KR101169762B1 - 신규한 난모세포 매개된 유전자 이식 방법 및 그를 통한 형질전환 배아 생산방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 난모세포 매개된 유전자 이식 방법 및 그를 통한 형질전환 배아 생산방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 난모세포 매개된 유전자 이식 방법 및 그를 통한 형질전환 배아 생산방법에 관한 것이다.
일반적으로 공여 세포를 유전학적으로 변형하고 이를 핵 이식에 사용하는 기술은 예를 들어 심각한 인간 질병의 연구 및 약물 테스팅을 위한 질병 모델로서 사용될 수 있는 유전학적으로 변형된 동물의 생산을 위한 툴을 제공한다.
도 1에서 알 수 있는 바와 같이, 전통적인 세포 핵 이식 기술은 두 단계의 현미경 미세조작술을 포함한다. 첫 번째 단계는 성숙한 난모세포의 핵제거 (enucleation)를 포함하고, 두 번째 단계는 공여 핵 이식단계를 포함한다. 그러나, 현미경 미세조작술은 예를 들어 고가의 장비, 숙련된 기술의 필요 및 시간이 소요되는 작업의 몇 가지 단점을 가진다는 것이 알려져 있다.
공여 세포로서 체세포를 이용한 향상된 핵이식 방법은 최근 개발되었으며, 이는 투명층 자유 난모세포를 사용하는 핸드-메이드 클로닝(Hand-Made Cloning (HMC)) 방법으로 알려져 있다. 이 방법은 더 이상 필요하지 않는 현미경 미세조작술과 같은 전통적인 핵 이식과 비교하여 단순화되어있다. 이 방법은 소에서 사용되고 있다 (Vajta et al.2001 Cloning 3, 89-95; Vajta et al. 2003 Biol. Reprod. 68,571-578; Vajta et al. 2005 Reprod. Fertil.Dev.17, 1-16; Tecirlioglu, et al., 2004). 또한, 한 단계의 현미경 미세조작술을 이용한 층-자유(zona-free) 핵 이식의 이용도 소를 대상으로(Booth et al. 2001 Cloning Stem Cells 3, 139-150; Oback et al. Cloning Stem Cells 5, 3-12) 그리고 돼지를 대상으로(Booth et al. 2001 Cloning Stem Cells 3, 191-197) 설명되어 있다.
이 방법이 기술적으로 덜 힘들고 시간 소요가 적다는 사실은 연구자들로 하여금 HMC 기술을 다른 종에 적용시키도록 하였다. 하지만, 수많은 기술적 문제가 돼지에서의 HMC 적용을 본래 예상되었던 것보다 더 힘들게 했다.
봉착된 문제 중 하나는 돼지 난모세포, 층 있는(zona intact, ZI) 그리고 특히 층 없는(zona free, ZF) 난모세포의 낮은 부력밀도와 관련이 있다. 결과적으로, 돼지 난모세포는 접시의 바닥에 부착하지 못한다. 더욱이, 난모세포의 표면은 점착성이고, 층이 제거되었을 때 상호 간의 부착을 막기 어렵다. 또한, ZF 돼지 난모세포는 매우 약하고, 소 난모세포에서 사용한 방법으로 이등분하는 것은 어렵다.
일반적으로 형질전환 가축을 생성하는 종래의 기술들은 고 비용과 많은 노력과 시간을 필요로 하지만, 낮은 형질전환 효율 및 높은 모자이시즘(mosaicism) 등을 보인다.
MII 난모세포들(oocytes)은 DNA-결합된 정자의 난자내 정자주입술(ICSI)에 의하여 형질전환 배아를 생산하는데 사용되어 왔다(이 방법을 정자 매개된 유전자 이식(Sperm Mediated Gene Transfer) 또는 MII 형질전환이라 함). 그러나 본 발명은 기존의 방법들과 비교하여 DNA를 수정 전에 MII 난모세포들에 삽입하여 초기 유전자 인터그레이션을 가능케 할 것이다. 따라서 본 발명은 모자익 배아의 발생의 가능성을 감소시킨다.
또 ICSI대신에, 본 발명자들은 수정에 체외수정(IVF)을 사용하여 단일 실험에서 단일 연구자에 의하여 여러 개의 난모세포를 수정하게 하였다.
포유류의 경우 2세 생산을 위해 많은 수의 배아를 이식하는 것이 매우 중요하기 때문에 본 발명의 방법은 정상적인 2세 생산률의 면에서 형질전환 효율을 증가시키는 방향으로 접근할 수 있다는 것을 나타낸다.
본 발명의 포유류 형질전환 방법은 전핵(PN) 주입법에 비하여 몇 가지 유리한 점이 있다. 본 발명에서 약 100배 더 큰 팁 입구를 가지는 피펫을 사용하여 효모 또는 포유류 인공 크로모좀과 같은 큰 구조물들의 취급을 용이하게 할 수 있을 뿐 아니라 접합체들(zygotes)은 그들의 지질 풍부함이 그들을 불투명하게 만들 때 전핵 주입법에서 어려운 기질들인 반면에 본 발명에서는 핵을 위치하는 것이 미세주입법(microinjection)에서는 중요하지 않다.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 인 비트로 발생 능력의 감소없이 포배기(blastocyst stage)에서 100%로 전이유전자 발현 효율을 개선하는 유전자 이식 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 유전자 이식 방법에 의하여 유전학적으로 조작된 또는 유전자 도입된 형질전환된 배아를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 돼지 배아를 냉동보존시키는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a) 난모세포를 얻는 단계;
b) 상기 난모세포를 성숙시키는 단계; 및 c) 상기 성숙된 난모세포에 이식될 유전자 DNA와 염기성 펩타이드의 복합체를 미세주입하는 단계를 포함하는 비인간 포유류 난모세포 매개된 유전자 이식 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염기성 펩타이드는 아르기닌이 풍부한 것이 바람직하고 살민인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 염기성 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 것이 바람직하고, 상기 이식될 유전자 DNA의 농도는 40ng/㎕에서 100ng/㎕의 범위인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명에 따른 용어 '난모세포(Oocyte)'는 성숙한 암컷의 생식세포로서 난자(gamete)를 형성하는 성숙 단계가 완료되지 않은 세포이다.
본 발명에 따른 난모세포는 포유동물의 난관 및/또는 난소로부터 분리한다. 비록 살아있는 동물의 난관 및/또는 난소로부터 분리할 수 있어도, 보통 난모세포는 죽은 동물로부터 얻는다, 하나의 실시 형태에서 난모세포는 난관 회수 과정 또는 경질(transvaginal) 회수 방법에 의해 분리된다. 바람직하게는 난모세포는 흡인 (aspiration)을 통해 분리된다. 난모세포는 일반적으로 핵제거 관련 분야의 당업자에게 잘 알려진 다양한 배지에서 성숙한다. 또한 난모세포는 방금 희생된 동물의 난소로부터 또는 난소가 해동 및/또는 녹을 때 분리될 수 있다. 바람직하게 난모세포는 난관으로부터 신선하게 분리된다.
또한 난모세포는 사용 전 냉동보존될 수 있다. 당업자에게는 신선하게 분리되고 성숙한 난모세포가 바람직하기도 하지만, 분리 또는 성숙 후에 난모세포를 냉동보존하는 것도 바람직하다. 만약 후에 난모세포를 사용하려면, 성숙 배지에 놓기 전에 먼저 해동되어야 할 것이다. 해동 과정 후에 난모세포가 활성이 있게 냉동보존된 물질을 해동시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 그러나, 일반적으로 난모세포 및 세포질체의 냉동보존은 매우 힘든 과정이며, 돼지에 있어서는 앞서 언급한 돼지 난모세포 및 세포질체의 연약함과 높은 지질 함량으로 인하여 특히 어려우며, 냉각 손상에 매우 민감하게 된다 (즉, 냉각 및 가온 공정 과정 중에서 +15 내지 +5 ℃사이에서 발생하는 손상).
다른 실시 형태에서, 인-비보(in vivo)에서 성숙된 성숙한 (중기 II) 난모세포는 수집되어 여기에서 언급된 유전자 이식 방법에 사용될 수 있다. 특히, 성숙한 중기 II 난모세포는 발정기 개시 또는 사람융모성 성선자극호르몬(hCG) 또는 유사 호르몬의 주입 후 35 내지 48시간 후에 비-과배란된 또는 과배란된 포유동물로부터 외과적으로 수집된다.
난모세포는 인-비트로에서 배양될 때, 인비보에서 축적될 수 있는 난모세포를 둘러싸고 있는 세포 더미는 제거되어 적절하게 성숙한 단계에 있는 난모세포를 제공하게 된다. 세포 더미는 예를 들어 0.2 내지 5% 히알루로니다아제 범위와 같은 0.1 내지 5 % 히알루로니다아제 범위에서, 예를 들어 0.2 내지 3% 히알루로니다아제 범위와 같은 0.5 내지 5 % 히알루로니다아제 범위에서, 예를 들어 0.5 내지 2 % 히알루로니다아제 범위와 같은 0.5 내지 3 % 히알루로니다아제 범위에서, 예를 들어 0.5% 히알루로니다아제와 같은 0.5 내지 1 % 히알루로니다아제 범위에서 피펫팅 또는 볼텍싱함으로써 제거될 수 있다.
바람직한 방법에서 첫 번째 단계는 적당한 동물로부터 수여자 난모세포의 분리를 포함한다. 이와 관련하여, 난모세포는 어떤 동물 기원으로부터 또한 어느 성숙 단계에서 수확할 수 있다.
인비트로상에서 난모세포의 성숙은 중기 Ⅱ 단계에 도달하거나 최초 극체(polar body)를 배출할 때까지 보통 성숙 배지에서 발생한다. 미성숙 난모세포가 성숙단계에 이르기까지 걸리는 시간을 성숙기간이라 한다.
본 발명의 바람직한 실시 형태에서 난모세포는 성숙한 암퇘지(sow) 또는 어린 암퇘지(gilt)로부터 얻는다.
본 발명에 따른 방법에서 비인간 포유동물이다. 또한, 본 발명에 따라 재조합 배아가 이식된 동물은 비인간 포유동물이다. 포유동물은 돼지, 소과(bovidae),오비즈(ovids), 사슴과(cervids), 멧돼지과(suids), 말과(equids), 낙타과(camelids)의 가축 또는 야생 대표동물로 구성되는 군으로부터 선택된 유제동물(ungulate)일 수 있다. 하나의 실시 형태에서 포유동물은 돼지(pig), 젖소(cow) 또는 황소(bull), 들소(bison), 버팔로(buffalo), 양(sheep), 큰뿔양(big-horn sheep), 말(horse), 조랑말(pony), 당나귀(donkey), 노새(㎍le), 사슴(deer), 엘크(elk), 산림순록(caribou), 염소(goat), 믈소(water buffalo), 낙타(camel), 라마(llama), 개, 토끼 또는 알파카(alpaca)이다.
본 발명의 특정 실시 형태에서 포유동물은 돼지이다.
특정 형태에 있어서 돼지는 랜드레이스(Landrace), 요크셔(Yorkshire), 햄프셔(Hampshire), 두록(Duroc), 차이니스 메이산(Chinese Meishan), 버크셔(Berkshire) 및 피트레인(Pietrain)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 고티엥(Goettingen), 유카탄(Yucatan), 바마 시앙 주(Bama Xiang Zhu), 유지산(Wuzhishan), 시 수앙 바나(Xi Shuang Banna)로 이루어진 군에서 선택된 미니 돼지에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 본 발명의 유전자 이식 방법에 의하여 이식될 유전자가 주입된 난모세포를 정자를 사용하여 체외수정하는 단계를 포함하는 형질전환된 비인간 포유류 배아를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 배아는 주입되는 유전자의 유전학적 요소를 가진다.
따라서, 본 발명의 배아는 유사분열이 개시된 후에 다세포 배아로 점점 분열된다.
본 발명에서 용어 '배아'는 유전자 이식 과정에 의해 형성된 배아를 일컫는다. 본 발명의 배아는 인비트로에서 배양된다.
배아가 약 12-16 세포를 포함할 때, 이를 "상실배아(morula)"라 한다. 그 후, 배아는 더 분열되고 많은 세포가 형성되어 센터 내에는 액체로 가득찬 낭 공동, 포배강 공동이 생긴다. 이 단계의 배아를 "배반포"라 한다. 이 시기에 있어서 발전된 단계의 "수정(fertilized)" 난모세포는 이식 준비가 되어 있다; 상실배아로부터 형성되고 내부 세포 물질, 내부 공동 및 영양외배엽(trophectodermal) 세포라 불리는 세포의 외층으로 이루어져 있다.
본 발명에 따른 배반포는 숙주 포유동물의 자궁에 이식되어 계속 자라 태아로 된 후 동물로 될 수 있다. 유전학적으로 변형된 또는 유전자 도입된 비-인간 포유동물을 생산하는, 비인간 포유동물을 클로닝하는, 재조합 배아를 배양하는, 및/또는, 돼지 배아를 냉동보존하는 여기에서 제공된 방법에 있어서, 배아는 인비트로에서 배양될 수 있다. 예를 들어 배아는 순차적 배양으로 배양될 수 있다. 배아는 정상적인 배아,또는 여기 다른 곳에서 설명된 재조합 배아가 될 것이다.
본 발명의 다른 형태는 난모세포 매개된 유전자 이식 방법에 관한 것이며, 이는 배아를 배양하는 과정을 포함한다.
여기에서 설명된 방법과 관련하여 바람직한 실시형태에서 배아는 순차적 세트의 배지에서 배양된다. 바람직하게 배반포는 예를 들어 NCSU37와 같은 전통적인 배지 또는 당업자에게 알려진 등가 배지에서 배양되며, 여기 배지에서 당은 제거되거나 다른 제제로 대체된다. 하나의 제제는 피루베이트가 될 수 있다. 다른 제제는 락테이트이다. 또한, 제제는 조합되거나 전통적인 배지 내에서 당을 대체할 수 있다.
배아는 0일 내지 2일과 같은 0일 내지 3일까지 상기 설명한 대체 배지 내에서 배양될 수 있다. 피루베이트 농도는 0.1 내지 1 mM와 같은 0.05 내지 1 mM, 예를 들어 0.15 내지 1 mM와 같은 0.125에서 1 mM 범위이다. 또한, 소디움 피루베이트는 0.05 내지 0.8 mM와 같은 0.05 mM 내지 0.9 mM, 예를 들어 0.05 내지 0.6 mM와 같은 0.05 내지 0.7 mM, 예를 들어 0.05 내지 0.4 mM와 같은 0.05 내지 0.5 mM, 예를 들어 0.05 내지 0.2 mM와 같은 05 내지 0.3 mM 범위일 수 있다.
락테이트 농도 범위는 0.75 내지 10 mM와 같은 0.5 to 10 mM, 예를 들어 1.5 내지 10 mM, 1.75 내지 10 mM과 같은 1에서 10 mM이다. 또한, 소디움 락테이트는 0.5 내지 8 mM와 같은 0.5 mM 내지 9 mM, 예를 들어 0.5 내지 6 mM와 같은 0.5 내지 7 mM, 예를 들어 0.5 내지 4 mM과 같은 0.5 내지 5 mM, 예를 들어 0.5 내지 03 mM 범위이다.
초기 당-비함유(free) 배양 배지 후에, 당은 다시 피루베이트와 락테이트로 대체된다. 배아는 4일 내지 3일,바람직하게는 3일 내지 7일간 당 함유 배지에서 배양될 수 있다. 당 농도는 2 내지 10 mM과 같은 1 내지 10 mM,예를 들어 4 내지 10 mM과 같은 3 내지 10 mM, 예를 들어 5 내지 10 mM이다. 또한, 당 농도는 2 내지 8 mM과 같은 1 내지 9 mM, 예를 들어 4-6 mM과 같은 3 내지 7 mM이다.
또 다른 실시형태에서 배아는 돼지 배아다.
또한 본 발명의 본 발명의 상기 배아 생성 방법에 의해서 생성된 상기 배아를 배양하는 단계; 및 상기 배아가 유전학적으로 변형된 태아로 발달할 수 있도록 상기 배양된 배아를 숙주 포유동물에게 이식하는 단계를 포함하는 유전학적으로 조작된 또는 유전자 도입된 비인간 포유동물을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시형태에 따라, 원하는 유전자형을 가진, 유전학적으로 변형된 또는 유전자 도입 동물이 제공된다.
형질전환은 질병 유발 유전자, 변이 유전자를 체세포의 개놈내로 무작위적으로 통합하는 것을 포함한다. 특정 조직 또는 특정 발현 수준에서 발현될 때 질병을 일으킬 수 있는 정상의 비변이된 유전자의 무작위적 통합이 될 수도 있다.
도입된 유전자 또는 트랜스진은 여러 종, 박테리아, 돼지, 인간, 마우스, 래트, 이스트, 무척추동물, 또는 식물로부터 유래할 수 있다. 트랜스진의 조절 서열은 편재하는 또는 유도되는 또는 조직- 및/또는 시간-특이적 발현을 일으킬 수 있으며, 돼지, 인간, 마우스, 래트, 이스트, 무척추동물 또는 식물을 포함하는 여러 종으로부터 기원할 수 있다.
중요하게, 체세포 내 형질전환은 목적 구조물의 동종 재조합 또는 유전자 편집 과정에 의해서 돼지 유전자 내의 특정 부위에 타게팅될 수 있다. 이는 질병 또는 표현형을 유발하는 특정 유전자의 비활성화(즉, knockout)일 수 있으며, 질병을 유발하는 특정 유전자에 대한 특이적 변이의 통합(knock-in)일 수 있다. 또한, 질병유발 트랜스진은 동종 재조합 방법에 의해 돼지 게놈의 특정 조절 부위에 통합될 수 있다.
돼지 게놈에 도입된 유전자 변형은 트리코스타틴 또는 이와 유사한 효과를 갖는 화합물과 같은 화학물질로 체세포, 난모세포 또는 재조합 HMC 배아를 배양함으로써 후생학적 변형(즉, DNA의 메틸화 또는 히스톤의 메틸화 또는 아세틸화/디아세틸화)이 될 수도 있다.
본 발명은 예를 들어 퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴 무도병 또는 경화증 모델과 같은 질병 모델로서 유전학적으로 변형된 동물에 관한 것이다.
다른 실시형태에서 질병 모델은 예를 들어 유방암과 같은 모든 종류의 암을 포함한다. 또한, 결장암 또는 폐암과 같은 모든 암 질병이 연구될 수 있다.
또한, 동물 모델은 예를 들어 당뇨 또는 비만과 같은 흔한 질환에 포함되는 대사성 질환을 위한 모델도 포함한다.
이하 본 발명을 설명한다.
본 발명은 미수정된 중기 난모세포(unfertilized metaphase oocytes)로 DNA 구축물을 미세주입하여서 형질전환 돼지 배아를 생산하는 간단한 방법 및 이후에 인비트로에서 수정하는 방법을 제공한다.
이를 위해서 성년 이전(Prepubertal) 돼지 난소들로부터 회수된 난모세포를 인 비트로에서 42-44h 성숙시키고, femtojet microinjector (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 사용하여서 DNA 용액(10 ng/㎕)으로 미세주입하였다. 그 DNA (4.7 kb)는 pEGFP-C1 플라즈미드(Clontech Laboratories Inc., CA, USA)로부터 유래되었고, 그것은 cytomegalovirus 프로모터의 조절 하의 이식유전자(transgene)를 코딩하는 enhanced green fluorescent protein (EGFP)를 포함하고, ApaLI 제한효소로 리니어라이즈되었다. 다음 주입된 난모세포는 돼지 정소로부터 유래한 신선한 부고환정자(epididymal sperm)를 사용하여 인 비토 수정하였고 0.4% BSA로 보충된 NSCU23 배지에서 배양하였다. 형질전환(transgenesis)의 효율은 EGFP 필터 세트를 사용한 UV 조사 하에서 녹색 형광의 시각화에 의하여 모니터되었다.
결과들은 주입된 난모세포의 난할률(cleavage rate)은 비록 높은 퍼센테지의 주입된 난모세포가 2-4 세포기에서 발생학적 불록(developmental block)을 보였지만 미-주입된 대조군 난모세포의 것(67.8 ± 0.4%)과 유사한 결과(68.7±0.5%)를 나타내었다. 주입된 난모세포의 비율로 표시할 때 2-4 세포기에서 EGFP 발현률(expression rate)은 17.2 ±0.1%이었다. 흥미롭게도 모자이시즘(mosaicism)은 관찰되지 않았다. EGFP 발현률은 DNA 농도를 40 ng/㎕로 증가시키는 경우 26.7 ±0.1%로 증가하였다. 난모세포의 중기 판(metaphase plate) 근처에 jecting the DNA 용액을 주입하는 것은 EGFP 발현률(22.2 ±0.1%)을 개선하지 못하였다(P < 0.05).
흥미롭게도, pDNA (50 ng/㎕)와 살민(Salmine)을 1:10의 차지 비율로 혼합하여 처리하면 인 비트로 발생 능력의 큰 감소없이 포배기(blastocyst stage)에서 100%로 전이유전자 발현 효율을 개선하였다. 따라서 이러한 결과는 형질전환 가축에 대한 유망한 방법으로서 난모세포 매개된 유전자 전달(oocyte mediated gene transfer)법을 제안하는 것이다.
표 1은 pDNA 용액(10 ng/㎕)으로 OMGT를 수행한 인 비트로 수정된 돼지 난모세포의 발생률을 나타낸 표이다. 상기 표에서 괄호 안의 숫자는 배아들의 수를 나타내고, 컬럼 내에 다른 윗첨자(a,b)를 가지는 값은 차이(p<0.05)를 나타내며, EGFP 발현률은 2-4 세포기에서 측정하였다.
표 2는 OMGT에 의하여 생성된 돼지 난모세포의 EGFP 전이유전자의 발현률에 대한 pDNA 농도의 효과를 나타낸 표이다. 상기 표에서 괄호 안의 숫자는 배아들의 수를 나타내고, 컬럼 내에 다른 윗첨자(a,b)를 가지는 값은 차이(p<0.05)를 나타내며, EGFP 발현률은 2-4 세포기에서 측정하였다.
표 3은 OMGT에 의하여 생성된 돼지 배아에서 EGFP 전이유전자의 발현률에 대한 미세주입의 부위의 효과를 나타낸 표이다. 상기 표에서 괄호 안의 숫자는 배아들의 수를 나타내고, 컬럼 내에 다른 윗첨자(a,b)를 가지는 값은 차이(p<0.05)를 나타내며, EGFP 발현률은 2-4 세포기에서 측정하였다.
표 4는 OMGT에 의하여 생성된 돼지 배아에서 EGFP 전이유전자의 발현률에 대한 살민(Salmine)의 효과를 나타낸 표이다. 난모세포는 1:10의 차지 비율로 살민과 복합체화된 ~12 pl pDNA (50 ng/㎕)로 2회 주입하였다.
상기 표 4에서 괄호 안의 숫자는 배아들의 수를 나타내고, EGFP 발현률은 2-4 세포기 및 배반포기에서 측정하였다.
본 발명을 통하여 알 수 있는 바와 같이 본 발명의 방법은 큰 기술을 요하지 아니하고, 다른 방법으로 효과적이지 않은 돼지와 같은 종에 적합하며, 단 시간 내에 다수의 배아를 주입(>200 embryo / 10 min.)할 수 있으며, 모자이시즘도 관찰되지 아니하고, 다중유전자(Multigene) 형질전환도 가능하며, 큰 크기의 벡터의 주입도 가능한 효과가 있다. 더욱이 살민과 pDNA를 혼합하여 처리하면 인 비트로 발생 능력의 큰 감소없이 포배기(blastocyst stage)에서 100%로 전이유전자 발현 효율을 개선하였다.
도 1은 형질전환의 기존의 방법과 본 발명의 방법의 차이를 도시한 그림이다.
도 2는 중기(M) II 단계에서 DNA 미세주입법에 따른 체외수정에 의하여 생성된 2-4 세포기 돼지 배아들에서 EGFP 발현을 나타내는 사진. 배아들을 표준 FITC 필터 셋을 사용한 형광 현미(도 2a) 또는 RT-PCR 후(도 2b)에 의하여 조사하였다. 모자이시즘이 없는 것을 주목.
도 3은 중기(M) II 단계에서 DNA 미세주입법에 따른 체외수정에 의하여 생성된 2-4 세포기 돼지 배아들에서 EGFP 발현을 나타내는 사진. 배아들을 표준 FITC 필터 셋을 사용한 형광 현미(도 2a) 또는 RT-PCR 후(도 2b)에 의하여 조사하였다. 널 1: 비형광 광 하에서의 배아들, 패널 2: EGFP 양성 할구들을 보이는 형광 하에서의 배아들. 배반포 뿐 아니라 2-세포에서도 모자이시즘은 없는 것을 확인 가능. 청색 화살표: 비 형질전환 배반포; 붉은 화살표: 형질전환 배반포.
도 4는 살민(Salmine)과 복합체를 형성하는 것을 도식화한 그림이고, 또한 도 4에서는 살민의 아미노산 서열 등을 나타내었다.
도 2는 중기(M) II 단계에서 DNA 미세주입법에 따른 체외수정에 의하여 생성된 2-4 세포기 돼지 배아들에서 EGFP 발현을 나타내는 사진. 배아들을 표준 FITC 필터 셋을 사용한 형광 현미(도 2a) 또는 RT-PCR 후(도 2b)에 의하여 조사하였다. 모자이시즘이 없는 것을 주목.
도 3은 중기(M) II 단계에서 DNA 미세주입법에 따른 체외수정에 의하여 생성된 2-4 세포기 돼지 배아들에서 EGFP 발현을 나타내는 사진. 배아들을 표준 FITC 필터 셋을 사용한 형광 현미(도 2a) 또는 RT-PCR 후(도 2b)에 의하여 조사하였다. 널 1: 비형광 광 하에서의 배아들, 패널 2: EGFP 양성 할구들을 보이는 형광 하에서의 배아들. 배반포 뿐 아니라 2-세포에서도 모자이시즘은 없는 것을 확인 가능. 청색 화살표: 비 형질전환 배반포; 붉은 화살표: 형질전환 배반포.
도 4는 살민(Salmine)과 복합체를 형성하는 것을 도식화한 그림이고, 또한 도 4에서는 살민의 아미노산 서열 등을 나타내었다.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예
1:난모세포
복구(retrieval)회수
및 체외 성숙
성년 이전(Prepubertal) 돼지 난소들을 지역 도살장으로부터 모아서 실험실로 가져와서 30 ～ 37℃ 식염수에서 보존하였다. 난구 난모세포 복합체들(Cumulus oocyte complexes;COCs) 18 G 니들을 가지는 10ml 주사기를 사용하여 3-6mm 지름의 난포로부터 빨아내었다. 그 COCs를 1mg/ml BSA(낮은 카보네이트 TALP)를 포함하는 TL-HEPES 배지로 3회 세척하고, 25mM NaHCO3, 10%(v/v) 돼지 난포액, 0.57mM cysteine, 0.22μg/ml sodium pyruvate, 25μg/ml gentamicin sulfate, 0.5㎕/ml p-FSH(Folltropin V; Vetrepharm, Canada), 1μg/ml estradiol-17β 및 10ng/ml 표피 성장 인자(EGF; E-4127, Sigma)가 보충된 Earle's salts(TCM-199; Gibco BRL, Grand Island,NY)를 가지는 500㎕의 Tissue Culture Medium 199에서 50개의 군으로 광유 하에서 39℃, 5% CO2 습도 환경에서 42-44시간 성숙시켰다.
실시예
2:
DNA
미세주입법
DNA 미세주입법을 위하여, 실시예 1의 체외 성숙된 난모세포들을 0.1% 히알루노니다제가 보충된 TL-HEPES 내에서 난구 세포들로부터 떼어내어서 0.1% BSA를 함유하는 TL-HEPES에서 3회 세척하였다.
그 후에 미세주입될 떼어낸 난모세포들을 40㎕ 드롭의 10% FBS가 보충된 HEPES 버퍼 TCM 199(HTCM-199; Gibco BRL, Grand Island, NY)로 광유 하에서 위치하고 스테이지 셋을 가지는 미세조작기가 부착된 femtojet microinjector(Eppendorf, Hamburg,Germany)를 사용하여 35℃에서 미세주입하였다. 그 DNA(4.7 kb)는 pEGFP-C1 plasmid(Clontech Laboratories Inc., CA, USA, 'pDNA'라 함)로부터 유래하였고, 사이토메칼로바이러스 프로모터의 조절하에서 트랜스진을 코딩하는 인헨스드 녹색 형광 단백질(EGFP)을 포함하고, ApaLI 제한효소로 리니어라이즈되었다.
각 난모세포는 약 5pl의 p DNA로 주입되었다. DNA 용액의 주입은 세포 팽윤으로 시각적으로 확인하였다.
주입 부피(1 vs. 5% cytoplasmic volume), pDNA (10 vs. 40 ng/㎕)의 농도 또는 주입의 위치(랜덤 vs. 극체 근처)의 효과도 평가하였다. 형질전환의 효율에 대한 살민(Salmine)의 효과를 평가하기 위하여 pDNA를 Salmine (Calbiochem)과 1:1의 비율로 혼합하고 볼텍스를 하여 1:10의 차지 비율로 복합체를 형성하였다(complexed). 차지 비율은 공식 {살민의 농도 x 살민에서 라이신 및 아르기닌 잔기의 수/ 살민의 분자량}/(pDNA의 농도/pDNA의 분자량)에 의하여 계산되었다.
예비실험에서 본 발명자들은 ~5-10 pl의 pDNA를 200 ng/㎕의 농도로 주입하였다. 이 농도의 DNA (200 ng/㎕)는 발생을 정지시켰다(도시 생략). ~12 pl의 pDNA를 100 ng/㎕로 주입하면 그 결과는 개선되었지만 최상의 결과는 ~12 pl (12 + 12 = 전체 24 pl)의 pDNA를 50 ng/㎕ 농도로 이중 주입(double injection)하는 경우에 얻었다.
실시예
3: 체외 수정(
IVF
)
생존한 난모세포들의 체외 수정은 다음과 같이 이루어졌다. 난모세포들을 1mM 카페인 소디움 벤조에이트 및 0.1% BSA를 함유하는 수정 배지(변형된 Tris-버퍼 배지)로 3회 세척하고, 50㎕의 수정 배지 당 10에서 15(대조군) 또는 25에서 30 (주입군) 난모세포들의 군으로 놓았다. 돼지 정소를 도살장으로부터 모아서 실험실로 가져 와서 75 μg/ml penicillin G와 50 μg/ml streptomycin sulfate가 보충된 0.9%(w/v)식염수에서 30에서 35℃에서 보관하였다. 정자를 미부 부고환으로부터 TL-HEPES에 회수하여 800rpm에서 5분간 원심분리하여 펠렛화하였다. 그 후 부드러운 펠렛을 Sp-TALP 배지에서 10분간 스윔-업을 수행하였다. 그 상등액을 모아서 800 rpm에서 5분간 원심분리하여 2회 세척하였다. 세척 과정의 말기에 정자 펠렛을 수정 배지에서 재부유하고 5×105(대조군) 또는 2.5×105(주입군) 정자/ml의 최종 정자 농도를 얻기 위하여 수정 드로프렛에 첨가하였다. 정자 및 난모세포들은 39℃, 5% CO2 습도 환경에서 6시간(대조군) 또는 5시간(주입군).
실시예
4: 배아의 인 비트로 배양
추정적 접합체들을 0.4% 지방산 없는 소 혈청 알부민(BSA; Sigma; A6033)이 보충된 NCSU23 배지에서 7일간 배양하였다. 난할률은 2일째 측정하였고, 배반포 률은 배양 7일째 측정하였다.
실시예
5:
EGFP
발현 측정
형질전환의 효율은 EGFP 필터 세트를 이용하여 UV 조사하에서 녹색 형광의 시각화(visualization)에 의하여 모니터하였다. 형질전환된 배아들은 녹색 형광을 보이는 반면에 비 형질전환된 것들은 비형광을 나타내었다.
배아들은 또한 RT-PCR에 의하여 EGFP의 mRNA 전사체에 대하여 평가되었다 .
실시예
6: 통계 분석
데이터는 student's t-테스트에 의하여 분석하였다. P=0.05를 통계학적으로 유의하다는 것으로 간주하였다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (9)
- a) 난모세포를 얻는 단계;
b) 상기 난모세포를 성숙시키는 단계; 및 c) 상기 성숙된 난모세포에 이식될 유전자 DNA와 서열번호 1에 기재된 염기성 펩타이드를 1:10의 차지 비율로 혼합하여 미세주입하고, 상기 이식될 유전자가 주입된 비인간 포유류 난모세포를 정자를 사용하여 체외수정하는 단계를 포함하는 형질전환된 비인간 포유류 배아를 생성하는 방법. - 삭제
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 이식될 유전자 DNA의 농도는 40ng/㎕에서 100ng/㎕의 범위인 것을 특징으로 하는 형질전환된 비인간 포유류 배아를 생성하는 방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 비인간 포유류는 돼지(pig), 젖소(cow), 황소(bull), 들소(bison), 버팔로(buffalo), 양(sheep), 큰뿔 양(big-horn sheep), 말(horse), 조랑말(pony), 당나귀(donkey), 노새(㎍le), 사슴(deer), 엘크(elk), 산림순록(caribou), 염소(goat), 물소(water buffalo), 낙타(camel), 라마(llama), 개, 토끼 또는 알파카(alpaca)인 형질전환된 비인간 포유류 배아를 생성하는 방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 비인간 포유류는 돼지(pig)인 형질전환된 비인간 포유류 배아를 생성하는 방법.
- 삭제
- a) 제 1항에 의해서 생성된 상기 배아를 배양하는 단계; 및
b) 상기 배아가 유전학적으로 변형된 태아로 발달할 수 있도록 상기 배양된 배아를 숙주 포유동물에게 이식하는 단계를 포함하는 유전학적으로 조작된 또는 유전자 도입된 비인간 포유동물을 생산하는 방법. - 제 8항에 있어서, 상기 비인간 포유 동물은 돼지, 젖소, 황소, 들소, 버팔로, 양, 큰뿔 양, 말, 조랑말, 당나귀, 노새, 사슴, 엘크, 산림순록, 염소, 물소, 낙타(camel), 라마, 개, 토끼 또는 알파카인 유전학적으로 조작된 또는 유전자 도입된 비인간 포유동물을 생산하는 방법.
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|---|---|---|---|
| KR1020100017349A KR101169762B1 (ko) | 2010-02-25 | 2010-02-25 | 신규한 난모세포 매개된 유전자 이식 방법 및 그를 통한 형질전환 배아 생산방법 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20110097488A KR20110097488A (ko) | 2011-08-31 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101169762B1 (ko) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060130163A1 (en) * | 1998-08-11 | 2006-06-15 | Perry Anthony C | Method of performing trangenesis |
| US20080153737A1 (en) | 2004-08-16 | 2008-06-26 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method of Delivering Rna Interference and Uses Thereof |
-
2010
- 2010-02-25 KR KR1020100017349A patent/KR101169762B1/ko not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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| US20080153737A1 (en) | 2004-08-16 | 2008-06-26 | The Cbr Institute For Biomedical Research, Inc. | Method of Delivering Rna Interference and Uses Thereof |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| GenBank Accession Number B02669(2009.02.12.)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20110097488A (ko) | 2011-08-31 |
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