CN111676190B - 一种干细胞向成软骨分化的诱导剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种干细胞向成软骨分化的诱导剂及其应用，所述诱导剂包括PDGF、bFGF和TGF‑β；所述诱导剂还包括胰岛素和/或IGF。本发明的PDGF、bFGF、TGF‑β和胰岛素或IGF在高浓度的配比条件下，发挥多因子的网络调节作用，协同作用在3天内高效诱导间充质干细胞向成软骨细胞的分化，配方简洁，配制工艺简单，有助于明显缩短成软骨细胞生产周期。

Description

一种干细胞向成软骨分化的诱导剂及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种干细胞向成软骨分化的诱导剂及其应用。

背景技术

关节软骨的损伤严重影响患者的生活质量，由于自身修复能力有限，损伤的关节软骨无法进行自我修复。临床治疗通常采用保守策略，或者利用生物材料替代品替换损伤的关节软骨，但是仍然面临许多问题，无法达到完全修复的目的。

近年来，干细胞治疗技术的发展为退行性或损伤性疾病的治疗提供了无限可能。间充质干细胞(MSCs)是一类具有自我更新和分化能力的细胞，越来越多的研究证实其在多种疾病的治疗中具有应用潜能。MSCs有多种来源，如脐带、骨髓、皮肤、外周血等。围产期组织由于处于早期发育阶段，细胞活力更强，是理想的干细胞来源。围产期来源的组织包括脐带和胎盘两种，人脐带MSCs(hUC-MSCs)细胞纯度高，增殖和分泌活性强，免疫风险低，无需配型，无伦理争议，是未来临床应用的理想的种子细胞。脐带的解剖学结构主要包括外层羊膜、中间三根血管及其间的华通胶，华通胶是主要结构。在现有研究中，脐带MSCs分离自脐带华通胶和羊膜，通常称为脐带MSCs和羊膜MSCs，两种MSCs均具有贴壁生长、表达特异的细胞表面标记分子和成骨、成脂和成软骨三向分化能力等特征，符合国际通用的MSCs鉴定标准。

MSCs分化为软骨的潜能和对软骨分化的促进作用使其在软骨损伤治疗中具有无可比拟的优势，有望作为治疗药物彻底治愈软骨损伤。然而，无论是直接移植MSCs原位诱导软骨分化还是通过软骨组织工程体外构建软骨后进行移植替换，两种思路均无法避开一个关键的步骤，即诱导MSCs成软骨向分化。

目前，MSCs诱导分化成软骨一般使用含有地塞米松、转移生长因子β1(TGF-β1)、抗坏血酸、丙酮酸钠等的诱导剂并补充其他辅助成分，例如CN105039247A公开了一种含有小分子多肽、TGF-β、地塞米松和维生素C的诱导干细胞向成软骨分化的制剂，CN109825469A公开了一种含TGF-β1、铁蛋白、抗坏血酸、地塞米松、丙酮酸钠的软骨分化诱导剂，添加因子种类繁多，容易导致配制比例不准确和增加成本，并且需要对MSCs进行14～21天诱导，MSCs才会出现明显的形态特征和染色阳性结果；CN110468097A、CN108753700A等对软骨分化诱导剂或方法进行了改良，诱导时间缩短到了8天，但是仍然存在添加因子种类繁多、操作流程复杂等问题。

现有技术尚无法实现将MSCs向成软骨的诱导分化周期缩短至一周以内。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种干细胞向成软骨分化的诱导剂及其应用，所述诱导剂配方简洁，成本低廉，可以在3天内高效诱导间充质干细胞向成软骨向分化，显著缩短了研究周期。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种干细胞向成软骨分化的诱导剂，所述诱导剂包括PDGF、bFGF、TGF-β；

所述诱导剂还包括胰岛素和/或IGF。

血小板衍生因子(PDGF)是一种重要的促有丝分裂因子，具有刺激特定细胞群分裂增殖的能力，可以促进成骨系细胞的存活和分化，指引成骨细胞系的迁移。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞因子家族中的一种，FGFs及其受体(FGFRs)在MSCs向软骨分化及软骨形成过程中具有重要作用，FGFs能促进软骨细胞增殖并抑制其肥大化，抑制FGF信号会导致软骨发育不良；MSCs在体外培养时，FGF是促进其增殖及维持其分化潜能的主要细胞因子。FGF信号通路不仅与骨骼系统的发育有关，还与软骨形成密切相关，有研究利用FGF9和FGF18基因敲除小鼠证明了FGFs是Runt相关的转录因子2(RUNX2)的上游细胞因子，并能促进未成熟的软骨细胞增殖和成软骨分化；能够上调转录因子Sox2并抑制Wnt信号从而导致MSCs成骨分化能力下降，促进MSCs向软骨分化；FGF在诱导MSCs成软骨分化时，能够提高软骨微球中的蛋白多糖的生成。TGF-β对间充质起源的细胞具有刺激作用，TGF-β通路已被证明在成骨和成软骨分化体系中具有重要作用；TGF-β通过Smad3通路可以抑制MSCs向脂肪分化，阻断了Smad 3介导的TGF-β信号传导致成脂分化。TGF-β也可以激活MAPKs(丝裂原活化蛋白激酶)路径，MAPKs包括JNK、p38和ERK，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与大量的细胞活动，如增殖、炎症、迁移和分化，JNK、p38和ERK能够通过不同的信号通路调节TGF-β，刺激间充质干细胞向软骨分化及软骨形成；已有大量研究表明，微量的TGF-β即可使蛋白聚糖(proteoglycan)和Ⅱ型胶原的合成明显增加；TGF-β可以使成软骨分化早期相关基因SOX-9的表达水平升高，同时伴随着软骨细胞外基质Ⅱ型胶原的基因表达水平上升，而Ⅱ型胶原是透明质酸软骨合成的重要生物标志物；另一软骨细胞细胞外基质成分聚蛋白聚糖(aggrecan)的表达也具有类似的改变；而成骨相关基因Ⅰ型胶原的表达水平则进一步明显下降，由此显示TGF-β的另一作用即保持MSCs诱导而来的软骨细胞透明质酸软骨表型。胰岛素可以显著提高MSCs的成软骨分化程度，能显著提高聚蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和黏多糖等软骨细胞外基质主要成分的合成，并且与TGF-β具有协同作用，两者合用较单独添加能最大程度提高MSCs细胞增殖和成软骨分化程度。胰岛素样生长因子(IGF)能够通过刺激细胞增殖、调节细胞凋亡和诱导软骨细胞相关标志基因的表达来促进软骨形成。

本发明在研究间充质干细胞增殖过程中，意外发现PDGF、bFGF、TGF-β和胰岛素/IGF的组合可以作为诱导剂诱导干细胞向成软骨分化，在不添加其他辅助因子的条件下，就可以在3天内高效诱导间充质干细胞分化为软骨细胞，诱导后的细胞聚集形成了软骨分化经典的组织团模式，阿利辛蓝染色结果确认细胞发生了典型的软骨分化。

优选地，所述PDGF包括PDGF-AA、PDGF-AB或PDGF-BB中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，PDGF-AA、PDGF-AB和PDGF-BB在促进成骨系细胞的存活和分化、指引成骨细胞系的迁移等方面具有相似的功效，与bFGF、TGF-β和胰岛素/IGF相互配合，用于将干细胞诱导分化为成软骨。

优选地，所述TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2或TGF-β3中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3均对间充质起源的细胞具有刺激作用，可以保持MSCs诱导而来的软骨细胞透明质酸软骨表型。

优选地，所述IGF包括IGF-1和/或IGF-2。

本发明中，IGF-1和IGF-2、尤其是IGF-1被认为是软骨形成的重要生长因子之一。据报道，IGF-1可以招募关节内软骨细胞修复关节软骨损伤，IGF-1能增强软骨细胞的代谢，可以调节间充质干细胞向软骨分化，同时保持间充质干细胞向软骨分化的潜能。

优选地，所述PDGF和所述bFGF的质量比为(0.8～4):3，例如可以是0.8:3、1:3、2:3、3:3或4:3。

优选地，所述PDGF和所述TGF-β的质量比为(0.8～4):3，例如可以是0.8:3、1:3、2:3、3:3或4:3。

优选地，所述PDGF和所述胰岛素的质量比为(0.6～8):1000，例如可以是0.6:1000、1:1000、2:1000、3:1000、4:1000、5:1000、6:1000、7:1000或8:1000。

优选地，所述PDGF和所述IGF的质量比为(0.6～8):1000，例如可以是0.6:1000、1:1000、2:1000、3:1000、4:1000、5:1000、6:1000、7:1000或8:1000。

本发明中，PDGF、bFGF、TGF-β和胰岛素或IGF在合理的质量比范围内，可以高效诱导间充质干细胞分化为成软骨细胞，不在此合理的质量比范围内，则会影响诱导效率。

第二方面，本发明提供了一种成软骨分化诱导培养基，所述培养基包括基础培养基和添加于所述基础培养基中的第一方面所述的诱导剂。

优选地，所述PDGF在所述培养基中的浓度为30～80ng/mL，例如可以是30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL或80ng/mL，优选为40～50ng/mL。

优选地，所述bFGF在所述培养基中的浓度为60～110ng/mL，例如可以是60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL或110ng/mL，优选为70～90ng/mL。

优选地，所述TGF-β在所述培养基中的浓度为60～110ng/mL，例如可以是60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL或110ng/mL，优选为70～90ng/mL。

优选地，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为10～50μg/mL，例如可以是10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL或50μg/mL，优选为10～20μg/mL。

优选地，所述IGF在所述培养基中的浓度为10～50μg/mL，例如可以是10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL或50μg/mL，优选为10～20μg/mL。

本发明中，PDGF、bFGF、TGF-β和胰岛素/IGF在高浓度的配比条件下，发挥多因子的网络调节作用，协同作用高效诱导间充质干细胞向成软骨细胞的分化，配方简洁，不需要额外添加其他辅助因子，配制工艺简单，避免了细胞污染等情况对实验结果的影响。

优选地，所述基础培养基为无血清基础培养基。

优选地，所述基础培养基包括DMEM/F12、α-MEM或DMEM高糖中的任意一种，DMEM为Dulbecco’s Modified Eagle Medium的缩写。

本发明的培养基在诱导间充质干细胞向成软骨细胞分化方面具有显著效果，采用优选的培养基配方培养间充质干细胞3天，便聚集形成了软骨分化组织团。

第三方面，本发明提供了一种诱导干细胞向成软骨分化的方法，所述方法包括采用第二方面所述的培养基培养间充质干细胞。

优选地，所述培养的时间不超过3天。

本发明中，采用含有30～80ng/mL PDGF、60～110ng/mL bFGF、60～110ng/mL TGF-β和10～50μg/mL胰岛素或10～50μg/mL IGF的无血清基础培养基培养间充质干细胞，3天内就可以诱导形成成软骨细胞，显著缩短了干细胞研究周期。

优选地，所述间充质干细胞的传代代数为4～8代。

优选地，所述方法在培养间充质干细胞前，还包括从脐带华通胶和/或脐带羊膜获取所述间充质干细胞的步骤。

第四方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括采用第二方面所述的培养基诱导培养间充质干细胞制备得到的成软骨细胞。

优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。

第五方面，本发明提供了一种治疗软骨损伤的药物，所述药物包括第四方面所述的药物组合物。

第六方面，本发明提供了一种治疗方法，所述方法包括向个体施用采用第二方面所述的培养基诱导培养间充质干细胞制备得到的成软骨细胞的步骤，所述成软骨细胞的数量足以重构关节软骨。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明采用PDGF、bFGF、TGF-β和胰岛素的组合或PDGF、bFGF、TGF-β和IGF的组合作为诱导剂诱导干细胞向成软骨分化，在不添加其他辅助因子的条件下，四种因子发挥网络调节作用，协同作用在3天内高效诱导间充质干细胞向成软骨方向分化；

(2)本发明的诱导剂和诱导培养基配方简洁，不需要额外添加其他辅助因子，配制工艺简单，避免了细胞污染等情况对实验结果的影响；

(3)本发明的诱导方法简单高效，显著缩短了成软骨细胞培养周期，在软骨损伤治疗领域具有重要意义。

附图说明

图1A为实施例1的hUMSCs诱导3天后的细胞形态，图1B和图1C所示为不同视野范围内的阿利辛蓝细胞染色情况；

图2为实施例2的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图3为实施例3的hBMSCs诱导3天后的细胞形态；

图4为实施例4的hAMSCs诱导3天后的细胞形态；

图5为实施例5的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图6为实施例6的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图7为对比例1的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图8为对比例2的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图9为对比例3的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图10为对比例4的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图11为对比例5的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图12为对比例6的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图13为对比例7的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图14为对比例8的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图15为对比例9的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图16为对比例10的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图17为对比例11的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图18为对比例12的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图19为对比例13的hUMSCs诱导3天后的细胞形态；

图20为对比例14的hUMSCs诱导3天后的细胞形态。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1

本实施例以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为细胞类型，基础培养基选择DMEM/F12，进行成软骨分化诱导，步骤如下：

(1)收集足月健康剖宫产胎儿脐带，浸没于含1％青霉素和链霉素的PBS或生理盐水中，置于冰上；

(2)在超净台上将脐带剪裁为长度约3cm的小段，分别纵向剖开，用无菌PBS反复冲洗至液体无血污，分离动静脉(共3条)，剩余组织即为华通胶和羊膜；

(3)将剩余组织剪切为小于2mm³的小块，PBS冲洗后将组织块置于含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基中，在37℃、5％CO₂培养箱中培养；

(4)倒置相差显微镜下观察组织块周围细胞爬出情况，5天后首次更换培养液，以后每隔4天换液，当细胞扩增至占细胞瓶底面积80％～90％时，用0.05％胰酶-EDTA消化传代(首次1:2传代，后续每3天1:3或1:4传代)；

(5)取1×10⁶个第三代细胞，加入100μL细胞染色缓冲液，根据抗体说明书加入相应体积的抗体(PE、APC或FITC标记的鼠抗人CD105、CD44、CD90、CD29、CD34、CD45和人类白细胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)-DR单克隆抗体)，室温孵育30min，1000r/min离心5min，弃上清，加入500μL PBS上机检测，结果对比国际标准即细胞表面表达CD105、CD73和CD90(≥95％)，不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR(≤2％)，实验结果达到并超过该标准，说明成功分离得到脐带MSCs和羊膜MSCs；

(6)将细胞传代到4～8代时接种12孔板，使用含有80ng/mL PDGF-AB、110ng/mLbFGF、110ng/mL TGF-β1和50μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基进行培养；

(7)培养三天后，显微镜下观察细胞形态。

如图1A所示，采用本发明的诱导分化培养基诱导的hUMSCs细胞形态发生显著改变，细胞聚集形成了软骨分化经典的类组织模式；为确认成骨分化的发生，对细胞进行阿利辛蓝染色30min，蒸馏水冲洗两次后显微镜下观察染色效果，如图1B和图1C所示为不同视野范围内的细胞染色情况，阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖，染色结果可见所有细胞发生了软骨分化，分化程度高，成熟度高，每个培养皿的孔中可见6～15个软骨细胞团。

对细胞进行MSCs多能性标志分子的流式分析，结果如表1所示，说明细胞团确实从MSCs分化而来。

表1 MSCs表面标志分子流式分析结果

实施例2

本实施例以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为细胞类型，基础培养基选择DMEM高糖，进行软骨分化诱导，诱导分化培养基为含有30ng/mL PDGF-AB、60ng/mL bFGF、60ng/mLTGF-β1和10μg/mL胰岛素的DMEM高糖培养基，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

如图2所示，培养3天后可见hUMSCs细胞形态发生显著改变，细胞聚集形成了软骨分化经典的类组织模式，高效分化为软骨细胞样组织团，说明本发明的诱导分化培养基在3天内可以高效诱导MSCs分化为软骨细胞团。

实施例3

本实施例以人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)为细胞类型，基础培养基选择α-MEM，进行软骨分化诱导，诱导分化培养基为含有40ng/mL PDGF-AB、70ng/mL bFGF、70ng/mL TGF-β1和10μg/mL胰岛素的α-MEM培养基，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

如图3所示，培养3天后可见hBMSCs细胞形态发生显著改变，细胞聚集形成了软骨分化经典的类组织模式，高效分化为软骨细胞样组织团，说明本发明的诱导分化培养基在3天内可以高效诱导MSCs分化为软骨细胞团。

实施例4

本实施例以人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)为细胞类型，基础培养基选择α-MEM，进行软骨分化诱导，诱导分化培养基为含有50ng/mL PDGF-AA、90ng/mL bFGF、90ng/mL TGF-β1和10μg/mL胰岛素的α-MEM培养基，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图4所示，hAMSCs在诱导3天内高效诱导分化为软骨细胞团。

实施例5

本实施例以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为细胞类型，基础培养基选择DMEM/F12，进行软骨分化诱导，诱导分化培养基为含有80ng/mL PDGF-BB、110ng/mL bFGF、110ng/mL TGF-β1和50μg/mL胰岛素的DMEM/F12培养基进行培养，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图5所示，细胞也能发生明显的软骨细胞分化，染色结果确认分化程度高，但软骨细胞团较少。

实施例6

本实施例以人脐带间充质干细胞(hUMSCs)为细胞类型，基础培养基选择DMEM/F12，进行软骨分化诱导，诱导分化培养基为含有80ng/mL PDGF-AB、110ng/mL bFGF、110ng/mL TGF-β1和50μg/mL IGF-1的DMEM/F12培养基进行培养，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图6所示，细胞能高效聚集成软骨球的形态，阿里辛蓝染色明显。

对比例1

与实施例1相比，诱导分化培养基采用商用软骨分化诱导培养基(广州赛业货号HUXUC-90041)，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

如图7所示，采用商用软骨分化诱导培养基诱导hUMSCs 3天后，细胞发生大量增殖，数量显著提高，但是细胞形态未发生显著改变。按其说明需持续诱导21～28天后软骨细胞球才能用阿里辛蓝染色检测。

对比例2

与实施例2相比，诱导分化培养基采用WO2016147005A1的配方，其他条件和实验步骤与实施例2相同。

如图8所示，采用WO2016147005A1的配方诱导hUMSCs 3天后，细胞发生大量增殖，数量显著提高，但是细胞形态未发生显著改变，继续培养至14天，hUMSCs才逐渐分化为软骨细胞团。

可以看出，现有技术方案无法实现将MSCs向成软骨的诱导分化周期缩短至一周以内的效果，更无法实现将诱导分化周期缩短至3天的效果。

对比例3

与实施例1相比，诱导分化培养基中省略了PDGF-AB，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图9所示，细胞的诱导分化明显迟滞，细胞的排列模式仅仅出现了局部聚集的迹象，观察不到软骨细胞团样结构。

对比例4

与实施例1相比，诱导分化培养基中省略了bFGF，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图10所示，细胞的诱导分化明显迟滞，细胞的排列模式仅仅出现了局部聚集的迹象，观察不到软骨细胞团样结构。

对比例5

与实施例1相比，诱导分化培养基中省略了TGF-β1，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图11所示，细胞的诱导分化明显迟滞，细胞的排列模式仅仅出现了局部聚集的迹象，观察不到软骨细胞团样结构。

对比例6

与实施例1相比，诱导分化培养基中省略了胰岛素，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图12所示，细胞的诱导分化明显迟滞，细胞的排列模式仅仅出现了局部聚集的迹象，观察不到软骨细胞团样结构。

对比例7

与实施例1相比，诱导分化培养基中的PDGF-AB的浓度为10ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图13所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖。

对比例8

与实施例1相比，诱导分化培养基中的PDGF-AB的浓度为100ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图14所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖，但是同时可见细胞凋亡增加，分泌物累积过多，可能出现了快速过度增殖和凋亡，细胞状态变差。

对比例9

与实施例1相比，诱导分化培养基中的bFGF的浓度为30ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图15所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖。

对比例10

与实施例1相比，诱导分化培养基中的bFGF的浓度为150ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图16所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖，但是同时可见细胞凋亡增加，分泌物累积过多，可能出现了快速过度增殖和凋亡，细胞状态变差。

对比例11

与实施例1相比，诱导分化培养基中的TGF-β1的浓度为30ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图17所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖。

对比例12

与实施例1相比，诱导分化培养基中的TGF-β1的浓度为150ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图18所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖，但是同时可见细胞凋亡增加，分泌物累积过多，可能出现了快速过度增殖和凋亡，细胞状态变差。

对比例13

与实施例1相比，诱导分化培养基中的胰岛素的浓度为1ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图19所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖。

对比例14

与实施例1相比，诱导分化培养基中的胰岛素的浓度为60ng/mL，其他条件和实验步骤与实施例1相同。

结果如图20所示，细胞未观察到明显分化的形态，细胞发生了一定程度的增殖，细胞凋亡有增加的迹象。

综上所述，本发明采用PDGF、bFGF、TGF-β和胰岛素的组合或PDGF、bFGF、TGF-β和IGF的组合作为诱导剂诱导干细胞向成软骨分化，在不添加其他辅助因子的条件下，四种因子发挥网络调节作用，协同作用在3天内高效诱导间充质干细胞向成软骨细胞的分化，在软骨损伤治疗领域具有重要的应用前景。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (18)

1.一种间充质干细胞向成软骨分化的诱导剂，其特征在于，所述诱导剂由PDGF、bFGF和TGF-β组成；

所述诱导剂还同时由胰岛素和/或IGF组成；

所述PDGF和所述bFGF的质量比为(0.8~4):3；

所述PDGF和所述TGF-β的质量比为(0.8~4):3；

所述PDGF和所述胰岛素的质量比为(0.6~8):1000；

所述PDGF和所述IGF的质量比为(0.6~8):1000；

所述PDGF包括PDGF-AA、PDGF-AB或PDGF-BB中的任意一种或至少两种的组合；

所述TGF-β为TGF-β1；

所述IGF为IGF-1。

2.一种成软骨分化诱导培养基，其特征在于，所述培养基包括基础培养基和添加于所述基础培养基中的权利要求1所述的诱导剂。

3.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述PDGF在所述培养基中的浓度为30~80 ng/mL。

4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于，所述PDGF在所述培养基中的浓度为40~50 ng/mL。

5.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述bFGF在所述培养基中的浓度为60~110 ng/mL。

6.根据权利要求5所述的培养基，其特征在于，所述bFGF在所述培养基中的浓度为70~90 ng/mL。

7.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述TGF-β在所述培养基中的浓度为60~110 ng/mL。

8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述TGF-β在所述培养基中的浓度为70~90 ng/mL。

9.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为10~50 μg/mL。

10.根据权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素在所述培养基中的浓度为10~20 μg/mL。

11.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述IGF在所述培养基中的浓度为10~50 μg/mL。

12.根据权利要求11所述的培养基，其特征在于，所述IGF在所述培养基中的浓度为10~20 μg/mL。

13.根据权利要求2所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基为无血清基础培养基。

14.根据权利要求13所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基包括DMEM/F12、α-MEM或DMEM高糖中的任意一种。

15.一种诱导干细胞向成软骨分化的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求2-14任一项所述的培养基培养间充质干细胞。

16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述培养的时间不超过3天。

17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述间充质干细胞的传代代数为4~8代。

18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述方法在培养间充质干细胞前，还包括从脐带华通胶和/或脐带羊膜获取所述间充质干细胞的步骤。

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