KR20110039086A

KR20110039086A - 난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물

Info

Publication number: KR20110039086A
Application number: KR1020090096364A
Authority: KR
Inventors: 강다원; 한재희
Original assignee: 경상대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-09
Filing date: 2009-10-09
Publication date: 2011-04-15
Also published as: KR101163840B1

Abstract

본 발명은 난포액을 포함하는 세포성장 및 증식용 배지 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배지 조성물 및 세포배양 방법은 기존 배양액 또는 기존 일차세포 성장 배양액에서 혈청을 대체하여 난포액을 사용함으로써 기존의 혈청포함 배지가 가지는 문제점을 해결하면서도 그와 유사하거나 더 향상된 성장률을 보이는 효과를 갖는다.

일차세포(primary cell), 난포액(follicular fluid), 각질형성세포(keratinocyte), FBS, 배양액

Description

난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물{Composition Comprising follicular fluid as a growth factor for in vitro cell culture}

본 발명은 난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용하여 일차세포를 배양하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 포유동물의 난포로부터 채취한 난포액을 세포성장인자로 포함하여 기존의 고가의 혈청을 대체하고 향상된 세포성장율을 보이는 무혈청 배지 조성물에 관한 것이다.

세포배양은 동물조직을 배양하거나 실험실에서 세포 내의 매커니즘을 연구하는데 이용되며 최근에는 동물세포를 이용하여 생물의약품을 개발하는 등 그 이용 분야가 확대되고 있다.

이와 같은 세포배양을 위한 기존의 세포배양액에는 세포의 성장을 자극하기 위해 FBS(fetal bovine serum)나 FCS(fetal calf serum)와 같은 혈청이 성장인자로서 포함되어 왔다. 그러나 세포 배양액에 혈청을 사용할 경우, 첫째, 혈청이 마이코플라즈마(mycoplasma)나 바이러스에 의해 오염이 될 수 있기 때문에 사용 전에 검사를 해보아야 하고, 검사하여 오염이 되지 않은 경우라도 바이러스 제거 공정을 반드시 거쳐야 하고, 둘째, 가격이 비싸고 공급이 안정적이지 못하며, 셋째, 혈청 채취 때마다 혈청의 성분에 변화가 있을 수 있고 보존기간 동안 혈청 성분의 변화를 야기할 수 있는 등의 문제점이 있기 때문에 무혈청 배지에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.

그러나 현재 사용 중인 무혈청 배지의 경우도 혈청 내의 일부 단백질이 갖고 있는 방어적인 해독작용이 제거됨에 따라 오염 위험이 있고 세포주의 세대 수가 적은 문제점이 있다.

특히, 일차세포를 배양할 경우, 기본배양액을 이용하여 배양하면 원하는 정도의 세포성장 효과를 얻을 수 없기 때문에 일차세포 성장 배양액을 주로 이용하고 있는데, 현재 상용하는 일차세포 성장 배양액은 수입에 의존하고 있어 기본배양액의 10배가 넘는 비용부담이 크기 때문에 연구와 실험이 원활하게 진행되지 않는 등 많은 제한이 있어 왔다.

따라서, 혈청을 대신할 수 있으면서도 혈청배지가 가지는 문제점들을 해소하고, 세포 성장률이나 성장속도 면에서는 기존 혈청보다 우수하고 비용이 저렴한 일차세포 배양액에 대한 요구가 증가하고 있는 실정이다.

이러한 배경 하에, 본 발명자는 소 난포액을 포함한 포유동물의 난포액이 일차세포의 성장에 필요한 영양분을 갖고 있어 세포성장인자로서 사용될 수 있으며, 이러한 난포액을 혈청 대신 포함한 세포배양액에 세포를 배양하여 기존 배양액과 유사하거나 더 향상된 세포 성장을 보이는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하여 상기와 같은 문제를 해결하였다.

본 발명의 하나의 목적은 기존의 고가의 세포성장액을 대체할 수 있어 경제적이고 향상된 효과를 보이는 난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 난포액을 포함하는 배지 조성물을 이용하여 일차세포를 배양하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 난포액을 혈청 대용으로 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물 및 이를 이용하여 일차세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태에서, 본 발명의 배지 조성물은 난포액을 포함하여 세포 배양 시 기존의 고가의 일차세포 배양액을 대체할 수 있는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 “세포 배양(cell culture)”이란 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 말하는데, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시킨다.

본 발명의 배지 조성물에서 배양시킬 수 있는 세포는 동물세포이면 되고 제한이 없으나, 상기 동물세포는 분화가 완료된 세포이며, 일차세포, 계대배양세포, 세포주를 포함할 수 있다. 구체적으로는 피부세포가 바람직하며, 각질형성세 포(keratinocyte)가 더욱 바람직하다. 이외에도 섬유아세포(fibroblast), 기관지 평활근 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “일차세포”라 함은 세포 배양 시 개체의 기관이나 조직을 떼어내어 배양접시에 바로 배양한 세포를 말한다. 혈액세포와 같은 림프구형 세포(lymphoid cells)는 배양접시에 부착하지 않고 배양액에 현탁상태로 성장한다(suspension culture). 그러나 일반적으로 상기 림프구형 세포를 제외한 대부분의 세포는 배양접시에 부착하여 성장하게 되는데, 이들 세포는 계속 성장하여 배양접시 바닥에 단층(monolayer)으로 자라게 되고 이들 세포는 더 이상 부착할 곳이 없는 상태가 되면 증식을 멈추게 되는데, 이렇게 일차세포를 키우는 것을 “일차배양”이라고 한다. 만약 이러한 세포들을 계속하여 증식하게 하려면 세포의 일부를 배양접시에서 떼어내어 새로운 배양접시에 계속하여 옮겨줄 필요가 있는데, 이렇게 계속하여 배양하는 것을 “계대배양”이라고 한다. 그러나, 일차세포도 4회까지는 계대배양이 가능하다. 대부분의 세포들은 계대배양을 계속하면 더 이상 증식되지 않고 사멸하게 되는데, 세포를 오랜 기간 계대배양할 수 있도록 변화된 세포를 “세포주(cell line)”라고 한다.

동물세포가 성장하고 증식하기 위해서는 신호가 필요한데 이러한 신호의 시작은 일반적으로 성장인자(growth factor)라고 부르는 물질에 의해 나타난다. 상기 성장인자에 의한 신호는 세포의 성장인자 수용체에 결합되어 세포 안으로 전달되어 종국적으로 핵 안으로 전달된다. 핵 안으로 전달된 신호는 염색체에 있는 특정한 유전자의 전사로 나타나고, 그 결과 성장자극에 대응하는 단백질들이 만들어지고 세포는 증식하게 된다. 이와 같은 과정을 세포의 신호전달 과정(signal transduction)이라 하며, 동물세포의 신호전달 과정은 성장인자에 의해 시작되어 세포 내의 여러 가지 단백질이나 물질들의 상호작용에 의해 세포가 증식하게 된다.

이러한 세포의 성장을 자극하기 위하여 세포 배양액에는 성장인자가 함유된 혈청을 첨가한다. 그러나 혈청을 포함할 경우 종래 배지가 갖는 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는 상기 혈청 대신에 성장인자로서 난포액을 사용한다. 본 발명에서 대체하고자 하는 혈청은 우태혈청(FBS: fetal bovine serum), 우아혈청(BCS: bovine calf serum), FCS(fetal calf serum), 닭 혈청, 말 혈청, 돼지 혈청 및 분만 후 탯줄 혈청 등이며 세포배양액에 포함되는 혈청이면 여기에 포함되며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 “난포액(follicular fluid)”이란 난모세포가 성장하는 과정 중에 생성되어 생체 내에서 난자의 성장 및 성숙에 관여하는 포유류 난포 속 난자를 둘러싸고 있는 액체를 말하며, 여포액’이라고도 한다. 본 발명의 난포액은 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 포유동물 유래의 난포액을 포함하나, 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 및 생쥐 유래의 난포액이고, 가장 바람직하게는 소 유래의 난포액이다. 또한, 본 발명에서 난포액은 당업계에 널리 알려진 일반적인 방법에 의하여 난소로부터 획득할 수 있으나, 기존의 병력이 없는 동물의 난포에서 채취하는 것이 바람직하다.

바람직한 일 양태로서, 상기 채취한 난포액은 원심분리를 통해 난포액 내 혈 구 및 난구세포 등을 제거한 후 상층액만을 회수하고, 회수한 상층액을 불활성화시키고, 멸균 여과기를 이용하여 멸균한 후에 사용할 수 있다. 또한 상기 멸균한 난포액은 -20℃ 냉동고에 보관하였다가 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 포유동물의 난포액은 호르몬을 비롯하여 세포 성장에 필요한 다양한 영양인자를 포함하고 있는데, 히아루로난(hyaruronan), 각질형성세포 성장 인자, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 인슐린, 콜레스테롤, 글루타치온 에스-트랜스퍼라제, K⁺, Na⁺, Cl^-, 피브리노겐 등을 포함할 수 있다. 이러한 영양인자 중 대표적인 것은 히아루로난(hyaluronan)과 각질형성세포 성장인자(KGF: keratinocyte growth factor)이다.

상기 난포액에 포함된 주요 성분인 “히아루로난”은 히아루론산(hyaluronic acid) 또는 히아루로네이트(hyaluronate)라고도 불리우며, 연결 조직, 표피 조직, 및 신경 조직 등에 광범위하게 분포되어 있는 음이온적, 비-황산화(non-sulfated) 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan)이며, 피부의 주요한 구성성분으로서 피부 재생에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한, 인간 난포액 내 하이아루로난의 농도는 142-256 ng/ml로 보고되고 있다(Babayan 등, 2008).

상기 “각질형성세포 성장인자(KGF)”는 FGF7로도 알려져 있으며 상처 재생(wound healing)의 상피화 단계(epithelialization-phase)에 관여하는 성장 인자이다. 상기 단계에서 각질형성세포가 상처를 커버하면서 상피를 형성하게 된다. 또한, 상기 각질형성세포 성장인자는 현재 알려진 23개의 섬유아세포 성장인자중의 하나로서, 섬유아세포 성장인자 수용체 2b(FGFR2b: fibroblast growth factor receptor 2b)와 결합하는 신호분자의 역할을 하기도 한다.

또한, 상기 난포액에 포함된 “인슐린”은 당과 아미노산의 세포 내로의 섭취를 촉진하여 세포를 증식시키는 역할을 하는 호르몬이며, somatomedins(IGF)와 연계하여 세포 증식을 촉진시킬 수 있다.

따라서, 상기와 같은 세포의 성장 및 증식을 돕는 성장인자를 포함한 본 발명의 난포액은 세포 배양 배지에서 세포 성장인자로서 역할을 할 수 있다. 특히, 일차세포 배양액의 경우에는 세포 성장인자가 포함되는 것이 필수적인데, 이는 기본배지에 비해 일차세포배양액이 고가인 주요 원인이기도 하다. 본 발명에서는 난포액을 세포 성장인자로서 사용함으로써, 기존의 세포배양액과 유사하거나 더 향상된 세포성장률을 보일 수 있으므로 고가의 세포 성장인자를 대체할 수 있다.

하기 표 1은 난포액이 포함하고 있는 성분을 기존 보고와 본 연구결과를 종합하여 난포 크기에 따라 정리한 것이다. 표 1에서 보듯이, 난포액에는 특히 각질형성세포와 같은 표피세포의 성장에 필요한 영양분이 풍부하게 들어있으므로 일차세포 성장인자로서 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용하는 난포액은 난포의 크기에 상관없이 사용할 수 있으나, 10 mm를 초과하는 크기를 갖는 난포에서 채취한 것이 바람직하며, 20 mm 이상의 크기를 갖는 난포에서 채취하는 것이 더욱 바람직하며, 20 ~ 30 mm의 난포로부터 채취한 난포액이 가장 바람직하다.

특히, 20 mm 이상의 난포로부터 난포액을 채취할 경우 5 ~ 10 mm의 작은 크 기의 난포에서 채취하는 경우보다 많은 양의 난포액을 채취할 수 있는 장점이 있고 에스트로겐이나 프로게스테론 등의 호르몬의 함량이 더 많고 영양인자가 고농도로 존재할 수 있다. 일반적으로 25 mm 이상의 난포를 낭종성 난포라고 하는데 낭종성 난포는 호르몬 농도의 교란으로 배란이 정상적으로 일어나지 않아 형성되는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들 난포는 오히려 세포사멸이 더디게 일어나고 계속적인 세포증식을 보이는 특성이 있다. 그 이유에 대해 명확히 밝혀져 있지는 않지만, 본 발명자는 난소의 낭종은 난소 및 세포에서 발현되는 채널들의 변화로 정상적인 물 이동이 이루어지지 않아 형성되는 것으로 생각하고 있다.

한편, 하기 표 1에서 보듯이, 25 mm 이상의 난포에서 채취한 난포액에는 5 ~ 10 mm의 작은 크기의 난포에서 채취한 난포액에서보다 낮은 농도의 테스토스테론 함량을 보이는데, 이는 세포증식에 효과적으로 작용할 것으로 예상된다. 상기 테스토스테론은 일반적으로 세르톨리, 라이디히 세포 등 고환 및 정자세포와 관련하여 많은 실험이 진행되었다. 그러나 테스토스테론을 흰쥐 연골세포에 첨가하였을 때 세포의 증식은 억제되었다. 이러한 실험결과로부터 테스토스테론은 세포의 증식보다는 분화에 관여하는 것으로 생각된다(Schfwartz 등, 1994).

본 발명에 따르면, 배지 조성물에 5-10 mm 크기의 난포에서 채취한 난포액이 포함된 경우보다 20mm 이상 크기의 난포로부터 채취한 난포액이 포함된 경우에 보다 높은 세포 성장 및 증식 효과를 보일 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에서는 5 ~ 15% 난포액을 포함할 수 있는데, 바람직하게는 8 ~ 12% 난포액을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 10% 난포액을 사용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "배지(culture media)"는 인 비트로(in vitro)에서 일차세포를 비롯한 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이러한 세포 배양 최소 배지에는 예들 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명에서는 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이 세포 배지에 난포액을 포함시켜 사용할 수 있으며, 난포액을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 세포 성장 및 증식을 촉진하는 물질을 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다. 예컨대, 본 발명의 배지에는 난포액 외에도 세포의 배양 및 유지에 도움을 주는 성장인자, 호르몬, 폴리펩타이드 및 무기물질을 추가로 포함할 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 성장인자, 호르몬, 폴리펩타이드 및 무기물질은 보빈 뇌하수체 추출물(Bovine Pituitary Extract), 상피세포 성장 인자(Epidermal Growth Factor), 인슐린, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 에피네프린, CaCl₂ 및 암포테리신 B로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 또한 상기 배지는 세균 감염을 방지하기 위해 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예로서, 각질형성세포의 일차세포 성장 배양액의 성분 및 함량은 하기 표 2와 같고, 기본배양액으로서 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)의 구성성분 및 함량은 표 3과 같다.

Component
Bovine Pituitary Extract	0.4 % (v/v)
Epidermal Growth Factor, rec. human	0.125 ng/ml
Insulin, human	5 μg/ml
Hydrocortison	0.33 μg/ml
Transferrin, human	10 μg/ml
Epinephrine	0.39 μg/ml
CaCl₂	0.15 mM
Amphotericin B	50 ng/ml
Gentamycin	50 μg/ml

Component	mg/L
Inorganic Salt
CaCl₂(anhyd.)	200.00
Fe(NO₃)₃.9H₂O	0.10
KCl	400.00
MgSO₄(anhyd.)
MgSO₄.7H₂O	200.00
NaCl	6400.00
NaHCO₃	3700.00
Other components
Glucose	125.00
Phenol Red	15.00
Sodium Pyruvate	110.00
Amino Acids
L-Arginine.HCl	84.00
L-Cystine	48.00
L-Glutamine	584.00
Glycine	30.00
L-Histidine.HCl.H₂O	42.00
L-Isoleucine	104.80
L-Leucine	104.80
L-Lysine.HCl	146.20
L-Methionine	30.00
L-Phenylalanine	66.00
L-Serine	42.00
L-Threonine	95.20
L-Tryptophan	16.00
L-Tryosine	72.00
L-Valine	93.60
Vitamine
D-Ca Pantothenate	4.00
Choline Chloride	4.00
Folic Acid	4.00
i-Inositol	7.00
Nicotinamide	4.00
Pyridoxine.HCl	4.00
Riboflavin	0.40
Thiamine.HCl	4.00

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물을 이용하여 일차세포를 배양하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 배지 조성물에서 배양시킬 수 있는 일차세포는 피부세포가 바람직하며, 각질형성세포(keratinocyte)가 더욱 바람직하다. 이외에도 섬유아세포(fibroblast), 기관지 평활근 세포 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일차세포를 배양하는 방법은 일정한 크기의 난포에서 난포액을 채취하고 이를 일차세포배양액에 포함하여 일차세포를 배양하는 것으로 구성될 수 있다. 상기 일차세포 배양액에 성장인자로서 난포액은 혈청을 대신하여 사용될 수 있다. 상기 난포액은 인간(human), 원숭이(monkeys), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheeps), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 포유동물 유래의 난포액을 포함하나, 바람직하게는 인간, 소, 돼지, 및 생쥐 유래의 난포액이고, 가장 바람직하게는 소 유래의 난포액이다. 또한, 본 발명에서 난포액은 당업계에 널리 알려진 일반적인 방법에 의하여 난소로부터 획득할 수 있으나, 기존의 병력이 없는 동물의 난포에서 채취하는 것이 바람직하다.

바람직한 일 양태로서, 상기 채취한 난포액은 원심분리를 통해 난포액 내 혈구 및 난구세포 등을 제거한 후 상층액만을 회수하고, 회수한 상층액을 불활성화시키고, 멸균 여과기를 이용하여 멸균한 후에 사용할 수 있다. 또한 상기 멸균한 난포액은 -20℃ 냉동고에 보관하였다가 사용 전에 해동하여 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면, 배지 조성물에 5-10 mm 크기의 난포에서 채취한 난포액이 포함된 경우보다 20mm 이상 크기의 난포로부터 채취한 난포액이 더 바람직하다.

본 발명의 일차세포배양용 배지 조성물에서는 5 ~ 15% 난포액을 포함할 수 있는데, 바람직하게는 8 ~ 12% 난포액을 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 10% 난포액을 사용할 수 있다.

본 발명에서는 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이 세포 배지에 난포액을 포함시켜 사용할 수 있으며, 난포액을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 세포 성장 및 증식을 촉진하는 물질을 함께 사용할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 배지에는 난포액 외에도 세포의 배양 및 유지에 도움을 주는 성장인자, 호르몬, 폴리펩타이드, 항생제 및 무기물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 난포액을 포함하는 무혈청 배지 조성물을 이용하여, 고가의 일차세포 성장액을 대체하여 경제적이면서도 기존의 혈청을 포함할 때의 부작용이 없고, 기존의 일차세포 성장액보다 유사하거나 더 향상된 세포성장율을 나타내는 세포의 성장 및 증식 효과를 가진다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험재료의 준비

1. 세포배양

정상 인간 각질형성세포(Normal human epidermal keratinocytes, NHEKs, Donor age 11, passage 1)는 웰스킨으로부터 구입하였다(Welskin, Seoul, Korea). 상기 NHEKs는 다음과 같은 성장인자(bovine pituitary extract (0.4% vol/vol), human recombinant epidermal growth factor (0.1 ng/ml), insulin (10 μg/ml) 및 hydrocortisol (0.5 μg/ml)가 포함된 각질형성세포 성장배양액(KBM^® CAMBREX, USA)에서 배양되었다. 성장인자를 포함하지 않은 배양액을 각질형성세포 기본 배양액으로 사용하였다. 난포액의 효과를 확인하기 위하여 인간 각질형성세포를 기본배양액, 각질형성세포 성장배양액 및 DMEM에 난포액을 첨가하여 첨가 전과 후를 비교하였다. 그리고 각 그룹간의 세포성장률을 비교하였다. 그 외 섬유아세포 및 인간 기관지평활근 세포도 동일한 방식으로 실험하였다. 각 세포들은 95% 공기, 5% 이산화탄소가 공급되는 배양기에서 배양되었다. 배양액은 2일마다 교체되었다. 난포액의 효과를 관찰하기위하여 각 세포들은 5일간 배양하였다.

2. 소 난포액 채취

본 발명에 공시된 난소는 도축장에서 도살된 한우의 암소에서 즉시 적출하여 penicillin G(100 units/㎖)와 streptomycin(100 ㎍/㎖)이 함유된 생리식염수(25∼30℃)가 들어 있는 보온병에 담아 3∼4 시간 내에 실험실로 운반하였다. 난포액을 채취하기 전에 난소주위의 불필요한 조직을 제거한 후 penicillin G(100 units/㎖)와 streptomycin(100 ㎍/㎖)이 함유된 생리식염수(25∼30℃)로 3 회 세척하였다. 18 gauge의 바늘이 부착된 30 ㎖ 주사기를 이용하여 난포액을 채취하였다. 흡입된 난포액은 15 ㎖의 시험관에 담아 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상층액을 회수하여 -20℃에서 보관하여 실험 시에 사용하였다.

3. 혈청 및 난포액의 호르몬 분석

호르몬 분석은 냉동보관된 난포액을 실온에서 융해한 후 프로게스테론, 에스트로겐, 테스토스테론, 인슐린 및 글루타치온 s-transferase를 측정할 수 있는 형광면역분석법(DELFIAkit, PerkinElmer, Truku, Finland)을 이용하여 호르몬 및 효소농도를 측정하였다. 난포액의 구분은 직경 10-15 mm 내외의 난포로부터 채취된 난포액과 25-30 mm의 난포로부터 채취된 난포액으로 구분하여 실험에 사용하였다.

실시예 2. 인간 각질형성세포( KBM )의 일차세포 성장에 미치는 난포액과 상용 성장인자의 효과 비교

일차세포의 성장인자와 난포액의 효과를 비교하기 위하여 각질형성세포 기본배양액(keratinocyte basal medium, KBM)에 실시예 1에서 언급한 성장인자와 10% 난포액을 처리한 그룹간의 세포성장률을 비교하였다. 난포액은 다시 분류하여 10-15 mm 크기의 난포로부터 채취된 난포액과 25 mm 이상 크기의 난포로부터 채취된 난포액을 비교하였다. 각 처리군은 각질형성세포를 24시간동안 배양한 후 그 결과를 분석하였다. 각질형성세포는 섬처럼 그룹을 지어서 자라는 특징이 있으므로 그 형태를 분석하였다.

실험결과, 도 1A에서 보듯이, 각질형성세포 기본배양액만을 처리한 그룹보다 성장인자가 포함된 그룹이 세포의 성장이 효율적으로 이루어짐이 확인되었고, 10% 난포액이 첨가된 그룹도 각질형성세포 기본배양액만 처리된 그룹보다 높은 성장률을 보였다. 특히, 25 mm 이상 크기의 난포로부터 채취된 난포액이 10-15 mm 크기의 난포에서 채취된 난포액보다 섬처럼 무리를 지어 각질형성세포의 모양을 갖춘 세포가 많아 더 높은 세포 성장률을 보였다. 또한, 각질형성세포 기본배양액에 첨가된 난포액은 성장인자와 유사한 효과를 보였다.

실시예 3. 기본배양액 DMEM 에 첨가된 난포액의 성장인자로서의 효과

난포액이 각질형성세포 기본 배양액이 아닌 일반적으로 세포주 배양 시 많이 사용하는 DMEM 기본배양액에 배양할 경우에도 성장인자와 같은 효과를 낼 수 있는지를 확인하고자, DMEM 배양액에 10% FBS, 10% FF 및 성장인자를 처리한 후 세포성장을 관찰하였다. 도 1B에서 보듯이, 10% FBS 처리군보다 10% FF를 처리한 군이 세포의 성장이 빠르게 진행되었고 10% FF 처리군과 성장인자 처리군 간에는 유의한 차이를 볼 수 없었다. 그러나 성장인자 처리군에서 세포의 모양이 10% FF 처리군보다 선명하게 유지되었다.

실시예 4. 손상된 피부세포의 세포증식 및 세포이주에 있어서의 난포액의 효과

도 1A와 도 1B에서 보는바와 같이 난포액은 세포의 성장을 촉진시키는 것을 알 수 있었다. 세포성장에 있어서 난포액의 효과를 재검증하고자 각질형성세포의 상처치유 실험을 실시하였다. 체외 상처치유 현상은 세포증식과 세포이주로 이루어진다. 각질형성세포에 노란 파이펫(20-200 μL) 팁으로 직선 상처를 낸 후 10% FBS와 10% 난포액을 처리하여 24 시간 후 상처치유 정도를 비교하였다. 실험 결과 도 1C에서 보듯이, 10% FBS 처리군보다 10% 난포액 처리군이 상처치유를 촉진시켰다.

실시예 5. 인간 기관지평활근세포의 증식에 있어서 난포액의 효과

기관지평활근세포의 세포성장에 있어서 난포액의 효과를 살펴보았다. DMEM 배양액에 24시간 동안 10% FBS, 성장인자 및 10% 난포액을 처리한 후 세포성장을 관찰하였다. 10% FBS 처리군보다 성장인자 및 10% 난포액 처리한 군에서 높은 세포성장률을 보였다. 10% 난포액 처리군이 성장인자 처리군 보다 사멸된 세포없이 성장률이 높았다(도 2A). 인간 기관지평활근세포 기본배양액(human bronchial smooth muscle cell medium, HBSMCM)에 10% FBS, 성장인자 및 10% 난포액을 처리한 후 24시간 동안 세포를 배양하였다. 10% FBS 처리군보다 성장인자 및 10% 난포액을 처리한 그룹에서 높은 세포성장률을 보였다(도 2B). 난포액이 각질형성세포 기본 배양액이 아닌 일반적으로 세포주 배양시 많이 사용하는 일차세포의 성장인자와 난포액의 효과를 비교하기위하여 각질형성세포 기본배양액(keratinocyte basal medium, KBM)에 위에서 언급한 성장인자와 10% 난포액을 처리한 그룹간의 세포성장률을 비 교하였다. 난포액은 다시 분류하여 10-15 mm 크기의 난포로부터 채취된 난포액과 25 mm 이상 크기의 난포로부터 채취된 난포액과 비교하였다. 각 처리군은 각질형성세포를 24시간동안 배양한 후 그 결과를 분석하였다. 각질형성세포는 섬처럼 그룹을 지어서 자라는 특징이 있으므로 형태의 분석이 필요하다. 도 1A에서는 기본배양액만을 처리한 그룹보다 성장인자가 포함된 그룹이 세포의 성장이 효율적으로 이루어짐이 확인되었고 10% 난포액이 첨가된 그룹도 기본배양액만 처리된 그룹보다 높은 성장률을 보였다. 특히, 25 mm 이상 크기의 난포로부터 채취된 난포액이 10-15 mm 크기의 난포에서 채취된 난포액보다 모양을 갖춘 세포의 성장이 높았다.

도 1은 인간 각질형성세포 배양 시 일차세포배양액 및 기본배양액에서의 난포액의 효과를 나타낸 것이다. (A)는 인간 각질형성세포 배양액(Keratinocyte Basal Medium, KBM)에 상용하는 성장 인자(growth factor)를 첨가한 것과 상기 KBM에 10% 난포액(follicular fluid, FF)을 첨가한 것과 상기 KBM에 25mm 이상의 크기를 갖는 난포로부터 채취한 난포액을 첨가한 것을 측정시작시점(0 h)과 24시간 후(24 h)의 세포 성장 정도를 비교하여 나타낸 것이다. (B)는 기본배양액 DMEM에 각각 10% FBS를 첨가한 것과 10% 난포액을 첨가한 것과 상용하는 성장 인자를 첨가한 배지에서의 각질형성세포의 24시간 후의 성장정도를 나타낸 것이다. (C)는 기본배양액 DMEM에 각각 10% FBS를 첨가한 배지와 10% 난포액을 첨가한 배지에서의 손상된 피부세포의 재생정도를 측정시작시점(0 h) 및 24시간 후(24 h)에 측정한 것을 나타낸 것이다.

도 2는 인간 기관지상피세포의 일차세포배양액 및 기본배양액에서의 난포액의 효과를 나타낸 것이다. (A)는 기본배양액 DMEM에 각각 10% FBS를 첨가한 것과 상용하는 성장 인자, 10% 난포액을 첨가한 배지에서의 각질형성세포의 24시간 후의 성장정도를 나타낸 것이다. (B)는 인간 기관지상피세포 배양액(human bronchial smooth muscle cell medium, HBSMCM)에 상용하는 성장 인자(growth factor)를 첨가한 것과 상기 HBSMCM에 10% 난포액(follicular fluid, FF)을 첨가한 것을 측정시작시점(0 h)과 24시간 후(24 h)의 세포 성장 정도를 비교하여 나타낸 것이다.

Claims

난포액을 포함하는 세포 성장 및 증식용 무혈청 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 난포액은 10% 난포액인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 난포액은 히아루로난(hyaluronan), 각질형성세포 성장 인자, 에스트로겐, 프로게스테론, 테스토스테론, 인슐린, 콜레스테롤, 글루타치온 에스-트랜스퍼라제, K⁺, Na⁺, Cl^-, 및 피브리노겐을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 난포액은 인간, 소, 돼지 또는 생쥐로부터 추출한 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제2항에 있어서, 상기 난포액은 20 - 30 mm의 난포로부터 채취한 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 세포는 일차세포인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제6항에 있어서, 상기 일차세포는 각질형성세포(keratinocyte) 또는 기관지 평활근 세포인 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 소의 뇌하수체 추출물(Bovine Pituitary Extract), 상피세포 성장 인자(Epidermal Growth Factor), 인슐린, 하이드로코르티손, 트랜스페린, 에피네프린, CaCl₂, 암포테리신 B, 및 겐타마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 배지 조성물을 이용하여 일차세포를 배양하는 방법.