a 9 días para el desarrollo de las mórulas o blstocistos .

EJEMPLO 3 Cultivo de Células y Embriones Diferentes células donadoras, sistemas de cultivo y tratamientos del receptor de oocitos se probaron en un experimento dirigido a procedimientos simplificados y régimen aumentado de supervivencia de embriones en un programa de clonación de bovinos . Tres sistemas de cultivos para los embriones reconstruidos se usaron, cuando los fibroblastos adultos se usaron como células donadoras : TCM-199 + 5% FCS, Menezo + 5% de FSC (ambos con células VEO como co-cultivos) y SOF sin co-cultivo, pero con una concentración menor de 02. El medio SOF fue también usado para cultivar embriones reconstituidos, cuando las células donadoras fueron fibroblastos fetales modificados genéticamente y no genéticamente. Finalmente, cuando los fiboblastos fetales, modificados genéticamente, se usaron como las células donadoras, los oocitos receptores se trataron previamente con roscovitina (R) a la meiosis suspendida y optimizar la capacidad de uso del receptor. Los oocitos se aspiraron de los ovarios en el matadero y se maduraron en TCM-199 + 5% FCS a 39°C durante 24 horas. Para el grupo tratado R, los oocitos se incubaron con 25 µM R en TCM 100 + 5% FCS durante 24 horas a 39°C. antes de la maduración. Los oocitos maduros se desnudaron por vórtice durante 3 minutos en TL HEPS con 1 mg/ml de hialuronidasa de testículos de bovino. Las metafases se evaluaron y los oocitos se enuclearon por visualización con Hoechst 33342 (5 µg/ml) bajo luz UV (<6 segundos) . Los fibroblastos adultos de un toro Angus y los fibroblastos fetales de un feto hembra Jersey (raza de ganado lechero) de 45 días de edad, se usaron como las células donadoras . La transfección con constructores que contienen genes de resistencia a la neomicina se realizó usando liposomas. Después de la selección con geneticina durante 10-15 días, las células donadoras en las etapas G0/GI se fundieron a oocitos enucleados por un pulso eléctrico. Después de 3 horas, la activación se indujo por incubación en TL-HEPE con 5 µM de ionomicina durante 4 minutos y 2 mM de 6-DMAP durante 3 horas . Los oocitos luego se lavaron con IL-HEPES y se co-cultivaron en cualquiera de TCM-199 + 5% de FCS + 10 g(l de albúmina o Menezo + 2% de FCS con células VERO o en el medio SOF y una atmósfera de 5% de C02 + 5% de 02 + 90% de N2. Generalmente, dos blstocistos se transfirieron no quirúrgicamente por vaca receptora, y los embarazos a 30-35 días se determinaron por ultrasonografía. El desdoblamiento (48 hors) , desarrollo de blastocistos (días 7 a 9) se registraron y analizaron por el método de cuadrado de Chi. Los regímenes de desdoblamiento y desarrollo de blstocistos fueron mayores cuando los embriones se cultivaron en SOF. Sin embargo, no se observaron diferencias en los regímenes del embrazo debido a las diferentes condiciones de cultivo o fuente de células donadoras . La suspensión de la maduración moiótica durante 24 horas, no comprometió la competencia del desarrollo de los oocitos receptores. Por lo tanto, el tratamiento con roscovitina puede ser usado para aumentar la disponibilidad de los oocitos para el procedimiento de la NT. Véase la siguiente Tabla 1.

Tabla 1 Los porcentajes dentro de las columnas con diferentes índices son diferentes (P < 0.05). Las vacas implantadas se dejaron el paso normal del embarazo hasta el parto natural. Finalmente, un acercamiento quirúrgico (cesárea) pudo ser usado para el parto. Los recién nacidos se alimentaron con calostro rico en Ig, durante las primeras 48 horas, y luego se usaron alimentos naturales (todos ellos exentos de compuestos de origen animal) .

EJEMPLO 4 Pruebas realizadas en terneras transgénicas y la proteína recombinante producida En el presente actual presentamos una descripción completa de las pruebas realizadas en una ternera transgénica particular, la cual se obtuvo como resultado del procedimiento descrito en los Ejemplos 1 a 3, y en la proteína recombinante producida por el mismo. No obstante, debe ser claro que el mismo conjunto de ensayos se realizó en animales que nacieron como una consecuencia de otros métodos, para obtener terneras transgénicas, tal como los que se describirán en los Ejemplos 5 y 6 siguientes. Se ha probado que por medio de las reacciones de la PCR, realizadas en el ADN purificado de los leucocitos de la ternera, cuando el ADN de terneras Jersey no transgénicas, como el control negativo, que el promotor de la beta-caseína del bovino y el gene que codifica la hGH, se incluyen en el genoma de células de la ternera transgénica. Ellas se pueden encontrar juntas como un diferente fragmento del ADN único, al gene de la beta- caseína homologa del animal . Se corroboró que usando la secuencia automática de Pharmacia, la secuencia del gene insertado corresponde al 100% al gene encodificado de la hGH. Este incluye introns, señal de secreción y terminador. El promotor de la beta-caseína del bovino, que controla la misma expresión del gene de hGH en nuestra ternera formó una secuencia igualmente. Todos esos elementos coinciden exactamente con la secuencia teórica esperada del constructor genético usado para transformar las células fuera de las cuales se generaron las clonas .

Una vez conocida la exactitud de la fase genética del experimento, pasamos a probar si la proteína recombinante, producida es la esperada y coincide en cada una de las característícas físicas y químicas, con la hGH natural . Para este propósito, obtuvimos leche de la ternera, puesto que el promotor de la beta-caseína permite la expresión de la proteína recombinante solamente en las glándulas mamarias, cuando el animal está en el momento productor de leche. La ternera transgénica fue luego inducida por un tratamiento de hormonas a producir leche por el momento que completa su décimo mes. en este momento, la ternera pesaba 240 kilogramos. La primera fase de dicho tratamiento implicó la administración combinada por la ruta subcutánea, de estrógenos (benzoato de estradiol, Histeren®, Instituto Rosenbusch) y progestágenos (acetato de medroxiprogesterona, Pronal ®, Aton) , que comprende 5 aplicaciones sucesivas de cada droga, en una dosis de 0.1 mg/kg y 0.25 mg/kg, respectivamente, cada 48 horas (es decir, los días 1, 3, 5, 7 y 9, suponiendo que el tratamiento comience el día 1) . La segunda fase comprende la administración, por la ruta subcutánea, de la dexametrasona (Decadron, Sidus) y oxitocina (Orasthin®, Hehst Marión Rousel) ; una cantidad total de 20 mg del primero e inyectada en un período que comprende los días 18 20 (un tercio de la masa total cada día) y 3 aplicaciones de 50 Ul del último, en los días 21 a 23. La información anterior se resume en la Tabla 2 : Tabla 2 "Dia ' 7 8 9 10 (...) 17 18 19 20 21 21 23 Histeren {mg/kg) 0.10 s.10 0.10 0.10 0.10 ProtiaHmglhg) 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 Decadron (mg) 6.66* 6.66* 6.66* Orast ln (IU) 50 50 50 Aproximadamente un tercio de la masa total (20 mg) se administró cada día.

Como se esperaba, la vaca comenzó a producir calostro el día después que el tratamiento había terminado, la cualidad del fluido producido se volvió leche. El fluido recogido se almacenó apropiadamente y se analizó completamente . Varias pruebas, cuyos resultados se muestran en las Figuras 1 a 4, se realizaron en el calostro y la leche (para simplicidad, tanto el calostro como la leche se referirán aquí como "leche", excepto cuando se haga una distinción) . Primero, se midió el volumen de la leche recogida. La productividad de la leche inicial (primeros cinco días de lactancia) fue aproximadamente de 1.850 ml/día. Durante el primer mes productivo, dos ordeñas diarias se realizaron, una en la mañana y una en la tarde (la contribución de cada ubre en el volumen final se anotó, en tanto del segundo mes en adelante, conforme la producción de la leche comenzó a aumentar, tres ordeñas por día se realizaron (en la mañana, a medio día y en la tarde) . Los volúmenes diarios aumentaron en más o menos una forma continua, hasta alcanzar cerca de los 10,000 ml, tres meses después de la primera ordeña. La información detallada respecto a este tópico (Figura ÍA) se puede visualiza en la curva del volumen diario de leche vs . la fecha (Figura IB) . En paralelo con las mediciones del volumen de leche, se realizaron ensayos microbiológicos en la leche, cuyos resultados (Figura 2) se muestran en las proyecciones correspondientes de las CFU (Unidades Formadoras de Colonias) por ml vs . la fecha (Figuras 2B-2C) . La actividad biológica (de la hGH) también se evaluó por el ensayo de la actividad biológica in vitro en el cultivo de células NH2 (Figuras 3A-3B) . Se probó que la actividad biológica de la hGH recombinante, producida en la leche de vaquilla dentro del rango de error del método, en los valores normales para la hGH natural humana. Asimismo, la leche obtenida se estudió por el ensayo de la mancha Western, en el cual una banda principal, que corresponde a la hGH intacta, se detectó. Bandas menores que corresponden a variantes desdobladas y agregados también se encontraron, como se esperaba, en estos sistemas productivos . Con la información respecto a la actividad biológica y los volúmenes diarios, fue posible calcular la producción diaria de la hGH usando la Ecuación I, donde Mg. es la masa producida diaria de la hGH en miligramos; BA es la actividad biológica en Unidades Internacionales, SA es la actividad específica de la hGH (3 Ul/mg) ; y V es el volumen diario de la leche recogida. Los datos se muestran en la Figura 4A. Una proyección de la masa diaria de la hGH se muestra en la Figura 4B. Con el fin de establecer una correlación visual entre la masa diaria de la hGH, y el volumen diario de la leche, el último se proyectó en la Figura 4B: BA m hGH SAxV (Eq. 1) Co o se puede observar de esta información, la masa diaria de la hGH en la leche y el volumen diario de leche, tienden a aumentar conforme se desarrolla la vaca (la primera se piensa en una mayor proporción) , que constituye una tendencia ascendente en la productividad de la hormona recombinante (gramos de la hGH por litro de leche) . Puede ser notado que esta productividad pasó de alrededor de 2 g de hGH por litro (primera ordeña) , cuando el producto es el calostro, a una cantidad promedio de 5 g de hGH por litro de leche, del segundo mes de lactancia en adelante, así, un rendimiento inesperadamente alto de la hormona del crecimiento humana se obtuvo conforme la productividad aumentó, en una manera más o menos continua, conforme la cualidad del fluido de cambió del calostro a la leche. Aunque en el presente, la masa de la hGH producida por día es en verdad notable, se debe observar que, conforme la vaca no crece aún completamente, la tendencia ascendente en la masa de la proteína recombinante producida por día, debe continuar en el futuro, hasta alcanzar un máximo. En paralelo con las pruebas realizadas en la leche, un diferente conjunto de ensayos se llevaron a cabo en el suero de la vaca, cuyos resultados se muestran en las Figuras 5A-5C. Primero, las mediciones de la concentración de la hGH en el suero de la vaca se realizaron. Los resultados (Figura 5A) se proyectaron en una gráfica junto con la masa diaria de la hGH en la eche, para permitir una comparación de ambas magnitudes (Figura 5B) . El intervalo de referencia para la GH en el suero (en humanos) es de 0.06 a 5 ng/ml. Suponiendo un intervalo similar hipotético para los bovinos, se notará que, excepto para el inicio, la curva total de la hGH en el suero de la vaca transgénica versus la fecha se encuentra bien sobre el límite superior de dicho intervalo. Este hecho, no obstante, debe ser tomado en cuenta que, aunque la hGH y la hormona del bovino correspondiente (BGH) son muy similares, respecto a su secuencia de aminoácidos y la estructura 3D, la primera, aunque completamente funcional, no es activa completamente en el ganado. Por lo tanto, con el fin de evaluar el riesgo potencia de la salud de la vaca, debido a estos altos niveles de la hGH en su suero, mediciones de la concentración del suero del IGF-1 (Factor de Crecimiento 1 de tipo insulina, también conocido como somatomedin C( se realizaron en paralelo (Figura 5A) . La hormona del crecimiento realiza sus funciones primariamente a través del IGF-1, que se obtiene en el hígado. Debido a que el IGF media en muchos de los efectos de división celular in vivo y metabólicos de la hormona del crecimiento, la evaluación del IGF-1 es una herramienta de diagnóstico valiosa para la evaluación indirecta de los desórdenes de la hormona del crecimiento sospechados. Así, el IGF-1 representa un indicador desprendible de la hormona de crecimiento biodisponible. Los resultados de estos análisis se muestran en la Figura 5C, junto con aquellos que corresponden a la hGH, para permitir la visualízación simultánea de ambas magnitudes . Igualmente, el IGF.l y la hGH se midieron en el suero de un grupo de vacas no transgénicas, con el fin de tener un grupo de control y así establecer una comparación con los datos que corresponden a la vaca transgénica. Los promedios de las mediciones de ambas proteínas para el grupo no transgénico y la vaca transgénica se exhiben en la siguiente Tabla 3.

Tabla 3 Se debe notar que la concentración promedio del suero de la hGH en el grupo no transgénico se encuentra dentro del intervalo de referencia hipotético, en tanto el promedio para la vaca transgénica está sobre el límite superior de dicho intervalo. Asimismo, se indudable que el nivel promedio de una vaca no transgénica correspondiente, que constituye una diferencia fundamental, Por lo tanto, aunque la concentración alta de la hGH en el suero de la vaca transgénica (auque en humanos se sabe causa desórdenes con severas consecuencias, tal como la diabetes mellitus, la hipertensión, riesgo aumentado de enfermedades cardiovasculares y agrandamiento de órganos del cuerpo, que incluyen el hígado, bazo, ríñones y corazón) , hacen al animal teóricamente no viable, esto no representa, aparentemente, un obstáculo en su salud y bienestar. Una vaca con niveles alarmantemente altos de una hormona ajena en su sangre, pero que está perfectamente saludable y proporciona una productividad sobresaliente de una proteína recombinante, constituye una contribución inesperada e innovadora. Otro aspecto innovador de la presente invención es que la hGH recombinante, que entra en la corriente sanguínea de la leche, estimula la glándula mamaria para producir más leche. Este efecto se logra indirectamente, es decir, a través de la acción del IGF-1. La molécula aumenta el flujo de la sangre a través de la glándula mamaria, proporcionando precursores críticos para la síntesis de la grasa de leche, proteínas y lactosa. Así, el IGF-1 actúa para dirigir los nutrientes a través de la sangre a las células en la ubre, donde ellos ayudan en la producción de la leche. Por lo tanto, se obtiene un animal auto-estimulado, puesto que la hGH recombinante producida en la leche de las vacas transgénicas es promovida por un aumento sostenido en el volumen de la leche, producido por el animal, a través del estímulo de su glándula mamaria, con la secreción correspondiente de más hGH en su leche .

EJEMPLO 3 Obtención de terneras transgénicas por subclonación Cinco ejemplos de tejido de la oreja de una ternera transsgénica se tomaron empleando una aguja con un diámetro de 1.5 mm. cuya punta se ha biselado previamente para este propósito. Las muestras se transportaron en refrigeración al laboratorio en un medio basado en PBS, que contiene antibióticos y antimicóticos. En seguida, las muestras de tejido se incubaron durante 72 horas en un medio MEM, con 10! del suero fetal del bovino y antibióticos a 39°C y en una atmósfera de 5% de C02. Finalmente, los ejemplos de tejidos se removieron y los fibroblastos en la periferia de la placa se dejaron crecer hasta la confluencia. Una vez que se ha logrado, los fibroblastos se incubaron durante al menos 5 días, sin cambiar el medio de cultivo, con el fin de obtener su sincronización en la etapa GQ, lo cual se evaluó por medio de la visualización con un microscopio. Después de la tripsinización, fibroblastos individuales se fundieron con los oocitos de bovinos enucleados, de acuerdo con el Ejemplo y los embriones, así obtenidos, se cultivaron en el medio SOF y una atmósfera de 5% de C02 + 5% de 02 + 90% de N2 hasta la etapa de blastocistos . Después, generalmente dos blstocistos se transfirieron, no quirúrgicamente, por vaca receptora, y el embarazo se determinó en 30-35 días por ultrasonografía . Las vacas implantadas se dejaron pasar normalmente el embarazo hasta el parto natural ., Finalmente, un acercamiento quirúrgico (Cesárea) se usó para el parto. Los recién nacidos se alimentaron con Ig rico en calostro, durante las primeras 48 hors, y luego se usaron alimentos sintéticos o naturales (todos ellos libres de compuestos de origen animal . Las Figuras 6A y 6B muestran las mediciones de la concentración del suero de la hGH y el IGF-1, realizadas en paralelo para dos de los animales transgénicos por subclonación de una vaca transgénica, y los resultados de estos análisis se ilustran en las Figuras 6C y 6D, respectivamente, para permitir la visualización simultánea de ambas magnitudes para cada animal. Puesto que en el presente las terneras son jóvenes, los valores para tanto la hGH como el IGF-1 aún están dentro del intervalo respectivo de referencia, pero se espera que ellos se eleven de la misma manera como en la vaca transgénica fuera de los cuales estas dos clonas se obtienen.

EJEMPLO 6 Obtención de terneras transgénicas por inseminación artificial de una vaca transgénica superovulada Un acercamiento alternativo para obtener bovinos transgénicos se describirá en este ejemplo. Este método comprende la superovulación de una vaca transgénica por miedo de un tratamiento hormonal, inseminar artificialmente dicha vaca, recoleccionar los embriones así generados,, la implantación de dichos embriones en vacas sustitutas; y el desarrollo del embarazo hasta el nacimiento del animal . Una descripción de este proceso se presenta abajo.

Superovulación En la mañana del día 1 (es decir el día de inicio del procedimiento), 150 µg de las prostaglandinas (D(+)-clorprostenol, Arsprost®, Arsa) se administraron a la vaca transgénica por la ruta intramuscular. El animal se sometió a una dieta diaria de 4 kg que contiene aproximadamente 15% de proteínas (antes del día 1, el animal fue suministrado con 2 kg de alimento, con el mismo contenido de proteínas) . En la mañana del día 8, un dispositivo CIDT (liberación interna controlada de droga) de progesterona se colocó intravaginalmente . además, 50 mg de progesterona y estradiol se administraron por la ruta intramuscular. La cantidad de alimento del animal se elevó a 6 kg/día, con el mismo contenido de proteínas. Luego, dos inyecciones intramoleculares de FSH y LH (PLUSEt®, Galier) se administaron en los días 12, 13 y 14 (uno en la mañana y el otro en la tarde) . El siguiente día (día 15) , el tratamiento continuó con la administración, por la ruta intramuscular de dos inyecciones de PLUSET® (una en la mañana y la otra en la tarde) y dos inyecciones de 150 µg de prostaglandinas cada una (mismo régimen de administración) . En la mañana del día 16, el CIDR se removió. La cantidad total del PLUSET® administrado a través de la fase de superovulación fue de 350 Ul.

Inseminación Esta fase comprende tres administraciones sucesivas (la primera y la segunda, en la mañana y en la tarde del día 17, respectivamente, y la última en ña mañana del día 18) de semen de un toro Jersey donador, el cual se había obtenido previamente y mantenido congelado para preservar la viabilidad de los espermatozoides.

Recolección de Embriones y su implantación en Vacas sustitutas La recolección de embriones por inundación de ambas trompas del útero de la vaca con 1 litro de DMPBS (Nutricell®) tomó lugar en la mañana del día 26, inmediatamente después, dos embriones se transfirieron, no quirúrgicamente, por la vaca receptora y los embarazos se determinaron en 30-35 días por ultrasonografía. Las vacas implantadas se dejaron llevar normalmente el embarazo hasta el parto natural. Finalmente, un acercamiento quirúrgico (Cesárea) se usó para la entrega. Los recién nacidos se alimentaron con calostro rico en Ig, durante las primeras 48 horas y luego se usaron alimentos sintéticos, y naturales (todos ellos exentos de compuestos de origen animal) . Puesto que la generación de la descendencia biológica obedece la ley de Mendel, la mitad de los animales que nacieron como una consecuencia del procedimiento ante descrito, deben ser transgénicos y, de ellos, la mitad debe ser machos y la otra mitad hembras. Por lo tanto, existe una alta posibilidad de obtener un macho transgénico (animal fundador) , cuyo semen pudo ser útil para establecer un Banco Maestro de semen transgénico de animales Jersey, que se usará para la inseminación de vacas transgénicas / no transgénicas superovuladas, con el fin de expandir el rebaño .

EJEMPLO 7 Purificación de la hGH recombinante de la leche Una vez verificado el peso molecular aproximado, el ensayo de la mancha Western resultó y la actividad biológica de la hGH recombinante, producida en la leche de ternera, se corrigieron, se realizó un proceso exhaustivo de purificación, para ello es imperativo, cuando la fabricación de un producto biofarmacéutico, que es la proteína de interés resultó ser purificada hasta la homogeneidad, con el fin de evitar la presencia de posibles contaminantes en dicho producto. Este proceso comprendía las etapas de obtener la espuma de la leche por medio de la centrifugación y dilución del sobrenadante obtenido, para lograr una mejor solubilidad de la hGH recombinante, finalmente retenida en las micelas de la caseína (clarificación) y el pasaje de esta solución a través de una columna de cromatografía de intercambio aniónico de lecho expandido (una alternativa a esta etapa es el empleo de una columna de inmunoafinidad, véase el Ejemplo 8 siguiente) : la solución resultante se somete a una etapa de cromatografía HPLC (C4) de fase inversa; fracciones ricas en la hGH recombinante se sometieron después a una cromatografía de intercambio aniónico. El material purificado se desaló, concentró y sometió a la cromatografía de exclusión molecular. Esta separa por peso molecular, con el fin de obtener la hGH recombinante pura.

El procedimiento para la purificación de la hormona de crecimiento humana (hGH) de la leche, comprende las siguientes etapas en orden: () clarificación, (b) cromatografía de intercambio aniónico de lecho expandido; (c) cromatografía de fase inversa; (d) cromatografía de intercambio aniónico; (e) cromatografía de exclusión molecular (desalación) , (f) concentración y (g) cromatografía de exclusión molecular.

Clarificación La leche fresca se mezcló con una cantidad suficiente de Tween 80, con el fin de obtener una solución al 0.5%. Después de la adición del Tween, 80, se agregó 2M de Tris-HCl para obtener un pH de 7.3 + 0.1. En seguida, el producto se homogeneizó durante 30 minutos y luego se centrífugo a 14000 g, con el fin de separar la capa de grasa. Más tarde, la solución resultante se diluyó con 0.5% de Tween 80 hasta una conductividad de menos de, o igual a, 1500 µS/cm. El pH se ajustó en 7.3 + 0.1, con 2M Tris-HCl, y luego este producto se filtró a través de una membrana de poros de 0.8 µ y se almacenó convenientemente.

Cromatografía de Intercambio de Aniones de Lecho Expandido El material que resulta de la etapa previa, se sometió a cromatografía, usando una matriz de intercambio aniónico, de acuerdo con los siguientes parámetros: 1. Equipo : A. Columna: 1) Diámetro: 5 cm 2) Altura del lecho: 30 cm (lecho compacto) 3) Matriz a. Perfil aerodinámico Q XL (Amersham) b. Volumen: 600 ml- 2. Soluciones y Reguladores : A. NaOH 0.5 N B. 20% de etanol C. Regulador A: 10 mM de TrisHCl, pH de 7.3 D. Regulador B, 500 mM Tris-HCl, pH de 7.3 E. Regulador C: 20 mM TrisHCl, NaCl 150 mM, pH 7.3 F Regulador D: 20 mM TrisHCl, NaCl 500 mM, pH 7.3 3. Material que se va a someter a cromatografía: A. Leche clarificada B . Condiciones de muestra : 1) Volumen: 25 + 5.1 2) Conductividad < 1500 µS/cm 3) pH: 7.3 ± 0.1 Para equilibrar la columna, 1.5 volúmenes de la columna ("vc" (900 ml) de agua purificada se pasaron a través de ella, a un flujo de 115 + 5 cm/hora (flujo descendente) . En seguida, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detalladas, se pasaron en secuencia a través de ella, con un flujo de 230 + 30 cm/hora (flujo ascendente). 3.0 vc (1,800 ml) de NaOH 0.5N, 3.0 vc (1,800 ml) de agua purificada, 1.0 vc (600 ml) del Regulador B y, finalmente, 3.0 vc (1,800 ml) del Regulador A. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se cargó. Dicha carga se realizó a 12 ± 3°C y a un flujo de 230 + 30 cm/hora. En seguida, la levigación se realizó a un flujo de 115 + 15 cm/hora, y a la misma temperatura. Primeramente, una cantidad suficiente del Regulador A se pasó a través de la columna (flujo ascendente) y luego las soluciones y reguladores, aguí detallados, se pasaron en el siguiente orden (flujo descendente) : 1.5 vc (900 ml) del Regulador A; 2.0 vc (1,200 ml del Regulador C; y finalmente, 2.0 vc (1,200 m) del Regulador D. Una vez que ha finalizado la etapa, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detallada, se pasaron en secuencia a través de la columna, con el fin de limpiarla: 1.5 vc (900 ml) de agua purificada; 1.5 vc (900 ml) de NaOH 0.5 N, 1.0 vc (1,200 ml) de agua purificada; 1.0 cc (600 ml) del Regulador B, 1.5 vc (900 ml) de agua purificada, y finalmente, 1.5 vc (900 ml) de etanol al 20%. Las fracciones seleccionadas que contienen la hGH, se ensayaron para las proteínas totales (por el método Branford) y para la proteína de interés (por RÍA) y se almacenaron a 2-8 !C.

Cromatografía de Fase Inversa El material que resulta de la etapa previa, se sometió a cromatografía, de acuerdo con los siguientes parámetros : 1. Equipo : . Columna : 1) Diámetro: 45 cm 2) Altura del lecho: 47 cm 3) Matriz a. BakerBond Wide-Pore Butyl (C4) 15 nm prep. LC Packing (Baker) b. Volumen: 600 ml- 2. Soluciones y Reguladores : A. NaOH 0.5 N Fase Móvil 1 (MP1) 30 mM, NaHC03, pH 7.2: Agua Purificada : acetonitrilo (35:55:10) B. Fase Móvil 2 (MP2) : 30 mM NaHC02, pH 7.2: Agua Purificada: Acetonitrilo (20:10:70 C. Metanol al 50% 3. Material que se va a someter a cromatografía: A) Conjunto de fracciones seleccionadas que resultan de la etapa previa. B) Condiciones de la Muestra: 1) Volumen: 30 2) pH_ 7.3 ± 0.3 Para equilibrar la columna, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detalladas, se pasaron a través de ella, a un flujo de menos de, o igual a, 478 cm/hora; 0.3 vc (180 ml) de metanol al 50%, en seguida, un gradiente del 50% de mtanol-MP2 se aplicó partiendo de una relación de 100._0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones, hasta alcanzar un volumen total de 1.0 vc , una vez que el gradiente fue finalizado, 1.0 vc (600 ml) de MP2 se pasó a través de la columna; en seguida, un gradiente de MP2-MP1 se aplicó, partiendo de una relación de 100:0 de dicha solución, hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones, hasta que un volumen total de 1.0 vc fue alcanzado, y finalmente, 2.0 vc (1,200 ml) de MP1 se pasaron a través de la columna. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se filtró a través de una membrana de poros de 0.45 µm y se cargó inmediatamente después. Dicha carga se realizó a 20 + 5°C y a un flujo de menos que o igual a 238 cm/hora En seguida, la levigación se realizó a un flujo de 478 + 78 cm/hora, y a la misma temperatura y las soluciones y reguladores, después detallados, se pasaron en el siguiente orden: 10 vc (600 ml) de MP1; un gradiente de MPA-MP2, partiendo de una relación de 65:35 de dichas soluciones hasta una relación de 45:55 de dichas soluciones en un volumen total de | 8.0 vc (9,000 ml) alcanzado; 1.0 vc (600 ml) de MP1-MP-2 en una relación de 45:55 y, finalmente, 2.0 vc (1,200 ml) de MP2. Una vez que ha finalizado la etapa, con el fin de limpiar la columna, un gradiente de MP2-50% de Metanol, se aplicó, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta 0:100 de dichas soluciones, hasta alcanzar un volumen total de tolueno de 1.0 vc (600 ml) y, finalmente, 1.0 vc (1,200 ml) de metanol al 50% se pasaron a través de la columna. Las fracciones resultantes de la cromatografía se ensayaron por SDS-PAGE homogénea 20% y para la hGH oxidada y, dependiendo de los resultados, se realizó una selección.

En seguida, las fracciones seleccionadas que contienen la hGH y, dependiendo de los resultados, se hizo una selección. En seguida, las fracciones que contienen la hGH seleccionada se ensayaron para las proteínas totales (por el método Bradford) y se almacenaron a 2-8°C.

Cromatografía de Intercambio de Aniones El material que resulta de la etapa previa, se sometió a cromatografía usando una matriz de intercambio aniónica, como sigue: 1. Equipo: A. Columna : 1) Diámetro: 5 cm 2) Altura del lecho: 25 cm 3) Matriz a. Fuente: 30Q (Pharmacia) b. Volumen: 500 ml- 2. Soluciones y Reguladores: A. 30% de etanol B. Solución K:0.5 N NaOH, 3M NaCl C. Solución L: 50 mM tris, pH de 7.50 D. Solución M: 0. ÍN HCl, 3M NaCl E.Fase Móvil 3 (MP 3) : Solución L: acetonitrilo (90:30) F Fase Móvil 4 (MP4) 40 mM Tris, 0.1 M NaCl, pH 7.50 : Acetonitrilo (70:30) 3. Material que se va a someter a cromatografía: A. Fracciones seleccionadas que resultan de la etapa previa B. Condiciones de muestra: a. Volumen: 4.5 + 1 litro b.pH : 7.2 + 0.2.

Para equilibrar hacer sanitaria la columna, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades descritas después, se pasaron en secuencia a través de ella, a un flujo menor de, o igual a, 183 + 20 cm/hora, 1.0 vc (500 ml) de agua purificada, 1.0 vc (500 ml) de la Solución K, 1.0 vc (500 ml) de la Solución L y, finalmente, 1.0 vc (500 ml) de MP3. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se cargó. Dicha carga se realizó a 20 + 5°C y a un flujo menor que, o igual a, 183 cm/hora. En seguida, la levigación se realizó a un flujo de 183 ± 20 cm/hora, y a la misma temperatura, y las soluciones y reguladores, después detallados, se pasaron en el siguiente orden: 1.0 vc (500 ml) de MP3 , un gradiente de MP3-MP4, partiendo de una relación de 15.85 de dichas soluciones hasta una relación de 25:75 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 5.0 vc (2500 ml) , y, finalmente, 2.0 vc (1000 ml) de MP4 se pasaron a través de la columna . Una vez que ha finalizado la etapa, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detallada, se pasaron en secuencia a través de la columna, con el fin de limpiarla: un gradiente de MP4-agua purificada, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 ml) , ; 0.5 vc (250 ml) de agua purificada; un gradiente de agua purificada- Solución K, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 ml) ; 1.0 vc (500 ml) de la solución K, un gradiente de la Solución K - agua purificada, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 mi) ,0.5 vc (250 ml) de agua purificada, un gradiente de agua purificada - Solución M, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de ,1.0 vc (500 ml) : 1.0 vc (500 ml) de la Solución M un gradiente de la Solución M - agua purificada, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 ml) ; 1.0 cv (500 ml) de agua purificada; un gradiente de agua purificada - Solución L, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 ml) ; 0.5 vc (250 ml) de la Solución L, un gradiente de la Solución L -agua purificada, partiendo de una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta una relación de 0:100 de dichas soluciones hasta alcanzar un volumen total de 0.5 vc (250 ml) ; y finalmente, 1.5 vc (2250 ml) de agua purificada. Las fracciones seleccionadas que contienen la hGH, se ensayaron para las proteínas totales (por el método Branford) y se almacenaron a 2-8°C.

Cromatografía de Exclusión Molecular El material que resultó de la etapa previa, se sometió a cromatografía usando una matriz de exclusión molecular, como sigue: 1. Equipo: . Columna : 1) Diámetro: 5 cm 2) Altura del lecho: 25 cm 3) Matriz a. Cellufine GH25 (Millipore) b. Volumen: 500 ml- 2. Soluciones y Reguladores : A. NaOH 0.5 N B. 20% de etanol C. Regulador C: 150 mM de NaH2P04, pH de 7.2 D. Regulador G, 320 mM de Glicina, 10 mM de NaH2P04, 0.1% de Tween 80, pH de 6.9 3. Material que se va a someter a cromatografía: A. Fracciones seleccionadas que resultan de la etapa previa. B . Condiciones de la muestra : 1) Volumen: 0.5 + 0.2 litros 2) pH : 7.5 + 0.5 Para equilibrar y hacer sanitaria la columna, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después descritas, se pasaron en secuencia a través de ella, a un flujo de menos que, o igual a, 180 cm/hora. 1.0 vc (500 ml) de agua purificada, 1.0 vc (500 ml) de NaOH 0.5N, 0.5 vc (250 ml) de agua purificada, 0.5 vc (250 ml) del Regulador C y, finalmente, 2.0 vc (100 ml) del Regulador C. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se cargó. Dicha carga se realizó a 20 + 5°C y a un flujo de 183 + 20 cm/hora. En seguida, la levigación se realizó al mismo régimen de flujo y temperatura, y 1.0 vc (500 ml) del Regulador G se pasaron a través de la columna, tantas veces como el número de operaciones que fueron necesarias realizar. Una vez que ha finalizado la etapa, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detallada, se pasaron en secuencia a través de la columna, con el fin de limpiarla: 0.5 vc (250 ml) de agua purificada; 1.0 vc (500 ml) de NaOH 0.5 N, 0.5 vc (250 ml) de agua purificada; 0.5 vc (250 ml) del Regulador C; 0.5 vc (250 ml) de agua purificada y, finalmente, 1.5 vc (750 ml) de etanol al 20%. Las fracciones que contienen la hGH seleccionada se ensayaron en las proteínas totales y se almacenaron a 2-8°C.

Concentración Las fracciones que resultan del ejemplo previo se concentraron de acuerdo con las condiciones descritas abajo: 1. Equipo A. Bomba peristáltica:Wstson Marlow - Cat. No. 302S B. Tubería: Watson Marlow - Cay. No. 902.0080.016 C. Concentrador: Prep Scale Millipore - Cat. No. CDU F006LC 2 Soluciones y Reguladores : A. Dodecil-sulfato de sodio al 0.28% (SDS) B. Tritón al 0.06% C. NaOH 0.125N D. Regulador G: 320 mM de Glicina, 10 mM de NaH2P04, 0.1% de Tween 80, pH de 6.9 3. Material que se va a procesar: A. Fracciones seleccionadas que resultan del ejemplo previo. B. Condiciones de Muestra: 1) Volumen: 1.0 ± 0.5 litro 2) Conductividad: 1200 ± 100 µS/cm 3) pH:6.9 ± 0.1. Primero se limpió el equipo, se hizo sanitario y se equilibró, y la siguiente secuencia de soluciones y reguladores fluyó a través del equipo: 2 litros de NaOH 0.125N, 10 litros de agua purificada y, finalmente 2 litros del Regulador G. El equipo luego estaba listo para ser usado para la concentración de fracciones seleccionadas, siguiendo la metodología usual . El procedimiento de concentración se realizó hasta alcanzar una concentración de proteínas de 15 mg/ml (evaluado por el método Bradford) .

Las fracciones seleccionas se filtraron a través de una membrana de poros de 0.22 µm, ensayada para las proteínas totales (por el método Bradford) y se almacenó a 4°C. La conductividad y el pH de las fracciones seleccionadas fue de 1,100-1,300 µS/cm, y 6.9 + 0.1, respectivamente .

Cromatografía de Exclusión Molecular El material que resulta de la etapa previa se sometió a cromatografía usando una matriz de exclusión molecular, como sigue: 1. Equipo : A. Columna: 1) Diámetro: 1 cm 2) Altura del lecho: 92 cm 3) Matriz a. Seohacryl S-200 High Resolution (Amersham Pharmacia) b . Volumen: 1,800 ml 2. Soluciones y Reguladores : A. NaOH 0.5 N B. 20% de etanol C. Regulador H: 320 mM de Glicina, 2.2 M de NaH2P04, 1.8 mM de Na2HP04, pH de 7.30 3. Material que se va a someter a cromatografía: A. Fracciones seleccionadas que resultan de la etapa previa, concentradas N. Condiciones de la muestra: | )Volumen: 40 ± 20 ml 2) Conductividad: 1,200 ± 100 µS/cm 3)pH : 7.3 + 0.1 Para equilibrar y hacer sanitaria la columna, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después descritas, se pasaron en secuencia a través de ella, a un flujo de menor que 46 cm/hora. 1.0 vc (1,800 ml) de agua purificada, 1.0 vc (1,800 ml) de NaOH 0.5N, y finalmente, 2.0 cv (3,600 ml) del Regulador H. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se cargó. Dicha carga se realizó a 20 + 5°C y a un flujo de 46 + 15 cm/hora. En seguida, la levigación se realizó al mismo régimen de flujo y temperatura, y 1.0 vc (1,800 ml) del Regulador H se pasaron a través de la columna, tantas veces como el número de operaciones que fueron necesarias realizar. Una vez que ha finalizado la etapa, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detallada, se pasaron en secuencia a través de la columna, con el fin de limpiarla: 1.0 (1,800 ml) de agua purificada; y 1.5 vc (2,700 ml) de etanol al 20%. Las fracciones que contienen la hGH seleccionada se filtraron asépticamente a través de una membrana de poros de 0.22 µm en botellas de plástico estériles, despirogenadas, ensayadas para las proteínas totales, y se almacenaron a -20°C. EJEMPLO 8 Procedimiento alternativo para la purificación de la hGH de la leche. En lugar del método de purificación, previamente descrito, se puede emplear un esquema alternativo, con el fin de purificar la hGH recombinante, contenida en la leche. La diferencia principal entre el procedimiento descrito en el Ejemplo 7 y el alternativo presentado en este ejemplo, es que la segunda etapa del anterior implica la cromatografía de intercambio de aniones, de lecho expandido, en tanto la etapa correspondiente del último lleva a la cromatografía de inmunoafinidad. Las etapas de clarificación de ambos procedimientos son también levemente diferentes. Puesto que el resto de ambos esquemas de purificación son idénticos, sólo la primera de dos etapas del procedimiento alternativo será descrita abajo. Clarificación Leche fresca se mezcló con una cantidad suficiente de Tween 80, con el fin de obtener una solución al 0.5%. Después de la adición del Tween 80, se agregó ÍM de Tris para obtener un pH de 7.3 + 0.3. En seguida, el producto de homogenizó durante 30 minutos, y juego se centrífugo a 140000 G, con el fin de separar la capa de grasa. Después, la solución resultante se diluyó 20 veces con el Regulador S (50 mM de Tris. HCl, 500 mM de NaCl, ,0.5% de Tween 80, pH de 7.3) y luego se filtró a través de una membrana de poros de 0.45 µm y se almacenó convenientemente. Cromatografía de Inmunoafinidad El material, que resulta de la etapa previa, se sometió a cromatografía, usando una matriz de interacción de inmunoafinidad (Afigl 10 Ester Agarose, fabricado por BioRad, con Anticuerpos Monoclonales anti-GH, unidos covalentemente, fabricados por Bio Sidus) , de acuerdo con los siguientes parámetros . 1. Equipo : A . Columna : 1) Diámetro: 30 cm 2) ltura del lecho: 15 cm 3) Matriz a. Affiged 10 Este Agarose (BioRad) , con anticuerpos monoclonales anti- GH, unidos covalentemente (Bio Sidus) b. Volumen: 10 litros 2. Soluciones y Reguladores: A. Regulador A: 50 mM de Tris.HCl, 500 mM de NaCl, pH de 7.2 B. Regulador B: 100 mM de ácido cítrico, pH de 3.0 C. Regulador C; 150 mM de NaH2P04, pH de 7.2 D. Regulador D: 50 mM de Tris.HCl, 500 mM de NaCl, pH de 7.2, 0.2% de Azida de Sodio, 0.1 g/1 de Gentamicina. E. Regulado E: 50 mM de Tris.HCl, 500 mM de NaCl, pH de 7.2, 0.2% de Azida de Sodio, 0.1 g de gentamicina. 3. Material que se va a someter a cromatografía: A. Leche clarificada B. Condiciones de la muestra. | ) Volumen: 30 - 50 litros 2) Conductividad: 45 ± 15 mS/cm 3) pH: 7.3 + 0.33 Para equilibrar y hacer sanitaria la columna, si no se ha usado en los últimos siete días, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después descritas, se pasaron en secuencia a través de ella, a un flujo menor de 51 cm/hora. 1.0 vc (10 litros) del Regulador A, 2.0 vx (20 litros) del Regulador D, 2.0 vc (20 litros del Regulador A, 1.0 cv (10 litros) del Regulador B, 2.0 vc (20 litros) del regulador C y, finalmente, 1.0 vc (10 litros) del Regulador A. Por otra parte, si la columna se ha usado en los últimos siete días, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades detalladas después, se pasaron en secuencia a través de ella, a un flujo menor de 51 cm/hora, : 1.0 vc (10 litros) del Regulador C y, finalmente, 2.0 vc (20 litros) del Regulador A. Una vez que la columna se equilibró, el material que se va a someter a cromatografía se cargó. Dicha carga se realizó a 5 ± 3°C y a un régimen de flujo menor de 51 cm/hora. En seguida, la levigación se realizó a 42 ± 9 cm/hora y a la misma temperatura, y las soluciones y reguladores, detallados después, se pasaron en el siguiente orden: 2.0 (20 litros) del Regulador A, y 1.5 vc (15 litros) del Regulador B. Una vez que ha finalizado la etapa, las siguientes soluciones o reguladores, en las cantidades después detallada, se pasaron en secuencia a través de la columna, con el fin de limpiarla: 2.0 vc (20 litros) del Regulador D; 2.0 (20 litros) del Regulador A, y finalmente, 2.0 vc (20 litros) del Regulador E.

Las fracciones que contienen la hGH seleccionada se ensayaron para las proteínas totales (por el método de Btadford) y para la proteína de interés (por RÍA) y se almacenaron a 4°C. EJEMPLO 5 Control de Calidad de la hGH recombinante pura Dos lotes de la hGH recombinante se sometieron a una serie de ensayos para verificar que el producto es indistinguible de la hGH natural . Tales procedimientos incluyeron, pero no se limitaron a, SDS/PAGE, mancha Western, actividad biológica in vitro (células nb2) e in vivo (ratas hipofisectomizadas) , determinación de mapa de péptidos de la secuencia de aminoácidos completa, enfoque isoeléctrico (IEF) y análisis de HPLC de fase inversa y de exclusión de tamaño. Los resultados obtenidos en todos esos ensayos fueron exactamente los mismos para la hGH tanto recombinante como natural, lo cual probo que la hGH recombinante pura corresponde exactamente a la hGH natural, siendo así adecuada para la fabricación de un producto biofarmacéutico. Habiendo ahora descrito completamente la invención, se entenderá, por loa expertos ordinarios en la técnica, que la misma puede ser llevada a cabo dentro de un amplio intervalo de equivalentes de condiciones, formulaciones y otros parámetros, in afectar el ámbito de la invención o cualquiera de sus modalidades . Todas las patentes y publicaciones citadas aquí, se incorporan completamente como referencia en su totalidad.

Claims (48)

1. REIVINDICACIONES . Un método para producir una proteína, este método comprende : a) obtener un mamífero transgénico, no humano, el cual produce una proteína de interés en su leche; b) obtener dicha leche de dicho mamífero transgénico no humano; y c) purificar dicha proteína de interés de dicha leche. . El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho mamífero transgénico no humano, se obtiene por un proceso que comprende: a) obtener un gene, el cual codifica una proteína de interés; b) clonar dicho gene en una plasmida, por lo cual el gene se enlaza operablemente a n promotor, , que dirigirá la expresión de dicho gene en células mamarias que resultan en una plasmida de expresión; c) transfectar células somáticas con dicha plasmida de expresión, de modo que esta plasmida se incorpore en el genoma de las células somáticas, lo cual resulta en células somáticas transgénicas; d) enuclear un oocito maduro, lo que resulta en un oocito enucleado; e) fundir una de dichas células somáticas transgénicas con dicho oocito enucleado, lo que resulta en un embrión monocelular; f) implantar este embrión en el útero de un mamífero receptor; y g) vigilar el embarazo hasta el nacimiento de un animal transgénico . 3. El método de la reivindicación 2, en que dicha plasmida es un promotor de la beta-caseína y donde dicha proteína de interés es la hormona del crecimiento humana. 4. El método de la reivindicación 3 , en que la plasmida de expresión es la pRßhGH. 5. El método de la reivindicación 4, en que la plasmida de expresión además comprende un gene de resistencia a la neomicina. 6. El método de la reivindicación 5, en que la plasmida de expresión es la pRNeo. 7. El método de la reivindicación 2, en que dicho mamífero es un bovino, que produce la hormona del crecimiento humana recombinante en su leche, cuyo genoma comprende una plasmida integrada, donde dicha plasmida comprende el gene de la hormona del crecimiento humana y un promotor de la beta- caseína, que dirige la expresión de dicho gene en las células mamarias de dicho mamífero. 8. El método de la reivindicación 7, en que dicha plasmida es la pRßhGH. 9. El método de la reivindicación 8, en que dicha plasmida además comprende un gene de resistencia a la neomicina. 10. El método de la reivindicación 9, en que dicha plasmida es la pRNeo. 11. El método de la reivindicación 2, en que dichas células somáticas son fibroblastos . 12. El método de la reivindicación 2, en que dichas células somáticas se obtienen por aislamiento desde un mamífero transgénico hembra, para la producción de dicha proteína de interés en su leche. 13. El método de la reivindicación 12, en que las células somáticas transgénicas son fibroblastos . 14. El método de la reivindicación 1, en que dicho mamífero transgénico no humano se obtiene por un proceso que comprende: a) sobreovular un mamífero no humano, hembra, el cual es transgénico, para la producción de dicha proteína de interés en su leche; b) inseminar artificialmente dicho mamífero con semen obtenido de un mamífero no transgénico, no humano, macho, para producir embriones. c) recoger dichos embriones; d) implantar dichos embriones en el útero de un mamífero receptor; y e) vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico . 15. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho mamífero transgénico, no humano, se obtiene por un proceso que comprende: a) sobreovular un mamífero, no humano, hembra; el cual es transgénico, para la producción de dicha proteína de interés en su leche; b) inseminar artificialmente dicho mamífero con semen obtenido de un mamífero no humano, macho, el cual es transgénico, para producir dicha proteína de interés, para producir embriones. c) recoger dichos embriones; d) implantar dichos embriones en el útero de un mamífero receptor; y e) vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico . 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en que dicho mamífero transgénico no humano se obtiene por un proceso que comprende: a) sobreovular un mamífero no transgénico, no humano, hembra; b) inseminar artificialmente dicho mamífero con semen obtenido de un mamífero no humano, macho, el cual es transgénico, para producir embriones. c) recoger dichos embriones; d) implantar dichos embriones en el útero de un mamífero receptor; y e) vigilar el embarazo hasta el nacimiento del mamífero transgénico . 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 12, 14, 15 ó 16, en que dicho mamífero es de la especie de bovinos, especie de porcinos, especie de ovinos, especie de caprinos o especies de roedores. 18. El método de la reivindicación 17, en que el mamífero es de la especie de bovinos . 19. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 12, 14, 15 ó 16, en que dicha proteína de interés es una hormona del crecimiento de mamíferos . 20. El método de la reivindicación 19, en que dicha hormona del crecimiento de mamíferos es la hormona de crecimiento humana, hormona de crecimiento de bovinos, hormona de crecimiento de porciones, hormona del crecimiento de ovinos, hormona del crecimiento de caprinos o la hormona de crecimiento de roedores. 21. El método de la reivindicación 20, en que dicha hormona de crecimiento de mamíferos es la hormona de crecimiento humana. 22. El método de la reivindicación 21, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 1.0 g de hGH / litro de leche. 23. El método de la reivindicación 22, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 2.0 g de la hGH / litro de leche. 24. El método de la reivindicación 23, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 3.0 g de la hGH / litro de leche. 25. El método de la reivindicación 24, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 4.0 g de hGH / litro de leche . 26. El método de la reivindicación 25, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 5.0 g de hGH / litro de leche. 27. El método de la reivindicación 26, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 6.0 g de hGH / litro de leche. 28. El método de la reivindicación 19, en que la producción de dicha hormona del crecimiento de mamíferos por este mamífero, estimula al mamífero a producir más leche que comprende dicha hormona del crecimiento de mamíferos . 29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2, 12, 14, 15 ó 16, en que el gene que codifica dicha proteína de interés (enlazada a un promotor, que dirige la expresión de dicho gene en las células mamarias) se forma en las células somáticas y las células de germen de dicho mamífero . . Un método para purificar una hormona del crecimiento recombinante de la leche de un mamífero transgénico no humano, el cual produce una hormona de crecimiento recombinante, este método comprende: a) clarificar la leche de un mamífero transgénico no humano, que resulta en una leche clarificada; y b) someter dicha leche clarificada a cromatografía, que resulta en una hormona del crecimiento recombinante purificada. . El método de la reivindicación 30, en que dicha cromatografía es la cromatografía de intercambio de iones, cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión molecular o cromatografía de afinidad. . El método de la reivindicación 31, en que se realizan múltiples etapas de cromatografía. . El método de la reivindicación 31, en que dicha cromatografía de intercambio de iones es la cromatografía de intercambio de aniones . . El método de la reivindicación 31, en que la cromatografía de afinidad es la inmunocromatografía . . El método de la reivindicación 31, que además comprende una etapa de concentración . . Un método para purificar una hormona del crecimiento recombinante de la leche de un mamífero transgénico no humano, , que produce la hormona del crecimiento recombinante, este método comprende: a) clarificar la leche de un mamífero transgénico no humano, lo que resulta en una leche clarificada; b) someter dicha leche clarificada a la cromatografía de intercambio de aniones, de lecho expandido, lo que resulta en un material cromatografiado de intercambio de aniones . c) someter dicho material cromatografiado de intercambio de aniones a la cromatografía de fase inversa, lo que resulta en un material cromatografiado de fase inversa; d) someter dicho material cromatografiado de fase inversa a la cromatografía de intercambio de aniones, en un material cromatografiado de intercambio de aniones . e) someter dicho material cromatografiado de intercambio de aniones a la cromatografía de exclusión molecular, lo que resulta en un material cromatografiado de exclusión molecular; f) concentrar dicho material cromatografiado de exclusión molecular, lo cual resulta en un material cromatografiado de exclusión molecular; y g) someter dicho material concentrado a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en una hormona del crecimiento recombinante pura. . Un método para purificar una hormona del crecimiento recombinante de la leche de un mamífero transgénico no humano, que produce la hormona del crecimiento recombinante, este método comprende : a) clarificar la leche obtenida de un mamífero transgénico, lo que resulta en una leche clarificada; b) someter dicha leche clarificada a la cromatografía de inmunoafinidad, lo cual resulta en un material cromatografiado de inmunoafinidad; c) someter dicho material cromatografiado de inmunoafinidad a la cromatografía de fase inversa, lo que resulta en un material cromatografiado de se inversa; d) someter dicho material cromatografiado de fase inversa a una cromatografía de intercambio aniónico, lo que resulta en un material cromatografiado de intercambio aniónico ; e) someter dicho material cromatografiado de intercambio aniónico a la cromatografía de exclusión molecular, lo cual resulta en un material cromatografiado de exclusión molecular; f) someter dicho material cromatografiado de exclusión molecular a concentración, lo cual resulta en un material concentrado; y g) someter dicho material concentrado a la cromatografía de exclusión molecular, lo que resulta en una hormona del crecimiento recombinante pura. 38. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 39, en que dicha hormona del crecimiento es una hormona del crecimiento de un mamífero. 39. El método de la reivindicación 38, en que dicha hormona del crecimiento de un mamífero es la hormona del crecimiento humana, la hormona del crecimiento de bovinos, la hormona del crecimiento de porcinos, la hormona de crecimiento de ovinos, la hormona de crecimiento de caprinos o la hormona del crecimiento de roedores . 40. El método de la reivindicación 39, en que dicha hormona de crecimiento de un mamífero es la hormona de crecimiento humana. 41. El método de la reivindicación 40, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 1.0 g de la hGH / litro de leche. 42. El método de la reivindicación 41, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 2.0 g de la hGH / litro de leche. 43. El método de la reivindicación 42, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 3.0 g de la hGH / litro de leche. 44. El método de la reivindicación 43, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 4.0 g de la hGH / litro de leche. 45. El método de la reivindicación 44, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 5.0 g de la hGH / litro de leche. 46. El método de la reivindicación 45, en que dicho mamífero produce la hormona del crecimiento humana en un nivel mayor de aproximadamente 6.0 g de la hGH / litro de 5 leche. 47. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 ó 39, en que dicho mamífero transgénico humano es de la especie de bovinos . 48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 36 10 ó 39, en que dicho mamífero transgénico humano es un cerdo, una oveja, una cabra o un roedor. Resumen La invención se relaciona con un método para producir una proteína de interés , que comprende hacer un mamífero transgénico no humano que produzca tal proteína en su leche, obteniendo la leche del mamífero transgénico no humano y purificando la proteína de interés de la leche. Se generaron bovinos transgénicos, los cuales fueron capaces de producir hormona humana del crecimiento en glándulas mamarias. El método implica la clonación de una construcción genética que codifica el gene hGH y un promotor de beta-caseína convenientemente en un vector de expresión. También incluye procedimientos de transfección en células somáticas de bovinos fetales, generalmente fibroblastos y la transferencia nuclear en oocitos sin núcleo de bovinos, generando así embriones transgénicos . El método también incluye procedimientos para generar embriones transgénicos para la expansión posterior de la manada transgénica, hilan como la subclonación de bovinos femeninos transgénicos, la sobreovulación de vacas transgénicas y su inseminación con semen proveniente de bovinos masculinos no transgénicos o transgénicos, y la sobreovulación de vacas no transgénicas y su inseminación con semen procedente de bovinos masculinos transgénicos . Posteriormente, los embriones transgénicos dan lugar a ganado transgénico que produce en su leche, hormona humana del crecimiento en grandes cantidades, a partir de la leche, la hormona se purifica y se analiza totalmente para satisfacer todos los requisitos para la fabricación de un producto biofarmacéutico puro.