KR101939570B1 - 복제 개의 생산방법 및 그에 따른 복제 개 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 복제 개의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 acteoside로 처리한 공여세포를 이용한 것을 특징으로 하는 복제 개의 생산방법 및 그에 따른 복제 개에 관한 것이다.
본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정),
상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정),
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정(3과정),
체세포 복제견을 생산하는 과정을 수행하되(4과정),
상기 수핵난자의 난자 주위의 난구세포를 제거하는 과정(4-1과정),
상기 수핵난자들을 탈핵하는 과정(4-2과정),
상기 탈핵된 난자에 상기의 세포 배양 배지 처리된 공여세포를 주입하는 과정(4-3과정),
상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정(4-4과정),
상기 융합된 수정란을 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 배양함으로써 활성화를 유도하는 과정(4-5과정),
상기 복제된 수정란을 세척한 후 PZM-3 내에서 추가로 배양하는 과정(4-6과정)
상기 배양된 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식하는 과정(4-7과정),
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정)은
10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 0.5% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정인 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정)은
개과 동물의 태아를 제왕절개 방법으로 회수하는 과정(1-1과정),
회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 세척하는 과정(1-2과정),
상기 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 15% (v/v) FBS (invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양 접시에서 배양하는 과정(1-3과정),
상기 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하는 과정(1-4과정),
상기 배양된 세포를 트립신 처리하고 DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정(1-5과정)
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 방법에 의하여 생산된 복제 개를 제공한다.
본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정),
상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정),
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정(3과정),
체세포 복제견을 생산하는 과정을 수행하되(4과정),
상기 수핵난자의 난자 주위의 난구세포를 제거하는 과정(4-1과정),
상기 수핵난자들을 탈핵하는 과정(4-2과정),
상기 탈핵된 난자에 상기의 세포 배양 배지 처리된 공여세포를 주입하는 과정(4-3과정),
상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정(4-4과정),
상기 융합된 수정란을 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 배양함으로써 활성화를 유도하는 과정(4-5과정),
상기 복제된 수정란을 세척한 후 PZM-3 내에서 추가로 배양하는 과정(4-6과정)
상기 배양된 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식하는 과정(4-7과정),
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정)은
10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 0.5% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정인 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정)은
개과 동물의 태아를 제왕절개 방법으로 회수하는 과정(1-1과정),
회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 세척하는 과정(1-2과정),
상기 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 15% (v/v) FBS (invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양 접시에서 배양하는 과정(1-3과정),
상기 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하는 과정(1-4과정),
상기 배양된 세포를 트립신 처리하고 DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정(1-5과정)
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 방법에 의하여 생산된 복제 개를 제공한다.
Description
본 발명은 복제 개의 생산방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 acteoside로 처리한 공여세포를 이용한 것을 특징으로 하는 복제 개의 생산방법 및 그에 따른 복제 개에 관한 것이다.
최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵 이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어지고 있다.
체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
일반적으로 체세포 핵이식 기술에서 체세포 공여 핵을 이식할 수핵 난자(recipient oocyte)는 인위적으로 시험관 내(in vitro)에서 배양하여 2차 감수분열 중기까지 도달하도록 성숙시켜 사용한다. 그 다음 체세포 핵이식에 따른 염색체 이상 발생을 방지하기 위하여 체세포를 이식하기 전에 상기 성숙 난자의 핵을 제거하고 상기 탈핵 난자의 주란강 또는 세포질 내에 체세포를 주입한다. 그 후 상기 탈핵 난자와 주란강 또는 세포질에 주입된 체세포를 전기적 자극을 통하여 물리적으로 융합시키고 전기자극 또는 화학물질에 의하여 활성화시킨 후 대리모에 이식하여 산자를 탄생시킨다.
이러한 체세포 핵이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀· 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포· 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.
체세포 핵이식을 통한 동물복제기술은 영국 로슬린 연구소의 윌멋(Wilmut) 박사에 의해 6세 된 암컷 양에서 채취한 유선세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 핵 이식란을 생산한 후 생체 내 이식을 통하여 체세포 복제동물인 돌리를 탄생시킴으로써 최초로 성공하였다. 이후 소, 마우스, 염소, 돼지 및 토끼 등에서 체세포 핵 이식 방법에 의한 복제된 산자 생산이 보고 되었다(WO9937143A2, EP930009A1, WO9934669A1, WO9901164A1 및 US5,945,577).
한편, 소, 돼지와 같은 산업동물의 복제와 더불어 개 또는 다른 애완동물의 복제는 많은 사람들의 관심의 대상이 되고 있다. 최근 애완동물로는 처음으로 고양이가 복제되었으며 수백만 달러의 기금으로 개 복제의 연구가 수행되기도 하였다. 그러나 개의 경우 독특한 종-특이적 생식 특성으로 인해 다른 가축에 비해 체세포 핵 이식에 의한 복제가 매우 어렵다.
또한 본 발명자는 특허등록 10-0733012(복제된 개과 동물 및 이의 생산 방법, 이하 선행기술)으로 복제개를 생산하는 방법을 제시한 바 있다.
상기한 선행기술은 복제 효율이 낮은 어려움이 있었다.
본 발명은 체세포 복제시 공여세포의 리프로그래밍이 매우 중요한데 이를 위해 세포주기를 동기화하거나 세포내 활성산소를 감소시키며 세포사멸 방지를 위한 처리 방법을 개발하여 개과 동물의 복제개를 생산효율을 증진하는 기술을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 세포의 리프로그래밍의 효율을 향상시킬 수 있는 허브추출물인 acteoside로 처리한 세포를 이용하여 개 체세포 복제의 효율이 향상된 복제 개의 생산방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 상기한 목적 및 요구를 해결하기 위하여,
개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정),
상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정),
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정(3과정),
체세포 복제견을 생산하는 과정을 수행하되(4과정),
상기 수핵난자의 난자 주위의 난구세포를 제거하는 과정(4-1과정),
상기 수핵난자들을 탈핵하는 과정(4-2과정),
상기 탈핵된 난자에 상기의 세포 배양 배지 처리된 공여세포를 주입하는 과정(4-3과정),
상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정(4-4과정),
상기 융합된 수정란을 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 배양함으로써 활성화를 유도하는 과정(4-5과정),
상기 복제된 수정란을 세척한 후 PZM-3 내에서 추가로 배양하는 과정(4-6과정)
상기 배양된 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식하는 과정(4-7과정),
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정)은
10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 0.5% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 배양하는 과정,
또는 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정인 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정)은
개과 동물의 태아를 제왕절개 방법으로 회수하는 과정(1-1과정),
회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 세척하는 과정(1-2과정),
상기 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 15% (v/v) FBS (invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양 접시에서 배양하는 과정(1-3과정),
상기 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하는 과정(1-4과정),
상기 배양된 세포를 트립신 처리하고 DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정(1-5과정)
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기한 방법에 의하여 생산된 복제 개를 제공한다.
본 발명에 따른 복제 개의 생산방법은 체세포 복제시 공여세포의 리프로그래밍의 효율이 현저히 높은바 특히 세포주기를 동기화하고 세포내 활성산소를 감소시키며 세포사멸 방지의 효과가 현저하여 개과 동물의 복제 개의 생산효율이 현저히 증진하게 된다.
특히 본 발명은 허브추출물인 acteoside로 공여세포를 처리하여 공여세포의 리프로그래밍의 효율을 현저히 향상시키게 되는 효과가 나타난바, contact inhibition, serum starvation 그룹과 유사하게 G0/G1 세포 주기에 동기화 되었으며, 활성산소종과 세포사멸이 contact inhibition, serum starvation 비하여 현저히 적게 나타나는 효과가 있고, 배발달이 16세포기까지 발달하는 작용을 하게 되어 개과 동물의 복제 개의 생산효율을 증진하는 효과가 나타난다.
도 1은 본 발명에 따른 개 태아 섬유아세포의 다양한 acteoside 처리에 의한 세포주기 동기화 효과 비교표.
도 2는 본 발명에 따른 개 태아 섬유아세포의 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리에 따른 세포 주기 동기화 효과 비교표.
도 3은 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 개 태아 섬유아세포의 활성산소종 비교표.
도 3b는 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 개 태아 섬유아세포의 세포사멸, 세포괴사, 세포 생존율 비교표.
(Q1, necrosis; Q2, late-apoptosis; Q3, live cell; Q4, early-apoptosis)
도 3c는 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 세포사멸, 세포괴사, 세포 생존율 비교표.
도 4는 본 발명에 따른 contact inhibition, acteoside 처리 그룹의 개 체세포 복제란의 배발달율 비교표.
도 5는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 개 체세포 복제개 생산표.
도 5b는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 복제개의 임신낭 안의 복제개 배아 초음파 사진.
도 5c는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 복제개의 사진.
도 6은 본 발명에 따른 복제개의 Microsatellite 분석표.
도 7은 본 발명에 따른 복제개의 마이토콘드리아 분석표.
도 2는 본 발명에 따른 개 태아 섬유아세포의 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리에 따른 세포 주기 동기화 효과 비교표.
도 3은 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 개 태아 섬유아세포의 활성산소종 비교표.
도 3b는 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 개 태아 섬유아세포의 세포사멸, 세포괴사, 세포 생존율 비교표.
(Q1, necrosis; Q2, late-apoptosis; Q3, live cell; Q4, early-apoptosis)
도 3c는 본 발명에 따른 contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리 그룹의 세포사멸, 세포괴사, 세포 생존율 비교표.
도 4는 본 발명에 따른 contact inhibition, acteoside 처리 그룹의 개 체세포 복제란의 배발달율 비교표.
도 5는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 개 체세포 복제개 생산표.
도 5b는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 복제개의 임신낭 안의 복제개 배아 초음파 사진.
도 5c는 본 발명에 따른 acteoside로 처리한 세포를 이용한 복제개의 사진.
도 6은 본 발명에 따른 복제개의 Microsatellite 분석표.
도 7은 본 발명에 따른 복제개의 마이토콘드리아 분석표.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정을 수행한다.(1과정)
개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정은 다음과 같다.
인공수정 또는 자연교미한 개(비글견)의 태아를 임신 28일령에 제왕절개 방법으로 회수하는 과정을 수행한다. (1-1과정)
상기 회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 1~ 5회 바람직하게는 3회 세척하는 과정을 수행한다. (1-2과정)
상기 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 35~42℃, 3~7% CO2 및 93~97% 공기의 가습 조건으로 10~20% (v/v) FBS (invitrogen), 0.5~1.5% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양 접시에서 배양하는 과정을 수행한다. (1-3과정)
바람직하게는 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 39℃, 5% CO2 및 95% 공기의 가습 조건으로 15% (v/v) FBS (invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 100mm 배양 접시에서 배양하는 과정을 수행할 수 있다.
상기 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하는 과정을 수행한다.(1-4과정)
상기 배양된 세포를 0.1~0.3% 트립신-EDTA을 사용하여 수(數) 분간 트립신 처리하고 다수의 세포를 5~15% DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 -196℃의 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정을 수행한다.(1-5과정)
바람직하게는 상기 배양된 세포를 0.25% 트립신-EDTA을 사용하여 1분간 트립신 처리하고 세포 2×106 개씩 10% DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 -196℃의 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정을 수행한다.
본 발명은 상기 준비한 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정을 수행한다.(2과정)
본 발명의 기술적 특징은 세포 배양 배지 처리하는 과정에 있으며 그 과정은 다음과 같다.
본 발명은 상기의 동결한 세포를 융해하여 80% 컨플루언시 될 때까지 5~15%(v/v) 바람직하게는 10% (v/v) FBS, 0.5~1.5% 바람직하게는 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양하는 과정을 수행한다.
그리고 0.15~0.3% 바람직하게는 0.25%의 트립신-EDTA를 사용하여 0.5~3분간 바람직하게는 1분간 트립신 처리하여 세포를 배양배지로부터 분리시킨 후 배양시키는 과정을 수행하되 바람직하게는 60mm 배양 접시에 세포 106 개씩 배양하는 과정을 수행한다.
본 발명은 세포 주기를 G0/G1 주기에 동기화시키기 위해 세 가지 방법으로 처리하여 세포를 배양하는 것이 특징이며 특히 Acteoside (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., China)로 처리한 것이 큰 기술적 특징을 나타낸다.
먼저, 본 발명에서 contact inhibition 그룹(처리 그룹)의 의미는 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 5일 동안 배양하는 과정을 수행하는 것을 의미한다.
또한 Serum starvation 그룹(처리 그룹)은 0.5% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 5일 동안 배양하는 과정을 수행하는 것을 의미한다.
또한 Acteoside (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., China) 처리 그룹은 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정을 수행하는 것을 의미한다.
바람직하게 Acteoside (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., China) 처리 그룹은 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 10, 30, 50 μM acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정을 수행한다.
상기한 각각의 처리 그룹의 처리시간은 24, 48, 72시간으로 다양하게 처리할 수 있다.
본 발명은 개과 동물의 수핵난자의 준비 과정을 수행한다.(3과정)
본 과정은 상기한 공여세포를 분리배양하는 과정 또는/및 세포 배양 배지 처리하는 과정과 별도의 과정으로 동시 또는 이시에 수행할 수 있다.
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정은 다음과 같이 진행한다.
1~5년령의 발정견(잡종 발정견)으로부터 수술적인 방법으로 성숙된 난자를 회수하는 과정을 수행한다.
발정이 관찰된 날로부터 매일 채혈하여 DSL-3900ACTIVE Progesterone Coated-Tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA)을 이용하여 혈청 프로게스테론을 측정한다.
프로게스테론 농도가 4ng/ml 이상되는 날을 배란일로 잡고 그 후 72시간 후에 외과적 수술을 통하여 체내에서 성숙된 수핵 난자를 회수하는 과정을 수행한다.
발정견을 6mg/ml 케타민(ketamine)으로 마취한 후, 2% 아이소플루란(isoflurane)으로 마취를 유지하며 수술을 진행한다.
개복하여 자궁을 꺼내고 고정시킨후, 난소를 쌓고 있는 버사의 슬릿을 통해 난관개시부에 플러싱 니들(flushing needle)을 장착한다.
난관접합부에 인접한 난관에 혈관내튜브카테터(IV cartheter)를 삽입하고 플러싱 배지를 사용해 성숙된 난자(수핵난자)를 회수하는 과정을 수행한다.
본 발명은 상기한 과정 후에 체세포 복제견 생산하는 과정을 수행한다.(4과정)
상기 회수된 성숙 난자를 실험실로 가능한 빨리 이동하여 체세포 복제를 실시하는 과정을 수행하며 그 과정은 다음과 같다.
먼저 난자 주위의 난구세포를 0.5~1.5% hyaluronidase를 이용하여 제거하는 과정을 수행한다.(4-1과정)
바람직하게는 난자 주위의 난구세포를 0.1% hyaluronidase를 이용하여 제거하는 과정을 수행하는 것이 좋다.
다음으로 각각의 난자들을 홀딩 마이크로피펫 (내경 150 m)으로 고정하고, 3~7% (v/v) FBS 및 3~7 ug/mL 비즈벤지미드 (bisbenzimide Hoechst 33342)와 3~7 ug/mL 사이토칼라신 B가 보충된 Hepes-buffered TCM-199 배지 내에서 미세조작기 (Nikon-Narishige, Tokyo, Japan)로 탈핵하는 과정을 수행한다.(4-2과정)
바람직하게는 각각의 난자들을 홀딩 마이크로피펫 (내경 150 m)으로 고정하고, 5% (v/v) FBS 및 5 ug/mL 비즈벤지미드 (bisbenzimide Hoechst 33342)와 5 ug/mL 사이토칼라신 B가 보충된 Hepes-buffered TCM-199 배지 내에서 미세조작기 (Nikon-Narishige, Tokyo, Japan)로 탈핵하는 과정을 수행한다.
상기 탈핵된 난자는 3~7% (v/v) FBS가 보충된 TCM-199에 세척 후, 난자의 위란강 공간 (perivitelline space)으로 contact inhibition, Serum starvation 또는 acteoside로 처리된 공여세포를 주입하는 과정을 수행한다.(4-3과정)
바람직하게는 탈핵된 난자는 5% (v/v) FBS가 보충된 TCM-199에 세척 후, 난자의 위란강 공간 (perivitelline space)으로 contact inhibition, Serum starvation 또는 acteoside로 처리된 공여세포를 주입하는 과정을 수행한다.
더욱 바람직하게는 상기한 acteoside로 처리된 공여세포는 48시간 동안 30μM acteoside 처리된 세포를 주입하는 것이 매우 효과적이다.
상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 0.23~0.3 M 만니톨, 0.05~0.15 mM MgSO4, 0.3~0.7 mM Hepes 및 0.03~0.1% (w/v) BSA를 포함하는 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 70-73 voltage로 10~20 μs씩 1~3번 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정을 수행한다. (4-4과정)
바람직하게는 상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 0.26 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM Hepes 및 0.05% (w/v) BSA를 포함하는 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 70-73 voltage로 바람직하게는 15μs씩 2번 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정을 수행한다.
앞서 설명한 선행기술은 공여세포를 융합 배지에 침전시키고 전압 3.0~3.5kV/cm 조건으로 10~30 μs 동안 자극을 주어 융합을 수행하여 그 융합률이 낮았던 반면에, 본 발명은 70-73 voltage로 15μs씩 2번 전기 자극을 주어 융합률을 높이는 효과가 나타난다.
상기 재구성된 개 수정란의 화학적 활성은 35~42℃의 7~13 uM 칼슘 아이노포어 (calcium ionophore)를 포함하는 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 3~8분 배양함으로써 복제수정란의 활성화를 유도하는 과정을 수행한다.(4-5과정)
바람직하게는 재구성된 개 수정란의 화학적 활성은 39℃의 10 uM 칼슘 아이노포어 (calcium ionophore)를 포함하는 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 4분 배양함으로써 복제수정란의 활성화를 유도하는 과정을 수행한다.
그 후, 복제된 수정란을 세척한 후 1.9 mM 6-디메틸아미노푸린 (dimethylaminopurine)이 보충된 PZM-3 내에서 여러 시간 동안 추가로 배양하는 과정을 수행한다.(4-6과정)
바람직하게는 복제된 수정란을 세척한 후 1.7~2.3 mM 6-디메틸아미노푸린 (dimethylaminopurine)이 보충된 PZM-3 내에서 4시간 동안 추가로 배양하는 과정을 수행한다.
상기 핵 이식의 마지막 과정, 즉 복제된 수정란을 세척한 후 1.7~2.3 mM 6-디메틸아미노푸린 (dimethylaminopurine)이 보충된 PZM-3 내에서 4시간 동안 추가로 배양하는 과정이 끝난 후 수(數) 시간 이내에 바람직하게는 4시간 이내에, 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식하는 과정을 수행한다.(4-7과정)
상기 수술적 이식을 위하여, 호흡마취 하에서 3.5F Tom cat catheter를 사용하여 대리모의 난관 팽대부에 이식한다.
이식 후 22일에 7.0 MHZ막대형 프로브가 부착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너를 사용하여 임신을 관찰한다. 임신 최초 확인 후 매 2주 간격으로 초음파로 모니터링한다.
본 발명은 상기한 과정으로 복제견을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명은 아래와 같은 실시예로 복제견을 생산하였는바 복제개의 복원율이 현저히 높아짐을 알 수가 있다.
<실시예>
A. 복제견 생산
1. 공여세포 분리배양
인공수정 또는 자연교미한 비글견의 태아를 임신 28일령에 제왕절개 방법으로 회수한다. 회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 3회 세척한다. 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 39℃, 5% CO2 및 95% 공기의 가습 조건으로 15% (v/v) FBS (invitrogen), 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 100mm 배양 접시에서 배양한다. 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양한다. 0.25% 트립신-EDTA을 사용하여 1분간 트립신 처리하고 세포 2×106 개씩 10% DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 -196℃의 액체 질소 내에서 동결 저장한다.
2. 세포 배양 배지 처리
동결한 세포를 융해하여 80% 컨플루언시 될 때까지 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양한다. 0.25% 트립신-EDTA을 사용하여 1분간 트립신 처리하여 세포를 배양배지로부터 분리시킨 후 60mm 배양 접시에 세포 106 개씩 배양한다. 세포 주기를 G0/G1 주기에 동기화시키기 위해 본 실험에서 세 가지 방법으로 세포를 배양하였다. contact inhibition 그룹은 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 5일 동안 배양한다. Serum starvation 그룹은 0.5% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포를 5일 동안 배양한다. Acteoside (Chengdu Biopurify Phytochemicals Ltd., China) 처리 그룹은 10% (v/v) FBS, 1% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 10, 30, 50 μM acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하였다. 이때 처리시간은 24, 48, 72시간으로 다향하게 처리하였다.
3. 수핵난자의 준비
1~5년령의 잡종 발정견으로부터 수술적인 방법으로 성숙된 난자를 회수하였다. 발정이 관찰된 날로부터 매일 채혈하여 DSL-3900ACTIVE Progesterone Coated-Tube Radioimmunoassay Kit (Diagnostic Systems Laboratories, Inc., TX, USA)을 이용하여 혈청 프로게스테론을 측정하였다. 프로게스테론 농도가 4ng/ml 이상되는 날을 배란일로 잡고 그 후 72시간 후에 외과적 수술을 통하여 체내에서 성숙된 수핵 난자를 회수한다. 발정견을 6mg/ml 케타민(ketamine)으로 마취한 후, 2% 아이소플루란(isoflurane)으로 마취를 유지하며 수술을 진행한다. 개복하여 자궁을 꺼내고 고정시킨후, 난소를 쌓고 있는 버사의 슬릿을 통해 난관개시부에 플러싱 니들(flushing needle)을 장착한다. 난관접합부에 인접한 난관에 혈관내튜브카테터(IV cartheter)를 삽입하고 플러싱 배지를 사용해 성숙된 난자를 회수한다.
4. 체세포 복제견 생산
회수된 성숙난자를 실험실로 가능한 빨리 이동하여 체세포 복제를 실시한다. 먼저 난자 주위의 난구세포를 0.1% hyaluronidase를 이용하여 제거한다. 각각의 난자들을 홀딩 마이크로피펫 (내경 150 m)으로 고정하고, 5% (v/v) FBS 및 5 ug/mL 비즈벤지미드 (bisbenzimide Hoechst 33342)와 5 ug/mL 사이토칼라신 B가 보충된 Hepes-buffered TCM-199 배지 내에서 미세조작기 (Nikon-Narishige, Tokyo, Japan)로 탈핵한다. 탈핵된 난자는 5% (v/v) FBS가 보충된 TCM-199에 세척 후, 난자의 위란강 공간 (perivitelline space)으로 contact inhibition 또는 48시간 동안 30μM acteoside 처리된 세포을 주입한다. 상기 결합체 (couplets)를 0.26 M 만니톨, 0.1 mM MgSO4, 0.5 mM Hepes 및 0.05% (w/v) BSA를 포함하는 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 70-73 voltage로 15μs씩 2번 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시킨다. 재구성된 개 수정란의 화학적 활성은 39℃의 10 uM 칼슘 아이노포어 (calcium ionophore)를 포함하는 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 4분 배양함으로써 복제수정란의 활성화를 유도한다. 그 후, 복제된 수정란을 세척한 후 1.9 mM 6-디메틸아미노푸린 (dimethylaminopurine)이 보충된 PZM-3 내에서 4시간 동안 추가로 배양한다.
핵이식 마지막 과정이 끝난 후 4시간 이내에, 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식한다. 수술적 이식을 위하여, 호흡마취 하에서 3.5F Tom cat catheter를 사용하여 대리모의 난관 팽대부에 이식한다. 이식 후 22일에 7.0 MHZ막대형 프로브가 부착된 SONOACE 9900 초음파 스캐너를 사용하여 임신을 관찰한다. 임신 최초 확인 후 매 2주 간격으로 초음파로 모니터링한다.
5. 복제견 확인
복제개의 탯줄, 난자제공견과 대리모의 피, 공여세포에서 genomic DNA를 추출하였다. Genotyping을 위해 총 7개 (FH2054, FH2010, FH2079, PEZ12, PEZ01, PEZ03, PEZ08)의 microsatellite markers를 사용하였고 마이토콘드리아 DNA의 sequencing을 위해 cytochrome b, 16S rRNA, D-loop region의 primers를 제작하여 수행하였다.
B. 실시 결과
1. Flow cytometry를 통한 세포 주기 분석, 활성산소종 (ROS) 분석, 세포 사멸 (apoptosis) 분석
상기한 세포 배양 배지 처리 과정의 세 그룹의 세포를 아래와 같은 방법으로 Flow cytometry를 통한 세포 주기 분석, 활성산소종 (ROS) 분석, 세포 사멸 (apoptosis) 분석하였다.
(1) Flow cytometry를 통한 세포 주기 분석
세포 주기 분석을 위하여, 상기한 세포 배양 배지 처리 과정의 세 그룹의 세포를 0.25% 트립신-EDTA을 사용하여 1분간 트립신 처리하여 회수하고, 원심분리를 통해 PBS로 3번 세척한다. 마지막 세척 후, 상층액은 버리고 세포에 0.3ml PBS를 넣어 부유시키고, 0.7mL 차가운 무수 알코올을 천천히 떨어뜨린다. 살살 볼텍싱한 후, 4℃에서 하루 밤 보관하여 세포를 고정시키고, 차가운 PBS로 2번 세척한다. 0.25mL PBS에 10mg/mL RNase를 5μl 첨가하여 세포를 부유시키고, 1시간동안 37℃의 인큐베이터에 넣는다. 그 후, 1mg/mL propidium iodide를 10μL를 첨가하여 FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)을 이용하여 세포 주기를 분석한다. 세포의 DNA 양에 따라 G0/G1(2n), S(2n-4n), G2/M(4n) 주기로 세포를 정량화하였다.
(1) Flow cytometry를 통한 활성산소종 (ROS) 분석
세포 내의 활성산소종은 Image-iTTM Live Green Reactive Oxygen Species Detection Kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 이용하여 평가하였다. 먼저, 세포 배양액을 제거한 후 PBS로 세척하고, 100μM tert-butyl hydroperoxide (TBHP) working 배지 2ml을 넣어 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. TBHP working 배지 제거하고, 따뜻한 Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS; Gibco)을 이용하여 3번 세척한다. 세척 후, 25 μM 5-(and-6)-carboxy-2,7dichlorodihydrofluorescein diacetate (carboxy-H2DCFDA) working 배지 넣고 37℃에서 30분 동안 빛에 노출 되지 않게 하여 인큐베이션한다. PBS로 3번 세척 후, 트립신을 이용하여 세포를 회수하고, PBS로 부유시켜 FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 세포 내 활성산소종을 분석하였다.
(3) Flow cytometry를 통한 세포 사멸 (apoptosis) 분석
Vybrant ® Apoptosis Assay Kit #2 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)을 이용하여 세포 사멸을 분석하였다. 트립신을 이용하여 세포를 회수한 후, 차가운 PBS로 2번 세척하고, 100μL의 1× annexin-binding buffer, 5 μL의 Alexa Fluor 488 annexin V와 1 μL의 propidium iodide (PI)을 세포에 첨가한다. 15분 동안 인큐베이션 한 후, 400μL의 1× annexin-binding buffer를 더 넣고 조심스럽게 섞어준다. FACS Calibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 이용하여 사멸된 세포와 살아있는 세포를 분석하였다.
2. 분석 결과
(1) 세포 처리 방법에 따른 세포 주기 동기화 분석
허브에서 추출된 acteoside의 적절한 농도와 처리시간을 알아보기 위해 10μM, 30μM, 50μM acteoside를 24시간, 48시간, 72시간 처리하였을 때, 30μM acteoside를 48시간 처리한 그룹이 유의차는 없지만 가장 높은 비율로 G0/G1 주기 동기화 됨을 확인하였다 (도 1).
또한 개 섬유아세포에 contact inhibition, serum starvatiom, acteoside를 처리하여 세포주기를 확인한 결과, contact inhibition 그룹과 유사하게 G0/G1 주기에 동기화 됨을 확인하였다 (도 2).
(2) 세포 처리 방법에 따른 활성산소종과 세포 사멸 분석
Contact inhibition, serum starvation, acteoside 처리한 세포를 이용하여 세포 내 활성산소종과 세포사멸을 분석하였다. 활성산소종 결과에서 피크가 오른쪽으로 이동될수록 세포 내 활성산소종이 많다는 것을 의미한다 (도 3).
contact inhibition에 비해 acteoside 처리한 세포는 그래프 피크가 왼쪽에 위치하여 세포 내 활성산소종이 contact inhibition이 적다는 것을 확인하였다. 또한 serum starvation 그룹은 그래프의 피크가 오른쪽으로 심하게 위치하는 것으로 보아 세포 내 활성산소종이 많다는 것을 의미한다.
또한 세 그룹 간의 세포 사멸을 비교 분석 한 결과, acteoside 처리한 세포가 다른 두 그룹의 세포보다 세포 사멸과 세포 괴사가 유의차 있게 감소하고 많은 세포가 살아있음을 확인하였다 (도 3b, 도 3c).
(3) 세포 처리에 따른 배발달율 비교
세포에 contact inhibition과 acteoside 처리하여 체세포 복제를 하여 배발달을 비교하였다(도 4).
Serum starvation 처리한 세포는 세포 사멸과 괴사가 많아서 이 실험에서는 배제하였다. Contact inhibition 처리와 acteoside를 처리한 세포를 복제에 이용한 결과 acteoside 그룹에서 난자-세포 융합율과 배발달율이 향상됨을 확인하였다. 특히 acteoside 그룹에서 16세포기까지 발달함을 확인하였다.
(4) 형질전환 복제개의 생산 및 확인
Acteoside 처리한 세포를 이용하여, 3마리의 대리모에 38개의 복제수정란을 이식하였다. 1마리의 대리모가 임신하였으며, 1마리의 복제견이 생산되었다 (도 5, 도 5b, 도 5c).
복제개 임을 증명하기 위해 복제개의 탯줄, 난자제공견의 피, 대리모의 피, 공여세포에서 genomic DNA를 추출하여 miceosatellite분석과 마이토콘드리아 DNA의 시퀀싱을 수행하였다. 복제개와 공여세포의 microsatellite 패턴이 모든 locus들에서 일치하지만, 난자제공견과 대리모와는 서로 다른 패턴을 확인하였다(도 6).
또한, 마이토콘드리아 DNA 분석에서는 복제개와 난자제공견이 일치하였으며, 공여세포과 대리모와는 다르다는 것을 확인하였다 (도 7). 이는 복제개가 체세포 복제를 통해 복제된 개라는 결론을 내릴 수 있다.
본 발명은 상기한 바와 같은 기능과 작용 및 효과가 있는 복제 개 생산방법 및 그에 따른 복제개를 제공한다.
본 발명은 개과 동물의 생산, 제조, 복제, 연구, 유통하는 산업 및 이와 관련된 생명공학 산업에 매우 유용하다.
Claims (2)
- 개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정),
상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정),
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정(3과정),
체세포 복제견을 생산하는 과정을 수행하되(4과정),
상기 수핵난자의 난자 주위의 난구세포를 제거하는 과정(4-1과정),
상기 수핵난자들을 탈핵하는 과정(4-2과정),
상기 탈핵된 난자에 상기의 세포 배양 배지 처리된 공여세포를 주입하는 과정(4-3과정),
상기의 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정(4-4과정)을 수행하되,
상기의 4-4과정은 공여세포가 주입된 결합체 (couplets)를 0.23~0.3 M 만니톨, 0.05~0.15 mM MgSO4, 0.3~0.7 mM Hepes 및 0.03~0.1% (w/v) BSA를 포함하는 융합 배지에 침전시키고, 바늘 형의 전극을 사용하여 70-73 voltage로 10~20 μs씩 1~3번 전기 자극을 주어 난자 세포질과 세포를 융합시키는 과정으로 수행하며,
상기 융합된 수정란을 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 배양함으로써 활성화를 유도하는 과정(4-5과정)을 수행하되,
상기 4-5과정은 35~42℃의 7~13 uM 칼슘 아이노포어 (calcium ionophore)를 포함하는 돼지접합체배지 (PZM-3)에서 3~8분 배양함으로써 복제수정란의 활성화를 유도하는 과정으로 수행하고,
상기 복제된 수정란을 세척한 후 PZM-3 내에서 추가로 배양하는 과정(4-6과정)을 수행하되,
상기 4-6과정은 복제된 수정란을 세척한 후 1.7~2.3 mM 6-디메틸아미노푸린 (dimethylaminopurine)이 보충된 PZM-3 내에서 추가로 배양하는 과정으로 수행하고,
상기 배양된 체세포 복제란을 발정주기가 일치하는 대리모의 난관으로 수술적 방법으로 이용해 이식하는 과정(4-7과정)을 포함하되,
상기 공여세포에 대한 세포 배양 배지 처리하는 과정(2과정)은 5~15%(v/v) FBS, 0.5~1.5% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 세포 배양하다가 acteoside를 배양 배지에 첨가하여 배양하는 과정으로 수행하고,
개과 동물의 수핵난자의 준비 과정(3과정)은,
1~5년령의 발정견으로부터 수술적인 방법으로 성숙된 난자를 회수하는 과정을 수행하되,
발정이 관찰된 날로부터 매일 채혈하여 혈청 프로게스테론을 측정하고,
상기 측정된 프로게스테론 농도가 4ng/ml 이상되는 날을 배란일로 잡고 그 후 72시간 후에 외과적 수술을 통하여 체내에서 성숙된 수핵 난자를 회수하는 과정으로 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법.
- 제1항에 있어서,
개과 동물로부터 공여세포를 분리배양하는 과정(1과정)은,
인공수정 또는 자연교미한 개의 태아를 임신 28일령에 제왕절개 방법으로 회수하는 과정(1-1과정),
상기 회수된 태아는 실험실로 운반하여 머리와 사지를 제거하고 몸통만 PBS (Phosphate buffered saline)로 1~ 5회 세척하는 과정(1-2과정),
상기 세척 후 남아있는 조직은 잘게 자르고 35~42℃, 3~7% CO2 및 93~97% 공기의 가습 조건으로 10~20% (v/v) FBS (invitrogen), 0.5~1.5% penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM에서 배양 접시에서 배양하는 과정(1-3과정),
상기 배양접시에 붙지 않은 조직은 제거하고 부착된 세포들을 컨플루언시(confluency)까지 배양하는 과정(1-4과정),
상기 배양된 세포를 0.1~0.3% 트립신-EDTA을 사용하여 수(數) 분간 트립신 처리하고 다수의 세포를 5~15% DMSO를 첨가한 FBS를 사용하여 액체 질소 내에서 동결 저장하는 과정(1-5과정),
을 포함하는 것을 특징으로 하는 복제개 생산 방법.
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