CN107338218B - 一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法 - Google Patents

一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法，属于细胞生物学技术领域，采用的技术方案是，所述诱导分化培养基中包括TGF‑β3、FGF‑18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸‑2‑磷酸酯和脯氨酸。具有如下优点：快速促进软骨细胞合成代谢，促进软骨发生，显著提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖表达，并且减少了体外诱导培养所需的时间；广泛适合于各培养体系，尤其的适合于pellet体系及三维细胞支架培养体系。

Description

一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和 方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法。
背景技术
关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)组成，是一种特殊形式的结缔组织，其功能是减轻关节运动作用于软骨下骨的压力并减少关节面的摩擦。由于软骨组织没有血液供应，只能依靠关节液提供营养，因此，一旦软骨组织发生损伤，再生修复能力极差，很难自愈。而导致软骨损伤的原因诸多，如外力冲击、自生免疫性疾病如类风湿性关节炎、老龄化导致的机体退化等，造成软骨损伤发病率高，治疗费用昂贵，是骨科领域的一大难题。据统计，仅美国的软骨损伤患者就有4000万，每年治疗费用约300亿美元。自体软骨细胞移植(ACI)技术是目前软骨损伤治疗的主要方法，然而在临床上，ACI技术为“两步法”手术治疗方式，要将患者关节非负重区的自体软骨取出少量，在体外进行软骨细胞的分离培养和扩增，然后回植于缺损区进行局部软骨缺损修复，存在供区部位损伤、软骨细胞数量少，体外扩增困难，软骨细胞去分化等问题，并且治疗费用超过人工关节置换费用，因此，大大限制了临床的广泛应用，需要寻找更合适的移植细胞。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSCs)具有增殖能力强、多向分化潜能及免疫调节等功能，在软骨损伤的修复中成为研究热点。与自体软骨细胞移植相比，MSCs来源广泛、获取方便、能够快速扩增，费用显著降低，有明显优势。关于骨髓间充质干细胞(BMSCs)的研究较多，但骨关节损伤患者通常出现自体的骨髓间充质干细胞活力下降，数量降低、增殖和分化潜能受损、软骨分化能力降低等。相比之下，脂肪间充质干细胞(Adipose-derived Stem Cells，ADSCs)同样具有多向分化潜能，来源于自体脂肪组织，获取更加方便，且含量更高(100g的脂肪组织中MSCs数量是100mL骨髓的～300倍)，即使是骨关节损伤患者，ADSCs受影响很小，因此，ADSCs是软骨损伤治疗的理想替代细胞，近年来作为种子细胞和细胞载体被广泛应用于软骨组织工程和基因治疗。然而，目前将ADSCs分化成软骨细胞的方法一般是将ADSCs培养至传代后，再以含有诱导剂的培养基中进行诱导培养，将ADSCs定向诱导为软骨细胞。公开号CN105695402A的中国发明专利公开了一种诱导间充质干细胞向软骨细胞分化的组合物，所述组合物中包含20-80μM的L-抗坏血酸-2-磷酸酯，2-10ng/mLTGF-β3，50-150nM地塞米松，10-50μg/mL维生素C，10-50μg/mL脯氨酸，0.5-5μg/mL吲哚美辛，1×ITS+1premix，0.5-10μg/mL氯地孕酮酯，该诱导剂可提高间充质干细胞的分化活性和分化定向性；公开号CN103146645A的中国发明专利公开了一种诱导间充质干细胞成为软骨细胞的方法，其中的诱导分化培养基中含有甲状旁腺激素相关蛋白1-34。上述诱导剂均添加了激素类物质，其临床安全性受质疑，另一方面，由于间充质干细胞的定向诱导分化受很多不同信号通路的影响，而且诱导培养间充质干细胞的细胞微环境变化对于间充质干细胞诱导分化及其分子结构有着非常重要的影响，导致现有的间充质干细胞分化成软骨细胞的方法所需周期都较长，通常需要3-5周，并且诱导后II型胶原的表达效率较低，难以用于临床的修复和治疗，因此，研究组分简单、安全性高、诱导活性高的诱导剂、诱导分化培养基及诱导方法是软骨修复研究及临床应用领域急需解决的一大难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基和方法，用以解决现有脂肪干细胞向软骨细胞分化时分化率低、周期长、诱导分化后II型胶原表达效率低的问题，通过科学组合配比TGF-β3、FGF-18、胰岛素、硒、转铁蛋白及丙酮酸钠等组分，实现了以FGF-18强烈促进TGF-β3诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，促进了软骨细胞分化关键基因Sox-9的表达，增加了软骨细胞合成代谢，促进软骨发生，组分相辅相成，协同增效，显著提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖表达，并且减少了体外诱导培养所需的时间。
为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基由TGF-β3、FGF-18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯和脯氨酸分散于基础培养基中形成，所述诱导分化培养基中各组分的终浓度如下：TGF-β3为8-12ng/mL，FGF-18为50-120ng/mL，地塞米松50-100nM、胰岛素10mg/L、硒5-6μg/L、转铁蛋白5-6mg/L、亚油酸4-5mg/L、BSA0.4-0.6g/L、丙酮酸钠溶液50-100mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯20-80mg/L、脯氨酸10-50mg/L；所述基础培养基为DMEM高糖培养基或DMEM/F12培养基。
本发明还提供一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)收集脂肪组织以胶原酶消化分离脂肪间充质干细胞，获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞培养至80-90％融合时，以胰酶消化，按分种率1∶3--1∶6接种至新培养瓶中进行传代培养，待细胞生长达到80-90％融合时，胰酶消化并离心得传代的脂肪间充质干细胞；
(2)传代的脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化培养：将传代的脂肪间充质干细胞加入至包括诱导分化培养基的细胞培养体系中，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，每2-4天更换一次诱导分化培养基，培养7-16天，得诱导分化的软骨细胞，所述诱导分化培养基由TGF-β3、FGF-18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯和脯氨酸分散于基础培养基中形成，诱导分化培养基中各组分的终浓度如下：TGF-β3为8-12ng/mL，FGF-18为50-120ng/mL，地塞米松50-100nM、胰岛素10mg/L、硒5-6μg/L、转铁蛋白5-6mg/L、亚油酸4-5mg/L、BSA0.4-0.6g/L、丙酮酸钠溶液50-100mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯20-80mg/L、脯氨酸10-50mg/L。
进一步的，所述细胞培养体系为Pellet培养体系或三维细胞水凝胶支架培养体系。
进一步的，所述三维细胞水凝胶支架培养体系为纤维蛋白水凝胶支架三维培养体系。
进一步的，所述Pellet培养体系中细胞密度为1×105个/g～1×108个/g。
上述技术方案中，提供的诱导分化培养基组成中包括TGF-β3、FGF-18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯和脯氨酸，其组成及配比是本发明通过科学巧妙选择，合理配比所得，该比例是无数次细胞水平、分子水平实验及结合理论依据探究所得，本发明提供的诱导分化培养基利用地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯等一定量的辅助组分结合恰到好处的FGF-18协同促进TGF-β3对脂肪间充质干细胞向软骨细胞的分化，从而进一步显著提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖表达。
本发明方法具有如下优点：(1)本发明通过科学配比TGF-β3和FGF-18组成比例，以FGF-18促进TGF-β3对脂肪间充质干细胞向软骨细胞的诱导分化效果，促进了软骨细胞合成代谢及软骨发生，显著提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖表达。(2)本发明提供的诱导分化培养基能大大缩短体外诱导培养所需的时间，由传统的3-5周缩短到10天即可大量诱导软骨细胞，提高了实验效率；(3)本发明提供的诱导分化培养基广泛适合于各培养体系，尤其的适合于pellet体系及三维细胞支架培养体系，具有良好的、广阔的应用前景，且成本较低,适合大规模广泛使用；(4)本发明阐明了FGF-18联合TGF-β3通过协同增加转录因子Sox-9的表达促进脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的分子机制，为深层次科学研究及临床研究提供了理论基础。
附图说明
图1为实施例1中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后的总胶原含量结果。
图2-1为实施例1中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后软骨相关基因Col2a1的表达结果。
图2-2为实施例1中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后软骨相关基因Aggrecan的表达结果。
图2-3为实施例1中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后软骨相关基因Sox-9的表达结果。
图2-4为实施例1中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后软骨相关基因Prg4的表达结果。
图3为实施例2中诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化后不同时间点软骨细胞外基质糖胺聚糖的表达结果。
具体实施方式
以下实施例用于详细说明本发明提供的诱导脂肪间充质干细胞向软骨分化的诱导剂和方法，但不用来限制本发明的范围。实施例中所涉及的试剂，如无特殊说明，均可从商业途径获得，所涉及的操作方法，如无特殊说明，均为常规方法，所涉及单位如nM表示nmol/L，wt.％表示质量百分比。
实施例1
1.1人脂肪干细胞原代培养：收集手术患者脂肪组织20mL，PBS磷酸缓冲液冲洗3次，将脂肪组织剪碎并转移到15mL离心管内，加入等体积0.1wt.％的Ⅰ型胶原酶，37℃水浴消化1.5小时，2000r/min离心5min；弃上清，PBS磷酸缓冲液重悬后以200目细胞筛过滤悬至新离心管中，再次2000r/min离心5min；弃上清，加入含10％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM/F12培养基重悬，将细胞涡旋混匀后接种于10cm培养皿，放置于37℃、5％CO2培养箱中培养。48h后首次换液，以后每隔1-2天换液，80％融合时，以胰酶-EDTA消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，弃上清，以1∶3的比例传代，培养至第三代，消化离心后，得P3代脂肪间充质干细胞；
1.2Pellet培养体系诱导培养软骨细胞：收集P3代脂肪间充质干细胞，重悬计数，在每个15mL离心管中加入5×105个细胞，共设置12个离心管，分为对照组、阳性对照组A、阳性对照组B和实验组共4组，每组3个平行，分别以300g离心5min，倾弃上清，各组分别按照如下方式处理。
实验组各加入2mL本发明提供的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基为诱导剂分散于含10％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM/F12培养基形成，诱导剂组分及其在诱导分化培养基的终浓度如下：TGF-β3为10ng/mL，FGF-18为70ng/mL，地塞米松100nM、胰岛素10mg/L、硒5μg/L、转铁蛋白5.5mg/L、亚油酸4.7mg/L、BSA0.5g/L、丙酮酸钠溶液100mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯50mg/L、脯氨酸20mg/L。
对照组各加入2mL含10％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM/F12培养基；
阳性对照组A各加入2mL TGF-β3诱导培养基，TGF-β3诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含FGF-18，其余组分相同；
阳性对照组B各加入2mL FGF-18诱导培养基，FGF-18诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含TGF-β3，其余组分相同；
上述各组都放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中以相同条件培养10天，期间每2-4天更换一次对应的培养基，得诱导分化的软骨细胞。
培养结束后分别对各组细胞进行以下处理，通过检测羟脯氨酸含量反映向软骨分化后的总胶原含量，结果见附图1所示，结果表明，对照组总胶原表达量约12μg/pellet体系，阳性对照组A以TGF-β3诱导培养基培养，总胶原表达量约22μg/pellet体系，高于对照组83％；阳性对照组B以FGF-18诱导培养基培养，总胶原表达量约16μg/pellet体系，高于对照组33％；实验组以本发明诱导分化培养基培养，总胶原表达量约40μg/pellet体系，且与其他三组相比，均具有显著性差异(P<0.05)。以本发明诱导分化培养基培养的实验组总表达量高于对照组233％，表达提高率是阳性对照组A和阳性对照组B的提高率总和的2倍，远远高于二者之和。
进一步通过PCR检测成软骨分化后，II型胶原等软骨相关基因的表达量，结果参见图2-1～图2-4，结果表明，本发明提供的诱导剂从分子水平上调了软骨细胞分化关键基因Sox-9等的表达量，FGF-18联合TGF-β3协同增效诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化，显著提高软骨细胞外基质II型胶原的表达。
Pellet体系作为无支架培养的代表，长期培养软骨细胞仍可保持良好的生物学活性，同时特异性细胞外基质分泌增加，操作简单，产量较高。通过本实施例可见，本发明提供的诱导剂、以该诱导剂配制的诱导分化培养基非常适用于pellet体系，用于诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化。
实施例2
本实施例测定不同时期的诱导效果，参照实施例1中人脂肪干细胞原代培养方法获得P3代脂肪间充质干细胞，进一步分别进行如下Pellet培养体系诱导培养软骨细胞：收集P3代脂肪间充质干细胞，重悬计数，在每个15mL离心管中加入10×105个细胞，共设置48个离心管，分为对照组、阳性对照组A、阳性对照组B和实验组共4组，测定诱导一周、两周、三周和四周的诱导效果，每个时期设置3个平行，分别以300g离心5min，倾弃上清，各组分别按照如下方式处理。
实验组各加入2mL本发明的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基为诱导剂分散于含12％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM/F12培养基形成，诱导剂组分及其在诱导分化培养基的终浓度如下：TGF-β3为6ng/mL，FGF-18为60ng/mL，地塞米松100nM、胰岛素10mg/L、硒5μg/L、转铁蛋白5.5mg/L、亚油酸4.7mg/L、BSA0.5g/L、丙酮酸钠溶液70mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯50mg/L、脯氨酸30mg/L。
对照组各加入2mL含12％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM/F12培养基；
阳性对照组A各加入2mL TGF-β3诱导培养基，TGF-β3诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含FGF-18，其余组分相同；
阳性对照组B各加入2mL FGF-18诱导培养基，FGF-18诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含TGF-β3，其余组分相同；
上述各组都放置于37℃，5％CO2细胞培养箱中以相同条件培养，期间每2-4天更换一次对应的培养基，分别在培养1周、2周、3周和4周后对诱导分化的软骨细胞进行以下处理，通过DMMB法(二甲基亚甲基蓝试验)测定细胞胞外基质中GAG(氨基葡聚糖，也叫糖胺多糖)含量，进一步比较GAG/DNA结果，结果见附图2。
附图2结果表明，以本发明的诱导剂及诱导分化培养基培养的实验组，其GAG/DNA远高于对照组、阳性对照组A和阳性对照组B，均具有显著性差异，尤其是在诱导1周后和4周后，其提高率远高于阳性对照组A和阳性对照组B提高率的总和，说明本发明的诱导剂能显著提高脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的分化率，且诱导后的软骨细胞胞外基质糖胺聚糖的表达量显著提高。
实施例3
本实施例以三维细胞水凝胶支架培养体系，具体的是纤维蛋白水凝胶支架三维培养体系，测试本发明诱导剂、诱导分化培养基及诱导方法的效果。所用纤维蛋白水凝胶形成组分包括A液和B液，A液为凝血酶溶液，用来重悬细胞，其配置方法为以凝血酶溶于氯化钙，获得浓度5U/mL溶液，即为A液；B液为纤维蛋白原溶液，配制方法为纤维蛋白原溶于氯化钠溶液，使浓度为100mg/mL，并含抑酞酶10000KIU/mL，A液和B液混合即可形成纤维蛋白水凝胶。
首先参照实施例1中人脂肪干细胞原代培养方法获得P3代脂肪间充质干细胞，按照实验室常规方法进行纤维蛋白水凝胶复合脂肪干细胞体外培养：收集P3代脂肪间充质干细胞，计数，在1.5mL EP管中加入5x105个细胞，离心后弃上清，取A液30μL重悬细胞，加入至内径4mm的塑料模具内，再向其中加入B液30μL，形成混合液体，摇晃混匀，37℃反应40min后混合液凝固成纤维蛋白水凝胶，将凝胶取出放入6孔板内，再在凝胶上加入培养基或对应的诱导培养基，每隔两天全量换液。
本实施例同样设置对照组、阳性对照组A和阳性对照组B及实验组，实验组各加入2mL本发明的诱导分化培养基，所述诱导分化培养基为诱导剂分散于含10％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM高糖培养基形成，诱导剂组分及其在诱导分化培养基的终浓度如下：TGF-β3为15ng/mL，FGF-18为100ng/mL，地塞米松100nM、胰岛素8mg/L、硒7μg/L、转铁蛋白5.5mg/L、亚油酸4.7mg/L、BSA0.5g/L、丙酮酸钠溶液80mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯40mg/L、脯氨酸30mg/L。
对照组各加入2mL含10％FBS(体积分数)、1wt.％双抗的DMEM高糖培养基；
阳性对照组A各加入2mL TGF-β3诱导培养基，TGF-β3诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含FGF-18，其余组分相同；
阳性对照组B各加入2mL FGF-18诱导培养基，FGF-18诱导培养基与实验组的诱导分化培养基不同之处在于，不含TGF-β3，其余组分相同；
培养3周后，以阿尔辛兰染色和天狼猩红染色法，分别测定胞外基质中GAG和胶原含量,荧光定量PCR测定II型胶原基因表达，阿尔辛兰染色结果比较发现，实验组所得诱导分化的软骨细胞外基质大量分泌，融合成片，效果优于阳性对照组A和阳性对照组B，甚至优于两组之和；GAG/DNA结果显示，实验组GAG/DNA结果远高于阳性对照组A和阳性对照组B两组的和，且具有显著性差异，说明本发明提供的诱导剂通过科学配比TGF-β3和FGF-18，借助科学比例的其他组分，显著提高了脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的分化率，其提高效果高于单独以含TGF-β3或含FGF-18的诱导剂，还远远高于单独含TGF-β3和单独含FGF-18的诱导效果的简单加和，说明TGF-β3和FGF-18具体协同增效效果，利用FGF-18能促进软骨细胞的合成代谢，并且能促进软骨发生的效果，提高了TGF-β3对脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的诱导效果，还显著提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖的表达，并且减少体外诱导培养的时间，在第一周，第10天即明显高于对照组或阳性对照组。
基于支架的组织工程技术发展迅速的大背景下，可注射式细胞支架具有创伤较小、可塑性强、操作方便等优势，且纤维蛋白水凝胶来源广泛、价格低廉、生物相容性好，应用前景良好，而通过本实施例发现，本发明提供的诱导剂、诱导分化培养基及方法非常适合于三维细胞水凝胶支架培养体系，能显著提高软骨细胞分化率，维持细胞表型形态，提高软骨细胞外基质II型胶原和糖胺聚糖的表达，并且减少体外诱导培养的时间，可预见本发明诱导剂及诱导分化培养基对软骨分化领域、组织工程领域、骨疾病治疗具有重要意义，具有良好的、广阔的应用前景。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基由TGF-β3、FGF-18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯和脯氨酸分散于基础培养基中形成，所述诱导分化培养基中各组分的终浓度如下：TGF-β3为8-12ng/mL，FGF-18为50-120ng/mL，地塞米松50-100nM、胰岛素10mg/L、硒5-6μg/L、转铁蛋白5-6mg/L、亚油酸4-5mg/L、BSA 0.4-0.6g/L、丙酮酸钠溶液50-100mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯20-80mg/L、脯氨酸10-50mg/L；所述基础培养基为DMEM高糖培养基或DMEM/F12培养基。
2.一种诱导脂肪干细胞向软骨细胞分化的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)收集脂肪组织以胶原酶消化分离脂肪间充质干细胞，获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、5％的CO2培养箱中进行培养，细胞培养至80-90％融合时，以胰酶消化，按分种率1∶3--1∶6接种至新培养瓶中进行传代培养，待细胞生长达到80-90％融合时，胰酶消化并离心得传代的脂肪间充质干细胞；
(2)传代的脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化培养：将传代的脂肪间充质干细胞加入至包括诱导分化培养基的细胞培养体系中，于37℃，5％CO2细胞培养箱培养，每2-4天更换一次诱导分化培养基，培养7-16天，得诱导分化的软骨细胞，所述诱导分化培养基由TGF-β3、FGF-18、地塞米松、胰岛素、硒、转铁蛋白、亚油酸、BSA、丙酮酸钠溶液、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯和脯氨酸分散于基础培养基中形成，诱导分化培养基中各组分的终浓度如下：TGF-β3为8-12ng/mL，FGF-18为50-120ng/mL，地塞米松50-100nM、胰岛素10mg/L、硒5-6μg/L、转铁蛋白5-6mg/L、亚油酸4-5mg/L、BSA 0.4-0.6g/L、丙酮酸钠溶液50-100mg/L、左旋抗坏血酸-2-磷酸酯20-80mg/L、脯氨酸10-50mg/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养体系为Pellet培养体系或三维细胞水凝胶支架培养体系。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述三维细胞水凝胶支架培养体系为纤维蛋白水凝胶支架三维培养体系。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述Pellet培养体系中细胞密度为1×105个/g～1×108个/g。
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