CN1500384A - 一种提高哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种提高非人哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法，包括步骤：(a)将非人哺乳动物的供核细胞经饥饿处理2－5天；(b)冷冻保存供核细胞；(c)复苏；(d)在非饥饿条件下培养供核细胞2－5天：(e)将供核细胞饥饿处理1－4天；(f)将供核细胞用于核移植。该方法不仅能提高胚胎发育率，还解决了核移植试验中带有定点整合的供核细胞使用与长期保存，以及长期培养对染色体变异等产生的影响。

Description

一种提高哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法

技术领域

本发明涉及转基因动物技术、胚胎工程与发育生物学领域，更具体地，涉及一种提高哺乳动物核移植(NT)胚胎早期发育率的方法。

背景技术

核移植(Nuclear transfer，NT)是研究核质互作关系中诸多重要问题的最有效方法。应用不同分化程度的细胞核移入去核卵母细胞的方法，已经在两栖类动物获得发育完全的个体。在最近的二十年期间，核移植方法在哺乳动物中发展神速，并已开始应用于生产。

大量结果表明，在同种动物之间，把中II期卵母细胞/受精卵作为受体细胞(供质细胞)，把不同分化程度的细胞作为供核细胞，两者所组成的重构胚在移入寄母生殖道后，在牛、羊、猪、兔、猴、小鼠等多种动物中均已获得相应的核移植后代；甚至把经过修饰的体细胞作供核细胞，采用类似的径路，也相应获得转基因的核移植牛、绵羊、山羊、猪、兔等。

但至今为止，获得克隆动物的成功仍然较低，一般为1-3％，其原因很多，如重排序、印迹等使NT胚胎的着床前、后的发育受到影响。其中，在体细胞克隆动物制备过程中所使用的供核细胞需经体外的长期培养，尤其是经过基因遗传修饰(如随机整合或定点打靶)的单克隆体细胞，随着代次的增加，其染色体的变异等可能是影响NT的重排序及着床后发育的一个重要因素。因此，研究人员将体外培养的细胞(未饥饿)冷冻保存于液氮中，使用前再复苏，培养数天后再使用，或将体外培养的细胞(饥饿)冷冻保存于液氮中，复苏后直接用于核移植试验，但以上的研究表明，NT胚胎的着床前发育率一般仍较低。

因此，本领域迫切需要开发新的提高哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种提高核移植胚胎早期发育率的方法。该方法不仅提高了核移植胚胎早期发育率，而且解决了核移植试验中供核细胞的使用与长期保存，以及长期培养对染色体变异等产生的影响，也解决了冻存细胞复苏直接用于试验造成NT胚胎早期发育率低的缺点。

在本发明的第一方面，提供了一种提高非人哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法，包括步骤：

(a)将非人哺乳动物的供核细胞经饥饿处理2-5天；

(b)冷冻保存步骤(a)的供核细胞；

(c)复苏步骤(b)的供核细胞；

(d)在非饥饿条件下培养步骤(c)的供核细胞2-5天：

(e)将步骤(d)的供核细胞饥饿处理1-4天；

(f)将步骤(e)的供核细胞用于核移植。

在一优选例中，所述的饥饿处理条件为：含0.1-1％FCS的DMEM培养液。

在另一优选例中，所述的非饥饿条件为：含10-20％FCS的DMEM培养液。

在另一优选例中，所述的非人哺乳动物选自下组：牛、羊、猪、狗、猫、兔、猴、小鼠。

在另一优选例中，所述的供核细胞包括来自哺乳动物的组织、器官的细胞、体外培养的体细胞、及遗传修饰过的体细胞。

在另一优选例中，所述的步骤(f)包括：将步骤(e)的供核细胞用作供核细胞，移入去除遗传物质的哺乳动物的中II期卵母细胞的卵周隙内，经电融合、化学激活后，将NT胚胎经琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内或在体外培养、获得早期发育的NT胚胎。较佳地，所述的电融合条件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO₄，在140-160V/mm，80μs条件下3次电刺激；然后，融合卵在以下条件下化学方法激活：10μM伊屋诺霉素5分钟+2μM 6-DMAP 3-6小时。

在本发明的第二方面，提供了一种处理供核细胞的方法，包括步骤：

(a)将供核细胞经饥饿处理2-5天；

(b)冷冻保存步骤(a)的供核细胞；

(c)复苏步骤(b)的供核细胞；

(d)在非饥饿条件下培养步骤(c)的供核细胞2-5天：

(e)将步骤(d)的供核细胞饥饿处理1-4天，获得供核细胞。

在本发明的一优选例中，所述的供核细胞是非人哺乳动物的细胞。

附图说明

图1显示了本发明方法的技术路线图。

图2贴壁生长的(A)与悬浮的(B)经基因打靶的单克隆山羊胎儿成纤维细胞。

图3包理在琼脂内的发育的NT胚胎。箭头所指为囊胚。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，发现通过在冷冻保存前对供核细胞进行饥饿处理，并且在复苏后再次进行饥饿处理，可以大幅提高核移植胚胎早期发育率。在此基础上完成了本发明。

简而言之，本发明方法包括步骤：将哺乳动物的供核细胞经饥饿处理2-5天后，再冷冻保存，使用前复苏，在非饥饿培养液中培养2-5天，再饥饿1-3天的细胞用作供核细胞，移入去除遗传物质的哺乳动物的中II期卵母细胞的卵周隙内，经电融合、化学激活后，将NT胚胎经琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内或在体外培养、获得较高的早期发育的NT胚胎。

本发明的核心步骤是对供核细胞的处理(包括哺乳动物体细胞的培养)，它包括：

(i)首先，提供所需的哺乳动物细胞。

根据所需克隆动物的种类和要求，用常规方法选择组织或器官建立细胞系。一种常用的方法为：将组织、器官或末分化细胞用胰酶消化成单个细胞，用DMEM或RM1640等培养液(加10-20％胎牛血清，FCS)培养，传代，遗传分析，或进行遗传修饰。

(ii)接着，将以上所有类型的供核细胞，进行饥饿处理。

饥饿处理的条件指血清浓度低于1％的培养条件，例如含0.1-1％或0.25-0.75％小牛血清(FCS)的DMEM液。饥饿处理时间通常为2-5天，较佳地为2-4天；然后，冷冻保存供核细胞。一种优选的技术方案是在含0.5％FCS的培养液中，饥饿处理2-5天后。

冷冻保存可保存于-80℃冰箱中(短期)或在液氮中(长期)。例如，在冷冻液(含20％DMSO、80％FCS液)冷冻保存于-80℃冰箱中，每支冻存管含1000-5000个细胞。

(iii)然后，复苏冷冻保存的供核细胞，并在非饥饿条件下培养供核细胞。

复苏采用常规方法，而非饥饿条件就是常规的培养条件，通常是血清浓度大于5％(如10-20％FCS)的培养条件。特别优选的例子是含10％、15％或20％FCS的DMEM培养液。非饥饿条件下的培养时间通常为1-6天，较佳地为2-5天，具体时间根据细胞生长的丰度而定，最佳的丰度为75％左右。

一种优选的技术方案是在核移植试验前，将该细胞在37℃水浴中解冻，然后去除冷冻液，加入含10-20％的FCS的DMEM液，培养2-5天。

(iv)再次饥饿处理，获得用于核移植试验的供核细胞。

再次饥饿处理的条件基本上与冷冻前的饥饿处理条件相同，即含0.1-1％(如0.5％)小牛血清(FCS)的DMEM液中培养。饥饿处理时间通常为1-4天，较佳地为1-3天。

一种优选方法是是在含0.5％FCS的培养液中培养2天，再饥饿1-4天，用胰蛋白酶消化成悬浮的细胞，即得到用于核移植试验的供核细胞。

除了对供核细胞的进行至少两次饥饿处理(即在冷冻保存前的饥饿处理和在冷冻复苏后的饥饿处理)之外，制备转基因动物的其他技术与现有技术没有区别。因此，本领域常规的各种制备转基因动物的技术都可用于本发明。

为了人们更清楚地了解本发明，以下对包括制备卵母细胞、核转移等相关技术也作一描述。

一、供质(提供卵母细胞)母畜超数排卵技术(或应用体外成熟卵母细胞)：

超数排卵是指采用制剂诱导动物一次排出正常排卵数若干倍的方法。通过激素[孕马血清促性激素(PMSG)；促卵泡激素(FSH)、促卵泡激素释放因子(LRH)]处理，使母畜呈非季节性排卵，并且在一次排卵中，能排出较多的卵子。具体方法是：每只动物肌注氯前列烯醇(PG)0.06-0.1mg/次，间隔10-14天后注射第二次，在第二次注射PG 10-14天后开始超排，即首先肌肉注射FSH，用量按7-12IU/Kg计(不同种动物用量不尽相同)，分6次，2次/日，每次间隔8-12小时。间隔24小时发情时注射LRH，25ug/次，注射LRH后_28-30小时回收卵母细胞。

二、临时寄母的激素处理(与NT胚胎发育同步)：

为与提供卵母细胞胞质的供质母羊同步，临时寄母间隔10-14天分两次肌肉注射PG，在供质母羊超排注射PG前12小时，受体也同时注射PG，受体注射LRH的时间及剂量同供体。

三、卵母细胞的收集

提供卵母细胞的母畜在注射LRH后26-30小时，进行卵母细胞的收集。收集是通过手术的方法，在母畜的腹部作一切口，将母畜的输卵管与卵巢暴露在体外，用冲卵液(F10+5％FCS)从输卵管中冲出卵母细胞，将收集的卵母细胞培养在M16液中。

四、卵母细胞去核与移核

将卵母细胞移入含CB的M2手术液中20分钟后，将供核细胞与卵母细胞一同置于玻片上，在显微镜下，用持卵针固定卵母细胞，卵母细胞排出的极体处于钟表3点位，去核针正对着或稍偏离极体去除极体与一部分胞质。去核之后立即将1个供核细胞移入去核卵周隙内，重复下一枚卵的操作，直至所卵母细胞操作完成后，将移入供核细胞的卵母细胞置于M16液培养30min。

五、融合与NT胚胎的激活

将移入供核细胞的卵母细胞在激活液(0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO₄)中，在140-160V/mm，80μs电刺激三次，在M16液中培养30min，观察是否融合。未融合的卵再融合一次。融合的NT胚胎在M16液中培养4-6小时，再用化学方法激活(10μM离子霉素，Ionomycin5分钟+2μM 6-二甲基氨基嘌呤(6-dimethylaminopurine，6-DMAP)4-6小时)，激活后胚胎移入M16培养液中体外培养或经琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内培养。

六、重构胚体内培养

应用手术的方法，将激活后的NT胚胎用1％的低熔点琼脂糖包理后，吸入移卵管内，从输卵管喇叭口处插入将卵移进输卵管内，随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养4-7天后(不同种的动物培养的时间不同)，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。

本发明的主要优点在于：

1)显著地提高NT胚胎的早期发育率。

2)解决了供核细胞的使用与长期保存之间的矛盾，使长期培养所造成的对染色体变异等产生的影响，以及冻存细胞复苏后直接用于试验造成NT胚胎早期发育率低的缺点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1奶山羊体细胞的几种处理方式对核移植胚胎早期发育的影响

1材料与方法：

1.1.试剂

均为胚胎级试剂，除另有说明外均为Sigma产品。

1.2方法

1.2.1供质卵母细胞采集

奶山羊应用FSH按常规进行超数排卵，在注射LRH后29-30小时，采用手术回收卵母细胞，用含5％小牛血清(FCS，Gibco)的F-10(Gibco)培养液冲洗输卵管。收集卵母细胞，透明质酸酶去除附着的颗粒细胞。收集的卵母细胞置于M16液中，37.5℃，5％的二氧化碳培养箱中培养。

1.2.2供核细胞

1.2.2.1萨能奶山羊胎儿成纤维细胞

萨能奶山羊胎儿成纤维细胞按照文献[21]方法培养获得。即从怀孕35天母山羊经手术采集胎儿，去头、四肢以及内脏后，将其剪成泥状，加入胰蛋白酶(0.25％Trypsin/1mM EDTA)，37℃，消化20min，接着加入含10％FCS的DMEM培养液终止消化，500g离心15min。弃去上清，将细胞重悬于培养液内，接种至培养瓶中，置于培养箱中，37℃、5％CO₂培养。待细胞生长丰度达85％后，按常规传代培养。

1.2.2.2基因转染、筛选与单克隆细胞株的建立

将构建好的基因载体与胎儿成纤维细胞电转染，筛选、鉴定，获得定点整合的单克隆细胞株，将该细胞在含0.5％FCS培养液是饥饿处理72小时后，采用以下几种处理方式后，用于核移植试验。

1.2.2.2试验分组

试验分为三组，其中试验组I和II为对照，试验组II为本发明方法。

(a)试验组I：将经基因打靶的单克隆细胞，饥饿72h后，一部分细胞冻存于-80℃冰箱，试验前1小时复苏，即用于试验；

(b)试验组II：另一部分细胞消化传代，在含10％FCS的DMEM液，继续培养2天后，再饥饿48h，丰度在70-85％时用于试验；

(c)试验组III：第三部分细胞饥饿72h后，冻存于-80℃冰箱，使用前四天复苏，培养2-5天，再饥饿48小时，丰度在70-85％时用于试验。

除供核细胞的处理有差异外，其余操作均一致。

1.2.3重构卵的构建及其激活

1.2.3.1重构卵的构建：

卵母细胞在M16-Hepes(含Hepes 2.8mg/ml，CB 7.5μg/ml)液中洗涤3次，在M16-Hepes中处理10min；同时将培养的细胞用胰酶消化、分散成单个细胞后立即加入小牛血清以终止消化，经500g离心2min后，去除上清，加入20μlM16-Hepes液。将卵母细胞与供核体细胞同时移入M16-Hepes中，在显微镜下将卵母细胞核去除后随即将供核细胞移入卵周隙。去、移核方法按照Wilmut I，Schnieke AE，McWhir J，Kind AJ，Campbell KHS.Viable offspring derived fromfetal and adult mammalian cells.Nature 1997；385：810-813中所述的方法。

移入供核细胞的卵在M16培养液中洗涤3次，置于M16液中，37℃培养30min后，进行电融合(0.3mM甘露醇、0.05mM CaCl₂、0.1mM MgSO₄、5％BSA)，融合条件为DC、140-160V/mm，脉冲持续时间为80μs，连续刺激三次。刺激后的卵置于M16培养液中培养20-30min观察是否融合，融合卵为重构卵；未融合的重复一次。

1.2.3.2重构卵的激活

重构卵在M16液中，37℃、5％CO₂培养箱中培养5小时后，用含5μM离子霉素、7.5μg/ml细胞松弛素B(CB)、不含Ca²⁺、Mg²⁺的M16-Hepes液处理5min，再在2mM 6-二甲基氨基嘌呤(6-diethylaminopurine，6-DMAP)、7.5μg/mlCB、不含Ca²⁺、Mg²⁺的M16-Hepes培养液中培养4-5小时。激活后的重构胚置于M16培养液中作短暂培养。

1.2.4重构胚的体内培养与发育的观察

应用手术的方法，将激活后的NT胚胎用1％的低熔点琼脂糖包理后，吸入移卵管内，从输卵管喇叭口处插入将卵移进输卵管内，随后在输卵管与子宫连接部用缝线结扎。在体内培养4-7天后，剪下输卵管，用培养液冲出胚胎，观察胚胎发育情况。

2.结果：

2.1概况：

本次试验供投入羊数105头，其中供质羊数84头，寄母羊21头；平均每只供体羊经超数排卵后获9.3(785/84)枚，将卵细胞去核后再移入供核细胞，其移核率为92.3％(724/785)；移核卵经电刺激后融合率为78.67％(426/541)；将融合卵经琼脂包埋后移入寄母输卵管内培养6天再回收，其回收率为86.69％(469/541)；回收卵发育至桑椹与囊胚期的比率为56.29％(264/469)；将发育的桑椹与囊胚期胚胎移入受体羊的子宫内，共移124头植受体，至35日龄时，受体羊的妊娠率为38.7％。详见表1。

     表1、定点整合体细胞克隆试验结果

投入羊数(供质、寄母、受体)	84+21+124
		移核卵(％)	92.23
融合率(％)	78.67
		包埋后回收率	86.69
重构卵卵裂率	78.68
		重构卵发育桑椹囊胚率	56.29
异常分裂率	43.71

2.2供核细胞的几种处理方式对NT胚胎的早期发育的影响：

在试验组III中，应用经饥饿处理72小时，冷冻保存后，使用前复苏，培养2-5天后，再饥饿24-48小时的供核细胞所组构的NT胚胎的分裂率(89.70％、桑椹与囊胚的发育率(66.09％)，均显著地高于试验组I(分裂率、桑椹与囊胚的发育率分别为70％、22.00％)与试验组II(分裂率、桑椹与囊胚的发育率分别为67.35％，50.51％)。

冷冻复苏后直接用于试验的供核细胞所组构的NT胚胎的分裂率及桑椹囊胚发育率最低，与其它两试验组相比差异显著。其原因可能是解冻复苏后的细胞立即用于试验时，其细胞未能得到充分的恢复，影响了其在卵母细胞中的重排序，从而影响了NT胚胎的早期发育，而试验组III则完全避免了这点，具有很高的桑椹与囊胚的发育率，经对移植受体的早期妊娠检查，结果有近40％的受体妊娠。这表明，虽然具有很高的桑椹与囊胚的发育率，但仍不影响早期发育胚胎的着床。虽然试验组II的NT胚胎的早期发育率高于试验I，但随着细胞在体外的传代次数的增加(本身已为单克隆细胞株，其代次已很高)，其细胞体积增大，染色体发生的变异的几率也随着增加。因此，试验组III还具有一非常重要的优点，即是解决了细胞在体外的长期培养所造成的染色体变异的影响，能长期保存，在使用时复苏少量细胞(如四孔板中的四孔)，一次可用于四次试验，下批试验再复苏少量细胞即可。

                           表2.供核细胞经不同处理后对NT胚胎的早期发育的影响

试验组	融合率(％)	未分裂率(％)	卵裂(％)		发育情况(％)
							分裂率	正常分裂率	囊胚发育率	桑椹+囊胚发育率
			I	70.53(67/95)	30.00b(12/40)	70.00a(28/40)					42.50a(12/28)	15.00a(6/40)	22.00a(11/40)b
II	78.93(251/318)	32.65b(64/196)					67.35a(132/196	51.02a(67/132)	37.24b(73/196)	50.51(99/196)
			III	81.02(239/295)	9.87a(23/233)	89.70b(209/233)					63.09b(132/209)	46.78c(109/233)	66.09c(154/233)

未分裂率＝(1细胞数+瓦解数+空秀明带)/回收卵总数

a:b，a:c，P＜0.01，b:c P＜0.05；

注：表1是整个试验的数据统计，表2是三个试验组分开统计的。

3、结论：

1)饥饿后的供核细胞经冷冻保存后，复苏培养2-5天后，再进行饥饿处理后作供核细胞，能显著地提高NT胚胎的早期发育率(66.09％)。

2)解决了供核细胞的使用与长期保存之间的矛盾，使长期培养所造成的对染色体变异等产生的影响，以及冻存细胞复苏后直接用于试验造成NT胚胎早期发育率低的缺点。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

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Claims (9)

1.一种提高非人哺乳动物核移植胚胎早期发育率的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将非人哺乳动物的供核细胞经饥饿处理2-5天；

(b)冷冻保存步骤(a)的供核细胞；

(c)复苏步骤(b)的供核细胞；

(d)在非饥饿条件下培养步骤(c)的供核细胞2-5天：

(e)将步骤(d)的供核细胞饥饿处理1-4天；

(f)将步骤(e)的供核细胞用于核移植。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的饥饿处理条件为：含0.1-1％FCS的DMEM培养液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非饥饿条件为：含10-20％FCS的DMEM培养液。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳动物选自下组：牛、羊、猪、狗、猫、兔、猴、小鼠。

5.根据权利要求1所术的方法，其特征在于，所述的供核细胞包括来自哺乳动物的组织、器官的细胞、体外培养的体细胞、及遗传修饰过的体细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(f)包括：将步骤(e)的供核细胞用作供核细胞，移入去除遗传物质的哺乳动物的中II期卵母细胞的卵周隙内，经电融合、化学激活后，将NT胚胎经琼脂糖包理后移入临时寄母输卵管内或在体外培养、获得早期发育的NT胚胎。

7.根据权利要求6所术的制备方法，其特征在于，电融合条件是0.3M甘露醇，4mg/ml的胎牛血清，0.1mM MgSO₄，在140-160V/mm，80μs条件下3次电刺激；然后，融合卵在以下条件下化学方法激活：10μM伊屋诺霉素5分钟+2μM 6-DMAP 3-6小时。

8.一种处理供核细胞的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将供核细胞经饥饿处理2-5天；

(b)冷冻保存步骤(a)的供核细胞；

(c)复苏步骤(b)的供核细胞；

(d)在非饥饿条件下培养步骤(c)的供核细胞2-5天：

(e)将步骤(d)的供核细胞饥饿处理1-4天，获得供核细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的供核细胞是非人哺乳动物的细胞。

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