CN1970750B - 一种利用抗菌肽培育具有抗乳房炎病奶牛重构胚的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种抗乳房炎的奶牛育种方法，用抗菌肽培育具有抗乳房炎病的奶牛，首先是将抗菌肽基因，构建在乳腺组织特异性表达载体中，提取外源基因进行供体细胞的转染，所有成纤维细胞均可用于核移植的供体细胞，通过筛选将获得的阳性细胞与体外培养成熟的去核卵母细胞利用电融合法构建重构胚，将经过激活的重构胚进行体内培养，然后再将发育正常的重构胚用外科手术的方法移入同步情期的寄母牛子宫内，最后获得转基因克隆奶牛。
Description
技术领域
本发明公开一种利用抗菌肽培育抗乳房炎病奶牛重构胚的方法，用抗菌肽培育具有抗乳房炎病奶牛的重构胚，属于动物育种方法技术领域。
背景技术：
乳房炎是奶牛的多发病，泌乳奶牛乳房炎发病率在20％以上，是影响奶牛养殖业的重要病患之一。乳房炎的发病原因包括病原菌的入侵感染或机械性因素等，但在一般情况下，临床型乳房炎和无症状的隐性乳房炎90％以上都是由葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌等细菌性感染引起的。目前乳房炎的预防和治疗国内外多采用抗生素类药物、抗生素合剂、化学药物以及激素类抗炎药物，有的采用中药制剂。这些药物在过去对于乳房炎的预防和治疗都发挥了重要的作用，但是大部分抗生素类药物可残留于奶制品中。奶制品国家标准中明确规定奶中不能残留抗生素药物。中药制剂是具有良好应用前景的一类制剂，除了部分可能残留异味以外，大部分都有较好的抗菌消炎效果，但是很多中药制剂都是复方成分，制作和使用都比较复杂，其有效成分也有待阐明。随着奶牛业的日益规模化发展，目前相当一部分药物已经不能适应奶业发展的要求。
因此，研究一种对奶牛乳房炎具有抗病能力的奶牛新品种是本发明要解决的问题。
发明内容：
本发明公开一种利用抗菌肽培育具有抗乳房炎病奶牛重构胚的方法，利用该方法培养得到的奶牛具有抗乳房炎病的能力，适用于产业化培育生产。
本发明还提供了培育具有抗乳房炎病奶牛的抗菌肽。
本发明的技术解决方案如下：采用抗菌肽基因构建乳腺组织特异性表达载体，转化和筛选优良品种(产奶量高)的奶牛胎儿成纤维细胞或皮肤成纤维细胞，以转化的成纤维细胞作为核供体，以普通牛或淘汰优良品种奶牛的卵母细胞作为受体，进行核移植，再通过核移植卵母细胞(发育的)胚胎移植，获得转基因克隆奶牛。
本发明涉及的抗菌肽基因选自乳铁蛋白肽基因、牛气管抗菌肽基因、天蚕素B基因和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因中的一种或多种组合。
本发明是通过以下具体步骤实现的：首先是将所述的抗菌肽基因，构建在乳腺组织特异性表达载体中，提取外源基因进行供体细胞的转染，所有成纤维细胞均可用于核移植的供体细胞，通过筛选将获得的阳性细胞与体外培养成熟的去核卵母细胞利用电融合法构建重构胚，将经过激活的重构胚进行体内培养，然后再将发育正常的重构胚用外科手术的方法移入同步情期的寄母牛子宫内，最后获得转基因克隆奶牛。
一、抗菌肽基因的合成：
1.乳铁蛋白肽基因的合成
(1)乳铁蛋白肽基因的设计
在乳铁蛋白部分肽核苷酸序列前后分别加上乳铁蛋白信号肽序列和终止密码子，5′端加上酶切位点NotI，3′端加上酶切位点BamHI，由此组成的完整序列即为目标序列Lfcin B：
gcggccgc atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctg
tgt ctg gct ttc aaa tgc cgc cga tgg cag tgg agg atg aag aag ctg ggt gct
ccc tct atc acc tgt gtg agg agg gcc ttt taa ggatcc
(2)重叠引物的设计
根据Lfcin B的核苷酸序列设计合成了4条引物：
LfcinB-F1：5′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtccct
tggagccctt
LfcinB-R1：5′-ctgccatcggcggcatttgaaagccagacacagtccaagggct
ccaagggacag
LfcinB-F2：5′-aaatgccgccgatggcagtggaggatgaagaagctgggt
gctccc
LfcinB-R2：5′ggatccttaaaaggccctcctcacacaggtgatagaggga
gcacccagcttctt
4条引物的特点为：LfcinB-F1和LfcinB-R1的3′端互补，LfcinB-R1和LfcinB-F2的5′端互补，LfcinB-F2和LfcinB-R2的3′端互补。
(3)乳铁蛋白肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM的LfcinB-F1，LfcinB-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、PfuDNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物LfcinB-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM LfcinB-F2，LfcinB-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物LfcinB-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR)反应产物LfcinB-F1R1，LfcinB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM LfcinB-F1，LfcinB-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
(4)合成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
(5)合成的乳铁蛋白肽基因在pMD-18T中的克隆
第4步PCR反应结束后，将100μlPCR反应液全部上样，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，回收目的片段Lfcin B(149bp)，将目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段Lfcin B核苷酸序列完全一致，由此获得了含有完整乳铁蛋白部分肽基因(Lfcin B)核苷酸序列的表达载体pT-LfcinB。
2.牛气管抗菌肽基因的合成
(1)牛气管抗菌肽基因的设计
依据6enBank登陆号为AF014106的牛气管抗菌肽基因序列，选用真核细胞偏爱的密码子对其进行优化，结合真核表达载体pIRES1-neo和pMD18-T的多克隆位点，在基因两端设计酶切位点，在5′端引入EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，在3′端引入BamHI酶切位点，并根据酶切位点添加相应的保护碱基。改造后的序列为：
ggaattc gcggccgc atg agg ctc cat cac ctg ctc ctc gct ctc ctc ttc ctggtc ctg tct gct tcc tca gga ttt act caa gga gta gga aat cct gta agc tgtgtt agg aat aaa ggc atc tgt gtg cca atc agg tgt cct gga aac atg aaa cagatt ggc acc tgt gtc ggg aga gca gta aaa tgc tgt aga aag aag taa ggatcccg
5′端第一个G为保护碱基，下划线的GAATTC为EcoRI酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，3′端GGATCC为BamHI酶切位点，CG为保护碱基。
(2)重叠引物的设计
设计bTAP-F1、bTAP-R1、bTAP-F2、bTAP-R2 4条引物，由上海生物工程公司合成。
bTAP-F1：5′-aattcgcggccgcatgaggctccatcacctgctcctcctc
tcctcttcctggtcctgtctgcttcctca
bTAP-R1：5′-ctttattcctaacacagcttacaggatttcctactccttgag
taaatcctgaggaagcagacaggac
bTAP-F2：5′-gctgtgttaggaataaaggcatctgtgtgccaatcaggtgtcct
ggaaacatgaaacagat tggcacc
bTAP-R2：5′-cgggatccttacttctttctacagcattttactgctctcccg
acacaggtgccaatctgtttcat
引物bTAP-F1，bTAP-R1的3′端18个碱基互补，引物bTAP-F2，bTAP-R2的3′端18个碱基互补，引物bTAP-R1，bTAP-F2的5′端18个碱基互补。
(3)气管抗菌肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM bTAP-F1，bTAP-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物bTAP-B-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM bTAP-F2，bTAP-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物bTAP-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物bTAP-F1R1，bTAP-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μMbTAP-F1，bTAP-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10mi n进行PCR产物末端的加A反应。
(4)成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
(5)成牛气管抗菌肽基因在pMD-18T中的克隆
将上述回收的PCR产物目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段bTAP核苷酸序列完全一致，测序正确的重组表达载体命名为pT-bTAP。
3.天蚕素B基因的合成
(1)天蚕素B基因的设计
参考Genbank登陆号为D11113的天蚕素B基因序列，选用真核细胞偏爱的密码子的对其进行优化，同时结合表达载体pIRES1-neo和pMD-18T的多克隆位点，考虑克隆后能保持正确的阅读框架。在两端设计酶切位点。在5`端引入EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，在3`端引入BamHI酶切位点，根据酶切位点添加相应的保护碱基。改造后的序列为：
ggaattc gcggccgc atg aat ttc gca aag atc cta tcc ttc gtc ttc gct ctggtg ctg gct ttg agc atg acc agc gct gct ccc gag ccc agg tgg aag atc ttcaag aaa att gaa aaa atg ggc agg aac att aga gac ggc atc gtc aaa gct ggccca gct atc gag gtc ctt ggt agc gct aaa gct ata gga aaa tga ggatcc gc
5′端第一个G为保护碱基，下划线的GAATTC为EcoRI酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，GGATCC为BamHI酶切位点，3′端GC为保护碱基
(2)叠引物的设计
设计cecF1、cecR1、cecF2、cecR2 4条引物，由上海生物工程公司合成。
cecF1：5′-ggaattcgcggccgcatgaatttcgcaaagatcctatccttcgtc
ttcgctctggtgctggctttgagcatg
cecR1：5′-ttcaattttcttgaagatcttccacctgggctcgggacagcgct
ggtcatgctcaaagccagcac
cecF2：5′-atcttcaagaaaattgaaaaaatgggcaggaacattagagacgg
catcgtcaaagctggcccagct
cecR2：5′-gcggtacctcattttcctatagctttagcgctaccaaggacc
tcgatagctgggccagctttgac
引物cecF1，cecR1的3′端18个碱基互补，引物cecF2，cecR2的3′端18个碱基互补，引物cecR1，cecF2的5′端18个碱基互补。
(3)蚕素B基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μMcecF1，cecR1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物cecB-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM cecF2，cecR2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物cecB-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物cecB-F1R1，cecB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM cecF1，cecR2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
(4)成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
(5)合成天蚕素B基因在pMD-18T中的克隆
上述回收的PCR产物在如下体系内，12℃进行连接反应过夜：
Ligation solution I 5μl
回收的天蚕素B基因片段 约100ng
pMD-18T载体 1μl
加水补至总体积 10μl
取过夜连接产物5μl，转化E.coli DH5 α，涂布氨苄青霉素抗性LB-琼脂平板，挑取重组菌落4个进行测序，测序正确的重组表达载体命名为pT-cecB。
4.天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因CM的合成
(1)杂合肽基因的设计
取天蚕素A1-8位氨基酸和蛙皮素1～12位氨基酸组成杂合肽，在该杂合肽核苷酸序列前后分别加上乳铁蛋白信号肽序列和终止密码子序列，并在其5′和3′分别加上酶切位点NotI和BamHI。由此组成的完整核苷酸序列即为设计的天蚕素A-蛙皮素杂合肽(CM)基因核苷酸序列：
gcggccgc(NotI)atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt
gga ctg tgt ctg gct(singal peptide)aag tgg aag ctg ttc aag aaaatc ggt
atc ggg aag ttc ctg cat tca gct aag aag ttc taa ggatcc(BamHI)
(2)据CM的核苷酸序列设计合成4条引物：
CM-F1：5′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggagccctt
CM-R1：5′-cagcttccacttagccagacacagtccaagggctccaagggacag
CM-F2：5′-ctggctaagtggaagctgttcaagaaaatcggtatcgggaagttcctg
CM-R2：5′-ggatccttagaacttcttagctgaatgcaggaacttcccgatacc
4条引物的特点为：CMF1和CMR1的3′端互补，CMR1和CMF2的5′端互补，CMF2和CMR2的3′端互补。
(3)蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM的CM-F1，CM-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物CM-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM CM-F2，CM-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物CM-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物CM-F1R1，CM-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM CM-F1，CM-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
(4)成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
(5)成的天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因在pMD-18T中的克隆
第4步PCR反应结束后，将100μl PCR反应液全部上样，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，回收目的片段CM，将目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段CM核苷酸序列完全一致，由此获得了含有完整天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因(CM)核苷酸序列的表达载体pT-LfcinB。
二、含有抗菌肽基因质粒的构建：
(一)含有单个抗菌肽基因的质粒pIB-LfcinB-neo、pIB-CecB-neo、pIB-CM-neo和pIB-bTAP-neo(见附图1、2、3、4)
图1、2、3、4分别是本发明中含有牛乳铁蛋白肽基因、天蚕B基因、杂合肽基因和牛气管抗菌肽基因的质粒结构，其基础框架为商业化表达载体pIRES1-neo。图示中，neo为新霉素抗性基因、bcp为beta-酪蛋白启动子、LfcinB为乳铁蛋白部分肽基因(CecB为天蚕素B基因、CM为杂合肽基因、bTAP为牛气管抗菌肽基因)、IVS及IRES分别为合成内含子和内源性核糖体结合位点、polyA为牛生长激素多聚A信号。
①.各部分来源
a.bcp：山羊β-酪蛋白启动子序列，全长1132bp，由本室克隆于莎能奶山羊基因组，GenBankAY311384。
b.LfcinB：人乳铁蛋白部分肽基因，由本室设计序列，委托上海博亚生物技术公司化学合成。
c.CecB：天蚕素B抗菌肽基因，由本室设计序列，委托上海博亚生物技术公司化学合成
d.bTAP：牛气管抗菌肽基因，由本室设计序列，委托上海博亚生物技术公司化学合成。
e.CM：天蚕素A和蛙皮素杂合肽基因，由本室设计序列，委托上海博亚生物技术公司化学合成。
f.IVS、IRES、poly(A)、Amp均来自商业化表达载体pIRES1-neo。
②.含乳铁蛋白肽基因质粒pIB-LfcinB-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-LfcinB、pT-bcp分别提供乳铁蛋白肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。
③.含天蚕素B基因质粒pIB-CecB-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-CecB、pT-bcp分别提供天蚕素B抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。
④.含牛气管抗菌肽基因质粒pIB-bTAP-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-bTAP、 pT-bcp分别提供牛气管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。
⑤.含杂合肽CM基因质粒pIB-CM-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-CM、pT-bcp分别提供杂合肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。
(二)含有双抗菌肽基因的质粒pLN-bCP-LfcinB-CE-MA、pLN-bCP-cecB-bTAP、pLN-bCP-LfcinB-CecB和pLN-bCP-LfcinB-bTAP的构建
以NotI和XhoI双酶切本研究组保存的质粒pIRES-bCP-LfcinB-CM、pIRES-bCP-cecB-bTAP、pIRES-bCP-LfcinB-CecB、pIRES-bCP-LfcinB-bTAP和pLN-bCP-LK(R)，分别回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNALigase连接，构建成含牛乳铁蛋白肽和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-CM、含牛气管抗菌肽和天蚕素B基因的载体pLN-bCP-cecB-bTAP；含牛乳铁蛋白肽和天蚕素B基因的载体pLN-bCP-LfcinB-CecB；含牛乳铁蛋白肽和牛气管抗菌肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-bTAP(见附图5、6、7、8)。
三、核移植转基因动物的制备方法：
(1)抗菌肽表达载体的制备
首先提取足量的含有抗菌肽基因的质粒，然后用特定的限制性内切酶切下载体上所需的外源基因。DNA样品通过0.7％～1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，割下含有所需外源DNA条带的凝胶，用电洗脱方法回收DNA，上离子交换柱(Qiagen)脱盐浓缩。
(2)体细胞的选择与培养
哺乳动物体细胞核内含有全部基因组信息，即核的全能性，因此分化的体细胞能够经核移植使其发育程序逆转，重新发育成个体。我们选择奶牛胎儿成纤维细胞和小牛皮肤成纤维细胞为转基因的中间受体。
(3)体细胞的转染
脂质体是人工合成的阳离子去垢剂和二油酰脂酰乙醇胺的混合物。因其表面带有阳离子，可与带负电的DNA相互作用，形成阳离子脂质层，包裹DNA分子，脂质体-DNA复合物则通过静电引力作用被细胞吸附，通过细胞融合或胞吞作用使脂质体-DNA复合物进入细胞质、再进入细胞核，最终使外源DNA整合到细胞染色体上达到转基因目的。在脂质体转染时，不同的脂质体浓度，DNA浓度和转染时间都影响细胞的转染效率。浓度太高或太低，细胞克隆数均降低，这可能是脂质体与DNA的不恰当包装所至。另外，高浓度的脂质体和DNA对细胞的毒性较大，其结果影响了转染效率：转染的时间短也会降低转染效率，然而随着转染时间的延长，细胞死亡率增加，最好将转染时间控制在8～12小时。
(4)转染后供体细胞的筛选
只有很少的机会可以通过细胞的形态来鉴定核筛选被转染的细胞，通常总是利用转入一个基因(称为筛选标志基因)，其表达产物能赋予细胞一个特性，如使细胞产生对特定药物的抗性或产生荧光等，从而将转染细胞和无转染细胞区分开来。常用的筛选标志基因有很多，我们选用的是新霉素抗性基因(neo)。新霉素抗性基因(neo)的表达产物能灭活新霉素类似物G418对哺乳动物细胞蛋白合成的抑制作用。
筛选物或多或少对细胞有毒性作用，要保证准确筛选情况下使其对细胞的毒性降低到最低程度，保证转染细胞的正常生长发育，就要测定筛选物的毒性，并确定其用量(300～400μg/ml)。
(5)卵母细胞的体外成熟
卵巢卵母细胞体外成熟是获得廉价成熟卵母细胞的主要方法。利用此技术可以获得大量体外成熟的卵母细胞，用于核移植，从而充分利用实验材料，大大降低实验成本。
将得到的卵丘卵母细胞复合体(COC)进行分级，只有包被1层以上致密卵丘细胞、形态正常的卵母细胞才能用于成熟培养。
研究表明一定的基础培养液能使卵母细胞发育成熟。我们选择近年来报道最多的TCM199(Earle’salt)为培养液，应用这种培养液后卵母细胞体外成熟率均可达到80％以上。
在基础培养液中添加胎牛血清(FCS)可获得更高的成熟率。在基础培养液中添加促性腺激素对卵母细胞体外成熟具有十分重要的作用。
(6)重构胚的建立
①卵母细胞的去核
采用的方法是Mc Greath和Solter等1983年创造的一步法。其方法是：先用固定针吸住卵母细胞，使极体处于适当位置；然后用去核针刺破透明带，从极体的下部将第一极体及其附近细胞质一起去除。
②核移植的方法
融合法(透明带下注射法)是将一个供体细胞沿去核切口注入卵周隙，使注入细胞的细胞膜与去核卵母细胞的质膜紧密接触。然后通过细胞融合将整个细胞溶入去核卵母细胞。由于此法融合效率高、重复性好，此法被广泛地使用。用0.3mol/L甘露醇，0.1mmo/L，CaCl2，0.2mmol/L MgSO4，0.5mmol/L HEPES和0.05％FAF-BSA配制成的融合液，以两次2.26kV/cm，16μs的直流电脉冲进行操作，得到了93.6％的融合率。
③重构胚的激活
在自然受精或人工条件下受精，精子必须穿过透明带进入卵母细胞。在精子胞质内存在某些可溶性蛋白质分子，在精卵质膜融合后，他们作为一种信号分子通过融合孔进入卵子胞质中，从而激活卵子内的钙释放系统而使卵子活化。精子诱发卵母细胞内一系列Ca2+离子瞬间升高。Ca2+离子的瞬间升高是以波的形式扩散到整个卵母细胞，引发皮质反应使卵母细胞退出分裂中期而进入间期。在Ca2+离子介导的卵母细胞激活过程中，其中激酶MPF的灭活是中期向间期过渡的前提。在目前的实验中使用的任何激活方法都不能完全模拟精子诱发卵母细胞激活的过程。
核移植胚必须激活后才能启动发育。常用的激活方法有：电激活法和化学激活法。
电激活时，在瞬间高压电场的作用下，引起细胞膜发生瞬间的变化，使细胞膜瞬间形成很多微孔，溶液中的Ca2+离子通过微孔进入细胞质，使细胞内Ca2+离子呈脉冲式升高激活卵子。多次电刺激引起的Ca2+离子的多次脉冲式升高，可以模拟在自然条件下发生的受精过程。有效地提高了卵母细胞的人工激活率，融合时的电刺激也具有部分激活的作用。在哺乳动物体细胞核移植中，此法被广泛地应用。
四、转基因后代的鉴定：
(1)DNA的提取
选择出生两周左右时间的新生幼仔尾部或耳部组织用于提取DNA供分子检测，因为这些组织的采集方便且对幼仔伤害较小。
(2)鉴定方法
①PCR鉴定
②Southern杂交
Southern杂交是目前公认的最好的最可靠的分子检测方法。Southern杂交使用的探针是根据被转移基因的序列特别设计合成的DNA序列。Southern杂交的底物是基因组DNA。
③Northern杂交
用Northern杂交来检测目标基因是否表达、表达强弱和在哪些组织中表达。Northern杂交的底物是RNA，与探针进行RNA/DNA杂交。底物是从不同组织提取的总RNA。
(3)转基因奶牛乳腺中表达产物的检测：
采集获得的转基因奶牛泌乳期不同时间的乳汁进行抑菌活性检测，结果表明乳汁中的表达产物对乳房炎主要病原菌具有很好的抑菌活性，阴性对照为正常非转基因奶牛泌乳期采集的奶牛乳汁。抑菌活性检测结果如图9、10、11。
本发明的积极效果在于：培育的奶牛不得乳腺炎疾病，也避免了预防和治疗乳腺炎过程中药物的残留和副作用，该转基因克隆牛在泌乳期具有抵抗细菌感染、从而避免乳房炎发生的能力，建立了一种奶牛乳房炎抗病育种的新方法。
本发明涉及的抗菌肽是普遍存在于生物体内的一类由特定基因编码的具有广谱抗菌功能的小分子多肽，它们对真核细胞没有杀伤作用。大量的研究已经表明，抗菌肽在动物体内对细菌、真菌等都有较强的杀伤作用。
泌乳期乳腺是蛋白合成表达最旺盛的组织之一，我们经过试验证实，乳腺组织特异性启动子可指导外源蛋白在乳腺组织局部的高效表达，如能使抗菌肽在乳腺组织获得表达，将可发挥其抗菌的生物学特性，并将达到预防及治疗乳房炎的目的。
附图说明
图1含有牛乳铁蛋白肽基因的质粒结构图。
图2中含有天蚕B基因的质粒结构图。
图3含有杂合肽基因的质粒结构图。
图4含有牛气管抗菌肽基因的质粒结构图。
图5含牛乳铁蛋白肽和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-CM。
图6含牛气管抗菌肽和天蚕素B基因的载体pLN-bCP-cecB-bTAP。
图7含牛乳铁蛋白肽和天蚕素B基因的载体pLN-bCP-LfcinB-CecB。
图8含牛乳铁蛋白肽和牛气管抗菌肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-bTAP。
图9乳中表达产物对链球菌抑菌活性检测结果。
图10乳中表达产物对大肠杆菌抑菌活性检测结果。
图11乳中表达产物对金葡球菌抑菌活性检测结果。
图12胚胎成纤维细胞。
图13阳性细胞克隆。
具体实施方式
实施例1
(一)乳铁蛋白肽基因的合成
1.乳铁蛋白肽基因的设计
在乳铁蛋白部分肽核苷酸序列前后分别加上乳铁蛋白信号肽序列和终止密码子，5′端加上酶切位点NotI，3′端加上酶切位点BamHI，由此组成的完整序列即为目标序列Lfcin B：
gcggccgc atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctg
tgt ctg gct ttc aaa tgc cgc cga tgg cag tgg agg atg aag aag ctg ggt gct
ccc tct atc acc tgt gtg agg agg gcc ttt taa ggatcc
2.重叠引物的设计
根据Lfcin B的核苷酸序列设计合成了4条引物：
LfcinB-F1：5′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtccctt
ggagccctt
Lfci nB-R1：5′-ctgccatcggcggcatttgaaagccagacacagtccaagggct
ccaagggacag
LfcinB-F2：5′-aaatgccgccgatggcagtggaggatgaagaagctggg
tgctccc
LfcinB-R2：5′ggatccttaaaaggccctcctcacacaggtgatagagggagcacc
cagcttctt
4条引物的特点为：LfcinB-F1和LfcinB-R1的3′端互补，LfcinB-R1和LfcinB-F2的5′端互补，LfcinB-F2和LfcinB-R2的3′端互补。
3.乳铁蛋白肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM的LfcinB-F1，LfcinB-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、PfuDNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物LfcinB-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM LfcinB-F2，LfcinB-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物LfcinB-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物LfcinB-F1R1，LfcinB；-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM LfcinB-F1，LfcinB-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
4.合成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
5.合成的乳铁蛋白肽基因在pMD-18T中的克隆
第4步PCR反应结束后，将100μlPCR反应液全部上样，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，回收目的片段Lfcin B(149bp)，将目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段Lfcin B核苷酸序列完全一致，由此获得了含有完整乳铁蛋白部分肽基因(Lfcin B)核苷酸序列的表达载体pT-LfcinB。
(二)含有乳铁蛋白肽基因的质粒pIB-LfcinB-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，表达载体pT-LfcinB、pT-bcp分别提供乳铁蛋白部分肽基因和乳酪蛋白启动子。质粒pIB-LfcinB-neo的构建过程：
1.取表达载体pT-bcp 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶SpeI+SacII双酶切并以Klenow补平末端，CIAP去磷后电泳，回收1.1kb的bCP启动子序列，溶于10μl灭菌去离子水中备用；
2.取表达载体pIRES1-neo 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NruI+EcoRV双酶切，回收4.6kb的载体片段；
3.将步骤1、2获得的二片段在10μl体系内连接，16℃过夜，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细菌，对重组菌落进行鉴定，获得正向插入bcp启动子的重组质粒，命名为pI-B(5.7kb)；
4.取表达载体pI-B 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收DNA片段；
5.取表达载体pT-L 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收149p的DNA片段，与步骤4中获得的片段，以T4DNA连接酶，参照步骤3方法连接二片段，正确重组质粒命名为pIB-LfcinB-neo；
(三)建立转基因动物
1.卵母细胞的准备
供质牛选用成年黑白花奶牛，两次注射PG调节母牛的情期，连续3天注射FSH，每天2次，在注射LRH26～30h后，手术回收中II期卵母细胞，回收的卵母细胞在37℃，50％CO2，M2培养液中作短期培养。如卵母细胞周围有颗粒细胞，可用透明质酸酶去除。
2.卵母细胞的去核
将卵母细胞在含有7.5μg/mL细胞松驰素(CB)+M2培养液组成的显微操作液中，37℃，5％CO2培养30min，每次取20～30枚卵母细胞移入显微操作液，在Olympus显微镜下将位于第一极体处的中期染色体和部分细胞质去除。
3.胚胎成纤维细胞的分离和培养
取正常怀孕的奶牛胚胎，清洗剪碎后胰蛋白酶消化，分离得到的细胞在DMEM+10％FBS的培养液，37℃，5％CO2中培养，得到贴壁的培养细胞(见图8)。
4.供体细胞的转染
用NruI+XhoI酶切重组质粒pIB-LfcinB-neo上所需的外源基因。DNA样品通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，割下含有所需外源DNA条带的凝胶，用电洗脱方法回收DNA，上离子交换柱(Qiagen)脱盐浓缩。通过脂质体转染法转染供体细胞。
取50ml细胞培养瓶中处于旺盛生长期的供体细胞做1∶2传代，37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养18～24h，待细胞75％汇片时，准备转染。
脂质体/DNA复合物的制备在500μl无菌Eppendorf管中配液。A液：将2～3μgDNA稀释于250μl无血清无双抗的营养液中。B液：将30μlLipofectamineTM2000稀释于250μl无血清无双抗的DMEM营养液中。混合AB两液，轻微震荡，充分混匀后，室温放置30min，此时如果溶液浑浊，不影响转染。如果出现沉淀，则停止转染。
在DNA和Lipofectamine作用过程中，将75％汇片的细胞用无血清无双抗的营养液清洗三次，加入2ml无血清无双抗的营养液。将作用完毕的DNA/Lipofectamine混合物，加入到细胞上清中，轻晃摇匀，37℃，5％CO2，饱和湿度培养5～12h后，换入10％血清的营养液。
G418抗性细胞的筛选
转染后的供体细胞在37℃，5％CO2饱和湿度培养36h后，将细胞按1∶5，1∶10，1∶15，1∶20分传入6孔板中，培养12h，待细胞贴壁后，加入含G418(大于最小致死浓度)的营养液继续培养。由于G418对真核生物与原核生物细胞均具有毒性作用，增殖中的细胞对G418更为敏感并容易死亡，而转染有重组质粒的细胞由于可表达质粒上的G418抗性基因，所以可以存活。根据生长情况，转染后的细胞每三天换一次液，随着时间的延长，未转染重组质粒的死亡细胞数目增加，大约10～14天，可见转染质粒阳性的细胞克隆(见图9)。
5.供核细胞的饥饿
将生长良好的培养细胞中的原培养液吸出，并用PBS洗2次，加入DMEM+0.5％FBS培养液，继续培养1～3d。饥饿培养的细胞用胰蛋白酶消化，悬浮细胞用作供核细胞。
6.供核细胞的移植
去核卵母细胞和供核细胞在含有CB的M2培养液中，移核针吸取成纤维细胞，移入去核卵母细胞的卵周隙中。
7.融合和激活
采用电融合法，电融合操作在室温下进行，将经短期恢复培养后的卵母细胞与供体细胞复合体移入融合液中(0.3mol/L甘露醇，0.1mmol/L MgSO4，0.05mmol/LCaCl2和3％BSA)。融合条件是：1.25kV/cm，40μs；电刺激后，重构胚胎在M16培养液中培养30min，检查其融合结果。融合卵在M16中培养5h；在激活液(5μmol/L离子霉素+7.5μg/mLCB)中5min；然后在含有2μmol/L 6-DMAP和5μmol/LCB的M16培养液中5h；最后在M16培养液中培养。
8.重构胚胎的体内培养
重构胚胎琼脂包埋：用1％琼脂糖，作双层包埋。包埋后的克隆胚胎移入同步情期牛的结扎后的输卵管内培养6d。
回收体内培养的克隆胚胎：手术回收体内培养的克隆胚胎，在显微镜下判定其发育。
9.胚胎移植
选择正常发育的重构胚胎，用外科手术的方法移入同步情期的寄母牛子宫内。一般每头牛移植2～3枚胚胎。
10.寄母羊妊娠诊断与妊娠期的护理
胚胎移植后4～6周进行超声波检查。用加拿大生产的AMI2900型B超仪，配用5M的直肠探头进行妊娠诊断。以见到尿囊、胎儿或胎心搏动作为妊娠的判别标准。再过2～3周后复查1次，对妊娠牛隔离饲养，增加营养。
11.克隆牛的出生
在预产期前10天进行昼夜观察，做好产前和难产的应急准备。正常生产的牛及时清理口鼻粘液，消毒脐带。难产牛及时破腹产，以保证牛犊成活。
12.外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在LfcinB的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-GGATCCTTAAAAGGCCCTCCTCA-3′(LfcinB)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎。
实施例2
(一)牛气管抗菌肽基因的合成
1.牛气管抗菌肽基因的设计
依据GenBank登陆号为AF014106的牛气管抗菌肽基因序列，选用真核细胞偏爱的密码子对其进行优化，结合真核表达载体pIRES1-neo和pMD18-T的多克隆位点，在基因两端设计酶切位点，在5′端引入EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，在3′端引入BamHI酶切位点，并根据酶切位点添加相应的保护碱基。改造后的序列为：
ggaattc gcggccgc atg agg ctc cat cac ctg ctc ctc gct ctc ctc ttc ctggtc ctg tct gct tcc tca gga ttt act caa gga gta gga aat cct gta agc tgtgtt agg aat aaa ggc atc tgt gtg cca atc agg tgt cct gga aac atg aaa cagatt ggc acc tgt gtc ggg aga gca gta aaa tgc tgt aga aag aag taa ggatcccg
5′端第一个G为保护碱基，下划线的GAATTC为EcoRI酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，3′端GGATCC为BamHI酶切位点，CG为保护碱基。
2.重叠引物的设计
设计bTAP-F1、bTAP-R1、bTAP-F2、bTAP-R2 4条引物，由上海生物工程公司合成。
bTAP-F1：5′-aattcgcggccgcatgaggctccatcacctgctcctcctctcctcttcc tggtcct
gtctgcttcctca
bTAP-R1：5′-ctttattcctaacacagcttacaggatttcctactccttgagtaaatcctgaggaa
gcagacaggac
bTAP-F2：5′-gctgtgttaggaataaaggcatctgtgtgccaatcaggtgtcctggaaacatgaa
acagattggcacc
bTAP-R2：5′-cgggatccttacttctttctacagcattttactgctctcccgacacaggtgccaa
tctgtttcat
引物bTAP-F1，bTAP-R1的3′端18个碱基互补，引物bTAP-F2，bTAP-R2的3′端18个碱基互补，引物bTAP-R1，bTAP-F2的5′端18个碱基互补。
3.气管抗菌肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM bTAP-F1，bTAP-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物bTAP-B-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM bTAP-F2，bTAP-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物bTAP-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物bTAP-F1R1，bTAP-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μMbTAP-F1，bTAP-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、PfuDNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
4.产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
5.牛气管抗菌肽基因在pMD-18T中的克隆
将上述回收的PCR产物目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段bTAP核苷酸序列完全一致，测序正确的重组表达载体命名为pT-bTAP。
(二)含有牛气管抗菌肽基因质粒pIB-bTAP-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-bTAP和pT-bcp分别提供牛气管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。质粒pIB-bTAP-neo的构建过程：
1.取表达载体pT-bcp 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶SpeI+SacII双酶切并以Klenow补平末端，CIAP去磷后电泳，回收1.1kb的bCP启动子序列，溶于10μl灭菌去离子水中备用；
2.取表达载体pIRES1-neo 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NruI+EcoRV双酶切，回收4.6kb的载体片段；
3.将步骤1、2获得的二片段在10μl体系内连接，16℃过夜，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细菌，对重组菌落进行鉴定，获得正向插入bcp启动子的重组质粒，命名为pI-B(5.7kb)；
4.取表达载体pI-B 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收DNA片段；
5.取表达载体pT-bTAP 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收218p的DNA片段，与步骤4中获得的片段，以T4DNA连接酶，参照步骤3方法连接二片段，正确重组质粒命名为pIB-bTAP-neo；
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
12.外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在bTAP的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎。
实施例3
(一)天蚕素B基因的合成
1.天蚕素B基因的设计
参考Genbank登陆号为D11113的天蚕素B基因序列，选用真核细胞偏爱的密码子的对其进行优化，同时结合表达载体pIRES1-neo和pMD-18T的多克隆位点，考虑克隆后能保持正确的阅读框架。在两端设计酶切位点。在5`端引入EcoRI酶切位点和NotI酶切位点，在3`端引入BamHI酶切位点，根据酶切位点添加相应的保护碱基。改造后的序列为：
ggaattc gcggccgc atg aat ttc gca aag atc cta tcc ttc gtc ttc gct ctggtg ctg gct ttg agc atg acc agc gct gct ccc gag ccc agg tgg aag atc ttcaag aaa att gaa aaa atg ggc agg aac att aga gac ggc atc gtc aaa gct ggccca gct atc gag gtc ctt ggt agc gct aaa gct ata gga aaa tga ggatcc gc
5′端第一个G为保护碱基，下划线的GAATTC为EcoRI酶切位点，GCGGCCGC为NotI酶切位点，GGATCC为BamHI酶切位点，3′端GC为保护碱基
2.叠引物的设计
设计cecF1、cecR1、cecF2、cecR2 4条引物，由上海生物工程公司合成。
cecF1：5′-ggaattcgcggccgcatgaatttcgcaaagatcctatccttcgtc
ttcgctctggtgctggctttgagcatg
cecR1：5′-ttcaattttcttgaagatcttccacctgggctcgggacagcgct
ggtcatgctcaaagccagcac
cecF2：5′-atcttcaagaaaattgaaaaaatgggcaggaacattagagacgg
catcgtcaaagctggcccagct
cecR2：5′-gcggtacctcattttcctatagctttagcgctaccaaggacc
tcgatagctgggccagctttgac
引物cecF1，cecR1的3′端18个碱基互补，引物cecF2，cecR2的3′端18个碱基互补，引物cecR1，cecF2的5′端18个碱基互补。
3.蚕素B基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM cecF1，cecR1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物cecB-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM cecF2，cecR2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物cecB-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物cecB-F1R1，cecB-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM cecF1，cecR2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
4.成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
5.合成天蚕素B基因在pMD-18T中的克隆
上述回收的PCR产物在如下体系内，12℃进行连接反应过夜：
Ligation solution I 5μl
回收的天蚕素B基因片段 约100ng
pMD-18T载体 1μl
加水补至总体积 10μl
取过夜连接产物5μl，转化E.coli DH5α，涂布氨苄青霉素抗性LB-琼脂平板，挑取重组菌落4个进行测序，测序正确的重组表达载体命名为pT-cecB。
(三)含有牛气管抗菌肽基因质粒pIB-cecB-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-cecB和pT-bcp分别提供牛气管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。质粒pIB-bTAP-neo的构建过程：
1.取表达载体pT-bcp 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶SpeI+SacII双酶切并以Klenow补平末端，CIAP去磷后电泳，回收1.1kb的bCP启动子序列，溶于10μl灭菌去离子水中备用；
2.取表达载体pIRES1-neo 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NruI+EcoRV双酶切，回收4.6kb的载体片段；
3.将步骤1、2获得的二片段在10μl体系内连接，16℃过夜，将连接产物转化E.coli DH5α感受态细菌，对重组菌落进行鉴定，获得正向插入bcp启动子的重组质粒，命名为pI-B(5.7kb)；
4.取表达载体pI-B 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收DNA片段；
5.取表达载体pT-cecB 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收213bp的DNA片段，与步骤4中获得的片段，以T4DNA连接酶，参照步骤3方法连接二片段，正确重组质粒命名为pIB-cecB-neo；
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端下游引物在cecB的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-GCGGTACCTCATTTTCCTATAGC-3′(cecB)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎。
实施例4
(一)天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因CM的合成
1.杂合肽基因的设计
取天蚕素A1-8位氨基酸和蛙皮素1～12位氨基酸组成杂合肽，在该杂合肽核苷酸序列前后分别加上乳铁蛋白信号肽序列和终止密码子序列，并在其5′和3′分别加上酶切位点NotI和BamHI。由此组成的完整核苷酸序列即为设计的天蚕素A-蛙皮素杂合肽(CM)基因核苷酸序列：
gcggccgc atg aag ctc ttc gtc ccc gcc ctg ctg tcc ctt gga gcc ctt gga ctg
tgt ctg gct(singal peptide)aag tgg aag ctg ttc aag aaa atc ggt atc ggg
aag ttc ctg cat tca gct aag aag ttc taa ggatcc
2.据CM的核苷酸序列设计合成4条引物：
CM-F1：5′-gcggccgcatgaagctcttcgtccccgccctgctgtcccttggag
ccctt
CM-R1：5′-cagcttccacttagccagacacagtccaagggctccaagggacag
CM-F2：5′-ctggctaagtggaagctgttcaagaaaatcggtatcgggaagttcctg
CM-R2：5′-ggatccttagaacttcttagctgaatgcaggaacttcccgatacc
4条引物的特点为：CMF1和CMR1的3′端互补，CMR1和CMF2的5′端互补，CMF2和CMR2的3′端互补。
3. 蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的拼接
通过3次PCR反应合成完整基因，第1次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM的CM-F1，CM-R1各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第一次扩增，得到产物CM-F1R1；第2次PCR反应：在100μL反应体系中加入10μM CM-F2，CM-R2各2μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积，循环参数为：94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。共25个循环做第二次扩增，得到产物CM-F2R2；第3次PCR反应：取第1次，第2次PCR反应产物CM-F1R1，CM-F2R2各1μL混合，94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min，循环一次后反应产物作为模板，加入10μM CM-F1，CM-R2各1μL，2.5mM dNTP 2μL、10×Buffer 10μL、Pfu DNA聚合酶0.5μL，加水补足体积100μL，循环参数为94℃，1min，50℃，2min，72℃，1min。循环25次后加入Taq DNA聚合酶0.5μL，72℃延伸10min进行PCR产物末端的加A反应。
4.成产物的回收
PCR产物以DNA凝胶回收试剂盒回收，溶解于10μl四馏水中。
5.成的天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因在pMD-18T中的克隆
第4步PCR反应结束后，将100μl PCR反应液全部上样，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，回收目的片段CM，将目的片段与pMD18-T载体连接，10μl连接反应体系为：4.5μl目的片段，5μl SolutionI和0.5μl pMD18-T载体，16℃过夜。将连接产物转化E.coli感受态细胞DH5α，经PCR鉴定和酶切鉴定后，挑取阳性克隆测序，测序结果与目的片段CM核苷酸序列完全一致，由此获得了含有完整天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因(CM)核苷酸序列的表达载体pT-LfcinB。
(三)含有杂合肽基因质粒pIB-CM-neo的构建
以商品化表达载体pIRES1-neo为载体框架，载体pT-CM和pT-bcp分别提供牛气管抗菌肽基因和山羊β-酪蛋白启动子。质粒pIB-CM-neo的构建过程：
1.取表达载体pT-bcp 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶SpeI+SacII双酶切并以Klenow补平末端，CIAP去磷后电泳，回收1.1kb的bCP启动子序列，溶于10μl灭菌去离子水中备用；
2.取表达载体pIRES1-neo 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NruI+EcoRV双酶切，回收4.6kb的载体片段；
3.将步骤1、2获得的二片段在10μl体系内连接，16℃过夜，将连接产物转化e.coli DH5α感受态细菌，对重组菌落进行鉴定，获得正向插入bcp启动子的重组质粒，命名为pI-B(5.7kb)；
4.取表达载体pI-B 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收DNA片段；
5.取表达载体pT-CM 0.5μg，在40μl总体积内，以限制性内切酶NotI+BamHI双酶切，回收213bp的DNA片段，与步骤4中获得的片段，以T4DNA连接酶，参照步骤3方法连接二片段，正确重组质粒命名为pIB-CM-neo；
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端下游引物在CM的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-GGATCCTTAGAACTTCTTAGCT-3′(CM)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎。
实施例5
(一)牛乳铁蛋白肽基因和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因CM的合成抗菌肽基因的合成方法同前面实施例
(二)含有牛乳铁蛋白肽基因和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的质粒pLN-bCP-LfcinB-CM的构建
以NotI和XhoI双酶切本研究组保存的质粒pIRES-bCP-LfcinB-CM、分别回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase连接，构建成含牛乳铁蛋白肽和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-CM。
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在远离β-casein的CM的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-GGATCCTTAGAACTTCTTAGCT-3′(CM)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎
实施例6
(一)牛乳铁蛋白肽基因和天蚕素B基因的合成抗菌肽基因的合成方法同前面实施例
(二)含有牛乳铁蛋白肽基因和天蚕素B基因的质粒pLN-bCP-LfcinB-CecB的构建
以NotI和XhoI双酶切本研究组保存的质粒pIRES-bCP-LfcinB-CecB、分别回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase连接，构建成含牛乳铁蛋白肽和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因的载体pLN-bCP-Lfc i nB-CecB。
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在远离β-casein的CecB的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-GCGGTACCTCATTTTCCTATAGC-3′(cecB)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎
实施例7
(一)牛乳铁蛋白肽基因和牛气管抗菌肽基因的合成抗菌肽基因的合成方法同前面实施例
(二)含有牛乳铁蛋白肽基因和牛气管抗菌肽基因的质粒pLN-bCP-LfcinB-bTAP的构建
以NotI和XhoI双酶切本研究组保存的质粒pIRES-bCP-LfcinB-bTAP、分别回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase连接，构建成含牛乳铁蛋白肽和牛气管抗菌肽基因的载体pLN-bCP-LfcinB-bTAP。
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在远离β-casein的bTAP的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎
实施例8
(一)天蚕素B基因和牛气管抗菌肽基因的合成
抗菌肽基因的合成方法同前面实施例
(二)含有天蚕素B基因和牛气管抗菌肽基因的质粒pLN-bCP-CecB-bTAP的构建
以NotI和XhoI双酶切本研究组保存的质粒pIRES-bCP-CecB-bTAP、分别回收1.6kb和7.2kb的基因片段，用T4 DNA Ligase连接，构建成含天蚕素B和牛气管抗菌肽基因的载体pLN-bCP-CecB-bTAP。
(三)建立转基因动物
重复实施例1中1～11的步骤，获得转基因克隆牛。
(12)外源转基因检测
外源基因检测采用PCR扩增法。上游引物在β-casein的5′端，下游引物在远离β-casein的bTAP的3′端，PCR引物：
5′-CTTCCGTGCATCCCAGCCAAGAT-3′(β-casein)
5′-CGGGATCCTTACTTCTTTCTACA-3′(bTAP)
扩增产物经凝胶电泳后，与阳性对照一致，可判定为阳性。
获得的含有抗菌肽基因的转基因后代在泌乳期没有发生乳房炎实验例(预防效果的比较)：
实验中共获得转基因克隆奶牛8头，分别编号为转1、2、3、4、5、6、7、8，对照组为8头自然产非转基因黑白花奶牛，分别编号为非转1、2、3、4、5、6、7、8，两组奶牛在相同的饲养条件下饲养，比较泌乳期非转基因奶牛与获得转有不同抗菌肽基因的转基因奶牛乳房炎的发病率，结果如下：
| 奶牛编号 | CMT诊断 |
| 转1 转2 转3 转4 转5 转6 转7 转8 非转1 非转2 非转3 非转4 非转5 非转6 非转7 非转8 | - - - - - - - - - ++ - - - - - + |
结论：转有抗菌肽基因的8头奶牛泌乳期均没有发生乳房炎，而8头非转基因奶牛乳房炎发病率为37.5％。该结果表明，转基因奶牛乳汁中分泌的抗菌肽对于泌乳期乳房炎的预防起到了积极的保护作用，在乳房炎的抗病育种方面具有重要的应用前景。
Claims (1)
1.一种利用抗菌肽培育具有抗乳房炎病奶牛重构胚的方法，是通过以下步骤实现的：将抗菌肽基因构建在乳腺组织特异性表达载体中，提取外源基因进行供体细胞的转染，以奶牛胎儿成纤维细胞或小牛皮肤成纤维细胞作为核移植供体细胞，通过筛选获得的阳性细胞与体外培养成熟的去核卵母细胞利用电融合法构建重构胚；
所述的抗菌肽基因选自乳铁蛋白肽基因、牛气管抗菌肽基因、天蚕素B基因和天蚕素A-蛙皮素杂合肽基因中的一种或多种组合。
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| 张锦霞.抗菌肽在动物乳腺中的表达及对乳房炎主要病原菌的抑制效应研究.吉林大学博士学位论文.2006,摘要. * |
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