KR101389852B1

KR101389852B1 - 골격근줄기세포의 배양방법 및 그 용도

Info

Publication number: KR101389852B1
Application number: KR1020120047703A
Authority: KR
Inventors: 양영일; 이승진; 김형인
Original assignee: 이화여자대학교 산학협력단; 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-05-04
Publication date: 2014-04-29
Also published as: KR20130124077A

Abstract

본 발명은 골격근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포를 회수하는 단계;를 포함하는 골격근줄기세포의 배양방법, 이에 의해 배양된 골격근줄기세포, 이를 포함한 세포치료제 및 골격근질환 치료제에 관한 것으로, 상기 배양방법에 의해 배양된 골격근줄기세포는 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 또는 신경세포 등 다양한 인체내 세포로의 다분화능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 특별한 분화유도인자가 없어도 골격근세포로 자발적으로 분화할 수 있기에, 이를 세포치료제 및 조직공학적 치료제 등의 바이오 신약 생산에 적용 가능하다.

Description

골격근줄기세포의 배양방법 및 그 용도 {Method for Culture of Skeletal Muscle Stem Cells and Uses Therefor}

본 발명은 골격근줄기세포 및 이의 배양방법, 이를 포함한 세포치료제 및 골격근질환 치료제에 관한 것이다.

골격근(Skeletal muscle)은 다양한 원인인자에 의하여 손상 받으면 제한적으로 재생되는 특성을 지닌 장기이다. 특히 근육 이영양증(muscular dystrophy)는 100,000명당 3명으로 보고되는 드문 선천성 질병으로 근긴장과 저작근, 목, 인후두, 사지 말단의 근소실 및 안검하수, 백내장, 골격근병증, 심전도장애, 제한성 폐질환, 폐쇄성 수면무호흡증후군, 연하곤란, 위 배출 지연과 갑상선 기능저하, 생식샘 저하, 불임, 당뇨 같은 내분비 질환들도 동반하게 된다[Br J Hosp Med 1993;50:22, Br J Anaesth 1994;72:210]. 특히 호흡기계를 관장하는 골격근을 침범하여 호흡부전을 유발할 수 있다. 이는 횡격막과 흉곽 골격근의 손상으로 인하여 근육기능이 약화되어, 환자의 호흡량은 정상인 보다 심각히 감소되게 된다. 그 결과 환자는 폐렴과 같은 치명적인 합병증을 동반하게 되어, 호흡 부전증으로 사망을 초래하기도 한다[Am Rev Respir Dis 1993;148:1018]. 치료로는 근본적으로 질환의 진행이나 이영양증을 회복시키는 방법은 없는 실정이다[Psychiatr Neurol 1965;149:302]. 물리치료와 약물치료를 병용할 수 있으나, 환자는 결국 점차로 악화되어 평활근의 손상이 동반되면 사망에 이루게 된다. 상기 골격근 이영양증은 예후가 좋지 않아서 발병한 후 15 내지 20년 후에 심부전이나 호흡마비로 사망하는 것이 일반적인 질환의 자연경과이다[Psychiatr Neurol 1965;149:302]. 근육 이영양증과 같은 선천성 그리고 난치성 골격근 질환은 전통적인 약물요법과 수술요법으로는 치료되지 않으며, 현재로선 세포이식과 유전자 치료법만이 유일한 치료법이다. 이러한 난치성 골격근질환에 적용될 수 있는 줄기세포치료제 및 유전자치료제 기반의 바이오신약 개발이 절실히 요구되고 있다. 또한 최근 고령화에 인한 괄약근 기능저하에 따라 발생하는 뇨실금(urinary incontinence) 내지 대변실금(fecal incontinence)과 같은 퇴행성 질환에도 골격근 재생과 기능강화 시키기 위한 목적의 바이오신약 개발이 요구되고 있다.

선천성 내지 퇴행성 골격근 질환에 적용될 수 있는 줄기세포치료제는 배아줄기세포(embryonal stem cells, ESCs), 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPSCs), 그리고 성체줄기세포로 구분할 수 있다. 그러나 상기 ESCs 및 iPSCs의 임상적 적용은 면역거부반응, 종양형성, 그리고 골격근세포로의 분화조절 등과 기술적 난제들을 극복하여야 된다. 반면 성체줄기세포는 면역거부반응 및 종양의 발생 위험도가 낮아, 현재 골격근 질환 환자를 대상으로 한 임상적 적용은 모두 성체줄기세포를 기반으로 한 세포치료제이다.

선천성 골격근 질환에 적용되는 성체줄기세포는 (1) 조혈계 기원 줄기세포, (2) 골수 혹은 제대혈 기원 성체줄기세포, (3) 지방조직 기원 성체줄기세포, (4) 골격근 기원 성체줄기세포, (5) 위성세포(satellite cells)등이 세포치료제로 개발되고 있다[Cell Death Diff 2010;17:1222]. 조혈모세포는 골수로부터 천자하여 얻어지는 경우, GM-CSF 투여 후 말초혈액으로부터 동원된 조혈모세포에서 분리하는 경우, 신생아의 제대혈로부터 분리한 조혈계 기원 줄기세포들은 선천성 골격근질환을 치료하기 위한 세포치료제로 적용 개발되고 있다. 그러나 조혈계 기원 줄기세포는 체외에서 증폭 배양이 제한적이라 충분한 수의 세포치료제를 확보하기 힘든 단점이 대두되었다. 더불어 조혈계 기원 줄기세포는 골격근 세포로 직접 분화할 수 있는 능력이 없는 것으로 밝혀졌다. 최근 지방조직에서부터 분리한 성체줄기세포는 조혈계 기원 줄기세포와 비교하여 체외증폭 배양이 가능하여 세포치료제로 갖는 가능성은 크다. 그러나 지방조직 기원 성체줄기세포는 골격근으로 분화할 수 있는 능력과 생체 내 골격근 재생능력이 제한적이라 세포치료제로서 갖는 조건이 부족하다. 그러나 골격근에서부터 기원한 성체줄기세포는 골격근세포로의 직접적인 분화능력이 입증되었으며, 체외증폭 능력이 우수하고, 최소한의 침습적인 수술로 얻어지는 소량의 골격근으로부터 치료용량의 선천성 골격근질환 치료제를 제조할 수 있는 체외 증식능력을 갖추어 세포치료제로소 그 가능성이 아주 높다고 할 수 있다[Medicina(Kaunas) 2011;47:469].

골격근 기원 성체줄기세포(skeletal muscle-derived stem cells, MDSCs)의 분리 및 배양은 아래에 기술한 종래의 3가지 방법이 널리 적용되고 있다. 첫째, 골격근조직을 콜라제네이즈(collagenase), 디스페이즈(dispase), 혹은 트립신(trypsin) 등과 같은 조직분해효소를 처리하여 고형성 골격근조직으로부터 해리된 단일세포군을 분리하는 조직해리과정(tissue dissociation step)을 거친 후, 면역학적 방법으로 특정 표지자를 발현하는 세포만을 해리된 단일세포군으로부터 선택적으로 정제하고, 단층배양법으로 정제된 골격근줄기세포를 증폭하는 방법이 있다[Cell Tissue Res 2010;340:549]. 둘째 방법은 첫 번째 방법과 동일하게 골격근의 조직해리과정을 거친 후 얻어진 단일해리세포(single dissociated cells)의 기질부착특성(substrate adhesion characteristic)을 이용하여 골격근줄기세포를 분리 배양하는 방법이 제시되었다. 셋째 방법은 골격근절편의 외식배양법(explant culture)이 사용되고 있다[Nat Cell Biol 2007;9:255]. 골격근절편을 배양용기에 파종한 후 배양용기로 이동 성장하는 섬유모세포와는 구별되고, 배양 7일 이후 이동성장하는 둥글고 작은 세포를 수거하여 배양하는 방법이 제시되었으나, 종래 기술에는 문제점이 제시되고 있다.

상기 첫째 방법은, 골격근으로부터 단일해리세포를 분리하기 위하여 조직해리과정은 필수적이다. 조직해리과정은 사용한 조직분해효소의 종류, 역가, 반응시간, 반응온도, 사용한 조직의 상태에 따라 얻어지는 단일세포 수는 큰 편차를 나타내며, 또한 조직해리과정 중 세포의 손상은 피할 수 없다는 단점이 널리 제시되었다. 그 결과 조직해리과정은 표준화하기 어려우며 또한 분리수율이 낮다는 비효율성의 단점이 제시되었다. 또한, 상기 조직해리과정 후 얻어진 단일해리세포는 골격근을 구성하는 다양하고 이질적 특성을 지닌 세포를 모두 함유하고 있어 이질적 단일해리세포에서 골격근줄기세포만을 선택적으로 분리하기 위하여 골격근줄기세포에서만 발현되는 특정 표지자(marker)를 이용한 면역학적 정제방법이 요구된다. 이질적 단일해리세포 중에서 골격근줄기세포만을 정제하기 위하여 사용되는 표지자는 flk-1, Sca-1, CD10, CD13, CD56, CD90, CD105, CD140b 및 CD146등이 이용되고 있으나, 상기 표지자는 골격근줄기세포에서만 특이적으로 발현되는 표지자가 아니며, 그 결과 이들 표지자가 골격근줄기세포를 특징적으로 대표하는 표지자로 활용될 수 없다는 한계가 대두되었다. 또한 이들 표지자를 이용하여 MACS(magnetic assisted cell sorting) 내지 FACS(fluorescent activated cell sorting) 방법으로 정제된 세포는 전체 단일해리세포 중에서 1% 미만이라, 그 효율이 극히 저조하다는 문제점이 제시되었다.

상기 두번째 방법인, 배양용기에 파종한 세포의 기질부착특성을 이용한 방법은 단일해리세포를 얻기 위하여 필연적으로 요구되는 조직해리과정의 단점을 극복할 수 없다는 문제점이 제시되었다. 또한 기질부착특성에 사용한 기질의 종류에 따라 분리되는 세포의 특성이 차이가 날 수 있어, 표준화되기 어려운 단점이 대두되었고, 마지막에 기질에 부착되는 세포가 균일한 특성을 지닌 세포가 아니며 이질적인 세포의 오염이 일어날 수 있으며, 분리되는 골격근줄기세포의 수율이 저조하다는 단점이 있다.

상기 세번째 방법인, 골격근절편을 배양용기에 바로 파종하여 배양하는 방법의 경우 파종한 골격근조직과 배양용기 간의 안정적인 접촉이 골격근줄기세포를 분리 배양하기 위한 핵심적 성공요인 중 하나이다. 그러나 골격근조직은 절편을 절단하는 과정에서 유리되어 분해되는 세포외기질과 핵산 등에 의하여 배양용기와 안정적인 접촉이 저해되며, 그 결과 골격근조직으로부터 유래되는 세포가 부착, 이동, 성장할 있는 기질(substratum)과의 안정적인 접촉이 저해되어 안정적인 골격근줄기세포의 이동과 성장이 저해된다. 또한 파종된 골격근조직이 부착되는 기질이 표면적이 제한적이라 그 결과 골격근줄기세포의 배양용기 내로 이동 성장이 제한적이라는 단점이 대두되었다.

이에 본 발명에서는 성인으로부터 골격근 내 존재하는 골격근줄기세포를 분리함에 있어 조직분해효소의 사용 없이 줄기세포가 기생하는 골격근 내 줄기세포 미세구소를 파괴하지 않으면서, 안정적이고 효율적이며 높은 수율로 골격근줄기세포의 분리 배양방법을 제시하고자 하였으며, 또한 분리 배양한 골격근줄기세포의 골격근 재생을 위한 치료제로 적용하는 방법을 제공하고자 하였다.

본 발명은 골격근절편 내 골격근줄기세포를 선택적으로 하이드로젤 내로 동원, 이동, 성장을 유도하는 하이드로젤-지지 3차원 장기배양(organ culture)방법을 제공하고자 하며, 상기 하이드로젤만을 선택적으로 분해시켜 골격근줄기세포를 분리하여 조직분해과정 없이 골격근으로부터 골격근줄기세포를 분리 배양하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 상기 하이드로젤-지지 3차원 골격근절편 장기배양(organ culture)법을 통하여 분리 배양한 골격근줄기세포로, 골격근을 구성하는 골격근세포 및 혈관내피세포로 분화할 수 있는 다분화 능력을 지니고, 중간엽줄기세포 표지자, 혈관주위세포 표지자, 골격근-특이 전사인자가 발현되는 면역표면학적 특성을 보이며, 어떠한 분화유도인자 없이도 자발적으로 골격근세포로 분화할 수 있는 능력을 지니는 골격근줄기세포를 제공하고자 한다.

또한 본 발명은 상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 항섬유소용해 기능을 지닌 하이드로젤을 통하여 손상된 골격근 내로 이식하여, 골격근 재생에 적용될 수 있는 세포치료제 및 골격근 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 골격근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포를 회수하는 단계;를 포함하는 골격근줄기세포의 배양방법을 제공한다.

상기 골격근줄기세포는 (i)CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii)CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) MyoD1 및 Pax7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위성세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi)Lin, CD3, CD14, CD19, CD34 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 림프계세포 또는 조혈계세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vi)CD31 및 CD34으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 가질 수 있다.

상기 하이드로젤은 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 천연고분자로 이루어질 수 있다.

상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤이며, 상기 피브린 하이드로젤 1ml에 대하여 0.8 mg 내지 5.0 mg 중량부의 피브리노겐을 포함할 수 있다.

상기 하이드로젤은 항섬유소용해제가 포함될 수 있다.

상기 항섬유용해제는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 하이드로젤은 1 ml에 대하여, 항섬유소용해제를 10 내지 1000 ㎍를 포함할 수 있다.

상기 하이드로젤의 분해는 특별히 한정된 것은 아니나, 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루로니다아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 통하여 분해될 수 있다.

본 발명은 골격근줄기세포의 배양방법의 일례로,

1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 골격근절편을 함입시키는 제 1단계; 2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture) 하는 제 2단계; 3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤만을 분해함으로, 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포 및 골격근절편을 회수하는 제 3단계; 및 4) 상기 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포를 단층배양법으로 증폭시키는 제 4단계;를 포함할 수 있다.

상기 제 3단계에서 회수된 골격근절편을 다시 제 1단계의 하이드로젤 내에 함입시켜 배양할 수 있다.

본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 골격근줄기세포이며, 상기 세포는 (i)CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii)CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) MyoD1 및 Pax7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위성세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi)Lin, CD3, CD14, CD19, CD34, CD45 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 림프계세포 또는 조혈계세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vi)CD31 및 CD34으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지니는 골격근줄기세포를제공한다.

상기 골격근줄기세포는 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포로 분화할 수 있다.

본 발명은 상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.

상기 세포치료제는 그 대상에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포의 치료제일 수 있다.

상기 골격근줄기세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합될 수 있다.

상기 세포치료제는 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하며, 상기 골격근줄기세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 있는 골격근질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 골격근질환은 골격근이영양증, 골격근결손 또는 괄약근 기능부전일 수 있다.

본 발명의 골격근 유래 골격근줄기세포는 체외증식능력이 우수하고 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 또는 신경세포 등 다양한 인체내 세포로의 다분화능력이 뛰어날 뿐만 아니라, 특별한 분화유도인자가 없어도 골격근세포로 자발적으로 분화할 수 있기에, 세포치료제 및 조직공학적 치료제 등의 바이오 신약 생산에 적용 가능하며, 골격근줄기세포의 동원, 이동, 성장, 그리고 골격근세포로의 분화에 관계하는 세포생물학적, 분자생물학적 기초 연구에 적용될 수 있다.

도 1은 피브리노겐의 농도에 변화에 따른 하이드로젤의 미세구조 변화를 나타낸 도이다. (*, 5.0 mg/ml 및 10.0 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 2는 골격근줄기세포에 의한 하이드로젤의 섬유소용해 작용을 나타낸 도이다. (*, w/o MDSCs 군과 비교하여 p < 0.01).
도 3은 항섬유소용해제에 따른 골격근줄기세포의 섬유소용해 억제 효과를 나타낸 것이다. (*, aprotinin 및 aminocaproic acid군과 비교하여 p < 0.01).
도 4는 Aminomethylbenzoic acid가 도입된 하이드로젤 조성에 따른 골격근줄기세포의 거동 및 성장 변화를 나타낸 것이다. (*, 5.0 mg/ml 및 10.0 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 5는 Aminomethylbenzoic acid가 도입된 하이드로젤의 조성에 따른 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로의 골격근줄기세포의 이동과 성장에 미치는 영향을 나타낸 것이다. (A: 골격근절편에 의한 하이드로젤의 섬유소용해 작용. B: 골격근절편으로부터 골격근줄기세포의 이동 및 성장 면적. *, 5.0 mg/ml 및 10.0 mg/ml 피브리노겐 군과 비교하여 p < 0.01).
도 6은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 인간 골격근절편의 3차원 장기배양(organ culture)을 거쳐 하이드로젤 내로 이동 성장한 근육줄기세포의 위상차 현미경 사진(위), 조직화학염색(HE) 및 면역화학염색 사진(아래)을 나타낸 것이다.
도 7은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 3차원 장기배양(organ culture) 후 골격근절편 내 인테그린-매게 signalling pathway 인자들의 활성화를 나타낸 것이다. (Fresh 내지 F, 배양 전 골격근절편; 2D, 배양용기에 하이드로젤-지지 없이 파종 후 배양한 골격근절편; 3D, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 함입 후 장기배양(organ culture)한 골격근절편. *, Fresh 군과 비교하여 p < 0.05; #, Fresh 및 2D 군과 비교하여 p < 0.05).
도 8은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 골격근절편의 배양환경에 따른 골격근줄기세포의 이동 및 성장을 나타낸 것이다. (Dynamic, 15 rpm에서의 역동적 배양환경; Static, 정치된 상태에서의 배양환경. *, Static 군과 비교하여 p < 0.05).
도 9는 인간 골격근절편에서 하이드로젤 내로 이동 성장하는 세포의 면역학적 특성을 나타내는 면역형광현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 10은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 골격근절편의 3차원 장기배양(organ culture) 후 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포의 분리한 것으로, A는 선택적 하이드로젤 분해과정의 위상차 현미경사진이며, B는 조직해리과정 후 단층배양(2D), 하이드로젤-지지 3차원 골격근장기배양(3D w/o AMBA) 내지 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 골격근장기배양(3D w/ AMBA) 후 얻어지는 골격근줄기세포의 수율을 나타낸 것이다. (*, 2D 및 3D w/o AMBA와 비교하여 p < 0.01).
도 11은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 골격근줄기세포의 콜로니형성능력(A, B) 및 성장특성(C)을 나타낸 것이다.
도 12는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 면역표면학적 특성을 나타낸 것이다.
도 13은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 MyoD1 및 Pax7의 발현특성을 나타낸 것이다.
도 14는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 골격근줄기세포의 골격근세포로의 분화능력을 나타낸 것이다.
도 15는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 지방세포(A, D), 조골세포(B, E) 및 연골세포로의 분화능력을 나타낸 것이다.
도 16은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 혈관내피세포로의 분화능력을 나타낸 것이다.
도 17은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 혈관성장 및 조직재생 관련 인자의 분비능력을 antibody array 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 18은 허혈성 사지경색 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 혈관재생 및 유도능력을 나타낸 것이다. (A: 하지의 육안사진. B: 하지 및 발바닥의 괴사길이. C: 주입한 골격근줄기세포의 신행혈관형성 및 혈관내피세포로의 분화. *, PBS군과 비교하여 p < 0.05).
도 19는 cardiotoxin 유래 골격근손상 모델에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 분리한 후 단층배양법으로 증폭하여 얻어진 골격근줄기세포의 골격근재생 능력을 나타낸 것이다. (A: Hematoxylin eosin 염색사진. B: 주입한 인간 골격근줄기세포에 의하여 생성된 인간 골격근을 나타낸 형광면역염색 사진).

본 발명은 골격근 유래 골격근줄기세포 및 이의 배양방법, 이를 포함한 세포치료제 및 골격근질환 치료제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

종래에 골격근질환의 치료제로 조혈모세포 혹은 중간엽줄기세포가 통상적으로 사용되고 있는데, 조혈모세포는 체외에서 증폭 배양이 어려우며, 유효한 용량의 조혈모세포를 분리, 정제하기 위해서는 10 L의 골수가 요구되었다. 종래의 중간엽줄기세포의 수득은 고형성 장기인 경우 조직분해과정과 이차적인 중간엽줄기세포의 정제과정이 요구되었으며, 이렇게 얻어진 중간엽줄기세포는 골수 혹은 지방조직 내 유핵세포 백만 개 중 하나의 빈도로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 골수 혹은 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 1% 미만에서 콜로니를 형성하는 등 세포치료제 용량만큼 체외에서 증폭 능력이 어려운 한계점이 대두되었다. 이에 본 발명자는 상기 문제점을 해결하고자 노력하던 중 본 발명의 배양방법에 의할 때 골격근줄기세포를 골격근의 조직분해과정과 이차적인 골격근줄기세포의 정제과정 없이도 골격근절편으로부터 체외증식능력이 뛰어난 골격근줄기세포를 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 골격근줄기세포의 배양방법의 일례로,

1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 골격근절편을 함입시키는 제 1단계; 2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture) 하는 제 2단계; 3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤만을 분해하여, 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포 및 골격근절편을 회수하는 제 3단계; 및 4) 상기 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포를 단층배양법으로 증폭시키는 제 4단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 배양방법은 종래의 통상적인 골격근줄기세포 분리, 배양방법과는 달리 골격근절편만을 선택적으로 채취하고, 조직분해효소 처리과정 없이 그 구조가 온전히 보존된 골격근절편을 사용할 수 있다.

상기 골격근절편은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 골격근으로부터 골결근막(fascia) 및 주위 지방조직을 제거하고 일정한 크기로 절단한 것일 수 있다. 조직기원 줄기세포(tissue-resident stem cells)는 주로 미세혈관 벽에 존재하기에, 본 발명에서는 골격근 내 골격근줄기세포의 이동을 저해하는 골격근막 및 주위 지방조직과 같은 해부학적 구조물을 제거함으로써, 골격근 내 미세혈관이 하이드로젤과 직접 접촉할 수 있도록 하여 골격근줄기세포의 하이드로젤 내로 선택적 이동 및 성장을 증진시킬 수 있다.

하이드로젤은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어져 형성되는 3차원 망상구조물로서, 상전이가 가능하여 용액상태에서 골격근절편과 골고루 혼합이 가능하며, 혼합 후 고형성 젤로 상전이가 되어 골격근절편에 안정적인 3차원적 물리적 지지를 제공할 수 있으며, 동시에 골격근절편 내 존재하는 골격근줄기세포가 부착하고, 이동 및 성장할 수 있는 3차원적 세포부착 기질을 제공할 수 있다.

상기 골격근절편이 혼합된 액상상태의 하이드로젤에서 고분자의 중합(polymerization) 및 가교(cross-linkage) 반응을 개시하여 젤상태의 하이드로젤로의 상전이 속도는 중합제 및 가교제의 농도, 및 반응온도 조절을 통하여 조절할 수 있다.

상기와 같이 하이드로젤을 통하여 3차원적 세포부착 기질을 제공한 경우에서 골격근절편에서부터 골격근줄기세포의 이동과 성장에 필요한 인테그린-β1(integrin-β1) 결합 수용체를 제공하여, 하이드로젤 내로 골격근줄기세포가 지속적으로 이동, 성장할 수 있는 3차원적 기질을 제공할 수 있다.

세포는 세포외기질과 인테그린-베타1(integrin-β1)와 결합한 후 FAK가 인산화되어 세포신호전달체제가 활성화되어 세포분열이 개시된다. 즉, 골격근절편은 부착할 수 있는 세포외기질과의 면적이 넓을수록 세포신호전달체제의 활성도는 증가되어, 그 결과 세포분열은 증가되는데, 상기 하이드로젤은 단층배양법의 제한적인 2차원적 세포부착 기질보다 넓은 3차원적인 세포부착 기질을 제공함으로 골격근줄기세포가 이동 성장할 수 있는 충분한 공간을 제공할 수 있어, 세포분열이 증가되며, 세포 간 접촉저해(contact inhibition)을 억제하며 장기간 배양이 가능할 수 있다.

상기 하이드로젤의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 천연고분자, 합성고분자, 및 다양한 고분자를 혼합한 공중합고분자(copolymer)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로부터 제조된 것을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 천연고분자로 구성된 하이드로젤일 수 있다.

일례로, 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 콘드로이틴(chondroitin), 하알루로닉산(hyaluronic acid), 알지닌(alginic acid), 메트리젤(Matrigel^TM), 키토산(chitosan), 펩티드(peptide), 피브린(fibrin), PGA(polyglycolic acid), PLA(polylactic acid), PEG(polyethylene glycol) 및 폴리아크릴아미드 (polyacrylamide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 콜라겐, 피브린, 메트리젤 및 젤라틴으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 천연고분자로 제조된 하이드로젤일 수 있다.

합성고분자 혹은 공중합고분자로 구성된 하이드로젤은 장시간 분해되지 않아 물리적 기능이 우수하지만 세포의 이동과 성장이 저하되는 취약한 생물학적 기능을 나타내는 반면, 콜라겐, 피브린 등과 같은 천연고분자로 구성된 하이드로젤은 세포의 이동 및 성장이 우수한 생체적합성을 나타내지만 장기 혹은 세포에서 분비되는 섬유소용해효소인 tPA(tissue plasminogen activator) 혹은 uPA(urokinase plasminogen activator)에 의하여 합성고분자 혹은 공중합고분자로 구성된 하이드로젤보다 빨리 분해되는 물리적 취약성을 나타낼 수 있다.

본 발명에서는 세포의 이동 및 성장이 우수하여 생체적합성을 나타내는 천연고분자로 구성된 하이드로젤을 선택하면서도, 항섬유소용해제를 하이드로젤 내에 도입하여 빨리 분해되는 물리적 취약성을 극복할 수 있다.

항섬유소용해제는 세포 또는 조직에서 분비되는 tPA 혹은 uPA에 의한 섬유소용해 작용을 방지할 수 있는데, 상기 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 세포 혹은 골격근절편의 배양과정 중 분비되는 tPA 혹은 uPA에 의하여 하이드로젤이 장기간 분해되지 않는 특성을 가질 수 있기에, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 세포의 이동과 성장에 절대적인 세포부착 기질로서의 기능을 골격근절편 장기배양(organ culture)기간 동안 유지할 수 있다.

일 실시예에 나타난 바와 같이, 항섬유소용해제가 도입되지 않은 경우 골격근절편에서 분비되는 uPA/tPA에 의하여 하이드로젤이 분해되어, halo가 형성되어 골격근절편에서부터 하이드로젤로의 세포의 이동, 성장이 관찰되지 않고 배양용기 표면으로만 세포가 이동, 성장이 이루어지는데 반하여, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 3차원 기질로서의 기능을 유지하고 골격근줄기세포의 하이드로젤 내로의 이동과 성장이 일어날 수 있다. 그 결과, 골격근절편 1 gm에서부터 7일간 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양 후 얻어지는 골격근줄기세포의 수는 2.5ㅧ10⁷으로, 항섬유소가 도입되지 않은 하이드로젤을 이용한 배양방법에 의한 것보다 10배 이상 높은 수율을 보일 수 있다.

상기 항섬유소용해제의 종류는 특별히 한정된 것은 아니며, 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 트란이그제믹산 및 아미노메틸벤조익산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid)은 아미노카프로이드산, 아프로티닌에 비해 골격근줄기세포의 섬유소용해 억제효과가 우수하여 피브린 하이드로젤의 물리적 지지 기능을 수행하는데 더 적절할 수 있다.

상기 항섬유소용해제의 농도는 특별히 한정된 것은 아니나, 상기 하이드로젤 1 ml에 대하여 항섬유소용해제 10 내지 1000㎍을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 450㎍을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 50 내지 200㎍을 포함할 수 있다.

항섬유소용해제의 농도가 감소 될수록 골격근줄기세포에 대한 독성이 감소될 수 있으며, 농도가 증가할수록 골격근에 의한 섬유소용해 효과를 억제하여 3차원적 세포부착기질로서의 역할을 유지할 수 있기에, 상기 농도는 세포독성과 섬유소용해효과를 모두 고려하여 선택한 것일 수 있다. 만일 항섬유소용해제의 용량이 상기보다 낮을 경우 섬유소용해 작용을 충분히 억제하지 못하여 하이드로젤이 용해되어 골격근줄기세포의 이동 및 성장이 소실될 수 있으며, 항섬유소용해제 용량이 상기보다 높을 경우 섬유소용해 작용을 억제할 수 있으나 고용량에 의한 골격근 및 골격근줄기세포에 독성을 유발하여 골격근줄기세포의 수득율이 감소할 수 있다.

상기 항섬유소용해제가 첨가된 피브린 하이드로젤 제조시, 피브리노겐의 농도는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 0.8 내지 5.0 mg/ml, 바람직하게는 1.0 내지 3.5 mg/ml가 적절할 수 있다.

일례로, 상기 피브린 하이드로젤은 1.25 내지 2.5 mg/ml 피브리노겐과 0.1 내지 2.5 unit/ml 트롬빈으로 제조될 수 있다.

피브리노겐 농도가 상기보다 높으면 제조된 피브린 하이드로젤은 그 미세구조는 치밀하고, 구조 내 공극은 감소하며 분해속도는 늦어지나, 세포의 이동과 성장은 심각히 저해되는 결과를 초래하는 반면, 상기 농도보다 낮은 피브리노겐으로 제조된 피브린 하이드로젤은 배양 과정 중 세포 및 골격근절편에서 분비되는 tPA 혹은 uPA 등에 의하여 분해되어 세포의 이동과 성장에 절대적인 3차원적 세포부착 기질로서의 기능을 소실할 수 있다.

상기 성장배양액은 생체 외에서 골격근줄기세포의 동원, 이동, 성장을 유도할 수 있는 배지를 의미할 수 있고, 포유동물 세포배양에 사용되는 통상의 배지를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일례로 상업적으로 제조된 세포배양액인 Dulbeccos Minimum Essential Medium(DMEM), RPMI, Hams F-10, Hams F-12, α-Minimal Essential Medium(α-MEM), Glasgow's Minimal Essential Medium, Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 성장배양액 내에는 골격근줄기세포의 동원, 이동, 성장을 촉진시킬 수 있는 성장인자를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 성장인자는 혈청, 즉 인간을 포함한 동물의 혈청, basic fibroblastic growth factor(bFGF), 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 인슐린(Insulin), 상피세포성장인자 (epidermal growth gactor, EGF), leukemia inhibitory factor(LIF), insulin-like growth factor(IGF), platelet-derived growth factor(PDGF), stem cell factor(SCF) 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 성장배양액은 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등의 항생제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일례로, 성장배양액은 DMEM:HamsF12 (1:1) 배양액, 우태아혈청, EGF, bFGF, IGF, 젠타마이신으로 구성될 수 있으며, 보다 구체적으로 70 내지 95 (vol/vol) % DMEM:Hams F12 (1:1) 배양액, 5 내지 15 (vol/vol)% 우태아혈청, 5 내지 50 ng/ml EGF, 0.5 내지 10 ng/ml bFGF, 5 내지 50 ng/ml IGF, 5 내지 50 mg/ml 젠타마이신으로 구성될 수 있다.

종래에 장기(organ)절편의 3차원 배양은 산소 및 영양분 교환을 증진하기 위하여 공기 중에 장기절편을 노출시켜 배양하는 방법과 오비탈 셰이커(orbital shaker)에서 역동적(dynamic)으로 배양하는 방법이 존재하였는데, 장기절편을 공기 중에 노출시켜 배양하는 방법은 영양분 공급이 제한적이기에 장기간 배양에는 적합하지 않으며, 또한 역동적 배양은 배양액의 와류에 의하여 배양액으로 노출된 장기절편이 shearing 손상을 받게 되는 문제점이 존재하였다.

그러나 본 발명의 하이드로젤에 함입된 상태로 오비탈 셰이커에 장기(organ)배양시, 골격근조직이 하이드로젤에 함입되어 있어 shearing 손상을 받지 않을 수 있고 셰이킹(shaking)을 통해 충분한 산소와 영양분을 공급받아 골격근줄기세포의 성장을 촉진시킬 수 있다.

셰이킹(shaking) 속도는 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 5 내지 30 rpm 속도일 수 있다. 셰이킹 속도가 상기보다 낮을 때는 산소와 영양분의 공급이 충분히 이루어지지 않을 수 있으며, 상기보다 높을 때는 골격근절편에 shearing 손상이 일어날 수 있고 하이드로젤 내의 골격근줄기세포 배양의 안정성이 손상될 수 있다.

상기 하이드로젤만의 선택적 분해는 하이드로젤 구성 고분자만을 선택적으로 분해할 수 있는 고분자-특이 분해효소를 배양액 내에 첨가하여 이루어질 수 있다.

상기 고분자-특이 분해효소는 특별히 한정된 것은 아니나, 콜라지나아제(collagenase), 젤라티나아제(gelatinase), 유로키나아제(urokinase), 스트렙토키나아제(streptokinase), TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루노니데이즈(hyaluronidase)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 일례로, 콜라겐 하이드로젤, 젤라틴 하이드로젤, 혹은 매트리젤 하이드로젤을 사용하여 본 발명의 골격근절편을 3차원 장기배양(organ culture)한 경우는 콜라지나아제 혹은 젤라티나아제를 배양액 내로 첨가하여 상기 하이드로젤을 선택적으로 분해시킬 수 있으며, 피브린으로 구성된 하이드로젤을 사용한 경우는 유로키나아제, 스트렙토키나아제 혹은 플라즈민 군에서 하나 이상을 선택하여 배양액 내로 첨가하여 피브린으로 구성된 하이드로젤을 선택적으로 분해시킬 수 있으며, 히아루닌산 하이드로젤은 히알루노니데이즈를 사용하여 하이드로젤만을 선택적으로 분해시킬 수 있다.

본 발명에 있어서, 하이드로젤 구성 고분자-특이 분해효소를 배양액에 첨가하는 것은 골격근줄기세포 및 골격근절편에 어떠한 구조적 파괴 혹은 세포독성을 나타내지 않았고, 회수된 세포의 95%이상이 생존할 수 있다.

일례로, 콜라겐 혹은 젤라틴 하이드로젤의 선택적 분해를 위하여 콜라겐 혹은 젤라틴 하이드로젤 1 ml 당 0.1 내지 5 mg의 콜라게네이즈 중량을 배양액 내로 첨가할 수 있다.

일례로, 유로키나아제, 스트렙토키나아제 혹은 프라즈민은 골격근줄기세포 혹은 골격근절편의 구조적 물질을 분해하지 않으며 피브린만을 선택적으로 분해할 수 있으며, 하이드로젤 1ml 당 100 내지 10,000 unit의 유로키나아제 혹은 스트렙토키나아제를 첨가할 수 있다.

일 실시예로, 유로키나아제 혹은 스트렙토키나아제의 피브린 분해효과를 증진시키기 위하여 30 내지 37℃에서 30분 내지 3시간 동안 반응시킬 수 있다.

상기 분해효소를 처리하여 하이드로젤만을 선택적으로 분해한 후, 하이드로젤내로 이동, 성장한 골격근줄기세포와 어떠한 구조적 손상이 없는 골격근절편을 회수할 수 있다.

상기 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포를 증폭시킬 수 있는데, 이러한 증폭방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 단층배양법에 의할 수 있다. 본 발명의 일례로, 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포를 배양용기에 파종 후, 배양용기 표면적의 60 내지 90%를 차지하면, 이들 세포를 트립신 (trypsin)-EDTA로 처리하여 배양용기에서부터 떼어내고, 다시 새로운 배양용기에 파종하는 계대배양(subculture)을 통하여 치료용량에 필요한 세포 수만큼 증폭배양할 수 있다.

또한, 상기 하이드로젤만을 선택적으로 분해하여 회수한 골격근절편을 다시 하이드로젤 내로 함입시켜 반복적으로 3차원 장기배양(organ culture)을 시행하여 지속적으로 골격근줄기세포의 분리, 배양을 할 수 있는데, 배양이 끝나면 하이드로젤만을 선택적으로 분해하기에 골격근절편의 구조가 온전히 보존된 상태로 지속적인 재사용이 가능할 수 있다.

즉, 본 발명의 하이드로젤을 이용한 골격근줄기세포의 배양방법은 골격근질환 환자로부터 단 한번의 소량의 골격근을 생검한 후에는, 추가적인 생검없이 무한 반복적으로 골격근줄기세포를 얻을 수 있음을 의미할 수 있다.

본 발명에 있어서, 골격근절편의 3차원 장기배양(organ culture)기간은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 1 내지 21일 동안 배양될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3 내지 10일 동안 배양될 수 있다. 상기 하이드로젤-지지 3차원 골격근절편의 장기배양(organ culture)은 배양 12시간째부터 골격근줄기세포가 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장을 유도할 수 있다.

상기 골격근줄기세포의 배양방법에 의해 수득된 골격근줄기세포는(i)CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii)CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) MyoD1 및 Pax7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위성세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi)Lin, CD3, CD14, CD19, CD34, 및 CD45으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 림프계세포 또는 조혈계세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vi)CD31 및 CD34으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지닐 수 있다.

골격근을 구성하는 세포 중 1% 미만이 골격근줄기세포임이 제기되었고, 나머지 99.9%는 분화된 골격근세포, 섬유모세포, 위성세포, 혈관내피세포, 신경세포, 조혈계 세포로 구성된다. 그러므로 종래의 통상적인 방법은 골격근을 콜라지네이즈와 같은 조직분해효소를 처리하여 골격근을 구성하는 세포를 단일세포로 분리하고, 면역학적 방법을 이용하여 골격근줄기세포를 이질적인 세포군으로부터 분리, 정제하는 단계가 필연적으로 요구되었는데 반해, 본 발명의 상기 골격근줄기세포 배양방법에 의해 얻어진 세포는 중간엽줄기세포의 표지자인 CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지자와 혈관주위세포 표지자인 CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표지자를 발현하는데 반하여, 림프계세포 표지자인 CD3에 음성, 조혈계 세포 표지자인 Lin, CD14, CD19, CD34, CD45, CD56 등은 음성이었고, 신경계 세포 표지자인 CD56, 위성세포 표지자인 MyoD1 내지 CD56은 음성이며, 혈관내피세포 표지자인 CD31 및 CD34은 발현하지 않는 특성을 보이는 고순도의 골격근줄기세포로, 특별한 추가적인 면역학적 정제방법이 불필요할 뿐만 아니라, 또한 본 배양방법은 단순하고 조직해리과정을 거치지 않아 세포 손상이 일어나지 않아 회수된 세포의 95% 이상이 생존율을 보이고 1gm의 골격근절편을 7일간 배양시 2.5ㅧ10⁷의 수득율을 나타내어, 종래의 조직분해과정을 거치는 골격근줄기세포 배양방법에 비해 27배 이상 압도적으로 우수한 골격근줄기세포 수득율을 나타낼 수 있다.

본 발명은 상기 배양방법에 의해 배양된 골격근줄기세포이며, 상기 세포는 (i)CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii)CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) MyoD1 및 Pax7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위성세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi)Lin, CD3, CD14, CD19, CD34, CD45 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 림프계세포 또는 조혈계세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vi)CD31 및 CD34으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 지니는 골격근줄기세포를 제공한다.

일 실시예에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 배양방법에 의해 배양된 골격근 줄기세포는 위성세포, 조혈계세포, 혈관내피세포, 림프계 세포, 골격근세포의 오염이 없는 고순도의 골격근줄기세포일 수 있다.

본 발명의 골격근줄기세포는 혈관주위세포 기원 중간엽줄기세포의 면역표면학적 특성을 보일 수 있으며, 생체 외 분화능력은 골수 또는 지방조직 기원의 중간엽줄기세포와 유사한 특성을 보일 수 있다.

상기 골격근줄기세포는 골격근 기원의 중간엽줄기세포로 자기복제능력과 골격근세포로의 자발적인 분화능력을 지닐 수 있다.

또한, 상기 골격근줄기세포는 골수 혹은 지방조직 기원 중간엽줄기세포와 같은 분화특성을 지닌 세포로써, 분화 가능한 세포는 특별히 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포로 분화할 수 있다.

본 발명의 하이드로젤-지지 3차원 골격근절편 장기배양(organ culture)법으로 분리 배양한 골격근줄기세포는 42%에서 콜로니를 형성할 수 있으며, 120번 이상 세포분열을 할 수 능력을 보였고, 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 시간이 42시간으로 뛰어난 체외 성장능력을 지닌 것을 확인할 수 있다.

상기 골격근줄기세포의 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포로의 분화는 당업계에 공지된 분화유도 조건 또는 배지에서 배양함으로 이루어질 수 있다.

골격근줄기세포는 특별한 분화과정을 거치지 않고 바로 세포치료제로 이용될 수 있으며, 또는 치료를 하고자 목적하는 세포로 분화하여 이용할 수 있다.

상기 세포치료제에서의 세포는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 골격근세포, 조골세포, 지방세포, 연골세포, 혈관내피세포 및 신경세포로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.

일례로 상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포는 골격근이영양증, 골격근결손 또는 괄약근 기능부전과 같은 골격근질환에 대한 골격근세포의 재생을 위한 세포치료제로 사용될 수 있다.

상기 세포치료제의 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 세포치료제로 이용하는 방법은 특별히 한정하는 것은 아니나, 종래의 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있으나, 바람직하게는 상기 골격근줄기세포를 생분해성 지지체 혹은 운반체에 담아 제공될 수 있다.

상기 생분해성 지지체 혹은 운반체는 숙주에 실질적인 해로운 반응을 유발하지 않으며 생물학적으로 분해될 수 있는 것으로, 생물학적 시스템으로부터 자연적으로 제거될 수 있고/있거나 생물학적 시스템에 화학적으로 혼입될 수 있는 것일 수 있다.

상기 생분해성 지지체 혹은 운반체는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 하이드로젤일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤일 수 있다.

상기 골격근줄기세포는 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 세포치료제로 사용될 수 있다.

상기 하이드로젤은 피브리노겐 및 항섬유소용해제 농도를 조절하여 생체 내에서 분해속도를 조절할 수 있다. 상기 하이드로젤은 골격근줄기세포를 주입시, 골격근줄기세포가 혈액 내로 소실되거나, 손상부위 내 염증세포 및 효소에 의한 골격근줄기세포의 손상을 감소시킬 수 있다.

상기 세포치료제는 추가적으로 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 항염증제제는 하이드로젤이 이식된 골격근줄기세포를 과도한 염증반응으로부터 보호하기 위하여 사용될 수 있고, 줄기세포 동원인자 또는 혈관성장 유도인자를 포함하여 골격근 내 줄기세포의 동원 및 혈관성장을 유도함으로 세포재생 효과를 증대시킬 수 있다.

상기 항염증제제는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 COX 억제제, ACE 억제제, 살리실산염(salicylate) 및 덱사메타손(dexamethasone)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 줄기세포 동원 인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 IGF, bFGF, PDGF 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 혈관성장 유도인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 EGF, PDGF, VEGF, ECGF 및 엔지오제닌(angiogenin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 골격근질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

골격근질환의 치료제로 조혈모세포 혹은 중간엽줄기세포가 통상적으로 사용되고 있다. 골격근질환, 일례로 골격근이영양증, 골격근결손 또는 괄약근 기능부전 환자에 적용될 수 있는 세포치료제로 유효한 용량은 천만 개 내지 일억 개의 세포가 요구된다. 조혈모세포는 체외에서 증폭 배양이 어려우며, 유효한 용량의 조혈모세포를 분리, 정제하기 위해서는 10 L의 골수가 요구된다. 중간엽줄기세포는 골수 혹은 지방조직 내 유핵세포 백만 개 중 하나의 빈도로 존재하는 것으로 알려져 있고, 골수 혹은 지방조직 유래 중간엽줄기세포는 1% 미만에서 콜로니를 형성하고, 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 시간은 60시간 이상으로 유효한 치료제 용량만큼 체외에서 증폭 능력이 어려운 한계점이 보인 반면, 본 발명의 배양방법에 의할 때 상기 배양된 골격근줄기세포는 42%에서 콜로니를 형성할 수 있으며 120번 이상 세포분열을 할 수 있는 능력을 보이고 1gm의 골격근에서부터 7일 이내에 2.5ㅧ10⁷의 골격근줄기세포를 수득할 수 있기에, 단시간 내에 골격근질환 치료제로 사용할 수 있는 골격근줄기세포 유효량을 획득할 수 있다.

상기 약학 조성물에서 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포는 특별히 한정된 것은 아니나, 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤과 혼합되어 사용될 수 있다.

종래에 골격근질환 치료제 혹은 줄기세포치료제는 직접 손상된 골격근부위에 주입하거나 혹은 혈관 내로 주입하는 방법이 적용되고 있다. 상기 치료제를 손상된 골격근부위로 직접 주입시 손상부위의 과도한 염증세포 및 효소에 의한 손상, 저산소증에 의한 손상, 주입시 혈관으로의 소실 등의 문제점이 존재하였다.

그러나 본 발명의 항섬유소용해제가 포함된 하이드로젤은 용액상태에서 골격근줄기세포와 혼합되어 골격근 내로 주입 후 상전이 되어 젤을 형성하여 효과적으로 골격근 내로 골격근줄기세포를 전달할 수 있다.

본 발명의 골격근 유래 골격근줄기세포는 체외 증식능력, 자발적인 골격근세포로의 분화능력을 지녀 골격근질환의 예방 또는 치료제로 효과적으로 활용될 수 있다.

상기 골격근질환은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 골격근이영양증, 골격근결손 또는 괄약근 기능부전 등에 이용될 수 있다.

상기 골격근줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 본 발명의 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 방법(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA)을 참조할 수 있다.

상기 약학조성물의 투여방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 일례로 골격근내 투여 등 비경구적으로 투여할 수 있으나, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약학조성물에 추가적으로 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시한 것으로 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 피브리노겐 농도의 조절에 따른 하이드로젤 미세구조의 조절

하이드로젤 내 미세구조를 조절하기 위하여, 피브리노겐 농도를 조절하여 4가지 유형의 피브린을 제조하였다. 인간혈장에서 분리한 피브리노겐(녹십자, 서울, 대한민국)은 10 mM CaCl2가 포함된 DMEM 배지에 녹여 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였다. 피브리노겐 1:50(중량) 비율의 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐(Invitrogen, Calsbad, CA)를 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 트롬빈(Sigma, St. Louis, MI)는 DMEM에 녹여 최종 1 unit/ml 농도의 트롬빈 용액을 제조하였다. 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 10㎕ 혼합액을 유리슬라이드에다 옮긴 후 습식챔버(humidified chamber)에서 37℃에서 2시간 동안 중합 및 가교반응을 거쳤다. 최종 1.25, 2.5, 5.0, 10.0 mg/ml 피브리노겐과 0.5 unit/ml 트롬빈으로 구성된 4가지 유형의 피브린 하이드로젤을 제조하였으며, 항섬유소용해제는 하이드로젤 1 ml 당 100 mg aminomethylbenzoic acid 혹은 tranexamic acid을 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 형성된 하이드로젤의 미세구조는 confocal microscope로 관찰하여 구조적 특성을 분석하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 하이드로젤의 미세구조는 피브리노겐 농도가 증가할수록 치밀해 지며, 섬유소의 두께는 증가하였으며, 섬유소 사이의 공극크기는 감소하였다. 피브리노겐 농도가 1.25 mg/ml로 제조한 하이드로젤 내 공극의 크기는 25 nm인 반면 5 mg/ml 및 10 mg/ml 피브리노겐으로 제조한 하이드로젤의 공극크기는 12.3 nm 및 7.5 nm로 유의하게 감소되었다(p < 0.05). 항섬유소용해제는 하이드로젤의 미세구조에는 어떠한 영향을 미치지 않았다.

실시예 2. 골격근줄기세포의 섬유소용해 작용

실시예 1의 방법으로 피브리노겐 농도에 따라 4가지 조성의 하이드로젤을 제조하였다. 피브리노겐 1:50(중량) 비율의 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐(Invitrogen, Calsbad, CA)를 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 골격근줄기세포는 4가지 농도의 피브리노겐 용액 100 ml 용양 당 2x10⁵ 세포와 혼합한 후 100㎕의 트롬빈 용액과 혼합한 후 24-multiwell tissue culture plate에 옮기고, 2시간 동안의 중합 및 가교반응을 거쳤다. 하이드로젤이 완전히 형성된 후 300㎕의 세포배양액을 첨가한 후 골격근줄기세포를 1일간 배양하였다. 골격근줄기세포가 포함되지 않은 하이드로젤은 동일한 조성으로 제조하여 대조군으로 사용하였다. 하이드로젤 내 포함된 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐이 분해과정 중 세포배양액으로 방출된 함량을 fluorometer로 측정하여 하이드로젤의 분해정도를 산정하였다.

도 2에서 나타난 바와 같이, 골격근줄기세포가 포함된 하이드로젤(w/ MDSCs)은 배양 4시간째부터 분해되기 시작하였으며, 배양 1일 후가 지난 후 피브리노겐 농도와 관계없이 모든 하이드로젤은 완전히 분해되어, 3차원 배양환경을 제공할 수 없었다. 반면 골격근줄기세포가 포함되지 않은 하이드로젤(w/o MDSCs)은 세포배양액을 첨가한 후 동일한 조건에서 반응시켰을 때 분해정도는 5% 미만이었고, 피브리노겐 농도에 따는 분해정도의 차이는 관찰할 수 없었다.

실시예 3. 항섬유소용해제가 골격근줄기세포에 의한 하이드로젤의 분해 억제효과

임상적으로 출혈성 질환에 사용되고 있는 aprotinin, aminocaproic acid, tranexamic acid, 그리고 aminomethylbenzoid acid를 Sigma 사에서 구입하여 사용하였다. 피브린은 5.0 mg/ml 피브리노겐 용액 100 ㎕와 1 unit/ml 트롬빈 용액 100㎕를 혼합하여 피브린 하이드로젤을 제조하였다. 피브리노겐 용액 내 피브리노겐 1:50(중량) 비율로 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐(Invitrogen) 및 100㎍/ml 농도의 항섬유소용해제 제제들을 피브리노겐 용액에 첨가하였다. 실시예 2의 동일한 방법과 같이 골격근줄기세포는 피브리노겐 용액 100 ㎕ 용양 당 2x10⁵ 세포와 혼합하였다. 골격근줄기세포 및 항섬유소용해제가 함유한 피브리노겐 용액과 트론빈 용액 혼합액 200 ㎕를 24-multiwell tissue culture plate에 옮기고, 2시간 동안의 중합 및 가교반응을 거쳤다. 항섬유소용해제가 도입된 피브린 하이드로젤이 완전히 형성된 후 300 ㎕의 세포배양액을 첨가한 후 골격근줄기세포를 3차원 피브린 하이드로젤 내에서 1일간 배양하였다. 실시예 3과 같이 피브린 내 포함된 Alexa Fluor 488-conjugate 피브리노겐이 피브린 하이드로젤의 분해과정 중 세포배양액으로 방출된 함량을 fluorometer로 측정하여 피브린의 분해정도를 산정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 항섬유소용해제가 도입되지 않은 하이드로젤은 골격근줄기세포에 의하여 완전히 분해되어 소실되었다. 그러나 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 제제에 따라 골격근줄기세포에 의한 분해억제 효과는 차이가 있었다. Aprotinin 및 aminocaproic acid가 도입된 피브린 하이드로젤은 골격근줄기세포에 의하여 90% 이상 분해되어, aprotinin 및 aminocaproic acid는 골격근줄기세포에 의한 섬유소용해 작용을 억제하는 효과는 미미하였다. 반면 tranexamic acid 및 aminomethylbenzoic acid가 도입된 하이드로젤은 골격근줄기세포에 의한 섬유소용핵 작용에 저항성을 보였으며, 전체 하이드로젤의 25% 미만에서 하이드로젤이 분해되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성에 따른 골격근줄기세포의 거동 및 성장

실시예 1과 같이 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였고, 피브리노겐 용액 내 100 ㎍/ml 농도의 aminomethylbenzoic acid를 첨가하였다. 골격근줄기세포는 1 unit/ml 농도의 트롬빈 용액 1 ml 당 2백만 개의 세포가 포함되도록 하였다. 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 골격근줄기세포가 포함된 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 200 ㎕ 혼합액을 24-multiwell tissue culture plate에 옮긴 후 습식챔버(humidified chamber)에서 37℃에서 2시간 동안 중합 및 가교반응을 거쳤다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤이 완전히 형성된 후 300 ㎕의 세포배양액을 첨가한 후 골격근줄기세포를 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내에서 3일간 3차원 배양하였다. 배양이 끝난 후 3% 포르말린 용액으로 고정한 후 위상차 현미경으로 촬영하여 골격근줄기세포의 cytoplasmic spreading을 관찰하였다. 또한 골격근줄기세포의 cytoplasmic spreading을 정량적으로 산정하기 위하여 actin filament에 특이적으로 결합하는 1 ㎍/ml Alexa Fluor 488-conjugated Phalloidine(Invitrogen)과 30분간 실온에서 결합시킨 후 confocal microscope를 이용하여 사진을 촬영하였다. 촬영한 사진은 Image J (NIH, Bethesda, MA)를 이용하여 측정하였다. 다양한 조성의 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 함입된 골격근줄기세포의 성장정도는 dsDNA PicoGreen Quantitation Kit를 이용하여 골격근줄기세포의 DNA 함량을 측정하여 평가하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 생리적 농도인 1.25 및 2.5 mg/ml 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 골격근줄기세포는 cytoplasmic spreading이 3차원적으로 뻗어 있었다. 반면 5.0 mg/ml 이상의 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 골격근줄기세포는 cytoplasmic spreading이 감소되었으며, 특히 10.0 mg/ml 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 골격근줄기세포의 cytoplsmic spreading은 이루어지지 않았다. 정량적 평가에서도 생리적 농도의 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내 골격근줄기세포의 cytoplasmic spreading이 5.0 mg/ml 이상의 피브리노겐으로 구성된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 골격근줄기세포보다 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*, p < 0.01 compared to 1.25 및 2.5)(도 4A).

도 4B에 나타난 바와 같이, Cytolasmic spreading의 결과와 동일하게 피브리노겐 농도가 증가할수록 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내의 골격근줄기세포는 유의하게 감소하였다. 생리적 농도인 0.125 및 0.25 mg/ml 피브리노겐으로 제조된 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내에서 골격근줄기세포의 성장이 유의하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다(*, p < 0.01 compared to 1.25 및 2.5).

실시예 5. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성에 따른 골격근절편 내 골격근줄기세포의 하이드로젤 내로 이동 및 성장

실시예 1과 같이 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 mg/ml 등 4가지 농도의 피브리노겐 용액을 제조하였고, 피브리노겐 용액 내 100 ㎍/ml 농도의 aminomethylbenzoic acid 혹은 tranexamic aicd를 첨가하였다. 뇌사자의 기증받은 조직으로부터 골격근만을 선택적으로 분리하였다. 골격근은 면도칼을 이용하여 1 내지 3 mm³ 크기의 절편으로 잘게 절단한 후 DMEM 용액으로 3차례 세척하였다. 1 unit/ml 농도의 트롬빈 용액 0.5 ml 당 10개의 절편이 포함되도록 골격근절편을 첨가하였다. 4가지 농도의 피브리노겐 용액과 골격근절편이 포함된 트롬빈 용액을 1:1(용량) 비율로 혼합한 후 1 ml 혼합액을 6-multiwell tissue culture plate에 옮긴 후 습식챔버(humidified chamber)에서 37℃에서 2시간 동안 중합 및 가교반응을 거쳤다. 하이드로젤이 완전히 형성된 후 2 ml의 세포배양액을 첨가한 후 골격근절편을 3차원 하이드로젤 내에서 3일간 장기(organ)배양하였다. 배양이 끝난 후 3% 포르말린 용액으로 고정한 후 위상차 현미경으로 촬영하여 골격근절편에서 하이드로젤 내로의 골격근줄기세포의 이동과 성장을 평가하였다. 골격근줄기세포의 outgrowth distance는 Image J(NIH, Bethesda, MA)를 이용하여 측정하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, 항섬유소용해제가 도입되지 않은 하이드로젤은 골격근절편에 의하여 분해되는 것을 확인할 수 있었다(도5A, No). 저 농도의 피브리노겐용액으로 제조한 하이드로젤은 골격근절편에 의하여 용해되는 하이드로젤의 면적이 5.0 및 10.0 mg/ml 농도의 피브리노겐으로 제조한 하이드로젤의 용해면적보다 높았다. 그러나 aminomethylbenzoic acid 혹은 tranexamic acid 등의 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 골격근절편으로 안정적인 3차원적 세포부착 기질을 장기배양(organ culture) 기간 중 제공할 수 있었다.

피브리노겐 농도가 높아질수록 골격근절편에서부터 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로의 골격근줄기세포의 이동과 성장은 현저하게 감소되었다(도5B). 1.25 mg/ml 피브리노겐으로 제조한 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 골격근절편에서 골격근줄기세포의 이동과 성장은 배양 1일 이전부터 관찰되기 시작하였으나, 5 mg/ml 농도 이상의 피브리노겐으로 제조한 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 골격근줄기세포의 이동과 성장은 배양 2일 이후부터 관찰되었다. Image J를 이용한 형태계측학적 분석에서도 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 조성 내 피브리노겐 농도가 증가할수록 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로의 골격근줄기세포의 이동과 성장은 유의하게 감소되었다(p < 0.01)(도6B).

실시예 6. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 골격근절편의 3차원 장기배양(organ culture)

항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤은 2.0 mg/ml 피브리노겐, 0.5 unit/ml 트롬빈, 100 ㎍/ml aminomethylbenzoic acid의 조성으로 제조하였다. 골격근으로부터 골격근막 및 주위 결체조직을 제거한 후 골격근조직만을 선택적으로 면도칼을 이용하여 분리하였다. 골격근조직은 면도칼을 이용하여 1 내지 3 mm³ 절편으로 잘게 절단한 후 DMEM으로 3차례 이상 세척하였다. 효소처리과정 없이 온전한 구조의 골격근절편은 100㎍/ml aminomethylbenzoic acid가 함유된 0.4% 피브리노겐 용액에 현탁하였다. 이후 동량의 1 unit/ml 트롬빈 용액과 혼합한 후 10 ml 혼합액은 100-mm tissue culture plate에 옮겼으며, 37℃ 습윤 챔버에서 2시간 동안 중합 및 가교반응 시켰다. 상기 10 ml 혼합액 내 10 내지 100 mg의 골격근절편을 포함시켰다. 중합과정이 끝난 후 15 ml의 세포배양액을 첨가하였다. 세포배양액은 90% (vol/vol) DMEM, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS; Invitrogen), 20 ng/ml EGF, 5 ng/ml bFGF, 10 ng/ml IGF, 10 ㎍/ml gentamicin(Invitrogen)로 구성하였다. 세포배양액을 첨가한 후 배양용기는 orbital shaker위에서 15 내지 30 rpm 속도로 천천히 교반하면서 1주간 배양하였다. 2일마다 신선한 세포배양액으로 교체하였다. 골격근절편에서부터 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 골격근줄기세포가 이동하고 충분한 수만큼 성장을 유도하였다. 골격근절편 장기(organ)배양을 통하여 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포 및 골격근절편은 선택적으로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤을 분해시켜 하이드로젤로부터 회수하였다. 회수한 골격근줄기세포는 통상적인 방법으로 2차원 단층배양법으로 증폭 배양하였고, 회수한 골격근절편은 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 다시 함입시킨 후 동일한 방법으로 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양을 반복하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동한 세포의 특성과 배양한 골격근절편의 구조를 검사하기 위하여, 장기(organ)배양 후 3% 포르말린으로 고정한 후 통상적인 방법으로 파라핀 블록을 제조하였다. 5 ㎛ 두께의 파라핀 절편을 취한 후 hematoxylin eosin 염색과 면역조직화학염색을 시행하였다. 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포를 추적연구하기 위하여 장기(organ)배양 과정 중 1 μM bromodeoxyuridine(BrdU, Sigma)를 배양 3일간 첨가하였으며, 이후 파라핀 블록 및 절편을 취한 후 BrdU을 uptake한 세포는 면역화학염색을 통하여 검출하였다. 배양 1일 후 골격근절편만을 회수하여 단백질을 분리한 후 인테그린 신호전달체제의 활성화를 western blotting 방법으로 분석하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 장기(organ)배양 1일 이전부터 골격근절편으로부터 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 골격근줄기세포의 이동과 성장이 관찰되기 시작하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 전형적인 섬유모세포와 유사한 방추상 모양을 보였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포의 90%이상에서 proliferating cell nuclear antigen(PCNA)가 발현되었으며, 또한 90% 이상의 세포에서 BrdU의 발현이 관찰되었다(도6, BrdU 및 PCNA).

도 7에 나타난 바와 같이, 골격근절편을 하이드로젤 지지 없이 파종방법으로 장기(organ)배양하였을 시(도 7A, 2D) 인테그린 세포전달체제가 활성화되었으나, 활성화되는 정도는 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양(도 7A, 3D)과 비교하였을 시 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다. 정량적인 방법으로 인테그린 신호전달체제의 활성도를 분석한 결과에서 배양 전과 비교하여 배양 후 골격근절편 내 인테그린 신호전달체제는 유의하게 활성화되었으며, 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양법은 단순한 2차원적 파종방법의 장기(organ)배양법과 비교하여 유의하게 골격근절편 내 인테그린 신호전달체제가 활성화되는 것을 확인할 수 있었다(도 7B).

도 8에 나타난 바와 같이 역동적 환경에서 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양은 산소 및 영양분 공급을 촉진시킬 수 있었으며, 그 결과 골격근절편에서부터 하이드로젤 내로 이동성장한 골격근줄기세포가 차지하는 면적이 정적인 환경에서 장기(organ)배양한 경우보다 30% 이상 유의하게 증가되었다(p < 0.01).

실시예 7. 골격근절편에서 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 골격근줄기세포의 면역표면학적 특성

뇌사자로부터 기증받은 조직에서 골격근조직만을 선택적으로 분리한 후 1 내지 3 mm³ 크기로 잘라 골격근절편을 취하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 골격근절편은 aminomethylbenzoic acid가 도입된 하이드로젤 내로 함입시킨 후 3차원 장기(organ)배양법으로 배양하였다. 세포배양액을 첨가한 후 역동적 환경에서 1주간 배양하였다. 배양 시작 1일부터 3일까지 세포배양액 내로 1 μM BrdU(Sigma)를 첨가하였다. 배양 1주 후 3% 포르말린으로 고정한 후 하이드로젤, 이동 성장한 세포, 그리고 골격근절편이 포함되도록 파라핀 블록과 파라핀 절편을 취하였다. 파라핀 절편은 CD140b, CD105, SMA, CD56 및 MyoD1을 포함한 일차항체와 각각 반응시켰다. 이후 상기 절편은 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체와 반응시켰다. 이후 절편은 다시 anti-BrdU(Sigma)와 반응시킨 후 isotype-matched Alexa Fluor 594-conjugated 이차항체와 반응시켰다. Topro-3(Invitrogen)으로 핵을 염색한 후 confocal microscope로 관찰하였다.

도 9에 나타난 바와 같이, 이중형광염색에서 하이드로젤 내로 이동 성장한 세포는 중간엽줄기세포 표지자(CD105), 혈관주위세포 표지자(CD140b, SMA)이 발현되었다(도 9A). 그러나 위성세포 표지자인 CD56과 MyoD1은 발현되지 않았다. BrdU에 양성인 세포의 90% 이상에서 중간엽줄기세포 및 혈관주위세포 표지자는 양성이었으나, 위성세포 표지자는 BrdU 양성인 세포에서는 검출되지 않았다.

실시예 8. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포의 회수 및 증폭배양

실시예 7에서 기술한 방법으로 1주일간 골격근절편을 배양하였다. 배양용기는 phosphate-buffered saline(PBS)로 3차례 10분간 실온에서 세척하였고, 이후 20% 송아지혈청이 포함된 DMEM로 1차례 수세하였다. 하이드로젤 10 ml 당 20 ml의 20% 송아지혈청이 포함된 DMEM과 10,000 unit의 urokinase(녹십자, 서울, 대한민국)을 배양용기에 첨가하였다. 배양용기는 orbital shaker 위에 놓고 37℃, 15 rpm 속도로 30분간 교반하였다. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤이 느슨해지고 분해된 후 transfer pipette을 이용하여 배양용기로부터 골격근줄기세포 및 골격근절편을 50 ml 코니칼 튜브에 옮겼다. 이후 200 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 제거하였다. 10 ml의 세포배양액을 첨가한 후 transfer pipette을 이용하여 분산시켰다. 100 mm 구경을 가진 cell strainer (BD Bioscience, 서울, 대한민국)을 이용하여 골격근줄기세포와 골격근절편을 분리하였다. 회수한 세포 수는 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit를 이용하여 분석하였고, 장기(organ)배양한 골격근절편 중량으로 보정하였다. 통상적인 방법으로 골격근절편은 조직분해효소로 처리한 후 분리한 후 세포 수는 상기의 동일한 방법으로 측정하였다. 골격근줄기세포는 다시 200 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액은 제거하고, 세포층은 세포배양액으로 분산시켰다. 골격근줄기세포는 cm² 당 만개의 밀도로 배양용기에 파종하여 통상적인 단층배양법을 통하여 증폭 배양하였다.

도 10에 나타난 바와 같이, 우로키나아제 (Urokinase) 처리 전 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포는 방추상 모양으로 3차원적으로 분포하고 있다(도 10A). Urokinase 처리 30분 후 세포부착 기질이 분해되어, 골격근줄기세포는 세포질이 수축되어 둥근 형태를 취하며, 개개로 흩어져 분포하였다. 이들 세포는 하이드로젤이 분해된 후 용액상태로 분산되어 있어 원심분리를 통하여 용이하게 회수할 수 있었다. 회수 후 세포배양 용기에 파종하면 골격근줄기세포는 30분 이내에 단층으로 배양용기 표면에 부착하여 성장하였다. 골격근절편 1 gm에서부터 7일간 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤-지지 3차원 장기(organ)배양 후 얻어지는 골격근줄기세포 수는 2.5 x 10⁷으로, 골격근절편을 조직분해과정 이후 얻어지는 세포 수에 비하여 27배, 항섬유소용해제가 도입하지 않는 하이드로젤을 이용하여 3차원 장기배양(organ culture)하여 얻어지는 세포 수보다 10배 높은 수율을 보였다(p < 0.01)(도 10B).

실시예 9. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포의 단층배양환경에서의 성장 특성

콜로니형성 유닛-섬유아세포 (colony forming unit-fibroblast, CFU-F)의 형성능력은 하이드로젤로부터 회수한 세포를 5 cells/cm² 밀도의 60-mm 배양 접시에 파종한 후 성장배양배지를 첨가한 후 11일간 배양하였다. 이후 배양용기는 2% 완충 포르말린으로 고정하고 5분간 10% 크리스탈 바이올렛(LabChem Inc., Pittsburgh, PA)으로 염색하였다. 염색용기는 디지탈 CCD 카메라로 이미지를 획득하였고, 형성된 CFU-F 수는 영상분석 프로그램(Image J)을 이용하여 산정하였다. 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포의 PDT를 측정하기 위해, 2 ㅧ 10³ 세포들을 48-멀티웰(multiwell) 배양용기에 파종한 후 배양하였다. 배양 1일째와 5일째 세포는 CelLyticTM 용액(Sigma)으로 용해하였고, 용해된 샘플 내 DNA 함량은 PicoGreen dsDNA Quantitation Kit을 사용하여 측정하였다. 형광 마이크로플레이트 리더기(fluorescent microplate reader, SynergyTM HT; Bio-Tek Instruments, Neufahrn, Germany)를 사용하여 발광(emission) 485nm, 여기(excitation) 540nm의 파장에서 형광강도를 측정하였다. 측정된 형광강도는 세포수로 전환하기 위해 골격근줄기세포를 이용하여 표준곡선을 구하였고, 이 표준곡선을 이용하여 샘플 내 형광강도를 세포수로 변환하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포수이다.

도 11에 나타난 바와 같이, 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포는 단층배양환경에서 방추상 모양을 나타내었다(도 11A). 골격근줄기세포는 42%에서 CFU-F를 형성할 수 있었다(도 11B). 골격근줄기세포는 26회 이상 계대배양이 가능하였고 120번 이상 세포 분열할 수 있는 능력을 지는 것을 확인할 수 있었다. 또한 골격근줄기세포의 군집배가시간은 35 내지 60시간 이내로 단층배양 환경에서 뛰어난 세포분열 능력을 확인할 수 있었다(도 11C).

실시예 10. 항섬유소용해제가 도입된 하이드로젤로부터 회수한 인간 골격근줄기세포의 면역표면학적 특성

1) 유세포분석 방법을 이용한 골격근줄기세포의 면역표면학적 특성

십만 개 세포는 일차항체 혹은 아이소타입 대조항체(isotype-matched control antibodies)와 30분 동안 반응시켰다. 일차항체는 피코에리트린(phycoerythrin, PE) 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC)와 결합된 항-인간 항체들로 CD3, CD14, CD19, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD133을 사용하였다. 형광물질과 결합된 모든 일차항체 및 대조항체는 BD Bioscience(San Jose, CA)에서부터 구입하였다. 형광표지자와 결합되지 않은 비접합된 항체(unconjugated antibodies)들인 CD105(R&D Systems), c-kit(DAKO, Glosrup, Denmark), Flk-1, PDGFR-β (CD140b; Abcam, Cambridge, MA), CD56(Abcam), CD146(Abcam), major histocompatibility complex-I 및 II(MHC-I 및 II, Abcam), STRO-1(R&D Systems), SMA(DAKO)은 10만개 세포와 30분간 반응시킨 후 FITC와 결합된 2차 항체와 30분간 반응하였다. 반응이 종료된 후 세포는 PBS로 3차례 세척한 후 2% 파라포름알데히드에서 5분간 고정하였다. 각 항체에 대한 양성률은 FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA) 유세포분석기을 사용하여 분석하였으며, 최소 만개 이상의 세포에서 발현율을 분석하였다.

도 12에 나타난 바와 같이, 골격근줄기세포는 95% 이상에서 CD29, CD44, CD73, CD90, STRO-1 및 CD105과 같은 중간엽줄기세포 표지자가 양성이었으나, 림프계 세포 표지자인 CD3, 조혈계 세포 표지자인 CD14, CD19, CD34, CD45, 혈관내피세포 표지자인 CD31 및 CD34, 조혈계 줄기세포 표지자인 c-kit, Flk-1 및 CD133는 모두 음성이었다. 상기 골격근줄기세포는 MHC-I 표지자는 95% 이상에서 양성으로 발현되었으나, MHC-II 표지자는 음성으로, 타가에게 골격근줄기세포를 이식할 수 있는 면역학적 조건은 충족하였다. CD140b, CD146, 그리고 SMA 등의 혈관주위세포 표지자는 골격근줄기세포에서 모두 발현되었으나, 발현빈도는 표지자마다 다소 차이를 보였다. 또한 위성세포 표지자인 CD56은 골격근줄기세포에서 검출되지 않았다.

2) 면역형광염색 방법을 이용한 골격근줄기세포의 면역표면학적 특성

골격근줄기세포 10만 개를 세포원심분리기(cytocentrifuge, Cyto-Tek, Sakura, Tokyo, Japan)를 이용하여 유리슬라이드에 부착시켰다. 위성세포 표지자인 MyoD1 및 Pax7의 단백질 발현을 세포형광염색을 실시하였다. 슬라이드는 anti-MyoD1 내지 Pax7(Abcam)과 반응한 후 isotype-matched Alexa Fluor 488-conjugated 이차항체와 반응시켰다. 이후 슬라이드는 DAPI(Invitrogen)으로 핵을 염색한 후 공초점 현미경(confocal microscope)으로 관찰하였다. 총 1000개의 세포를 산정하여 네스틴(nestin) 양성 골격근줄기세포에서 해당 단백질의 발현율을 산정하였다.

도 13에서 골격근줄기세포는 위성세포 표지자인 MyoD1 및 Pax7 표지자는 발현되지 않았다.

실시예 11. 체외증폭 배양한 골격근줄기세포의 분화능력

1) 골격근세포로의 분화능력

2만개의 골격근줄기세포를 골격근세포 분화배지로 현탁한 후 24-multiwell tissue culture 용기에 파종한 후 2주간 배양하였다. 골격근세포 분화배지(94.9% DMEM, 5% 송아지혈청, 0.1% DMSO)는 2일에 한 번씩 교체하였다. 골격근세포로의 분화여부는 분화유도 2주 후 2% 포르말린으로 고정한 후 MyoD1, desmin, myosin을 포함한 골격근세포 표지자의 발현 여부를 면역형광염색을 통하여 검증하였다. 또한 분화유도 후 총 RNA를 추출한 후 reverse-transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) 후 전기영동 분석을 통하여 골격근세포 특이 mRNA 발현여부를 판정하였다.

상기 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포는 특이한 유도인자 없이도 골격근세포로 자발적인 분화를 보였다.

도 14에서 나타나 바와 같이, 골격근줄기세포는 서로 융합하여 세포질이 합쳐져 myotube를 형성하였으며, 골격근세포-특이 단백질인 MyoD1, desmin, myosin 등이 발현되어 골격근세포로 분화할 수 있는 능력을 확인할 수 있었다. 또한 골격근세포-특이 mRNA인 MyoD1, myogenin, myosin heavy chain의 발현을 확인함으로써 골격근세포로 분화할 수 있음을 확인할 수 있었다.

2) 지방세포로의 분화능력

골격근줄기세포의 지방세포로 분화능력을 평가하기 위해서 이만 개의 세포를 24-multiwell tissue culture plate에 파종한 뒤 90% DMEM에 10% 송아지혈청, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 80μM indomethacin (Sigma), 1μM dexamethasone (Sigma), 5㎍/ml insulin (Sigma)이 첨가된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 단일클론 기원 골격근줄기세포의 지방세포로의 분화여부는 분화 유도 2주 후에 2% 포르말린으로 실온에서 10분간 고정시킨 다음 세포내 지방축적의 지표인 0.5% Oil Red O(Sigma)용액을 상온에서 1시간 염색하여 세포질 내 지방질의 축적여부로 판정하였다. 또한 분화유도 후 총 RNA를 추출한 후 RT-PCR 후 전기영동 분석을 통하여 지방세포 특이 mRNA 발현여부를 판정하였다.

도 15A에서 제시하듯이 골격근줄기세포는 지방세포로의 분화를 유도한 후 3일째부터 세포질 내로 지방질의 축적이 관찰되기 시작하였으며, 분화유도 14일째 90% 이상의 세포에서 세포질 내로 지방질의 축적을 Oil Red O 염색을 통하여 확인할 수 있었다. 또한 RT-PCR 후 지방세포-특이 mRNA인 lipoprotein lipase(LPL), peroxisome proliferator-activated receptor gamma(PPAR-g), leptin의 발현을 확인함으로써(도15D), 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포가 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 검증할 수 있었다.

3) 조골세포로의 분화능력

골격근줄기세포의 조골세포로의 분화능력을 평가하기 위해서 이만 개의 세포를 24-multiwell tissue culture plate에 파종한 뒤 1 μM dexamethasone, 50 μM ascorbic acid, 10 mM β-glycerol phosphate, 10% 송아지혈청을 함유한 α-MEM에서 2주간 배양하여 분화를 유도하였다. 골격근줄기세포의 조골세포로의 분화여부는 분화 유도 2주 후에 2% 포르말린으로 실온에서 10분간 고정시킨 다음 Alizarin Red(Sigma) 염색을 통하여 미네랄의 침착여부를 검사하였다. 또한 분화유도 후 총 RNA를 추출한 후 RT-PCR 후 전기영동 분석을 통하여 조골세포 특이 mRNA 발현여부를 판정하였다.

도15B에서 제시하듯이 RT-PCR 후 조골세포-특이 mRNA인 osteopontin(OPN), osteocalcin(OCN), bone sialoprotein(BSP)의 발현을 확인함으로써(도15E), 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포가 조골세포로 분화할 수 있는 능력을 검증할 수 있었다.

4) 연골세포로의 분화능력

골격근줄기세포의 연골세포로 분화능력을 평가하기 위해서 마이크로매스 배양법을 이용하였다. 이십만 개의 세포를 10㎕ 배양용액(90% DMEM 및 10% 송아지혈청)에 현탁한 후 24-multiwell tissue culture plate의 중앙에 파종하였다. 2시간 동안 세포 간 결합이 이루어지도록 유도한 후 200㎕ 연골세포 분화배지(99.5% DMEM, 0.5% 송아지혈청, 10 ng/ml TGF-β2)를 첨가한 후 2주간 분화를 유도하였다. 분화배지는 2일에 한 번씩 신선한 분화배지로 교체하였다. 분화유도 2주 후 형성된 마이크로매스는 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 파라핀 블록에서 5 ㎛의 절편을 Safranin O(Sigma)염색을 시행하여 연골조직 특이 당단백질인 glycosaminoglycan의 생성여부를 판정하였다.

도15C에서 제시하듯이 골격근줄기세포는 핵 주위로 경계가 명화한 halo가 관찰되었으며, 세포 사이로 glycosaminoglycan이 축적되는 것을 확인함으로써, 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포가 연골세포로 분화할 수 있는 능력을 검증할 수 있었다.

5) 혈관내피세포로의 분화능력

골격근줄기세포를 혈관내피세포로 분화시키기 위해서 이십만 개의 세포를 2.5 mg/ml 피브리노겐 및 0.5 U/ml 트롬빈로 구성된 300㎕ 피브린 하이드로젤위에 파종하였다. 혈관내피세포로의 분화는 98.5% DMEM, 1% 송아지혈청, 0.5% DMSO, 10 ng/ml VEGF (R&D systems), 10 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF로 구성된 혈관내피세포분화배지를 첨가하여 7일간 배양하였다. 파종 2시간 후에 모세혈관-유사 망상구조 형성여부 및 혈관내피세포 표지자의 발현여부로 판정하였다. 모세혈관-유사 망상구조의 형성은 위상차 현미경 관찰을 통하여 확인하였다. 혈관내피세포 표지자의 발현은 면역형광염색을 통하여 확인하였다. 분화 유도 7일 후에 세포를 회수하여 cyto-원심분리기를 이용하여 슬라이드에 부착시켜 완전히 건조시킨 다음 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 20분간 고정시켰다. 항체의 비특이적인 반응을 억제하기 위하여 0.4% 트리톤-X 100용액이 포함된 5% goat serum으로 40분간 blocking하고 혈관내피세포 표지자 CD31(abcam), CD34(DAKO), CD144(DAKO), von Willebrand Factor(vWF; Abcam) 항체를 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 슬라이드는 PBS로 3회 세척 후 Dylight 488-conjugated 이차항체를 상온에서 50분간 반응시키고 10 ㎍/ml DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Invitrogen)용액으로 핵을 염색하였다. 이후 PBS로 3회 세척 후 슬라이드는 ProLongGold antifade reagent (Molecular Probe)로 마운팅 하여 공초점 레이저주사현미경으로 표지자의 발현여부를 평가하였다. 혈관내피세포의 기능적 특징인 acetylated-low density lipoprotein(Ac-LDL) uptake여부는 골격근줄기세포를 혈관내피세포로 분화유도 7일 후 0.1 ㎍ CM-DiI-conjugated Ac-LDL(Invitrogen)을 첨가한 후 세포질 내로의 uptake 정도를 공초점 레이저주사현미경으로 평가하였다. 또한 분화유도 후 총 RNA를 추출한 후 RT-PCR 후 전기영동 분석을 통하여 조골세포 특이 mRNA 발현여부를 판정하였다.

도 16에서 제시하듯이 골격근줄기세포는 모세혈관 망상구조를 형성하였으며(A), 혈관내피세포-특이 mRNA인 Flk-1, vascular endothelial cadherin (VE-cad), vWF가 발현되는 것을 확인할 수 있었다(B). 분화유도 7일 이후 골격근줄기세포는 자갈모양으로 형태가 변하였으며, 이들 세포에서 혈관내피세포 표지자인 CD31, CD34, CD144, vWF가 90% 이상의 세포에서 양성으로 발현되었다(C). 또한 혈관내피세포로 분화가 유도된 세포는 Ac-LDL을 uptake할 수 있는 기능을 습득한 것을 확인할 수 있어서, 하이드로젤 내로 이동 성장한 골격근줄기세포가 혈관내피세포로 분화할 수 있는 능력을 검증할 수 있었다.

실시예 12. 체외증폭 배양한 골격근줄기세포의 분비특성

골격근줄기세포의 분비특성은 human antibody arrays(RayBiotech, Norcross, GA)을 이용하여 분석하였다. 근육줄기세포와의 발현특성을 동시에 분석하여 골격근줄기세포의 발현특성을 분석하였다. 골격근줄기세포 혹은 근육줄기세포는 각각 백만 개를 100-mm 크기의 배양용기에 파종한 후 1% 송아지혈청이 포함된 DMEM을 첨가한 후 1일간 배양하였다. 배양 후 배양상층액을 수거하여 100 x g에서 원심분리한 후 세포배양액을 정제하였다. Antibody arrays membrane은 제공된 blocking buffer로 30분간 실온에서 blocking하였다. 이후 정제한 배양상층액은 array membrane과 4℃에서 16시간 동안 반응시킨 후 washing buffer로 3회 세척하였다. 이후 antibody array membrane은 biotin-conjugated antibody과 실온에서 1시간 반응시키고 washing buffer로 세척 후 horseradish peroxidase (HRP)-conjugated streptavidin을 실온에서 2시간 반응시켰다. 발색을 위하여 detection buffer를 적용하고 LAS3000 system을 통해 영상을 획득하였다.

도 17에서 제시하듯이 본 실시예에서는 총 20개의 조직재생 관련 인자들을 분석하였으며, 골격근줄기세포는 angiogenin, EGF, ENA-78, bFGF, GRO, intergeron, leptin, PANTES, TIMP-1, VEGF, VEGF-D 등과 같은 혈관성장인자들을 분비하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 13. 체외증폭 배양한 골격근줄기세포의 혈관재생 능력

단층배양법으로 증폭한 후, 계대배양 3번째 골격근줄기세포의 생체 내 혈관유도능력을 규명하기 위하여 마우스 허혈성 하지모델을 채택하였다. 9~10주령의 수컷 BALB/c nu/nu 누드마우스의 대퇴동맥을 결찰하고 다음날 PKH-26 red(Sigma)로 표지된 이백만개의 골격근줄기세포를 하지근육 내로 주입하였다. 골격근줄기세포 대신 PBS만 주입한 마우스를 대조군으로 이용하였다. 주입한 골격근줄기세포에 의한 혈관유도능력은 발바닥 및 하지 괴사길이를 측정하여 판정하였다. 또한 골격근줄기세포 주입 12일 후에 마우스를 도살한 후 하지근육을 수거하고 2% 포르말린 용액으로 고정하였다. 근육 내로 주입한 골격근줄기세포의 생체 내 혈관내피세포로의 분화여부를 면역형광염색을 통하여 추적 분석하였다. 수거한 하지근육은 이후 파라핀블록을 제작하고 5 ㎛두께로 파라핀 절편을 제작하였다. 면역형광염색은 파라핀 절편을 isotype matched serum으로 실온에서 40분간 blocking한 후 CD31, CD34, vWF, VE(vascular endothelial)-cadherin 항체와 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS를 이용하여 3회 세척 후 isotype matched Dylight 488-conjugated 이차항체를 실온에서 40분간 반응시켰다. 10 ㎍/ml DAPI으로 핵을 대조염색한 후 ProLong　Gold antifade reagent을 이용하여 마운팅하였으며, 공초점 주사현미경으로 이미지를 획득하였다.

도 18A에서 제시하듯이, PBS만을 주입한 마우스의 경우 하지 및 발바닥의 괴사가 두드러지게 증가하였으나, 골격근줄기세포(MDSCs)를 주입한 마우스의 하지의 괴사는 대조군(PBS)와 비교하여 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 도 18B는 허혈성 하지경색 마우스의 하지 및 발바닥 괴사길이를 측정한 결과, 대퇴동맥 결찰 후 하루째는 발바닥의 괴사정도는 골격근줄기세포 주입여부와 관계없이 유의한 차이를 보이지 않았다. 그러나 세포 주입 4일 이후 측정한 하지 괴사정도는 골격근줄기세포를 주입한 마우스에서 유의하게 감소되는 것을 확인할 수 있었다(*, p < 0.01). 도18C는 주입한 골격근줄기세포가 생체 내에서 혈관내피세포로 분화하여 신생혈관을 생성하는 것을 나타내고 있다. 주입한 골격근줄기세포가 미세혈관 구조로 취하며, CD31, CD34, vWF, VE-cadherin을 발현하고 미세혈관 내관을 도포하는 혈관내피세포로 분화하는 것을 나타내고 있다.

실시예 14. 골격근줄기세포의 골격근재생 능력

골격근 손상은 1 ㎍ cardiotoxin(Sigma)을 50 ㎕ PBS로 희석한 후 9주령의 수컷 BALB/c nu/nu 누드마우스의 하지 근육 내로 주입하였다. Cardiotoxin 주입 하루 후 이백만개의 골격근줄기세포를 50 ㎕ PBS로 현탁한 후 동일한 하지근육 내로 주입하였다. 인간 골격근줄기세포 주입 1주 내지 2주 후 하지 골격근을 적출하였고, 2% 포르말린에 고정하였다. 3 mm 두께로 절단한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 이후 파라핀 절편을 취하여 hematoxylin eosin 염색을 시행하여 골격근 손상 및 재생정도를 평가하였다. 하지근육 내로 주입한 골격근줄기세포의 골격근 재생 및 분화특성을 규명하기 위하여 세포추적연구를 시행하였다. 주입한 인간 골격근줄기세포의 생체 내 골격근세포로의 분화여부를 판정하기 위하여 이중 면역형광염색을 시행하였다. 인간세포에만 반응하는 항-인간미토콘드리아항체(anti-human mitochondria antigen, hMt-Ag)을 이용하여 골격근 내 주입한 인간 골격근줄기세포를 검출하였다. 골격근세포로의 분화는 desmin, a-sarcomeric actinin(a-Actinin), myosin heavy chain(MHC)을 이용하여 표지하였다. HMA는 Alexa Fluor-488-conjugated 이차항체로 시그널을 검출하였으며, desmin, a-Actinin, MHC은 Alexa Fluor-594-conjugated 이차항체로 시그널을 검출하였다. 핵은 ToPro-3으로 염색하여 공초점 레이저 현미경으로 관찰하여 사진을 촬영하였다.

도19A에서 제시하듯이 PBS만을 주입한 골격근은 골격근의 괴사(검은 화살표)와 석회화를 관찰할 수 있었으나, 골격근 재생은 드물게 관찰되었다. 그러나 골격근줄기세포를 주입한 하지 근육 내는 재생되는 골격근(흰 화살표)이 빈번하게 관찰되었으며, 주입 2주 후 손상된 골격근이 재생되는 것을 확인할 수 있었다.

도19B에서 제시하듯이 hMt-Ag으로 주입한 골격근줄기세포를 표지하였으며, hMt-Ag 양성인 세포가 골격근 fiber를 형성하며, desmin, a-Actinin 및 MHC를 발현하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

골격근절편을 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는 단계; 및 하이드로젤만을 분해하여 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포를 회수하는 단계;를 포함하는 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 골격근줄기세포는 (i)CD29, CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 중간엽줄기세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (ii)CD140b, CD146, 및 SMA로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관주위세포 표지자 군에 양성인 면역학적 특성; (iii) MyoD1 및 Pax7으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위성세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; (vi)Lin, CD3, CD14, CD19, CD34, 및 CD45로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 림프계세포 또는 조혈계세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성; 및 (vi)CD31 및 CD34으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 혈관내피세포 표지자 군에 음성인 면역학적 특성;으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 면역학적 특성을 가지는, 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 천연고분자로 이루어진, 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 피브린 하이드로젤이며, 상기 피브린 하이드로젤 1ml에 대하여 0.8 mg 내지 5.0 mg 중량부의 피브리노겐을 포함하는, 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤은 항섬유소용해제가 포함된, 골격근줄기세포의 배양방법.
제5항에 있어서, 상기 항섬유소용해제는 아미노카프로이드산(aminocaproid acid), 트란이그제믹산(tranexamic acid), 아프로티닌(aprotinin) 및 아미노메틸벤조익산(aminomethylbenzoic acid)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 골격근줄기세포의 배양방법.
제5항에 있어서, 상기 하이드로젤은 1 ml에 대하여, 항섬유소용해제를 10 내지 1000 ㎍ 중량부를 포함하는, 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서, 상기 하이드로젤의 분해는 콜라지나아제, 젤라티나아제, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, TPA(tissue plasminogen activator), 플라즈민(plasmin) 및 히알루로니다아제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 통하여 분해되는, 골격근줄기세포의 배양방법.
제1항에 있어서,
1) 아미노카프로이드산(aminocaproid acid) 및 트란이그제믹산(tranexamic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항섬유소용해제가 포함된 피브린 하이드로젤 내에 골격근절편을 함입시키는 제 1단계;
2) 성장배양액을 첨가하여 5 내지 30rpm 속도의 셰이커에서 3차원 장기배양(organ culture) 하는 제 2단계;
3) 유로키나아제, 스트렙토키나아제 및 플라즈민으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 분해효소를 처리하여 피브린 하이드로젤을 분해함으로, 골격근절편으로부터 하이드로젤 내로 이동, 성장한 골격근줄기세포 및 골격근절편을 회수하는 제 3단계; 및
4) 상기 하이드로젤로부터 회수한 골격근줄기세포를 단층배양법으로 증폭시키는 제 4단계;를 포함하는 골격근줄기세포의 배양방법.
제9항에 있어서, 상기 제 3단계에서 회수된 골격근절편을 다시 제 1단계의 하이드로젤 내에 함입시켜 배양하는, 골격근줄기세포의 배양방법.
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