CN111718962A - 利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 - Google Patents
利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111718962A CN111718962A CN202010827935.2A CN202010827935A CN111718962A CN 111718962 A CN111718962 A CN 111718962A CN 202010827935 A CN202010827935 A CN 202010827935A CN 111718962 A CN111718962 A CN 111718962A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cells
- somatic
- cloned
- cats
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 title claims abstract description 95
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 46
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010370 cell cloning Methods 0.000 title description 4
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 75
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 230000012173 estrus Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 60
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 49
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims description 37
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 28
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 claims description 11
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 claims description 11
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 claims description 10
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000001771 cumulus cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000007159 enucleation Effects 0.000 claims description 7
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 claims description 7
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims description 6
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 claims 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 abstract description 13
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 abstract description 13
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 abstract description 11
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 abstract description 11
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 abstract description 6
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 abstract description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 abstract description 2
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 abstract description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 6
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 240000002234 Allium sativum Species 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 235000004611 garlic Nutrition 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 4
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 108010054624 red fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 3
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 2
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 210000003815 abdominal wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004340 zona pellucida Anatomy 0.000 description 2
- 241000879810 Felis silvestris lybica Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- ZFXVRMSLJDYJCH-UHFFFAOYSA-N calcium magnesium Chemical compound [Mg].[Ca] ZFXVRMSLJDYJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 230000030944 contact inhibition Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010449 nuclear transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000009806 oophorectomy Methods 0.000 description 1
- 208000025661 ovarian cyst Diseases 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 244000062645 predators Species 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000007790 scraping Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/873—Techniques for producing new embryos, e.g. nuclear transfer, manipulation of totipotent cells or production of chimeric embryos
- C12N15/877—Techniques for producing new mammalian cloned embryos
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及体细胞克隆猫的方法，其中利用马绒毛膜促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)，经物理刺激实现家猫的同期发情并超数排卵，通过冲卵(单侧输卵管冲卵或者双侧输卵管冲卵)获得了体内成熟的家猫卵母细胞。
Description
技术领域
本发明涉及利用体细胞克隆的方法。尤其是，本发明涉及体细胞克隆猫的方法。
背景技术
动物克隆技术是将细胞通过核移植，转移至受体卵母细胞内，生产与供体细胞具有相同DNA序列信息的动物个体。该技术的最大特点是，所出生的克隆动物具有与供体细胞完全一致的遗传信息。因此采用克隆技术可以复制动物，并且体细胞克隆技术可应用于转基因动物生产、优良家畜扩繁、濒危动物资源保存、进行治疗性克隆等。
首例体细胞克隆猫于2002年获得成功，由美国科学家Taeyoung Shin的科研团队完成，Shin等首次以供体母猫的卵丘细胞为核供体，成功获得存活后代。随后Gómez等利用非洲野猫作为供体细胞供体进行克隆，成功获得2只存活克隆幼猫，这是利用这一技术生产的首批野生食肉动物。2005年韩国科学家对比了猫胎儿成纤维细胞和成猫皮肤成纤维细胞作为供体细胞进行核移植后的胚胎发育能力，结果表明成体细胞可用于猫科动物的克隆。随后在2008年，Yin等利用克隆猫的皮肤细胞用于SNCT产生了第二代克隆猫，证实克隆猫可以作为供体猫来产生第二代克隆猫。Yin等还利用转导红色荧光蛋白(RFP)基因逆转录病毒载体的体细胞作为供体细胞用于SNCT，并成功获得表达RFP的克隆转基因猫，证实了利用遗传修饰的体细胞同样可以用于克隆猫。这些研究均为濒危猫科动物的保护提供了技术支持。
然而，上述的克隆技术均需要通过绝育手术或者诱导发情-摘除卵巢获得猫卵巢，利用切割卵巢的方法获得卵母细胞-卵丘细胞复合体，体外培养获得猫成熟的卵母细胞；或者体外培养从绝育的猫卵巢获得的卵母细胞；经体细胞核移植技术制备克隆猫重构胚胎；将胚胎移植到发情同期的代孕母猫输卵管内，代孕母猫分娩获得克隆猫。
因此，为了获得猫成熟的卵母细胞，均需要摘除猫的卵巢，然后通过切割卵巢获得卵母细胞-卵丘细胞复合体，通过体外培养获得成熟的卵母细胞，无法直接得到成熟的卵母细胞；而且现有体细胞克隆猫的方法需要的实验猫数量多，成本高，无法实现产业化的应用。
而且，现有技术中卵母细胞的体外成熟率比较低，体外成熟卵母细胞质量低于体内成熟卵母细胞，克隆效率低。
发明内容
本发明对体外成熟系统进行了优化，使成熟的卵母细胞质量更高，成熟率更高。具体而言，本发明利用马绒毛膜促性腺激素(PMSG)联合人绒毛膜促性腺激素(HCG)，经物理刺激实现家猫的同期发情并超数排卵，通过冲卵(单侧输卵管冲卵或者双侧输卵管冲卵)获得了体内成熟的家猫卵母细胞，本发明的方法超排效果好，得卵率(成熟卵母细胞)高，卵质量好，克隆效率高。
第一方面，本发明提供了体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于，去核卵母细胞获自受体母猫异体或自体只单侧冲卵的受体母猫冲卵那侧的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
优选地，在所述步骤(1)中，体细胞可以是来自各种组织和器官，例如皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢等的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于：皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。
优选地，在步骤(2)中，用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵，然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞，再进行成熟卵母细胞的去核处理。
优选地，所述PMSG的用量为100-600单位(IU)，所述HCG的用量为100-300单位(IU)。
优选地，在步骤(3)中，所述融合方法可以是用仙台病毒进行融合。
优选地，在步骤(3)，所述融合方法可以是电融合。电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
优选地，在步骤(3)中，所述融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合，所述电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
第二方面，本发明提供了体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于，去核卵母细胞获自绝育猫的卵巢，经体外成熟获得成熟的卵母细胞，然后进行去核处理；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
优选地，在所述步骤(1)中，体细胞可以是来自各种组织和器官，例如皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢等的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于：皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。
优选地，在步骤(3)中，融合方法可以是用仙台病毒进行融合。
优选地，在步骤(3)，融合方法可以是电融合。电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
优选地，在步骤(3)中，融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合，所述电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
具体而言，从动物医院收集健康绝育母猫的卵巢，置于含37℃添加青链霉素的生理盐水的保温杯中，在4h内尽快运回实验室。用无菌生理盐水清洗3次，然后用眼科剪和镊子小心分离卵巢周围的脂肪组织，剥离卵巢，并对卵巢状态进行评价，挑选肉眼可见明显卵泡的卵巢纳入试验。将卵巢放入含10％FBS的M199中，用无菌刀片进行切割，尽量释放卵母细胞。在显微镜下收集包裹2层以上，胞质均一的卵丘卵母细胞复合体(COCs)进行体外成熟培养。培养基为SOF+3mg/ml BSA+1-5IU/mlHCG+0.5-1IU/ml PMSG+20ng/mlEGF，每次使用前需在培养箱中预热2h。培养采取微滴培养的方式，每100μL做一个微滴，每滴不超过20个COCs。培养24h后放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，在37℃热台上，利用口径COCs相近的胚胎吸管移液枪反反复吸吐，将卵丘细胞移除。在显微镜下挑选排出极体的卵母细胞用作体细胞核移植。
第三方面，本发明提供了体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于：一部分去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母猫冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自进行了冲卵的供体母猫的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
优选地，在所述步骤(1)中，体细胞可以是来自各种组织和器官，例如皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢等的细胞。可用于本发明方法的体细胞的例子包括但并不限于：皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞、成骨细胞等。
优选地，在步骤(2)中，用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵，然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞，再进行成熟卵母细胞的去核处理。
优选地，所述PMSG的用量为100-600单位(IU)，所述HCG的用量为100-300单位(IU)。
优选地，在步骤(3)中，融合方法可以是用仙台病毒进行融合。
优选地，在步骤(3)，融合方法可以是电融合。电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
优选地，在步骤(3)中，融合方法可以是仙台病毒融合结合电融合，所述电融合的电压范围为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
可以看出，本发明的体细胞克隆猫的方法的步骤(2)卵母细胞的获取方式有两种，形式更丰富，更容易产业化。其中用PMSG和HCG处理母猫/输卵管冲卵的方法获得成熟的卵母细胞，一方面卵母细胞的质量更高(体内成熟卵母细胞质量比体外成熟卵母质量高)；另一方面可以不用摘除家猫卵巢，减少实验猫的数量。
因此，可以看出，本发明的胚胎移植方案可以采用自体、异体、自体/异体相结合3种方式，实现手段更多，减少了发情母猫的需求数量。并且自体移植受体母猫怀孕率更高，降低了生产成本。
而且，本发明的方法中的采卵过程无需摘除猫的卵巢，实现了周期化采卵，减少了实验猫的数量，实现按计划生产的目的。
在猫去核卵母细胞和猫供体细胞融合过程中使用了仙台病毒，提高了融合效率。
缩略语和关键术语定义：
克隆：采用相应的技术手段，生产与供核细胞具有相同DNA序列的动物个体。
NT：体细胞核移植，将犬成体细胞移植入去核的犬卵母细胞中构建克隆胚胎的方法。
DC：供核细胞，包含有完整的遗传物质的细胞，将其移植入受体卵母细胞内用于制备体细胞克隆动物。
AET：自体胚胎移植，发情母犬冲出M II卵母细胞进行体细胞核移植后，再以冲卵母犬作为克隆胚胎移植的受体，制备体细胞克隆犬。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书对本发明的技术方案做进一步描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的保护范围。
实施例1：
1.体细胞的分离培养
体细胞克隆所用体细胞的供体猫为英国短毛猫(“大蒜”)。首先用刮毛刀刮掉要采集皮肤部位周围的毛，利用75％酒精消毒，用高温灭菌后的剪刀剪取猫的皮肤组织约5mm2，然后置入含有100IU/ml的青霉素+100IU/ml链霉素的DMEM基础培养基中，低温运输尽快带回实验室。
组织块首先利用75％酒精消毒漂洗10秒；再用DMEM清洗5次，用眼科剪小心去除脂肪，露出真皮层。将皮肤组织转到另一个无菌培养皿中，利用眼科剪尽量剪碎组织块。用移液枪将组织块移至培养皿的皿底，用枪头将其铺均匀，然后将培养瓶翻转，加入含有20％FBS及5倍青链霉素的DMEM培养液，放入环境为38℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。6小时后翻瓶，使培养基完全浸没组织块后继续培养，每48小时更换培养液一次，10-14天冻存细胞。
2.体内成熟获得成熟的卵母细胞
经超数排卵的母猫，每组实验选5只猫同步肌肉注射PMSG200-500单位，96h后注射100-300IU HCG后人工刺激排卵，40-48h进行手术冲卵。暴露卵巢及子宫的宫管结合部，将带有圆形前端的金属注射针从卵巢囊的裂口处插入输卵管伞部；在宫管结合部输卵管处将插入注射针，用含有10％的FBS的TCM199培养基冲洗输卵管，将长度为3cm的塑料管穿刺入子宫内部，然后使用冲卵液从宫管结合部冲洗卵母细胞。供体猫则进行双侧输卵管冲卵，获得的卵母细胞用于体细胞核移植，受体猫不进行冲卵或单侧冲卵。将冲卵液置于显微镜下，捡出卵母细胞，放入含有0.1％透明质酸酶的DPBS溶液中，操作在37℃热台上进行，利用口径COCs相近的胚胎吸管反复吸吐，将卵丘细胞移除。在显微镜下挑选排出极体的卵母细胞用作体细胞核移植。
3.卵母细胞去核
挑选成熟的卵母细胞在HCR+CB(5μg/mL)中处理5min，HCR+CB+H33342中染色5min,HCR+CB中去核，去核后将针中取得的物质在紫外灯下照射以确定去核率。去核后的卵在SOF中恢复半小时。
4.供体细胞准备
供体细胞的准备：细胞在核移植前经过2天的接触抑制或者血清饥饿处理，使用时先把准备好的细胞在高倍显微镜下观察细胞的生长状态和密度，选好要的一孔进行消化。用1ml无钙镁的PBS把细胞洗一遍，使孔内没有血清了，减少对胰酶的中和，然后加入新配的0.25％的胰酶200ul左右，放入培养箱中定时2分钟，然后马上用1ml含血清的DMEM终止消化，用枪头吹打细胞，收集全部的细胞到15ml无菌的离心管中，1200RPM 5分钟。弃上清，加100-200ul的培养液(HCR)备用。
5.注核、融合及激活
使用灭活仙台病毒进行融合，将选取的供体细胞放入仙台病毒微滴中处理几秒后，立即注射到卵母细胞透明带和细胞质之间，用注射针轻轻点压透明带，使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。放入SOF微滴中培养30分钟以后，在体式显微镜下观察卵母细胞细胞质和供体细胞的融合。为了提高融合效率，接着采用0.5mm融合槽进行电融合：将重构胚用1根不沾油的捡卵针洗净油，并在融合液中平衡若干时间使复合体沉底，用枪头吸100μl融合液，放入电极槽并吹洗，再把液吸干(用此方法洗3遍)，然后放入逐个将复合体放入融合槽的平行电极之间。不同的卵用不同的电压，融合的重构胚采用的电压为约1.0KV/CM，2个脉冲，间隔60μs，进行电刺激。未融合的胚使每一个体细胞处在12点或6点的位置用电融合设备(BTX)进行电刺激，电压为1.6KV/CM，2个脉冲，间隔60μs把卵从融合槽中用捡卵针放入HCR液中，待所有卵电击完后，从HCR液中转移到SOF溶液中清洗至少三遍后，放入SOF微滴中培养30分钟以后，再在体式显微镜下将能观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合，统计融合效率。判定为融合的重构胚用含10μg/ml CHX和5μg/ml CB的胚培养液激活4h，完成激活后进行胚胎移植。
6.胚胎移植
受体猫麻醉后，选择未冲卵的一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体猫体内。
表1同期发情/超数排卵结果
表2周期化同期发情结果
表3卵母细胞体外成熟结果
| 序号 | 培养的卵的数量 | 成熟的卵的数量 | 成熟率 |
| 1 | 12 | 8 | 66.7％ |
| 2 | 11 | 8 | 72.7％ |
| 3 | 7 | 4 | 57.1％ |
| 4 | 35 | 22 | 62.9％ |
| 5 | 14 | 7 | 50％ |
| 6 | 12 | 10 | 83.3％ |
| 7 | 13 | 12 | 92.3％ |
| 合计 | 104 | 71 | 68.3％ |
表4克隆胚胎移植结果
7.克隆猫鉴定结果
为确定出生的克隆幼猫与体细胞供体猫(被克隆猫)是否具有相同的遗传信息，以及确定其与胚胎移植受体母猫的亲缘关系，采集克隆幼猫的血液、代孕母猫的血液及被克隆猫的体细胞，采用STR鉴定的方法，确定克隆幼猫与被克隆猫的同一性关系、克隆幼猫与代孕母猫之间的亲子关系。选择19个STR分别为Fe9、Fe17、Fe6、Fe5、Fe19、Fe4、Fe2、Fe13、Fe14、Fe16、Fe1、Fe12、Fe3、Fe11、Fe18、Fe8、Fe7、Fe10、AMEL。本次鉴定由北京中正司法鉴定所完成。
采用克隆幼猫(大蒜-1)的血液DNA为检材1(大蒜-1血)，代孕母猫的血液DNA(258血)为检材2，被克隆猫的体细胞DNA(大蒜细胞)为检材3，鉴定检材1与检材2之间的DNA亲子关系，鉴定检材1与检材3之间的DNA-STR分型同一性关系。
使用feline genotypes STR系统，用ABI 9700型扩增仪复合扩增STR基因座，扩增产物利用ABI 3130测序仪进行基因分型检测。
STR分型结果，不支持检材1(大蒜-1血)与检材2(258血)具有生物学亲子关系；检材1(大蒜-1血)与检材3(大蒜细胞)的STR分型相同。
表5检材1(大蒜-1血)、检材2(258血)、检材3(大蒜细胞)的STR基因座和性别基因座的基因分型结果
实施例2：
体细胞的分离培养，体内成熟获得成熟的卵母细胞，卵母细胞去核以及供体细胞准备参见实施例1。差别仅在于体细胞克隆所用体细胞的供体猫为中华田园猫“小黄”和山东师猫“BB”。
在注核、融合及激活步骤中的融合步骤进行了如下调整：
在细胞中加入1×的仙台病毒稀释液重悬细胞，1000RPM(～200g)离心5分钟，弃去上清，用3倍稀释仙台病毒重悬细胞，冰浴5分钟，将细胞悬液放入操作液中，挑选细胞进行注核，用注射针轻压透明带，使体细胞与卵母细胞膜紧密结合构建重构胚。放入SOF微滴中培养30分钟，在体式镜下观察卵母细胞细胞质和供体细胞的融合。
为了提高融合效率，接着采用0.5mm融合槽进行电融合：将重构胚用1根不沾油的捡卵针洗净油，并在融合液中平衡若干时间使复合体沉底，用枪头吸100μl融合液，放入电极槽并吹洗，再把液吸干(用此方法洗3遍)，然后放入逐个将复合体放入融合槽的平行电极之间。不同的卵用不同的电压，融合的重构胚采用的电压为约1.0KV/CM，2个脉冲，间隔60μs，进行电刺激。未融合的胚使每一个体细胞处在12点或6点的位置用电融合设备(BTX)进行电刺激，电压为1.6KV/CM，2个脉冲，间隔60μs把卵从融合槽中用捡卵针放入HCR液中，待所有卵电击完后，从HCR液中转移到SOF溶液中清洗至少三遍后，放入SOF微滴中培养30分钟以后，再在体式显微镜下将能观察卵母细胞细胞质和供核细胞的融合，统计融合效率。判定为融合的重构胚用含10μg/ml CHX和5μg/ml CB的胚培养液激活4h，完成激活后进行胚胎移植。
另外，胚胎移植步骤还进行了如下调整：
受体猫麻醉后，选择未冲卵的一侧腹壁侧切，暴露未冲卵的卵巢组织，将子宫及卵巢牵出。将克隆胚胎吸入胚胎移植管中，从输卵管伞部插入胚胎移植管，将胚胎植入受体猫体内。通过形态学观察，确认所有进行注核的卵母细胞均已去核，胚胎移植过程只移植融合胚胎，防止低质量胚胎影响克隆胚胎的着床。实施例1中没有确认卵母细胞全部去核。克隆胚胎移植结果参见下表6和表7。
表6小黄克隆胚胎移植结果
表7 BB克隆胚胎移植结果
7.克隆猫鉴定结果
为确定出生的克隆幼猫与体细胞供体猫(被克隆猫)是否具有相同的遗传信息，以及确定其与胚胎移植受体母猫的亲缘关系，采集克隆幼猫的血液、代孕母猫的血液及被克隆猫的体细胞，采用STR鉴定的方法，确定克隆幼猫与被克隆猫的同一性关系、克隆幼猫与代孕母猫之间的亲子关系。鉴定结果参见下表8和表9：
表8克隆猫小黄和克隆供体同一性比对结果
表9克隆猫BB与克隆供体同一性比对结果
实施例3
采用与实施例2相同的方法还对名称为黄枪枪，呆呆，咖啡和公猫四只猫进行了类似的体细胞克隆，连同实施例2的克隆效率汇总在下表10中：
表10克隆猫克隆效率统计
可以看出，通过优化克隆方法，将克隆猫的平均克隆效率提高到了3.8％，克隆效率最高的项目“公猫”达到了16.7％，相比于实施例1有了显著的进步。
Claims (10)
1.体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于，去核卵母细胞获自受体母猫异体或自体只单侧冲卵的受体母猫冲卵那侧的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
2.体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于，去核卵母细胞获自绝育猫的卵巢，经体外成熟获得成熟的卵母细胞，然后进行去核处理；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
3.体细胞克隆猫的方法，所述方法包括如下步骤：(1)体细胞的分离培养；(2)制备去核卵母细胞；(3)将体细胞导入去核卵母细胞的细胞质中；(4)激活克隆胚胎；(5)将步骤(4)获得的克隆胚胎移植到受体母猫；其特征在于：一部分去核卵母细胞获自只单侧冲卵的受体母猫冲卵的输卵管，另一部分去核卵母细胞获自进行了冲卵的供体母猫的输卵管；以及在上述步骤(5)中，将克隆胚胎移植到受体母猫未冲卵那侧的输卵管中。
4.根据权利要求1-3任一项的方法，其中，在所述步骤(1)中体细胞来自皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管或卵巢。
5.根据权利要求4的方法，所述体细胞为皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞或成骨细胞。
6.根据权利要求1或2的方法，其中，在步骤(2)中，用PMSG和HCG处理受体母猫后确定受体母猫的发情和排卵，然后进行单侧或双侧冲卵获得成熟的卵母细胞，再进行成熟卵母细胞的去核处理，优选地，通过形态学观察，确认所有进行注核的卵母细胞均已去核。
7.根据权利要求6的方法，所述PMSG的用量为100-600单位(IU)，所述HCG的用量为100-300单位(IU)。
8.根据根据权利要求1-3任一项的方法，其中，在步骤(3)中，所述融合方法是用仙台病毒进行融合，优选地，在细胞中加入1×的仙台病毒稀释液重悬细胞，离心，弃上清，用3倍稀释仙台病毒重悬细胞，冰浴，将细胞悬液放入操作液中，挑选细胞进行注核。
9.根据根据权利要求1-3任一项的方法，其中，在步骤(3)中，所述融合方法为电融合，所述电融合的电压为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
10.根据根据权利要求1-3任一项的方法，其中，在步骤(3)中，所述融合方法是仙台病毒融合结合电融合，所述电融合的电压为1.0-3KV/cm，优选地，电压为1.0-1.6KV/cm。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910758957 | 2019-08-16 | ||
| CN2019107589575 | 2019-08-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111718962A true CN111718962A (zh) | 2020-09-29 |
Family
ID=72574321
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010827935.2A Pending CN111718962A (zh) | 2019-08-16 | 2020-08-17 | 利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111718962A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030229909A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-12-11 | The Texas A&M University System | Cloning cats by nuclear transplantation |
| CN1500384A (zh) * | 2002-11-15 | 2004-06-02 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 一种提高哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法 |
| CN101228265A (zh) * | 2005-07-26 | 2008-07-23 | 首尔大学校产学协力财团 | 克隆的犬科动物及其生产方法 |
| KR20090060191A (ko) * | 2007-12-06 | 2009-06-11 | 경상대학교산학협력단 | 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법 |
-
2020
- 2020-08-17 CN CN202010827935.2A patent/CN111718962A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030229909A1 (en) * | 2002-02-13 | 2003-12-11 | The Texas A&M University System | Cloning cats by nuclear transplantation |
| CN1500384A (zh) * | 2002-11-15 | 2004-06-02 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 一种提高哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法 |
| CN101228265A (zh) * | 2005-07-26 | 2008-07-23 | 首尔大学校产学协力财团 | 克隆的犬科动物及其生产方法 |
| KR20090060191A (ko) * | 2007-12-06 | 2009-06-11 | 경상대학교산학협력단 | 적색 형광단백질을 발현하는 형질전환 고양이 및 그 생산방법 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| YIN等: "Production of second-generation cloned cats by somatic cell nuclear transfer", 《THERIOGENOLOGY》 * |
| 左伟勇 等: "《细胞工程技术》", 31 August 2014, 重庆：重庆大学出版社 * |
| 李云龙 等: "《动物发育生物学 修订版》", 30 September 2016, 济南：山东科学技术出版社 * |
| 李光鹏: "《动物解剖学、组织学与生殖生物学简明教程》", 31 May 2005, 呼和浩特：内蒙古大学出版社 * |
| 李光鹏等: "家猫及其他猫科动物的生殖工程研究", 《动物学研究》 * |
| 桑润滋: "《动物繁殖生物技术》", 31 July 2002, 北京：中国农业出版社 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lai et al. | Production of cloned pigs by using somatic cells as donors | |
| JP4081613B2 (ja) | 核転移用の静止状態の細胞集団 | |
| JP4102450B2 (ja) | 胎仔線維芽細胞による効率的な核移入 | |
| CN106520838A (zh) | 一种体细胞核移植重组胚注射基因新方法 | |
| US20190032086A1 (en) | Method for preparing a gene knock-out canine with somatic cell cloning technology | |
| US6590139B1 (en) | Method for producing cloned cows | |
| WO2001096533A1 (fr) | Cellules souches embryonnaires provenant d'un singe | |
| US20120142107A1 (en) | Method and system for somatic cell nuclear transfer | |
| CN111718962A (zh) | 利用体细胞克隆制备克隆猫的方法 | |
| Kazemi et al. | Royana: successful experience in cloning the sheep | |
| KR100479704B1 (ko) | 녹색 형광단백질을 발현하는 형질전환 돼지의 제조 방법 | |
| US7351876B2 (en) | Efficient nuclear transfer with primordial gametes | |
| JP2003503045A (ja) | 異種間核移植技術を用いたクローントラの生産方法 | |
| KR101939570B1 (ko) | 복제 개의 생산방법 및 그에 따른 복제 개 | |
| Wadhwa et al. | Optimization of embryo culture conditions for increasing efficiency of cloning in buffalo (Bubalus bubalis) and generation of transgenic embryos via cloning | |
| JP4119513B2 (ja) | クローン動物の作出方法 | |
| KR101943158B1 (ko) | 복제 개의 생산방법 및 그에 따른 복제 개 | |
| CN116904522A (zh) | 体细胞克隆北极狼的方法 | |
| AU747070B2 (en) | Efficient nuclear transfer using primordial germ cells | |
| Tao et al. | Production of Boer goat (Capra hircus) by nuclear transfer of cultured and cryopreserved fibroblast cells into slaughterhouse-derived oocytes | |
| Lian et al. | Application status of genome-editing tools in sheep and goats | |
| KR100868245B1 (ko) | 데메콜친 처리에 의한 효율적인 복제 동물의 생산방법 | |
| KR100502480B1 (ko) | 녹색 형광단백질을 발현하는 돼지 클론 체세포주의 제조방법 | |
| KR100723380B1 (ko) | 포유류과 조류 사이의 클래스간 핵이식 방법 | |
| CN115960958A (zh) | 一种改变猫毛色的遗传修饰方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |