KR102391917B1 - 근육 줄기세포의 효율적인 분리를 위한 완충액 조성물 - Google Patents

근육 줄기세포의 효율적인 분리를 위한 완충액 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물 및 상기 완충액 조성물을 이용한 가축 근육 줄기세포 분리 방법에 관한 것으로, 본 발명의 줄기세포 분리용 완충액 조성물은 가출 근육 줄기세포 분리시 세포 사멸 감소를 통해 근육 줄기세포 수득률을 높이므로, 배양육 생산과 같은 농생명공학적 활용에 이용될 수 있다.

Description

근육 줄기세포의 효율적인 분리를 위한 완충액 조성물{Buffer solution composition for efficient isolating muscle stem cells}
본 발명은 근육 줄기세포의 효율적인 분리를 위한 완충액 조성물에 관한 것이다.
근육 줄기세포는 근섬유의 기저층 아래에 존재하며 근육 조직의 재생을 담당한다. 근육 줄기세포는 근육생리 및 재생에 관한 연구에 이용되어 왔으며, 최근에는 가축의 배양육 생산을 위한 중요한 후보물질로 간주되고 있다. 근육 줄기세포의 체내 생장 환경은 근육섬유, 결체조직, 기질세포 등 다양한 형태의 조직과 다양한 세포들로 구성되어 있기 때문에 근육조직에서 근육 줄기세포를 분리하는 과정은 일련의 단계를 거쳐 진행된다.
동물의 근육 줄기세포를 분리하는 과정은, 먼저 동물에서 채취한 근육 조직을 트립신, 프로나제, 콜라게나제와 같은 단백질 분해 효소를 이용하여 조직에서 세포를 해리시킨다. 거름망을 통해 해리된 단일 세포를 조직 파편 및 근섬유로부터 분리한다. 분리된 세포 군집은 체세포, 혈액 세포, 기질 세포 및 근육 줄기세포와 같은 다양한 유형의 세포를 포함한다. 따라서 높은 순도로 정제된 근육 줄기세포를 얻기 위해 근육 줄기세포의 물리적, 생물학적, 분자적 특징을 기반으로 다양한 분류 방법이 개발되었다.
근육 줄기세포의 분류 방법 중 가장 널리 사용되는 방법은 특별한 도구가 필요하지 않은 밀도 구배 원심분리법(Density gradient centrifugation)과 사전배양(preplating)법이다.
밀도 구배 원심분리법는 밀도에 따라 세포를 분리하는 방법이다. 근육 줄기세포와 기타 체세포는 밀도가 다르기 때문에 밀도 구배가 있는 용액을 사용하여 원심분리를 통해 다양한 세포들로부터 줄기세포를 분리할 수 있다.
사전배양법은 부착성 세포의 경우 세포 종류에 따른 세포외기질(extracellular matrix; ECM)에 대한 부착 능력의 차이가 있으므로, 이를 이용하여 세포 집단을 나누는 방법이다. 근육 줄기세포와 섬유아세포는 각각 라미닌과 콜라겐 부착 환경을 선호하기 때문에, 콜라겐 코팅된 배양 플레이트에 근육 조직에서 분리된 세포군을 파종한(plating) 후 40-60분에 상층액을 수확하면 대부분의 섬유아세포와 상피세포는 배양 접시에 부착된 상태로 남아 있고, 근육 줄기세포는 배양 접시에 분리되지 않으므로 줄기세포 집단을 분리할 수 있다. 그러나 밀도 구배 원심분리법 및 사전배양법의 정제효율은 넓은 편차와 낮은 정확도를 나타내는 것으로 보고되었다.
최근, 분자 생물학의 발전으로 세포의 분자생물학적 특징(바이오마커)에 따라 세포를 분석하고 분리할 수 있게 되었다. 형광 활성 세포분류(Fluorescence-activated cell sorting; FACS) 및 자기활성세포분류(Magnet-activated cell sorting; MACS) 시스템은 각각 줄기세포의 마커 유전자에 대한 형광 및 자기 마이크로비드 접합 항체를 사용하여 근육줄기세포를 분리한다.
모든 세포는 세포의 성질에 따라 특이적으로 발현하는 표지인자가 있으며, FACS와 MACS는 항체를 이용하여 세포막에서 발현하는 표지인자를 인식하여 세포를 분석하고 분류한다. 현재까지 CD29(인테그린 β1), CD34, CD56(NCAM; 신경세포부착분자), CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4), 혈관세포부착분자(VCAM), 인테그린 α7 및 SM/C-2.6에서 선택된 바이오마커가 근육 줄기세포의 분류에 사용되고 있다.
앞서 언급한 두 개의 항체 기반 기술 중에 FACS 기법을 사용하면 유세포분석기(flow cytometry)를 사용하여 보다 정확한 분석을 수행할 수 있다. 하지만, FACS 기법의 운용 시스템은 laminar flow 를 이용한 단세포 검출 또는 분리이므로, 적은 함량의 세포를 정밀하게 검출 또는 분리하는 목적에는 유리하지만, 부착형 세포인 근육 줄기세포의 경우 부착된 상태가 아닌 부유된 상태에서 세포 분리를 해야 하므로, 분리 과정에서 세포에 손상을 가하여 세포 사멸을 유도하여 분리 효율을 감소시킬 수 있다.
이와는 반대로 MACS 기법은 자성을 지닌 bead에 부착된 항체를 이용하여 항체에 결합하는 항원을 발현하는 세포를 분리하는 방법을 이용하는 것으로 FACS 기법과 유사한 원리로 세포를 분리하는 방법이지만, 고가의 장비를 필요로 하지 않을 뿐 아니라, 대략 1시간 안에 1011개의 세포를 분리할 수 있다는 장점이 있으므로, MACS 기법은 분리 중 세포에 상대적으로 덜 해롭고 대용량 실험에 더 적합하다.
세포기질에 부착된 세포의 정제과정에서 세포들은 불가피하게 트립신과 같은 단백질 분해 효소의 처리를 통해 부유된 상태로 장기간 존재하게 된다. 암세포, 혈액세포, 일부 형질전환 세포주를 제외하고 일반적인 세포는 세포외기질과 같은 물리적인 환경에 반드시 부착하여 성장을 하는 부착형 세포이기 때문에 장기간 부착하지 못하고 부유된 상태로 존재하게 되면 일련의 과정을 통해 세포사멸(apoptosis)에 이르게 되고, 특히 미부착으로 인한 세포의 사멸현상을 anoikis라 한다. 또한 정제과정중 발생하는 물리, 화학적 스트레스로 인해 세포사멸이 증가하며 이는 최종적으로 세포 수율의 감소를 일으킨다.
배양육을 생산하기 위해서는 많은 근육 줄기세포를 효율적으로 분리하는 것이 중요하다. 돼지, 소 등의 가축 근육 줄기세포의 정제를 위해 밀도 구배 원심분리 및 사전배양 기술이 돼지 연구에서 널리 사용되었지만, MACS 기법을 사용하는 프로토콜은 아직 보고된 바가 없다.
이러한 배경하에서, 본 발명의 발명자들은 가축 근육 줄기세포 분리방법을 다각도로 연구한 결과, 본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물을 이용한 MACS 기법으로 분리하는 경우, 가축 근육 줄기세포 분리 수율 및 분리된 근세포로의 분화능을 유지하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허 10-2013-0124077(공개일: 2013.11.13.)
1. Ding, S., Wang, F., Liu, Y., Li, S., Zhou, G., & Hu, P. Characterization and isolation of highly purified porcine satellite cells. Cell Death Discovery, 3, 17003. (공개일: 2017.3) 2. Redshaw, Z., & Loughna, P. T. Oxygen concentration modulates the differentiation of muscle stem cells toward myogenic and adipogenic fates. Differentiation, 84(2), 193-202. (공개일: 2012.06.01) 3. Miersch, C., Stange, K., & Rontgen, M. Separation of functionally divergent muscle precursor cell populations from porcine juvenile muscles by discontinuous Percoll density gradient centrifugation. BMC Cell Biology, 19(1), 2. (공개일: 2018)
본 발명은 근육 줄기세포의 효율적인 분리를 위한 완충액 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물을 이용하여 가축에서 근육 줄기세포의 분리방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 포도당, Y27632, SB203580 중에서 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 완충액 조성물은 포도당을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 완충액 조성물은 Y27632를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 완충액 조성물은 포도당 및 SB203580를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따라 본 발명은 상기 완충액 조성물을 이용한 근육 줄기세포 분리 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따라 상기 분리 방법은 CD29에 대한 항원-항체 반응을 이용한다.
본 발명의 일 구현예에 따라 상기 근육 줄기세포는 가축 유래일 수 있다.
본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따라, 상기 가축은 돼지일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 일 구현예에 따라 분리된 근육 줄기세포를 이용한 배양육 생산 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물 및 상기 완충액 조성물 및 CD29 항체를 이용한 근육 줄기세포 분리 방법은 많은 양의 근육 줄기세포의 농축에 용이할 뿐 아니라, 분리 과정에서 세포 사멸률을 감소시키므로, 근육 줄기세포를 효율적으로 분리할 수 있을 분 아니라, 향후 배양육 생산과 같은 농생명공학적 활용에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 CD29 항체를 이용한 자기 활성 세포 분류(MACS) 기법을 통한 돼지 근육 줄기세포의 정제 결과를 나타낸 것으로, 도 1A는 정제 전·후의 돼지 근육 줄기세포에서의 CD56 및 CD29 항원의 발현 양상을 나타낸 것이고(스케일 바 = 200 μm), 도 1B는 정제 전·후의 돼지 근육 줄기세포의 CD56과 CD29 항원의 발현 비율을 나타낸 것이고, 도 1C는 다양한 품종에서 CD29 항체를 이용하여 분리된 근육 줄기세포의 CD56 및 CD29 항원 발현 양상을 분석한 결과이다.
도 2는 MACS 기법으로 분리 정제된 다양한 돼지 품종 유래 근육 줄기세포의 분화능을 면역학적 염색법(핵, 미오신 중쇄)에 의해 분화능을 확인한 결과이다(스케일 바 = 400 μm).
도 3은 MACS 기법으로 돼지 근육 줄기세포 분리시, 다양한 완충액 조성에 따른 세포 사멸률을 분석한 결과이다. 도 3A는 다양한 완충액으로 정제된 돼지 근육 줄기세포의 Ammexin V 염색 결과이고, 도 3B는 다양한 완충액 조성에 따른 세포 사멸률을 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 개시내용의 특정의 특성을 기술하고 청구함에 있어서, 다음의 용어는 달리 지정되지 않는 한 이하에 기술된 정의에 따라 사용될 것이다.
본 명세서에서 어떤 양태들이 "~를 포함하는"이란 용어와 함께 기술되더라도, "~로 구성된" 및/또는 "본질적으로 ~로 구성된"의 관점에서 기술된 다른 유사 양태들 또한 제공된다는 것이 이해되어야 한다.
본 발명에서 "근육 줄기세포"는 생장 정지 상태의 근위성세포(quiescent satellite cells)와 근아세포(myoblast)라 불리는 활성화된 근위성세포(activated satellite cells)와 같은 전구세포를 포함한다. 근육 줄기세포는 근세포로 분화할 수 있고, 특히 가축 유래 근육 줄기세포는 실제 배양육 생산 등에 사용될 수 있어, 농생물학적으로 효용가치가 매우 높은 세포이다.
본 발명에서 "근육 줄기세포의 분리"는 근육 조직에 존재하는 다양한 종류의 세포 중 근육 줄기세포를 분리하는 것을 의미한다.
본 발명에서 "근육 줄기세포의 정제"는 근육 조직에서 분리된 단일세포 중에서 근육 줄기세포에 특이적인 바이오마커를 이용하여 근육 줄기세포를 특이적으로 분리하는 것을 의미한다. 즉 상기 근육 줄기세포의 정제과정을 통해 높은 함량 및 순도의 근육 줄기세포를 얻을 수 있다.
본 발명에서 "근육 줄기세포의 배양"은 근육 줄기세포가 줄기세포능인 분화능을 유지한 채로, 세포증식하는 것을 의미한다.
근육 발달 및 배양육 생산에 관한 연구를 위해서는 근육 조직 내 다양한 종류의 세포로부터 근육 줄기세포를 분리 및 정제하는 과정이 필요하다. 근육 조직에서 근육 줄기세포 분리시 정제과정을 거치지 않은 근육 줄기세포는 낮은 근육 분화능을 나타낸다. 근육 줄기세포를 선택적으로 분리하기 위해 밀도 구배 원심분리 및 사전배양 기술이 널리 사용되고 있다.
밀도 구배 원심분리로 돼지 근육 조직에서 분리된 돼지 근육줄기세포는 신경세포부착분자(NCAM, CD56으로도 알려짐) 및 desmin과 같은 근육 줄기세포 특이적 유전자로 확인한 결과 90%의 순도로 근육 줄기세포의 정제가 가능한 것으로 보고된 바 있다. 또한, 사전배양 방법을 이용하는 경우에도 돼지 근육 줄기세포의 순도가 증가하는 것으로 알려졌다. 그러나 이러한 방법은 실험 결과의 편차가 크고 정확도가 낮은 것으로 보고되었고, 이러한 문제를 해결하기 위해 형광 활성 세포분류(FACS) 및 자기 활성 세포분류(MACS)와 같은 세포 표면의 바이오마커를 사용한 분류 시스템이 개발되었다. 돼지 연구에서도 FACS 기법을 사용하여 해리된 근육 조직에서 CD56+CD29+CD31-CD45- 세포 집단을 분리하는 연구가 수행된바 있고, 이들 세포의 94%가 근육 줄기세포 표지유전자인 PAX7을 발현하는 것을 확인한 바 있다.
그러나 FACS 기법을 이용하여 근육 줄기세포를 이용하는 경우 고가의 유세포분석기(Flow Cytometry)가 필요하고, 분석 원리가 완충용액에 분리하고자 하는 세포 집단을 부유상태로 만들어 laminar flow 를 이용하여 세포를 이동하는 과정에서 세포의 바이오마커에 부착된 항체의 형광표지를 검출하여 분리하는 원리이므로, 분석 또는 분리 시간이 오래 걸릴 뿐 아니라, 분석 또는 분리 도중 세포가 손상을 입혀 세포사멸을 유발하기 때문에 대량의 세포 분리에 적합하지 않다.
이와 같이 돼지 등의 가축 근육 줄기세포 분리 방법에 대한 다양한 시도에도 불구하고 지금까지 표준화된 방법이 존재하지 않는다. 특히 돼지 근육 줄기세포의 경우, 배양육 생산의 기초 재료가 되므로 다양한 분리방법을 통한 돼지 근육 줄기세포 분리가 시도되어 왔다. 또한, 정밀한 분리를 위해 근육 줄기세포의 세포막에서 특이적으로 발현하는 바이오마커가 발굴되어 왔고, 현재까지 CD29(인테그린 β1), CD34, CD56(NCAM; 신경세포부착분자), CXC 케모카인 수용체 4(CXCR4), 혈관세포부착분자(VCAM), 인테그린 α7 및 SM/C-2.6에서 선택된 바이오마커가 근육 줄기세포의 분류에 사용되어왔다. 하지만, 이들 바이오마커들은 주로 사람 근육 줄기세포에서 발굴되어 가축에 그대로 적용하였을 때 목적하는 재현성있는 결과를 얻기에는 어려움이 있었다.
본 발명에서는 자석을 이용한 MACS 기법을 이용하여 근육 줄기세포의 바이오마커 중 하나인 CD29 항체를 기반으로 하는 간편한 근육 줄기세포 분류 방법을 개발하였다.
MACS 기법은 FACS 기법과 마찬가지로 분리하고자 하는 세포의 세포 표면에서 발현하는 바이오마커에 대한 항체를 이용하여 세포를 분리하는 방법이다. 다만, MACS 기법은 FACS 기법에서 사용하는 형광표지된 항체와는 달리, 자성을 지닌 bead에 부착된 항체를 이용하기 때문에, 고가의 Flow Cytometry에 대신에 컬럼크로마토그래피 및 자석을 이용하므로 고가의 장비를 필요로 하지 않을 뿐 아니라, 대략 1시간 안에 1011개의 세포를 분리할 수 있다는 장점이 있으므로, MACS 기법은 분리 과정상 세포에 상대적으로 덜 해롭고, 대용량 실험에 더 적합하다.
본 발명에서는 돼지 근육 줄기세포를 분리하기 위해 분리된 돼지의 대퇴 이두근에서 결합조직 및 혈관 등을 제거한 후, 조직을 분쇄하고 프로나제(pronase)를 처리하여 단일세포 집단으로 분리한다.
고순도의 돼지 근육 줄기세포를 분리하기 위해 CD29 또는 CD56 근육 줄기세포의 바이오마커를 이용한 positive selection을 테스트하였고, 분화된 바이오마커인 CD90(Thy1; 섬유아세포 바이오마커), CD31(PECAM-1; 내피세포 바이오마커) 및 CD45(PTPRC; 조혈세포 표지인자)를 사용하는 음성 분리기법(negative selection)을 테스트하였다.
그 결과, CD56은 CD29와 마찬가지로 광범위하게 쓰이는 근육 줄기세포의 바이오마커이지만, 돼지 근육 줄기세포 뿐 아니라 다른 종류의 세포에서도 발현하는 것을 확인하였고, 실제 CD56 항체를 이용하여 정제한 결과 돼지 근육 줄기세포의 정제에는 효율적이지 않다는 것을 확인하였다. 또한, 분화된 세포들의 바이오마커인 CD90, CD31 및 CD45 항체를 이용한 negative seletion 역시 돼지 근육 줄기세포의 정제에는 효율적이지 않다는 것을 확인하였다.
앞서 언급한 바이오마커 중에서 CD29에 대한 항체를 이용한 MACS 기법으로 근육 줄기세포를 정제하는 경우, 정제 전 약 30%의 세포가 비근육성 세포인데 반해, 정제 후 CD29+/CD56+ 세포의 비율이 유의하게 증가하였고(91.5% 이상), CD56+ 단일 양성의 비근원성(non-myogenic) 세포의 비율은 급격히 감소하였다. 또한, LYD 품종의 돼지 뿐 아니라, Birkshire 및 한국 재래 돼지 등 다른 품종 유래의 돼지에서 근육 줄기세포를 정제하는데 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
또한, CD29 항체에 의해 분류된 세포는 분화 유도시 근육으로의 분화율이 증가하였고, 미오신 중쇄 발현율이 높다는 것을 확인하였다.
근육 줄기세포는 원래 세포외기질에 부착해야 하는 접착성 세포로서, 완충용액 또는 배양액에 부유하여 방치하는 경우 스트레스를 받게 되어 최종적으로 세포사멸을 유도한다(Anoikis). 따라서, 근육 줄기세포의 분리·정제 과정은 완충용액 또는 배양액에 부유하여 이루어지므로, 상기 분리·정제 과정 자체가 근육 줄기세포에 스트레스를 가하는 과정의 일부일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물은 포도당, Y27632 및 SB203580 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함한다.
포도당은 세포의 항상성 유지를 위한 필수성분으로 세포 유지를 위한 에너지원으로 사용되므로, 완충액에 에너지원으로 포함될 수 있다. 하지만 고농도의 포도당은 세포에 스트레스를 주어 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다. 하지만, 포도당을 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 사용된다는 보고는 없었다.
Y27632는 ROCK(Rho-associated protein kinse) 억제제로서 부착성 세포가 세포외기질에 부착하지 못하여 일어나는 세포사멸을 의미하는 anoikis 저해제로 알려져 있다. 하지만, 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 사용된다는 보고는 없었다.
SB203580는 p38 MAPK(MAP kinase) 저해제로서 신호전달 억제제로 사용되었지만, 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 사용된다는 보고는 없었다.
본 발명의 일 구현예에 따른 포도당, Y27632 및 SB203580 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물은 돼지 근육 줄기세포 분리 시 세포 사멸율을 감소시키고, 줄기세포능을 유지하는 효과를 보였다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 포도당, Y27632 및/또는 SB203580는 각각 0.01%(w/v) 내지 5%(w/v), 1μM 내지 50μM 및 1μM 내지 150μM의 함량을 가질 수 있다.
또한, 본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 포도당, Y27632 및/또는 SB203580는 각각 0.05%(w/v) 내지 1%(w/v), 1 μM 내지 20 μM 및 5 μM 내지 50 μM의 함량을 가질 수 있다.
상기 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 포도당의 함량이 0.01% (w/v) 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 5%(w/v) 이상인 경우 세포 독성을 나타낼 수 있다. 상기 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 Y27632의 함량이 1μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 50μM 이상인 경우 세포 독성을 나타낼 수 있다. 상기 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 SB203580의 함량이 1 μM 이하인 경우 특별한 효과가 없으며, 150 μM 이상인 경우 세포 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 포도당은 0.1%(w/v)의 함량을 가질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 Y27632은 5 μM 의 함량을 가질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 SB203580은 20 μM 의 함량을 가질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에 포함된 포도당과 SB203580은 각각 0.1%(w/v), 20 μM 의 함량을 가질 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 포도당, Y27632 및 SB203580 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물의 기본 완충액은 줄기세포의 분리에 적절하게 사용될 수 있는 해당 분야에서 사용되는 통상의 완충액에서 임의로 선택될 수 있다. 또한, 상기 기본 완충액은 기본 배지에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 기본 완충액은 PBS(phosphate-buffered saline), TBS(Tris-Buffered saline), DPBS(Dulbecco's phosphate buffered saline)에서 선택될 수 있으며, 기본배지인 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, aMEM(a-modified Minimum Essential Media), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물은 DPBS를 기본 완충액으로 하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에는 추가적으로, 박테리아, 곰팡이 등의 감염을 막기 위해 항생제, 항진균제 및/또는 마이코플라스마의 성장을 예방하는 해당 업계에서 일반적으로 사용하는 물질을 포함되는 것이 바람직하다. 항생제로는 페니실린-스트렙토마이신 등 통상적으로 세포배양에 사용되는 항생제를 모두 이용할 수 있으며, 항진균제로는 알포레리신 B, 마이코플라즈마 억제제로는 젠타마이신, 시프로플로사신, 아지트로마이신 등의 일반적으로 사용하는 물질을 사용할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 또한, 시판되는 항생제-항진균제(antibiotic-antimycotic; AA)(Gibco)가 사용될 수 있다.
본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에는 추가로 BSA(Bovine Serum Albumine)가 포함될 수 있다. 완충액 조성물에 포함된 BSA의 함량은 0.1%(w/v) 내지 5%(w/v)이다. 본 발명의 일 구현예에 따른 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에는 0.5%(w/v)의 BSA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물에는 추가로 2 mM EDTA가 포함될 수 있다.
본 발명의 근육 줄기세포 분리용 완충액 조성물을 사용하여 근육 줄기세포 완충액 조성물을 이용하는 경우, 일반적인 완충액(DPBS)에서보다 현저한 정도로 세포사멸을 억제하는 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 근육 줄기세포는 일반적인 가축에서 수득할 수 있다. 가축은 일반적으로 돼지, 소, 양, 닭, 염소, 토끼, 개 등을 의미하고, 본 발명에서는 돼지에서 근육 줄기세포를 수득할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
돼지는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), YBD종(Yorkshire X Berkshire X Duroc), 버크셔종, 듀록종, 및 한국 토종 돼지 등의 품종이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서는 근육 줄기세포를 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지의 근육에서 분리했지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서 CD29 항체를 이용하여 MACS 기법으로 근육 줄기세포를 분리하는 경우 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지에서 모두 90% 이상의 수율로 근육 줄기세포를 얻을 수 있었기 때문에 본 발명의 근육 줄기세포 분리 방법은 다양한 품종 및 개체 유래의 돼지 근육 줄기세포에서 실험적 편차를 줄이고 일관된 결과를 도출하는데 도움을 줄 수 있다는 장점이 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 모든 숫자는, 언급되었든지 아니든지, 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수식될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 정밀한 수치는 본 개시내용의 추가적인 실시양태를 형성하는 것으로 이해되어야 한다. 실시예에 개시된 수치의 정확성을 보장하기 위해 노력을 기울였다. 그러나, 측정된 모든 수치는 내재적으로 이의 각각의 측정 기법에서 실측된 표준 편차로부터 생성된 특정 오차값을 함유할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 돼지 근육 줄기세포의 분리 및 배양
모든 동물실험은 서울대학교의 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인(승인번호: SNU-180612-2) 후 서울대학교 동물관리실의 표준 규정에 따라 실시하였다.
돼지 근육 줄기세포는 CO2 흡입을 통해 안락사시킨 14일령의 LYD(LYD; Landrace Х Yorkshire Х Duroc), 버크셔, 한국 토종 돼지의 대퇴 이두근(biceps femoris muscle)으로부터 분리하였다. 대퇴 이두근을 채취하여 2X 항생제 항진균제 (antibiotic-antimycotic; AA; Gibco, Gaithersburg, USA)가 함유된 덜베코의 인산 완충 식염수(DPBS; Welgene, Gyeongsan, Korea)로 세척하고 결합 조직(connetive tissue)과 혈관(blood vessel)을 제거하였다.
분리된 조직을 분쇄기에서 다진 다음 0.8 mg/mL pronase(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하여 37 °C에서 40분 동안 10분마다 voltexing하면서 분해하였다. 결과물을 1200 Хg 에서 15분 동안 원심분리하고, 침전물을 10%(v/v) 소태아혈청 (FBS; Gibco)을 함유하는 MEM에 재현탁시켰다. 근육 줄기세포 집단을 포함하는 분리된 세포에서 분해되지 않은 조직을 분리하기 위해 위 결과물을 300 Хg에서 5 분 간 원심 분리하여 상층액을 수집하였다. 상층액을 100 μm 세포여과망으로 여과하고 15 분 동안 1200 Хg 에서 원심 분리하여 단일세포군을 수득하였다.
분리된 돼지 근육 줄기세포는 젤라틴 코팅 접시에서 3 일마다 계대배양하였다. 배양 배지는 F-10 기반 배지로서 10%(v/v) FBS, 1X AA, 1X 글루타맥스(GlutaMax(Gibco)), 0.1 mM 베타-머캅토에탄올 10 ng/ml EGF, 10 μM 덱사메타손 및 20 μM SB203580(Cayman Chemical, Ann Arbor, USA)이 포함된 F-10 배지를 사용하였다. 근육 줄기세포는 배양기간 동안 배지는 48 시간마다 교체하고, 37°C에서 5% CO2가 포함된 조건에서 배양하였다.
돼지 근육 줄기세포는 다시 사용할 때까지 10%(v/v) 디메틸설폭사이드(DMSO)를 함유하는 배양배지를 이용하여 동결보존하였다.
실시예 2. 자성 활성 세포분류기(Magnetic-Activated Cell Sorting; MACS)를 이용한 돼지 근육 줄기세포의 추가 정제
돼지 근육 줄기세포의 체외배양 동안 비근원성 세포(non-myogenic cell)를 제거하기 위하여 CD29-양성세포를 MACS 기법(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)을 사용하여 분류하였다. TrypLETM Express(Gibco)를 사용하여 실시예 1에서 분리된 돼지 줄기세포를 항-CD29 항체(1:100; MAB17783, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 항-마우스 IgG 마이크로비드(1:5; Miltenyi Biotec)와 반응시켰다. CD29-양성 세포를 제조업체의 지침에 따라 MS 컬럼(Miltenyi Biotec)에서 분류하였다.
MACS에 의해 정제된 돼지 근육 줄기세포 및 정제하지 않은 돼지 근육 줄기세포를 4%(v/v) 파라포름알데하이드로 고정하였다. 고정된 세포를 DPBS(Welgene)로 두 번 세척 한 후 샘플을 0.2%(v/v) Triton X-100(Sigma-Aldrich)으로 15분 동안 처리하고 10%(v/v) 염소 혈청으로 1 시간 동안 처리했다. 혈청처리 된 세포는 CD29 (1:200; MAB17783, R&D Systems), CD56 (1:200; 710388, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였다. 1 차 항체와 함께 배양한 후, 세포를 Alexa Fluor-접합 2 차 항체로 4 °C에서 하룻밤 처리하였다. 핵은 Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다.
LYD 돼지 근육에서 채취한 세포군집(정제되지 않은 세포군, 실시예 1의 방법 이용)에서 근육줄기세포의 표지 유전자로 알려진 CD56 및 CD29의 발현률을 분석하면, 전체 세포에서 약 30%의 비근원성 세포가 관찰되었다(도 1A 및 1B). 또한, 도 1B에서와 같이 근육줄기세포의 표지 유전자로 알려진 CD56 및 CD29의 발현양상이 일치하지 않는 것을 확인하여 CD56 항체, CD29 항체 각각을 이용한 MACS 법에 의해 돼지 근육 줄기세포를 분리하였다. 그 결과 CD29 항원을 발현하는 근육 줄기세포의 경우 CD56을 발현하는 세포에 비해 줄기세포능을 더 많이 유지한다는 것을 확인하여, CD56 항원은 근육 줄기세포의 정제에는 효율적이지 않다는 것을 확인하였다(구체적인 data 생략). 추가적으로 CD90(Thy1; 섬유아세포 표지인자), CD31(PECAM-1; 내피세포 표지인자) 및 CD45(PTPRC; 조혈세포 표지인자)를 사용하여 음성 분리기법도 검증하였지만, 돼지 근육줄기세포의 정제에는 적합하지 않았다(구체적인 data 생략).
CD29 항체를 이용한 MACS 분리 후, CD56+/CD29+ 근육줄기세포의 비율은 유의하게 증가하였고(91.5 ± 2.40%), CD56 단일 양성 비근원성 세포의 비율은 급격히 감소하였다(도면 1B). 또한, 이 방법을 Berkshire 및 한국 재래돼지 등 다른 품종의 근육줄기세포를 정제하는 데 적용할 수 있음을 확인하였다(도 1C).
실시예 3: 정제된 돼지 근육 줄기세포의 분화능 분석
CD29 항체를 이용한 MACS 법에 의해 정제된 각 품종의 돼지 근육 줄기세포를 일정 기간동안 배양한 후, 2%(v/v) 말 혈청(Biowest, Nuaillι, France), 1X 글루타맥스(Gibco), 1X AA(Gibco) 및 0.1 mM 베타-머캅토에탄올을 포함하는 MEM으로 구성된 분화 배지에서 2일 동안 배지 변경없이 세포를 배양하여, 근육 줄기세포로부터 근섬유로 분화시켰다. 분화된 세포를 4%(v/v) 파라포름알데히드로 고정시킨 후 미오신 중쇄에 대한 항체(1:200; 05-716, Sigma-Aldrich)를 이용하여 근육세포로의 분화능을 분석하였다. 핵은 Hoechst 33342(Molecular Probes, Eugene, USA)로 염색하였다.
미오신 항체 및 핵 염색 결과 CD29 항체를 이용한 MACS법에 의해 정제된 LYD, 버크샤이어 및 한국 재래돼지의 다양한 품종 유래 근육 줄기세포는 근섬유로 분화시키는 경유, 근세포의 특징인 다핵구조를 확인할 수 있고, 미오신 중쇄를 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 2).
실시예 4: 자성 활성 세포분류를 위한 완충 용액 테스트
자성 활성 세포분류 기술을 이용하여 돼지 근육줄기세포의 정제를 진행하는 동안 완충액 조성에 따른 세포사멸율의 비율을 조사하였다. 돼지 근육 줄기세포를 일정 기간동안 배양한 후, 0.5%(w/v) BSA (Sigma-Aldrich), 2 mM EDTA (Sigma-Aldrich), 1X AA(Gibco)을 포함하는 DPBS (Welgene)에 0.1%(w/v) 포도당 (Sigma-Aldrich), 5 μM Y27632 (Cayman) 및/또는 20 μM SB203580 (Cayman)을 첨가하여 상기한 바와 같이 자성활성세포분류를 진행하였다. 분류된 CD29 양성 세포들은 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abcam, Cambridge, UK)를 이용하여 세포사멸율을 측정하였고, 이 결과는 도 3에 나타내었다.
그 결과, 추가성분을 포함하지 않은 완충액을 사용한 대조군에서는 약 10% 의 세포사멸율을 보인 반면, 각각의 처리군에서는 세포사멸율이 감소하는 것을 확인하였다 (도면 3). 특히, 포도당을 추가한 경우 3개의 처리군 중 가장 많은 세포사멸 감소율을 보였고, SB203580은 가장 적은 감소율을 보였다. 하지만, 포도당과 SB203580의 복합처리는 유의하게 세포사멸율을 감소시켰다. 따라서, 포도당과 SB203580의 복합 처리 혹은 Y27632 처리는 근육 줄기세포 정제 중 세포사멸율을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다. 또한, 이와 같은 결과는 돼지 품종에 따라 차이를 보이지 않았다(구체적인 data 생략).

Claims (11)

  1. 포도당, 및 SB203580을 포함하는, 항원-항체 반응으로 근육 줄기세포를 분리하는 단계에서 사용하기 위한 완충액 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 포도당의 함량은 전체 완충액 조성물 기준으로 0.01%(w/v) 내지 5%(w/v)인, 완충액 조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    상기 SB203580의 함량은 전체 완충액 조성물 기준으로 1 μM 내지 150 μM인, 완충액 조성물.
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서,
    상기 포도당의 함량은 전체 완충액 조성물 기준으로 0.01%(w/v) 내지 5%(w/v)이고, 상기 SB203580의 함량은 전체 완충액 조성물 기준으로 1 μM 내지 150 μM인, 완충액 조성물.
  8. a) 분리된 가축 이두근으로부터 세포를 분리하는 단계; 및
    b) a) 단계에서 분리된 세포를 제1항, 제3항, 제5항, 및 제7항 중 어느 한 항의 완충액 조성물을 이용하여, CD29 항원-항체 반응으로 CD29 항원을 발현하는 세포를 분리하는 단계, 를 포함하는 가축 근육 줄기세포 분리 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 b) 단계는 MACS(magnetic-activated cell sorting) 기법을 이용하는 것인, 가축 근육 줄기세포 분리 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 가축은 돼지인, 가축 근육 줄기세포 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 돼지는 LYD종(Landrace X Yorkshire X Duroc), 버크셔종 및 한국 토종 돼지에서 선택되는, 가축 근육 줄기세포 분리 방법.



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