KR101316594B1 - 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물 및 이를 이용한 복제동물 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물, 이를 이용한 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법, 및 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법에 관한 것으로서, 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물을 이용할 경우, 공여세포의 세포사(apoptosis)가 감소하고 복제동물의 임신율과 생산 효율이 현저히 증가될 수 있다.
Description
본 발명은 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물, 이를 이용한 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법, 및 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법에 관한 것이다.
최근 세포융합 또는 세포 직접주입에 의한 체세포 핵 이식 기술이 발전되면서 복제동물의 생산이 본격적으로 이루어지고 있다. 체세포 핵 이식 기술은 생식과정에서 일반적으로 이루어지는 감수분열 및 반수 염색체 보유 생식세포를 경유하지 않고도 자손을 탄생시킬 수 있는 기술로서 성체가 가진 배수체 보유 체세포를 핵이 제거된 난자에 이식하여 수정란을 생산하고 상기 수정란을 생체 내로 이식하여 새로운 개체를 발생시키는 방법이다.
이러한 체세포 핵이식 기술은 우량 동물의 번식, 희귀, 멸종위기 동물의 보존, 특정영양물질의 생산, 치료용 생체물질 생산, 장기이식용 동물 생산, 질병질환 동물 생산, 세포, 유전자 치료와 같은 의학적으로 가치를 지니는 장기이식 대체용 동물의 생산 등과 같은 분야에서 넓게 활용될 수 있다.
최근에는 장기 이식용 동물 생산과 관련하여, 동물의 장기를 사람에게 이식할 수 있도록 이종(異種) 간에 면역거부반응을 일으키는 유전자를 제어하는 기술과 종래의 복제동물 생산 기법을 접목하여 바이오장기용 형질전환 복제동물 생산에 관한 연구가 활발하다. 최근 국내외적으로 성공적인 바이오장기용 형질전환 복제돼지의 생산이 보고되고 있으며, 일부 국가에서는 바이오장기용 돼지의 심장 등 장기를 바분원숭이 등에 이식하여 최장 6개월까지 기능이 유지되는 것으로 보고되기도 하였다.
2009년 국내에서도 바이오장기용 형질전환 복제미니돼지 지노(XENO)가 생산된 이래 몇몇 바이오장기용 형질전환 복제돼지 생산이 보고되기도 하였다. 하지만 결과물 위주로만 보고되어 복제동물 생산 효율 면에서는 명확히 파악되지 않아 효율성 부분에서 다소 부족한 면이 있는 것이 사실이다.
지금까지 복제동물의 생산 효율을 높이기 위하여, 복제란 생산 단계에서 수핵 난자 또는 재구축 난자에 별도 물질을 처리하는 다양한 노력이 시도되고 있으나, 여전히 복제동물의 생산 효율은 매우 낮은 수준으로 보고되고 있는 실정이다. 연구자들의 많은 노력에도 불구하고 아직까지도 체세포 핵이식 기술을 이용한 개체생산의 효율성은 크게 나아지지 않고 있으며, 높은 유산 및 사산이 보고되고 있다. 체세포 복제란 배발생의 지표로 사용되는 배반포 발달율도 체외수정란과 차이가 없다고 보고되고 있지만 산자로 태어날 확률은 3% 이내로서 그 확률이 매우 낮다.
한편, 복제동물의 생산 과정 중에서 공여 세포를 배양 하는 방법에 있어서는, 일반적으로 상업적으로 판매되고 있는 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle's Medium) 또는 DMEM/F-12 배양액에 10% 또는 20%의 소태아혈청(FBS)이 첨가된 배양액으로 배양한 다음, 복제란 생산을 위한 공여세포로 활용하는 방법이 이용되고 있다.
이에 본 발명자들은, 공여세포의 배양 방법 개선을 통한 복제동물의 생산 효율 향상에 관해서는 지금까지 연구된 바가 없다는 점에 착안하여 연구 및 개발을 수행한 결과, 돼지 난소에서 회수한 난포액을 첨가한 저혈청 배양액으로 공여세포를 처리하면 공여세포의 세포사(apoptosis)가 감소하고 복제동물의 임신율과 생산 효율이 현저히 증가될 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물을 이용한 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 과제 해결을 위해, 본 발명의 일 구체예는 수핵난자의 탈핵 단계, 공여 세포의 주입 단계, 융합 단계 및 융합된 난자의 활성화 단계를 포함하는 동물의 핵 이식란의 제조방법에 있어서, 공여 세포를 돼지 난포액을 포함하는 조성물에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법을 제공한다. 상기 조성물은 1 내지 5%의 소태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 상기 동물은 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 돼지일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예는 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계, 융합된 난자의 활성화 단계, 체세포 핵 이식란의 체외배양 단계 및 체내이식 단계를 포함하는 복제 동물의 생산방법에 있어서, 공여 세포를 돼지 난포액을 포함하는 조성물에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법을 제공한다. 상기 조성물은 1 내지 5%의 소태아혈청(FBS)을 포함할 수 있다. 상기 동물은 포유동물일 수 있으며, 예를 들면 돼지일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체예는 돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 1 내지 5%의 소태아혈청(FBS)을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "돼지 난포액"은 이에 의해 제한되지는 않으나, 돼지 난소에 존재하는 난포에서 회수한 난포액을 의미한다. 돼지 난포액에는 성장호르몬, 전해질, 호르몬, 아미노산과 아직까지 그 기능이 알려지지 않은 다양한 요소들이 첨가되어 있는 것으로 알려져 있다(Abeydeera et al., 2000. Theriogenology 15,787-797; Dode and Graves, 2002. Theriogenology 15, 811-821; Hong et al., 2004. Theriogenology 62, 1473-1482; Iwata et al., 2004. Reproduction ,159-164).
상기한 과제 해결 수단에 의한 본 발명에 따르면, 공여세포의 세포사(apoptosis)가 감소하고 복제동물의 임신율과 생산 효율이 현저히 증가될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
<1-1>
난포란
채취 및 체외성숙
도축장으로부터 채취된 난소를 30～35℃로 유지된 0.9% 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. 직경 3-6mm의 난포로부터 18 게이지 주사바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하여 미성숙 난자를 채취하였다. 채취한 난자는 실체 현미경 하에서 난구세포 및 세포질이 균질한 것을 선별하여 0.1% PVA(폴리비닐알코올)가 첨가된 TL-Hepes에 3회 세척 후에 성숙배양에 이용하였다. 성숙배양액은 0.1% PVA(w/v), 3.05mM D-글루코스, 0.91mM 소디움 파이루베이트, 0.57mM 시스테인, 0.5ug/ml 황체형성 호르몬, 0.5ug/ml 여포 자극 호르몬, 75ug/ml 페니실린 G 및 50ug/ml 스트렙토마이신이 첨가된 TCM-199(Gibco-BRL, Grand Island, NY, USA)을 사용하였다. 성숙배양은 4-웰 디쉬(Nunc, Denmark)를 이용하여 웰당 50-70개의 난자를 40-42시간 동안 38.5℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 실시하였다.
<1-2> 돼지
난포액
준비
도축장으로부터 채취된 돼지 난소를 30～35℃로 유지된 0.9% 생리식염수 용액에 넣어 실험실로 운반하였다. 직경 3-6mm의 난포로부터 18 게이지 주사바늘이 부착된 주사기로 난포액을 흡입하였다. 흡입된 난포액은 2,500 rpm으로 15분간 2회에 걸쳐 원심분리를 실시하여 난포액 내에 포함된 여러 종류의 세포 및 이물질들을 제거하였다. 원심분리가 끝난 후 상층액만을 회수하여 분주한 다음 -20℃ 냉동고에서 다음 사용시까지 보관하였다.
<1-3> 공여세포 준비
검증된 형질전환 체세포를 돼지 난포액이 첨가된 저혈청 배양액을 사용하여 배양을 실시하였다. 실험에 사용된 배양액의 조성은 하기 표 1에 나타내었다. 핵이식 시 공여 핵으로 사용하기 위하여 동결된 세포를 융해한 후 배양접시의 95% 이상으로 증식할 때까지 배양하였다. 핵이식 전 배양 중인 세포를 0.05% 트립신으로 처리하여 단일세포를 분리한 후 공여세포로 사용하였다. 일부는 동결보존 상태에서 핵이식 당일에 곧바로 융해하여 배양액에서 정치시킨 다음 공여세포로 사용하였다. 형질전환된 체세포는 국립축산과학원에서 보유하고 있는 초급성면역거부반응 유전자 제어 형질전환 체세포를 이용하여 실시하였다.
| 배양액 구성 성분 | 용량 | 농도 |
| DMEM(GibcoBRL, #10567) | 284.4ml | 60% |
| MCDB-201(Sigma #M6770) | 189.6ml | 40% |
| FBS(Hyclone #SH30070.03) | 10ml | 2% |
| ITS(Sigma #I3146) | 5ml | 1X |
| 아스코르브산(Wako, #013-19641) | 5ml | 0.1mM |
| EGF(GibcoBRL #13247-051) | 500ul | 10ng/ml |
| PDGF-BB(Sigma #P4306) | 500ul | 10ng/ml |
| 페니실린 및 스트렙토마이신(Sigma #P0781) | 5ml | 1X |
| 돼지 난포액 | 50ml | 10% |
<1-4> 형질전환 복제란 생산
성숙 배양이 완료된 난자를 0.1% PVA 및 0.1% 히알루로니다아제가 포함된 PBS에 위치시켜 4분 동안 교반(vortex) 처리하여 난구세포를 제거하였다. 난구세포가 제거된 난자들은 제 1 극체 주변의 세포질을 흡입하여 제거함으로서 제핵을 실시하였다. 제핵은 Hoechst 33342(10ug/ml)를 이용하여 15-20분 동안 39℃에서 염색을 실시한 후 확인하였다. 모든 미세조작 과정은 3mg/ml BSA와 5ug/ml cytochalasin B가 포함된 TCM-199 배양액 내에서 실시되었다. 제핵 후 난자들은 공여세포 도입 때까지 3mg/ml BSA가 포함된 TCM-199 배양액 내에 위치되었다. 배양 중인 공여세포를 트립신을 이용하여 단일세포를 분리한 후 3mg/ml BSA가 포함된 TCM-199 배양액 내에 위치시켰다. 재구축된 난자들은 0.1mM MgSO4, 1.0mM CaCl2 및 0.5mM HEPES가 포함된 0.3M 만니톨을 사용하여 융합을 실시하였다. 사용된 전압은 1초 간격으로 2회의 1.2 kV/cm의 직류전압을 30usec 동안 통전하여 융합을 실시하였다. 이 때 사용된 전원공급 장치는 Electro Cell Fusion이었다. 융합이 확인된 재구축 난자는 PZM-3 배양액에서 6일간 배양하였다.
비교예
1.
돼지 난포액 및 2% FBS 대신 10% 또는 20% FBS를 포함하는 배양액을 사용한 것을 제외하고는 실시예 <1-3>과 동일한 방법으로 공여 세포를 제조하였고, 이를 이용하여 실시예 <1-4>와 동일한 방법으로 복제란을 생산하였다.
실험예
1. 공여 세포의
세포사
비교 실험
체세포의 세포사를 분석하기 위하여 프로피디움 요오드(propidium iodide, PI)와 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)가 컨주게이션된 아넥신 V가 포함된 아넥신 V-FITC 세포사 검출 키트(BioVision, USA)를 사용하여 사용자 매뉴얼에 따라 염색을 실시하였다. 배양된 체세포는 0.05% 트립신으로 처리한 다음 차가운 PBS로 수차례 세척하였다. 이후 결합 완충액(5 × 105cells/ml)에 재부유 시켰다. 그런 다음 체세포를 1,000rpm으로 5분간 4°C로 원심분리를 실시하였다. 상층액을 제거한 다음, 아넥신 V-FITC 5μl와 PI 5μl가 포함된 500μl 결합 완충액에 세포를 부유시켰다. 이 상태로 20분 동안 빛이 차단된 암실에서 세포를 얼음에 4°C로 정치시킨 다음, 세포를 곧바로 유세포 분석기[Beckman Coulter Cytomics FC500 cell sorter with FITC fluorescence: (Ex = 488 nm; Em = 530 nm)]를 이용하여 분석을 실시하였다.
실험 결과, 10% 또는 20% FBS를 포함하는 배양액을 사용한 경우에는 공여 세포의 세포사 비율이 0.99%인 반면, 돼지 난포액을 포함하는 배양액을 사용한 경우에는 0.8%로 나타나, 세포사 비율이 약 20% 감소하였음을 알 수 있다.
실험예
2. 복제동물 임신율 및 분만율 비교 실험
실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 복제란을 수란돈에 이식하여 임신율 및 분만율 등을 분석한 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 이식두수 | 임신두수(%) | 분만두수(%) | 산자수 | |
| 실시예 1 | 21 | 11(52.4) | 3(27.3) | 6/10* |
| 비교예 1 | 23 | 6(26.1) | 0(0) | 0 |
* 하루 이상 생존한 산자수/총 산자수
표 2에 나타낸 바와 같이, 돼지 난포액을 포함하는 배양액으로 처리한 공여 세포를 이용하여 복제동물을 제조한 결과, 비교예에 비하여 임신율이 2배 이상으로 나타났고, 분만율도 우수함을 확인하였다.
Claims (10)
- 수핵난자의 탈핵 단계, 공여 세포의 주입 단계, 융합 단계 및 융합된 난자의 활성화 단계를 포함하는 동물의 핵 이식란의 제조방법에 있어서,
공여 세포를
배양액 조성물 100 부피부에 대하여
1% 내지 5% 소태아혈청(FBS) 1 내지 5 부피부;
0.01mM 내지 1mM 아스코르브산 1 내지 5 부피부;
1ng/ml 내지 20ng/ml 상피세포성장인자(EGF) 0.1 내지 0.5 부피부; 및
돼지 난포액을 포함하는 배양액 조성물에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법.
- 제3항에 있어서,
상기 포유동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 동물의 핵 이식란 제조방법.
- 수핵난자의 탈핵 단계, 공여핵세포의 주입 단계, 융합 단계, 융합된 난자의 활성화 단계, 체세포 핵 이식란의 체외배양 단계 및 체내이식 단계를 포함하는 복제 동물의 생산방법에 있어서,
공여 세포를
배양액 조성물 100 부피부에 대하여
1% 내지 5% 소태아혈청(FBS) 1 내지 5 부피부;
0.01mM 내지 1mM 아스코르브산 1 내지 5 부피부;
1ng/ml 내지 20ng/ml 상피세포성장인자(EGF) 0.1 내지 0.5 부피부; 및
돼지 난포액을 포함하는 배양액 조성물에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법.
- 삭제
- 제5항에 있어서,
상기 동물이 포유동물인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법.
- 제7항에 있어서,
상기 포유동물이 돼지인 것을 특징으로 하는 인간을 제외한 복제 동물의 생산방법.
- 배양용 조성물 100 부피부에 대하여,
1% 내지 5% 소태아혈청(FBS) 1 내지 5 부피부;
0.01mM 내지 1mM 아스코르브산 1 내지 5 부피부;
1ng/ml 내지 20ng/ml 상피세포성장인자(EGF) 0.1 내지 0.5 부피부; 및
돼지 난포액을 포함하는 공여 세포 배양용 조성물. - 삭제
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