KR102301574B1 - Mbp-fgf2를 포함하는 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식 강화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명의 MBP-FGF2는 골격근 줄기세포의 초기 세포 부착 및 증식을 개선하고, 구성성분이 명확하고, 제노-프리이며, 사용하기 쉽고, 비용 효율성이 높은 골격근 줄기세포 배양용 플랫폼 개발에 활용할 수 있다. 또한 이를 이용하여 배양된 골격근 줄기세포는 근육재생용 조성물의 개발에 유용하다.

Description

MBP-FGF2를 포함하는 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식 강화용 조성물{Composition for activation or proliferation of skeletal muscle stem cells comprising MBP-FGF2}

본 발명은 MBP-FGF2를 포함하는 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식 강화용 조성물에 관한 것이다.

골격근 줄기세포(Skeletal muscle stem cells, SkMSCs)는 근섬유의 기저막과 원형질막 사이에 위치하는 미분화 세포로, 손상된 근육의 재생 또는 골격근의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다.

정상적인 생리 조건에서 골격근 줄기세포는 휴지상태(quiescent state)에 있다. 그러나 근육의 손상 또는 퇴행성 근육 질환에서 다양한 분열촉진 인자의 자극으로 인해 격렬하게 증식하고 기존의 근섬유에 융합되거나 초기 근섬유를 형성할 수 있는 근세포(myocyte)로 분화한다.

골격근 줄기세포를 이용한 치료는 생체에서 새로운 근육세포를 재생하여 퇴행성 근육질환의 유망한 치료방법이다. 퇴행성 근육 질환 치료를 위해서는 골격근 줄기세포가 분화능을 유지하며 증식하여야 한다. 따라서 실제로 골격근 줄기세포를 치료용도로 사용하기 위해서는 생체 내에서 분화능이 감소하지 않아야 하므로, 배양조건이 제한적이다.

골격근 줄기세포의 증식과 분화를 제어하는 신호 메커니즘에 대해 다양한 연구가 진행되어 있음에도 불구하고, 체외에서 증식시 생체내 이식 효율이 제한적이었다.

게다가, 체외에서 배양시 골격근 줄기세포의 초기 부착력과 생장 촉진을 위해 화학적으로 정의되지 않은 동물 유래 세포외 기질인 매트리젤(Matrigel)을 사용해야 하는 문제가 있었다. 이러한 문제점은 골격근 줄기세포 기반 치료제 개발의 주요한 장애물로 작용한다.

따라서 골격근 줄기세포 기반 치료제 개발을 위해 매트리젤과 달리 구성성분이 명확하며(chemically well-defined), 줄기세포의 증식 및 분화능이 유지되며, 제노-프리(xeno-free)한 골격근 줄기세포의 체외 배양 기술 개발이 필요하다.

대한민국 등록특허 10-1852358호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 포함하는 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식 강화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 상기 조성물을 포함하는 세포 배양용 플레이트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 과제는 체외에서 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 포함하는 배양용기에서 골격근 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 골격근 줄기세포의 근육세포로의 분화를 유도하지 않으면서, 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식능을 강화시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 과제는 상기 방법에 의해 활성 또는 증식능이 강화된 골격근 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 근육소실로 인한 근육 재생용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명자는 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2) 고정 매트릭스에서 골격근 줄기세포(SkMSCs)를 배양하고 세포의 행동을 분석하였다. MBP-FGF2 고정 매트릭스가 시험관 내에서 골격근 줄기세포의 초기 부착을 돕고, 활성 및 증식능을 강화시키고 골격근 줄기세포의 분화능을 감소시키지 않음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기의 과제를 해결하고자 본 발명은 하나의 양태로 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 포함하는 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식 강화용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “골격근 줄기세포(skeletal muscle stem cells, SkMSCs)”는 골격근의 재생에 핵심이 되는 세포를 의미하며, 이는 위성세포(satellite cells)로도 불린다. 근육 재생 과정은 휴지상태의 위성세포가 활성화되고, 분열하여 근아세포(myoblast)를 만들고, 이러한 근아세포가 분화하여 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)를 형성하고 손상된 근섬유나 다른 근육세포와 융합함으로써 이루어진다.

본 발명에서 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)는 말토스 결합 단백질과 섬유아세포 성장인자2(FGF2)가 융합된 것을 특징으로 한다.

상기 말토스 결합 단백질(MBP)은 소수성 세포 배양용 기질(substrate)에 부착된다.

본 발명에서 “섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2)”는 여러 섬유아세포 성장인자 중 하나이며, 아미노산 서열 및 핵산 서열이 공지되어 있다. 강력한 혈관신생작용 및 신경세포 보호 작용을 가지고 있다. 또한, 생체 내에서 손상이 일어날 경우 그 치유를 위해서는 반드시 필요한 물질로 화상, 욕창 및 피부 상처 등에 뛰어난 효과를 가진다.

본 발명의 실시예에서 MBP-FGF2 재조합 단백질은 인간 FGF2 165 cDNA가 삽입된 pMAL-FGF2 플라스미드를 이용하여 대장균(Escherichia coli K12 TB1)에서 발현 및 생산하였다. 상기 MBP-FGF2 재조합 단백질은 서열번호3의 아미노산 염기서열이며, 서열번호4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

따라서 상기 MBP-FGF2은 구체적으로 서열번호3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 서열번호4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 또한, 인간 FGF2 165 cDNA 유전자를 이용하여 대장균에서 생산된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 MBP-FGF2가 고정된 매트릭스에서 배양한 골격근 줄기세포(skeletal muscle stem cells)는 MYOD가 약 98%로 발현되어 휴지상태의 골격근 줄기세포가 활성화됨을 확인하였으며, MYOG의 발현이 약 2% 미만으로 나타나 in vitro 증식에서 근육세포로의 자발적 분화가 억제됨을 확인하였다.

따라서 본 발명의 MBP-FGF2는 골격근 줄기세포를 활성화시키고, in vitro에서 증식시 자발적 분화를 억제시키는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 MBP-FGF2 고정된 매트릭스에서 수용성 FGF2 존재 하에서 BSA와 비교하여 골격근 줄기세포의 초기 접착을 개선하고 증식을 촉진함을 확인하였다. 따라서 본 발명의 MBP-FGF2는 시험관에서(in vitro) 골격근 줄기세포의 초기 접착을 개선시키는 것일 수 있다.

또한, BSA 기질에서 배양한 세포와 비교하여 MBP-FGF2 고정된 매트릭스에서 배양한 세포가 증식이 촉진됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 발명의 MBP-FGF2는 골격근 줄기세포의 증식을 촉진시키는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양한 골격근 줄기세포가 매트리젤(Matrigel)에서 배양한 세포와 유사한 수준으로 분화능을 유지하는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 조성물은 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식능을 강화시키는 것을 특징으로 한다. 또한, 시험관을 포함한 체외에서 배양시 상기 골격근 줄기세포가 근육세포로 분화가 진행되지 않고, 근육세포로의 분화능을 유지시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 “분화”는 골격근 줄기세포가 근원성 분화를 통해 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube)를 형성하는 과정이다. 근육세포의 분화가 거의 끝나는 경우 MyHC의 발현이 증가한다.

본 발명의 조성물은 구성성분이 명확하며(chemically well-defined), 줄기세포의 초기 부착 및 증식을 유지 또는 강화하며, 분화능의 감소가 없어, 제노-프리(xeno-free)한 골격근 줄기세포의 체외 배양에 활용할 수 있다.

MBP-FGF2 기질에서 배양시 활성화된 골격근 줄기세포를 생체외에서 비용 효율성 높게 배양할 수 있어 생체외 골격근 줄기세포 배양용 플랫폼에 이용될 수 있다. 또한, MBP-FGF2에서 배양된 골격근 줄기세포는 분화능이 유지되고 제노 프리하여, 근육 재생을 위한 목적으로 생체이식용 또는 골격근 줄기세포 기반 약학 조성물에 활용할 수 있다.

상기의 과제를 해결하고자 본 발명은 다른 양태로 상기 조성물을 포함하는 세포 배양용 플레이트를 제공한다.

본 발명의 “세포 배양용 플레이트”는 체외에서 골격근 줄기세포를 배양하기 위한 장치 또는 용기이다. 상기 세포 배양용 플레이트는 세포를 배양되는 표면에 MBP-FGF2가 코팅된 것을 특징으로 한다. 구체적으로 MBP-FGF2가 소수성 배양용기의 표면에 MBP 단백질의 일부분과 부착되어 있는 것 일 수 있다.

상기 배양용 플레이트의 표면의 재질은 세포를 배양할 수 있는 종류라면 제한이 없다. 예를 들어 유리, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌 등을 이용할 수 있다. 본 발명의 실시예에서 폴리스티렌으로 이루어진 배양용기를 사용하였다. 따라서 바람직하게 상기 배양용기는 폴리스티렌으로 이루어진 것일 수 있다.

전술한 실시예에서 MBP-FGF2가 코팅된 기질에서 골격근 줄기세포가 BSA와 비교하여 초기 접착이 우수하고, 활성 및 증식이 강화됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 세포 배양용 플레이트를 이용하여 체외에서 골격근 줄기세포 배양시 골격근 줄기세포의 활성 및 증식 강화에 효과적이다.

본 발명의 일실시예에서 10, 25, 30 및 50 ㎍/㎖ 농도의 MBP-FGF2로 코팅한 기질에서 골격근 줄기세포 배양시 초기 접착, 증식능을 강화시키는데 충분하다는 것을 확인하였다. 따라서 본 발명의 세포 배양 플레이트는 1 내지 100㎍/㎖, 구체적으로 10 내지 50 ㎍/㎖ 농도의 MBP-FGF2 용액을 이용하여 코팅된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 “체외”는 몸 밖을 의미하며, 본 발명은 인체 또는 동물에서 채취 또는 분리한 세포를 체외에서 배양 또는 증식시키기 위해 인공적으로 형성된 장치 또는 시스템을 포함하며, 상기 세포 배양용 플레이트도 이에 해당한다.

상기 과제를 해결하고자 본 발명은 또 다른 양태로 체외에서 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 포함하는 배양용기에서 골격근 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는, 골격근 줄기세포의 근육세포로의 분화는 유도하지 않으면서, 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식능을 강화시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2), 골격근 줄기세포에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

상기 배양하는 단계는 인체 또는 동물에서 분리된 골격근 줄기세포를 성장배지를 이용하여 MBP-FGF2(배양기질)가 코팅된 배양용기에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 한다.

전술한 실시예에서 MBP-FGF2가 코팅된 매트릭스에서 배양한 골격근 줄기세포에서 근육세포로 분화가 유도되지 않으면서, 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식이 강화되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 방법은 골격근 줄기세포에서 근육세포로의 분화가 유도되지 않으면서, 골격근 줄기세포의 활성 또는 증식능을 강화시킬 수 있다.

본 발명의 실시예에서 MBP-FGF2 고정 매트릭스가 골격근 줄기세포의 증식에 효과적이며, 배지에 sFGF2을 추가하는 경우 골격근 줄기세포 증식의 시너즈 효과를 높임을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 활성 또는 증식능을 강화시키는 방법은 섬유아세포 성장인자 2(FGF2)를 별도로 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명은 또 다른 양태로 상기 방법에 의해 활성 또는 증식능이 강화된 골격근 줄기세포를 유효성분으로 포함하는, 근육소실로 인한 근육 재생용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에서 골격근 줄기세포에 대한 설명은 전술한 바와 같다.

본 발명에서 “근육 소실”은 노화, 외상 또는 질병에 의해 근육의 재생 또는 근육의 량이 감소하는 것을 의미한다.

상기 외상에 의한 근육 소실은 상처 또는 수술에 의해 소실되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 질병은 근감소증, 근위축증, 근육퇴행 위축 또는 심위축증일 수 이다.

본 발명에서 “근감소증”이란, 노화에 따른 점진적인 골격 근육량의 감소를 의미하는 것으로서, 직접적으로 근력의 저하를 유발하며 그 결과 각종 신체기능의 감소 및 장애를 일으킬 수 있는 상태를 의미한다.

본 발명에서 “근위축증”은 사지의 근육이 거의 좌우대칭적으로 점점 위축되어 가는 것으로서, 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성을 유발하여 근위축성 측삭경화증(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)과 척수성 진행성 근위축증(Spinal progressive muscular atrophy, SPMA)을 일으킬 수 있다.

본 발명에서 “근육 퇴행 위축(muscle dystrophy)”이란, 점진적인 근위축과 근쇠약이 나타나는 질환으로서, 병리학적으로 근육섬유의 괴사를 특징으로 하는 퇴행성 근육병증을 의미한다. 근세포막의 손상으로 근육섬유의 괴사와 퇴행과정을 거쳐 근력저하 및 위축이 발생하게 된다.

본 발명에서 “심위축증”은 심장이 외부적이거나 내부적인 요인에 의해서 위축되어 가는 것으로서, 기아, 소모성질환, 노쇠했을 때 심근섬유가 마르고 가늘어져 지방조직의 감소를 유발하는 심장의 갈색위축 증세를 일으킬 수 있다.

본 발명에서 “약학 조성물”은 활성 및 증식능이 강화된 골격근 줄기세포를 포함하여 소실된 골격근의 재생을 돕거나, 정상인이 노화과정에서 나타나는 근육 소실에서 근육의 양을 증진 또는 근육재생을 촉진시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 피부 도포 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명에서 “투여”는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명에서 “유효량”은 목적하는 치료되어야 할 특정 질환의 발병 또는 진행을 지연하거나 전적으로 중지시키는 데 필요한 양을 의미하며, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 골격근 줄기세포의 유효량은 근육 재생 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 상기 유효량은 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명에 있어서, 약학 조성물의 대상체는 근육소실로 인한 근육 재생이 필요한 인간 또는 동물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 근육 보강이 필요한 개체라면 대상체에 포함될 수 있다. 상기 대상체에는 환자 또는 정상인이 포함된다.

본 발명의 조성물은 체외에서 골격근 줄기세포 배양시 초기 세포 부착, 활성 및 증식을 도우며, 분화능을 감소시키지 않아, 체외에서 골격근 줄기세포를 배양하는 플랫폼에 유용하게 적용할 수 있다. 따라서 체외에서 골격근 줄기세포 증식(expansion)에 유용하다. 또한, 상기 조성물은 구성성분이 명확하고(chemically well-defined), 제노(xeno)-프리이며, 사용하기 쉽고, 비용 효율성이 높다.

도 1은 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 골격근 줄기세포(SkMSCs)의 활성화를 확인한 결과이다. 도 1a는 성장배지에서 48시간동안 Matrigel 또는 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양한 휴지상태 골격근 줄기세포(quiescent SkMSCs)를 myogenic 마커(MyoD) 및 myogenin(MYOG)로 면역 염색한 이미지이다. 세포핵은 DAPI로 대조 염색하였다(스케일바. 50㎛).
도 1b는 MyoD 및 MYOG 양성 세포의 수를 나타낸 것이다. 마커 양성세포는 총 세포 수에 대한 백분율로 나타내었다. NS는 통계적으로 유의 없음을 나타낸다.
도 2는 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 골격근 줄기세포의 증식을 확인한 결과이다. 도 2a는 4일간 MBP-FGF2 고정 매트릭스 또는 매트리젤(Matrigel)에서 성장배지로 배양한 세포의 위상차 현미경 이미지이다(스케일바, 50㎛).
도 2b 및 도 2c는 변형된 MTS 분석법으로 생존 골격근 줄기세포의 밀도를 측정한 결과이다. MTS 분석은 4일간 매일 수행되었다. 골격근 줄기세포는 BSA, MBP-FGF2 고정 매트릭스 또는 Matrigel이 코팅된 96-웰 플레이트에서 가용성 FGF2(sFGF2) 부존재(도 2b) 또는 존재(도 2c) 상태로 배양하였다. 생존세포 밀도는 450㎚ 파장에서 광학밀도(O.D.)으로 결정되었다.
도 3은 MBP-FGF2가 고정된 매트릭스에서 배양된 골격근 줄기세포의 근원성 분화 가능성을 확인한 결과이다. 도 3a는 MBP-FGF2(50㎍/㎖) 또는 Matrigel에서 배양한 골격근 줄기세포를 분화 3일차에 MyHC의 발현을 면역형광 염색한 이미지이다. 세포 핵은 DAPI로 대조염색 하였다(스케일바, 50㎛).
도 3b는 분화 3일차 세포에서 분화지수를 나타낸 것이다. 분화지수는 MyHC 양성 세포 핵 수를 전체세포 핵 수에 대해 백분율로 표시하였다.
도 3c는 융합지수를 나타낸 것이다. 융합지수는 세포핵 수에 따른 MyHC 양성 세포의 분포로 나타냈다. 세포핵 수는 1(mono), 2 내지 5 및 5개 이상의 핵으로 분류하였다. 실험은 3회 수행되었으며, 오차 막대는 SEM으로 나타냈고, NS는 통계적으로 유의성 없음을 나타낸다.
도 4는 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양된 세포의 Focal adhesion kinase의 발현을 확인한 결과이다. 빈쿨린(vinculin, 적색)과 F-액틴(F-actin, 녹색)의 면역형광염색의 공초점 현미경 이미지이다. 골격근 세포는 Matrigel 또는 MBP-FGF2 고정 매트릭스(50㎍/㎕)에서 성장배지로 48시간 동안 배양하였다. 흰색 화살표는 vinculin과 F-actin의 발현이 중첩된 세포질 영역을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

<실시예1> 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

<1-1> FGF2 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드의 제조

FGF2 유전자가 클로닝된 플라스미드를 제조하기 위해, 서열번호1의 염기서열을 갖는 bFGF 정방향 프라이머 및 서열번호2의 염기서열을 갖는 FGF2 역방향 프라이머를 합성하였다.

프라이머 명칭	염기서열
bFGF forward 서열번호1	ccgaattccc cgccttgccc gaggatggc
FGF2 reverse 서열번호2	caaagctttc agctcttagc agacattgga ag

표 1에서 forward는 정방향 프라이머, reverse는 역방향 프라이머이다.

상기 프라이머 쌍을 사용하여 인간 섬유아세포(human fibroblast)에서 추출한 전체 유전자를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factors, FGF2) 부분만을 증폭하였다.

pGEM-T 벡터 시스템 Ⅰ(Promega)에 포함되어 있는 2× 접합 완충용액(rapid ligation buffer) 5 ㎕에 상기에서 증폭된 FGF2 유전자 단편 4 ng, pGEM-T 벡터 50 ng 및 T4 DNA 라이게이즈(ligase) 1 ㎕를 첨가한 후 총 부피가 10 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치한 후 이어서 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 접합물을 대장균(E.coli K12 TB1)에 형질전환시키고 이로부터 목적하는 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드를 선별하여 pGEM-FGF2라 명명하였다.

<1-2> MBP-FGF2 재조합 유전자 단편이 클로닝된 재조합 발현벡터의 제조

링커로서 말토오스 결합 단백질(MBP)과 FGF2 유전자를 융합시키기 위해, 상기 실시예1-1에서 제조된 재조합 플라스미드 pGEM-FGF2에 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼 Ⅰ을 첨가하고 제한효소 EcoRⅠ을 처리한 후, 완충용액 Ez 버퍼 Ⅱ를 첨가하고 제한효소 HindⅢ를 처리한 다음, 아가로스 겔 상에서 FGF2 유전자 절편을 분리하였다.

이후의 접합반응을 용이하게 수행하기 위하여 분리된 FGF2 유전자를 BAP로 처리하였다. BAP 처리는 완충용액(1 M 트리스-HCl, pH 8.0, Bioneer) 7.5 ㎕ 및 BAP 용액(Fermentas) 1 ㎕를 넣은 후 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 FGF2 유전자를 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응물을 아가로스 겔에서 전기영동한 후 UV 투과조명기(Avegene)로 조사하여 원하는 부분을 절단한 후 겔 추출 키트(gel extraction kit, Qiagene)를 사용하여 FGF2 유전자 단편을 분리하였다.

한편, 접합반응에 사용될 MBP 유전자를 가지고 있는 벡터 pMAL-c2X(New England Biolabs)에 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼 Ⅰ을 첨가하고 제한효소 EcoRⅠ을 처리한 후, 완충용액 Ez 버퍼 Ⅱ를 첨가하고 제한효소 HindⅢ를 처리한 다음, 아가로즈 겔 상에서 MBP 유전자 함유 벡터 절편을 분리하였다.

상기에서 분리된 FGF2 유전자 9 ㎕, 절단된 벡터 절편 pMAL-c2X 3 ㎕ 및 DNA 접합 키트(DNA Ligation Kit Ver 2.1, Takara)에 포함된 효소 용액 Ⅰ(enzyme solution Ⅰ) 12 ㎕를 혼합하고 총 부피가 20 ㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 접합반응(ligation)을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 접합물을 대장균(E.coli K12 TB1)에 형질전환시키고, 이로부터 MBP와 FGF2의 융합 유전자가 클로닝된 재조합 발현벡터를 스크리닝하여 pMAL-c2X-FGF2라 명명하였다. 상기 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2로 대장균(E.coli K12 TB1)을 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균인 대장균 K12 TB1(pMAL-bFGF)를 2009년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11505BP로 기탁하였다.

염기서열 분석 결과, MBP의 카르복실 말단에 FGF의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질은 서열번호3의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호4의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

	MBP-FGF 재조합 단백질
아미노산 서열 (서열번호3) 543 a.a	Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser
유전자 염기서열 (서열번호4) 1654 b.p	atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccccgcct tgcccgagga tggcagccgg gagcatcacc acgctgcccg ccttgcccga ggatggcggc agcggcgctt cccgcccggc cacttcaagg accccaagcg gctgtactgc aaaaacgggg gcttcttctg cgcatccacc ccgacggccg agttgacggg gtccgggaga agagcgaccc tcacataagc tacaacttca agcagaagag agaggagttg tgtctatcaa aggagtgtgt gctaaccgtt acctggctat gaaggaagat ggaagattac tggcttctaa atgtgttacg gatgagtgtt tcttttttga acgattggaa tctaataact acaatactta ccggtcaagg aaatacacca gttggtatgt ggcactgaaa cgaactgggc agtataaact tggatccaaa acaggacctg ggcagaaagc tatacttttt cttccaatgt ctgctaagag ctga

<실시예2> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 및 정제

<2-1> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 유도

상기 실시예1-2에서 수득된 MBP-FGF2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2를 대장균(E.coli K12 TB)에 형질전환시키고 37℃의 LB(Luria-Bertani) 고체 배지에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 배지 위에 형성된 콜로니(colony)를 취하여 60 ㎍/㎖ 농도의 암피실린을 함유하는 3 ㎖의 RB(rich medium + glucose) 액체배지에 접종하고 37℃에서 약 2시간 동안 배양하였다. 여기에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 최종 농도 3 mM이 되도록 첨가하고 다시 37℃에서 2시간 동안 더 배양하였다. 배양이 끝난 후 1 ㎖의 배양액을 취하여 원심분리기를 통해 세포 침전물을 얻었다. 상기 세포 침전물에 20 ㎕의 1× 시료 로딩 완충용액(sample loading buffer)을 첨가하고 잘 혼합하였다. 이 혼합물을 95℃에서 5분간 끓였다가 상온으로 냉각시킨 후 15 ㎕를 취하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 종결된 후 폴리아크릴아마이드 겔을 쿠마시 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하고 항-MBP 및 항-FGF 항혈청(New England Biolabs)을 이용한 웨스턴 블롯팅을 통해 MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 여부를 관찰하였다.

<2-2> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 2-1에서 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2로 형질전환된 대장균 세포를 암피실린이 60 ㎍/㎖ 첨가된 RB 배지에 접종한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양액 10 ㎖을 1 ℓ의 RB 배지에 첨가하고 37℃에서 계속 진탕 배양하였고, 배양액의 흡광도가 650 ㎚의 파장에서 약 0.6 정도가 될 때 3 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하였다. IPTG를 첨가하고 약 2시간 후에 배양을 멈춘 후 배양액을 4000× g에서 20분간 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 세포 침전물을 수거하였다. 이 세포 침전물에 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖) 50 ㎖를 첨가하여 현탁시킨 후, 최종 농도가 1mM이 되도록 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 PMSF(phenylmethanesulphonyl fluoride)를 첨가하였다. 상기 세포 혼합물을 정제에 앞서 -20℃에서의 냉동 및 해동을 반복하여 세포 파쇄가 쉽게 일어나도록 하였다. 그 후 세포 혼합물을 얼음 중탕 SO에서 초음파 분쇄기(Fisher Scientific Model 500 Sonic Dismembrator)를 이용하여 10% 출력으로 약 10초간 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 후 30초간 얼음 중탕 안에서 방치하였다. 상기와 같은 과정을 2회 반복하여 세포를 완전히 파쇄하였다. 이렇게 얻은 세포 균질액을 9000× g에서 1시간 동안 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 가용성 단백질이 녹아있는 상층액을 얻은 후 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA, 2 ㎖)으로 5배 희석하였다.

한편, 대장균 형질전환체로부터 발현된 MBP-FGF2 재조합 단백질을 분리하기 위하여, 아밀로오스 수지(amylose resin, New England Biolabs)를 이용한 친화성 칼럼 크로마토그래피를 준비하였다. 상기 칼럼을 미리 약 8× 베드 볼륨의 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖)으로 세척하여 평형화시켰다. 평형화된 아밀로오스 수지 친화성 칼럼 크로마토그래피에 상기에서 얻은 가용성 단백질이 녹아있는 상층액을 분당 1 ㎖의 속도로 로우딩하였다. 이어서 12× 베드 볼륨 이상의 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7g, 0.5 M EDTA 2 ㎖)을 상기 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 그 다음 10 mM 말토오스 용출 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖, 10mM 말토오스)을 첨가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질을 분당 1 ㎖의 속도로 용출시켜 회수하였다. 이로부터 회수된 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동(Bio-rad)하여 정제된 단백질의 대략적인 분자량과 순도를 확인하였다. 그 결과 정제된 단백질의 순도는 95% 이상이었으며 대략적인 분자량은 60,000 Da 정도로 나타났다.

상기 단백질 시료를 투석막(dialysis membrane, MWCO12-14,000, Spectrum laboratories, Inc.)에 담아 PBS로 3일간 투석하여 말토오스가 제거된 단백질만을 수득하였다. 그 뒤 원심분리 여과기(Centrifugal Filter, Amicon Ultra-15 MWCO 5,000, Millipore)를 이용하여 4000× g에서 45분간 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 단백질을 농축하였다. 상기 과정에 따라 최종적으로 농축된 단백질을 MBP-FGF2라 명명하였다.

<실시예3> 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)가 고정된 세포 배양용 기질의 준비

세포배양용 폴리스티렌의 소수성 표면에 섬유아세포 성장인자2(fibroblast growth factor 2, FGF2)를 고정시키기 위해 말토스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP)을 도입하였다. MBP-FGF2 융합 단백질은 인간 FGF2 165 cDNA가 삽입된 pMAL-FGF2 플라스미드를 이용하여 대장균(Escherichia coli K12 TB1)에서 발현 및 생산하였다. 실시예 2-2의 재조합 MBP-FGF2를 다양한 농도(10, 25, 30 및 50 ㎍/㎖)로 인산염 완충 생리식염수에 첨가하고 혼합한 후, 실온(24℃)에서 1시간동안 반응시킨 후, 4℃에서 밤새 인큐베이션하여 배양용기 표면에 부착하였다.

비특이적 세포의 부착을 최소화시키기 위해 세포 접종(Seeding) 전에 실온에서 1시간동안 1% 소혈청 알부민을 이용하여 블락킹(blocking) 하였다.

<실시예4> 골격근 줄기세포(skeletal muscle stem cells, SkMSCs)의 분리 및 배양

모든 동물실험은 순천향대학교 동물실험 윤리위원회(Soonchunhyang University Animal Care and Use Committee)의 지침(SCH16-0029)에 따라 수행되었다.

6주에서 8주된 ICR 쥐(mice)의 뒷다리 근육에서 자기 활성화 세포 분류(magnetic-activated cell sorting)를 이용하여 CD31, CD45, 및 Sca-1 음성 및 인터그린(integrin) α7 양성인 휴지상태의 골격근 줄기세포(Quiescent SkMSCs)를 분리하였다. 상기에서 분리한 휴지상태의 골격근 줄기세포는 즉시 성장배지를 이용하여 5% CO₂ 인큐베이터에서 37℃로 배양하였다. 상기 성장배지는 Ham-F10에 20% 말 혈청(horse serum), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin) 및 5 ng/㎖의 인간 FGF2(PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)를 첨가하였다.

대수증식기(exponential growth phase)의 골격근 줄기세포를 마트리겔(Matrigel) 코팅된 배양용 접시에 도말하고 AmnioMAX-II 완전 배지 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)를 이용하여 70 내지 80%의 밀집도(confluence)까지 배양하였다.

0.05% 트립신으로 세포를 배양접시에 분리하고, 실험을 위해 세포 접종(seeding) 전 10분간 코팅되지 않은 배양접시에 10분간 플레이팅하여 섬유아세포(fibroblasts)를 제거하였다. 근원성(Myogenic) 분화는 열처리하여 불활성화된 말 혈청(heat-inactivated horse serum)이 2% 첨가된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)를 사용하여 유도하였다.

<실시예5> 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)

골격근 줄기세포를 매트리젤(Matrigel) 또는 MBP-FGF2가 코팅된 96 웰 플레이트에 2×10³ 세포/웰의 밀도로 접종하고, 5 ng/㎖의 인간 FGF2를 첨가한 성장배지 또는 첨가하지 않은 성장 배지에서 배양하였다.

CellVia enhanced cell viability 분석 키트(Ab Frontier, 서울, 대한민국)를 이용하여 세포 증식률을 측정하였다. 간단히 CellVia 시약 10 ㎕를 각 웰에 첨가하고 5% CO₂, 37℃로 1 시간 동안 배양한 다음 멀티 스캔 GO 분광 광도계 (Thermo Fisher Scientific, 핀란드)를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.

<실시예6> 면역형광염색 및 현미경 분석(Immunofluorescence staining and microscopy)

골격근 줄기세포를 확인하기 위해 단백질 특이적 항체를 이용하여 면역형광 염색을 수행하였다. 1차 항체(Primary antibody)로 미오게닌(myogenin, 1:100), MYOD(1:250), 미오신 H 사슬(myosin heavy chain, MyHC, MF20, 0.3 ㎍/㎖) 및 빈쿨린(vinculin, 1:100)을 이용하였다. F-액틴은 팔로이딘-플루오레세인이소티오시안산염(Phalloidin-fluorescein isothiocyanate) 5 ㎍/㎖을 사용하여 검출하였다. 2차 항체는 Cy3 또는 Alexa Fluor 488가 결합된 항체를 사용하였고, 세포핵은 4’, 6- diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 염색하였다. 세포 이미지는 Nikon eclipse Ti-U inverted microscope과 연결된 니콘 디지털 SLR 카메라(DS-i2)로 촬영하였다.

공초점 현미경 분석을 위해 Matrigel 또는 MBP-FGF2로 코팅된 Lab-Tek II eight-웰 챔버 슬라이드에서 세포를 성장시켰다. 빈쿨린과 F-액틴의 세포내 위치는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용하여 촬영하였다.

<실시예7> 통계적 분석 (Statistical analysis)

모든 결과는 평균(mean) ± 표준오차(SEM)로 나타내며 양방적 스튜던트 티이검정(two-tailed Student’s t-test)을 사용하여 두 실험군을 비교하였다. 그래프 및 막대 다이어그램은 GraphPad Prism 소프트웨어를 이용하였다. P 값은 * P ≤ 0.05, ** P ≤ 0.01, *** P ≤ 0.001, P 값 ≤ 0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

<실험결과>

<실험예1> 골격근 줄기세포의 활성화 및 증식

휴지상태의 골격근 줄기세포의 근원적 분화(myogenic differentiation)의 첫단계는 근원성 마커(myogenic markers)의 활성화이다. 활성화된 골격근 줄기세포는 근원성 분화 프로그램(myogenic differentiation program)에 들어갈 때까지 빠르게 증식한다.

MBP-FGF2가 고정된 매트릭스가 시험관(in-vitro)에서 휴지상태의 골격근 줄기세포의 자발적인 분화를 억제하고, 농도 의존적으로 초기 부착 및 활성화를 돕는지 확인하고자, 활성화 골격근 줄기세포 지표인 MyoD와 근원성 분화 표지인 미오게닌(Myogenin, MYOG)의 발현을 분석하였다.

새로 분리한 골격근 줄기세포를 MBP-FGF2 또는 매트리젤(Matrigel)에서 48시간 동안 배양하고 관찰한 결과 MBP-FGF2 고정된 매트릭스 상에서 매트리젤(Matrigel)과 비교하여 부착된 골격근 줄기세포의 수가 약간 감소되는 것을 확인하였다(데이터는 표시하지 않음).

도 1에서는 MBP-FGF2 고정된 매트릭스에 접착되어 배양된 골격근 줄기세포 대다수(약 98%)에서 MyoD가 강력하게 발현됨을 확인하였다. 이는 매트리젤(Matrigel)에서 배양된 세포에서도 동일한 결과를 나타냈다.

이와 대조적으로, 미오게닌(myogenin)는 매트리젤(Matrigel)과 MBP-FGF2에서 배양된 세포 모두 2%의 미만의 발현을 나타냈다.

이러한 결과는 MBP-FGF2 고정화된 매트릭스에서 성장한 골격근 줄기세포가 효율적으로 활성화되며, 대부분 미분화 상태로 남아있음을 보여준다.

다음으로 MBP-FGF2 고정 매트릭스가 골격근 줄기세포의 증식에 미치는 영향을 분석하였다.

MBP-FGF2 고정 매트리스가 단독으로 골격근 줄기세포의 증식(expansion)을 돕는지 확인하고자, 골격근 줄기세포를 상이한 농도의 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 가용성 FGF2(soluble FGF2, sFGF2)를 첨가 또는 비첨가하고 4일간 배양하였다.

도 2A 및 도 2B에서 골격근 줄기세포는 MBP-FGF2 고정 매트릭스상에서 sFGF2 부재하에서 MBP-FGF2 의 농도와 상관없이 안정적인 성장패턴을 보였다. 이들의 세포증식 속도는 sFGF2의 존재하에 배양된 골격근 줄기세포에 대해 약 40 내지 50%로 나타났다.

반면, BSA 기질에서 배양한 세포는 sFGF2의 존재 하에서도 완전히 접착 및 증식을 하지 못하였다. 따라서 MBP-FGF2 고정 매트릭스는 적절한 분열 촉진 활성(mitogenic activity)을 가짐을 확인하였다.

다양한 농도의 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 sFSF2의 존재 하에 골격근 줄기세포의 증식능(proliferative capacity)을 평가하였다(도 2c).

sFGF2의 존재 하에서 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 기질에서 배양한 골격근 줄기세포는 배양 4일 동안 강력하게 증식하였다. MBP-FGF2 고정 매트리스에서 배양된 골격근 줄기세포는 MBP-FGF2의 농도 의존적으로 강한 증식 능력을 보였으나, 이들의 증식은 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 기질에서 배양된 세포보다 약간 느렸다. 배양 초기에 더 적은 수의 골격근 세포가 MBP-FGF2 고정 매트릭스에 부착되었다는 것을 고려하면, 본 결과는 매트릭스에 부착된 골격근 줄기세포가 역동적으로 증식함을 보여준다.

이들 결과를 통해 MBP-FGF2 고정 매트릭스가 골격근 줄기세포의 증식에 효과적이며, 배지에 sFGF2을 추가하는 경우 골격근 줄기세포 증식의 시너즈 효과를 높임을 확인하였다.

<실험예2> 골격근 줄기세포의 분화 가능성의 유지

MBP-FGF2 고정화 매트릭스에서 배양된 골격근 줄기세포가 근원 분화능을 유지하는지 확인하고자, MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 증식(expanded)된 골격근 줄기세포에서 근원성 분화(myogenic differentiation) 및 세포융합(cell fusion) 지수를 측정하였다.

새로 분리한 골격근 줄기세포를 매트리젤(Matrigel) 또는 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 증식시켰다. 그 후 세포를 매트리젤(Matrigel)이 코팅된 세포배양 용기(vessels)에 재접종하고 분화배지로 근원성 분화(myogenic differentiation) 수행하였다. 분화 3일 후, 면역염색을 이용하여 근절성(sarcomeric) MyHC 발현을 확인하였다.

도 3A에서 MBP-FGF2 고정된 매트릭스에서 배양된 골격근 줄기세포가 매트리젤(Matrigel)에서 전배양된 세포와 유사한 비율로 근관세포(myotubes)로 분화하였다. 또한 도 3B에서 매트리젤(Matrigel)과 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양된 세포 모두 유사한 분화지수가 관찰되었다. 또한 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 전 배양된 세포에서 분화지수가 농도 의존적으로 증가하였다.

도 3C에서 매트리젤(Matrigel)과 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양된 세포에서 세포융합지수의 유의한 차이가 나타나지 않았다. 또한, 분화지수와 유사하게 고농도의 MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양한 세포에서 융합된 근관세포(myotubes)가 약간 증가하는 것이 관찰되었다.

즉, MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 증식된 골격근 줄기세포(SkMSCs)가 매트리젤(Matrigel)에서 배양된 세포와 동등하게 근원성 분화 포텐셜(myogenic potential)을 유지함을 확인하였다.

<실험예3> focal adhesion kinase(FAK)의 발현 비교

세포외기질(Extracellular matrix)은 세포 형태, 이동 및 부착을 조절하는 focal adhesion(FA)라고 불리는 거대 인터그린 기반 다중 단백질 복합체를 통해 세포내의 세포 골격(cytoskeleton)과 연결된다.

빈쿨린(Vinculin)은 탈린-인터그린(talin-integrin) 복합체와 결합하여 F-액틴을 세포막에 고정시켜 인터그린의 클러스터링을 유도한다.

MBP-FGF2 고정 매트릭스에 부착된 골격근 줄기세포에서 FA의 분포를 확인하고자, 빈쿨린 및 F-액틴의 발현은 면역형광염색 및 공초점 현미경을 이용하여 분석하였다. 도 4를 보면, MBP-FGF2 고정 매트릭스에서 배양된 세포는 빈쿨린이 세포의 핵 주위에 고르게 분포되어 있었다. 이러한 결과는 매트리젤(Matrigel)에서 배양된 세포에서 빈쿨린 발현 패턴과 유의한 차이가 없었다. 두 경우 모두 빈쿨린 발현과 액틴 세포 골격이 대부분 같은 위치에 분포하였다.

요약하면, 본 발명을 MBP-FGF2 고정 매트릭스가 골격근 줄기세포의 배양 기질로 이용할 수 있음을 증명하였다. 구체적으로, 골격근 줄기세포의 접착, 활성화 및 증식을 도우며, in vitro에서 기존의 매트리젤(Matrigel)에서 관찰된 것과 동등한 근원성 분화(myogenic differentiation) 수준을 유지한다.

본 발명에서는 10 내지 50 ㎍/㎖의 농도 범위에서 MBP-FGF2의 농도 의존적 차이는 관찰되지 않았다. 즉, 10 ㎍/㎖의 농도로 고정화된 MBP-FGF2가 골격근 줄기세포의 행동(behavior)을 지원하는데 충분하였다.

즉, MBP-FG2-고정 매트릭스를 이용하여 골격근 줄기세포의 초기 세포 부착 및 증식을 개선하고, 골격근 줄기세포 증식(expansion)을 위한 구성성분이 명확하고(chemically well-defined), 제노-프리이며, 사용하기 쉽고, 비용 효율성이 높은 플랫폼을 제공할 수 있다.

<110> Soonchunhyang University Industry Academy Cooperation Foundation KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> Composition for activation or proliferation of skeletal muscle stem cells comprising MBP-FGF2 <130> DP20190020 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF forward primer <400> 1 ccgaattccc cgccttgccc gaggatggc 29 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2 reverse primer <400> 2 caaagctttc agctcttagc agacattgga ag 32 <210> 3 <211> 543 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-FGF recombinant protein <400> 3 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 370 375 380 Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu 385 390 395 400 Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp 405 410 415 Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His 420 425 430 Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile 435 440 445 Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly 450 455 460 Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu 465 470 475 480 Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu 485 490 495 Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr 500 505 510 Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly 515 520 525 Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 530 535 540 <210> 4 <211> 1654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-FGF recombinant protein <400> 4 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt 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1440 gaaggaagat ggaagattac tggcttctaa atgtgttacg gatgagtgtt tcttttttga 1500 acgattggaa tctaataact acaatactta ccggtcaagg aaatacacca gttggtatgt 1560 ggcactgaaa cgaactgggc agtataaact tggatccaaa acaggacctg ggcagaaagc 1620 tatacttttt cttccaatgt ctgctaagag ctga 1654

Claims (8)

1. 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 유효성분으로 포함하는 근육 재생용 약학 조성물로서,
   상기 MBP-FGF2는 위성세포(satellite cells)의 활성 또는 증식을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 위성세포를 체외에서 배양시 근육세포로 분화가 되지 않으면서, 근육세포로의 분화능을 유지하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 근육 재생은 노화, 질병 또는 외상에 의한 근육 소실을 재생하는 것인, 약학 조성물.
4. 체외에서 말토스 결합 단백질-섬유아세포 성장인자2(maltose-binding protein-fibroblast growth factor 2, MBP-FGF2)를 포함하는 배양용기에서 위성세포를 배양하는 단계를 포함하는 위성세포의 활성 또는 증식능을 강화시키는 방법으로,
   상기 위성세포는 근육세포로의 분화는 유도하지 않으면서, 위성세포의 활성 또는 증식능을 강화시키는 것을 특징으로 하는, 방법.
5. 제 4항에 있어서,
   섬유아세포 성장인자 2(fibroblast growth factor 2, FGF2)를 별도로 추가하는 단계를 더 포함하는, 방법.
6. 제1항의 조성물을 포함하는 위성세포 배양용 플레이트.
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