KR101094445B1 - 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 섬유아세포 성장인자의 재조합 단백질 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)의 재조합 단백질 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법에 관한 것으로서, 구체적으로 섬유아세포 성장인자의 아미노 말단에 폴리펩티드 링커가 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 재조합 단백질, 및 상기 재조합 단백질을 폴리펩티드 링커의 아미노 말단을 이용하여 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시킨 후, 상기 재조합 단백질이 고정된 배양용기에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 것을 포함하는, 고정된 섬유아세포 성장인자(immobilized FGF)를 이용한 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, FGF의 아미노 말단을 폴리펩티드 링커에 결합시키고 상기 폴리펩티드 링커의 아미노 말단을 자발적인 물리적 흡착에 의해 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시킴으로써, FGF-폴리펩티드 링커의 재조합 단백질이 고정된 표면은 FGF의 생물학적 활성은 그대로 유지하면서, 외부로 노출된 FGF가 줄기세포와의 상호작용에 의한 세포접착을 유도하여 줄기세포를 효과적으로 배양할 수 있다. 따라서 본 발명은 줄기세포의 분화 및 증식 연구와, 조직공학 및 세포치료와 같은 재생의료 분야에 매우 유용하게 적용될 수 있다.

말토오스 결합 단백질(MBP), 섬유아세포 성장인자(FGF), 생물활성 표면, 세포접착, 줄기세포

Description

줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 섬유아세포 성장인자의 재조합 단백질 및 이를 이용한 줄기세포의 배양방법{FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECOMBINANT PROTEIN WITH ADHESIVE ACTIVITY TO STEM CELLS AND METHOD OF CULTURING STEM CELLS USING THE SAME}

본 발명은 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)의 아미노 말단에 폴리펩티드 링커가 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 재조합 단백질, 및 상기 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시킨 후, 표면에 고정된 섬유아세포 성장인자에 줄기세포를 접착시켜 배양하는, 고정된 섬유아세포 성장인자를 이용한 줄기세포의 배양방법에 관한 것이다.

생체재료의 표면에서 일어나는 세포의 접착은 다양한 기작(mechanism)에 의해 이루어지는데, 이는 크게 생물학적 인식을 매개로 하는 특이적 세포접착과, 정전기적 혹은 표면에너지에 의해 좌우되는 비특이적 세포접착으로 구분될 수 있다. 특이적 세포접착은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 단백질인 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등에 존재하는 특정의 펩티드 리간드(예컨대, 아르기닌-글리신-아스파르트산, Arg-Gly-Asp, RGD)가 세포막에 존재하는 접착 수용체인 인테그 린(integrin)과 결합하여 일어나는 현상이다. 반면, 비특이적 세포접착은 인지질을 주요 구성성분으로 하는 세포막이 전기적으로 음성을 띠게 되므로 접착시키고자 하는 표면을 전기적으로 양성을 띠게 하여 세포의 접착을 유도하는 방법이다. 현재 사용되는 대부분의 조직세포 배양용 배양용기의 표면은 이러한 비특이적 세포접착 원리를 이용하여 플라즈마 처리에 의해 전기적 양성을 띠게 만든 제품이다. 그 외에도, 세포막의 표면에너지에 상응하게 접착시키고자 하는 표면에 적당한 표면에너지를 부여하면 세포접착을 유도할 수 있다. 세포마다 약간의 차이는 있지만, 대개 물의 접촉각인 60° 부근에서 세포접착이 잘 일어나는 것으로 알려져 있다.

기존에 줄기세포를 포함한 대부분의 세포들은 전술한 바와 같이 ECM이 코팅되어 있거나 표면이 전기적으로 양성을 띠는 배양용기를 이용하여 배양되었다. 최근에는 세포표면에 존재하는 다양한 수용체를 표적으로 하는 수용체 리간드를 유전공학적으로 설계한 인공 세포접착 매트릭스가 개발되었다. 예를 들어, 표피성장인자(epidermal growth factor, EGF)-Fc 혹은 캐드헤린(cadherin)-Fc를 폴리스티렌 배양용기에 고정화하여 용액성 EGF 혹은 젤라틴이 흡착된 표면에서 상피종양세포 또는 배아줄기세포를 배양하면, 이들 세포가 생화학적 및 세포생물학적으로 다른 거동을 나타낸다는 것이 보고되었다(Ogiwara K. 등, Biotech. Letters 27: 1633-1637, 2005; Nagaoka M. 등, PLoS ONE 1: e15, 2006).

그러나 이처럼 Fc를 이용하는 경우, Fc의 카르복실 말단은 소수성 표면과의 물리적 흡착에 요구되고 그의 아미노 말단이 표적하는 생리활성 폴리펩티드와의 결합에 요구되기 때문에, 생리활성 폴리펩티드의 카르복실 말단이 활성에 필수적인 경우에는 사용이 제한된다. 즉, 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)와 같이 카르복실 말단이 활성을 유지하는 데 중요한 역할을 하는 생리활성 폴리펩티드에는 상기와 같이 Fc를 이용한 고정화가 불가능하다.

FGF는 생체조직의 복원이나 상처에 대한 반응 등 생체 내에서 항상성 유지에 필수적인 인자로, 배아단계에서 세포의 증식, 이동, 분화 및 생존을 조절하는 것으로 알려져 있다. 또한 FGF는 지방줄기세포, 간엽줄기세포, 배아줄기세포 등의 배양에 있어서 분화나 증식의 유도에 매우 중요한데, 세포막 표면의 FGF 수용체(FGFR) 및 헤파린- 또는 헤파란-황산 프로테오글리칸(heparin- or heparan-sulfate proteoglycan, HSPG)과 결합하여 생물학적 기능을 발휘한다. 이러한 FGF를 누에고치 유래 단백질에 결합시킨 재조합 단백질을 고정한 표면에서 HUVEC(human umbilical vein endothelial cell) 세포를 배양한 연구가 보고되었다(Hino R 등, Biomaterials 27: 5715-5724, 2006). 그러나 상기 연구에서 세포의 접착에 대해서는 언급된 바 없으며, 누에고치 유래 단백질의 획득이 용이하지 않아 특정 세포를 대량으로 배양하는데 사용하기 어렵다는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 FGF를 이용하여 줄기세포의 효율적인 배양방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 재조합 단백질로서의 발현 및 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 이용하여 상기 링커의 카르복실 말단과 FGF의 아미노 말단을 결합시킨 재조합 단백질을 제조하고, 이 재조합 단백질을 폴리펩티드 링커의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양용기 표면에 단순한 물리적 흡착에 의해 고정시킨 후, 고정된 재조합 단백질의 FGF 부분이 여전히 생물 학적 활성을 유지하여 줄기세포와의 접착을 통해 줄기세포를 효율적으로 배양할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포의 효율적인 배양을 위하여 폴리펩티드 링커와 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정된 섬유아세포 성장인자를 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

아울러 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터 및 이 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 세균을 배양하는 것을 포함하는 상기 재조합 단백질의 제조방법을 제공한다.

마지막으로 본 발명은

1) 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단에 폴리펩티드 링커가 융합된 재조합 단백질을 폴리펩티드 링커의 아미노 말단을 이용하여 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시키는 단계; 및

2) 상기 재조합 단백질이 고정된 배양용기에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 단계를 포함하는, 고정된 섬유아세포 성장인자(immobilized FGF)를 이용한 줄기세포의 배양방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 줄기세포의 세포막에서 발현되는 FGF 수용체 및 HSPG에 결합하는 FGF를 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 이용하여 FGF의 생리활성은 그대로 유지하면서 간단한 물리적 흡착에 의해 소수성 표면에 고정시킬 수 있고, 이렇게 FGF가 고정된 표면은 FGF와 줄기세포의 상호작용에 의해 상기 표면에 줄기세포의 접착을 유도하고, 특히 인테그린-비의존성(integrin-independent) 세포접착을 통해 접착된 줄기세포의 형태 제어가 가능하며, 이러한 줄기세포의 형태 제어를 통해 줄기세포의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으므로, 본 발명은 다양한 줄기세포의 분화 및 증식에 관련된 배양기술에 적용될 수 있다.

본 발명은 줄기세포의 효율적인 배양을 위하여 배양용기 표면에 고정된 섬유아세포 성장인자를 이용하는 방법을 제공한다.

이를 위해 먼저, 본 발명은 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여, 상기 폴리펩티드의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단이 융합된 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 특징은 줄기세포의 분화 및 증식에 필수적인 FGF를 폴리펩티드 링 커를 이용하여 FGF 본래의 생물학적 활성을 유지하면서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정시킨 후 고정된 FGF의 줄기세포에 대한 접착활성을 이용하여 상기 표면에 줄기세포를 접착시킴으로써 줄기세포의 효율적인 배양을 도모하는 것이다.

FGF는 줄기세포의 세포막에 존재하는 FGF 수용체 또는 HSPG와 결합하여 지방줄기세포, 간엽줄기세포, 배아줄기세포 등의 배양 시 이들의 분화나 증식에 중요한 생물학적 기능을 발휘하는 성장인자로서, 서열번호: 1로 기재되는 염기서열 및 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

본 발명에서 링커로서 사용되는 폴리펩티드는 그의 카르복실 말단을 통해 FGF의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양용기에 흡착하는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 줄기세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것이면 어느 것이든 사용할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 링커로는 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin), 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시태양에서는, 이러한 폴리펩티드 링커의 일례로서 말토오스 결합 단백질(MBP)을 사용한다. MBP는 대장균(Escherichia coli)의 세포막을 가로질러 원형질막공간에 위치하며 세포 내로 말토오스나 말토덱스트린(maltodextrin)과 같은 당류의 이동에 관여하는 막 주변(periplasm) 단백질로서, 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열 및 서열번호: 4로 기재되는 아미노산 서열을 갖는다.

MBP는 유용한 외래 단백질을 재조합 단백질 형태로 생산하기 위해 주로 이용되는데, 세포 내의 유전자 malE로부터 해독되어 만들어지고, 클로닝된 malE 유전자의 하부 (downstream)에 외래 단백질의 유전자를 삽입하여 세포 내에서 발현시키면 2개의 단백질이 결합한 재조합 단백질을 손쉽게 대량으로 생산할 수 있다. 특히, 발현시키고자 하는 단백질의 크기가 작거나 다른 숙주세포 내에서는 그 안정성이 떨어지는 외래 단백질인 경우, 이와 같이 MBP를 이용하여 재조합 단백질 형태로 세포 내에서 발현시키는 것이 유리하다. 이처럼 malE 유전자가 결합된 유전자로부터 발현되는 외래 단백질은 MBP가 말토오스에 결합 친화력을 갖는다는 특성을 이용하여 분리할 수 있다. 예를 들어, 말토오스가 다중화된 형태인 아밀로스(amylose)가 코팅된 수지와 세포 파쇄액을 반응시키고, 반응시킨 수지를 수차례 세척하여 오염된 다른 단백질을 제거한 후, 고농도의 말토오스를 첨가하여 경쟁시킴으로써 원하는 단백질만을 간단하게 용출시킬 수 있다. 이와 같이 MBP를 이용하면 원하는 단백질을 세포 내에서 대량 발현시킨 후 매우 용이하게 분리하고 정제할 수 있으므로, MBP와 결합한 재조합 단백질을 발현시키는 시스템은 전 세계적으로 목적하는 외래 단백질을 생산하는데 많이 이용되고 있다.

본 발명의 일 실시태양으로서, 대장균에서 발현되는 단백질로서 말토오스와의 우수한 결합능력으로 발현 및 정제가 용이하다는 장점을 갖는 말토오스 결합 단백질(MBP)을 이용하여 말토오스의 카르복실 말단과 FGF의 아미노 말단을 결합시킨 재조합 단백질을 제조하고 이 재조합 단백질을 MBP의 소수성 도메인을 링커로 이용하여 소수성을 띠는 배양용기 표면에 단순한 물리적 흡착에 의해 고정시킨 후, 고 정된 재조합 단백질의 FGF 부분이 여전히 생물학적 활성을 유지하여 줄기세포와의 접착을 통해 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다. 상기 실시태양에 따르면, MBP의 카르복실 말단은 재조합 단백질의 제조를 위해 FGF와의 결합에 이용되는 반면, 소수성 도메인을 포함하는 아미노 말단은 이후의 단계에서 소수성 표면에의 물리적 흡착에 이용된다.

염기서열 분석 결과, 상기와 같이 제공되는 말토오스 결합 단백질(MBP)의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

또한, 본 발명은 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환 세균을 제공한다.

본 발명에서 "재조합 발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 구조물(construct)을 말한다. 본 발명에서 용어, "작동가능하게 연결된(operably linked)"이란 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에 사용가능한 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코스미드(cosmid) 벡터, 박테리오파아지 벡터, 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터(promoter), 오퍼레이터(operator), 개시코돈(initiation codon), 종결코돈(termination codon), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 인핸서(enhancer)와 같은 발현 조절서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열(signal sequence) 또는 리더서열(leader sequence)을 포함하여 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적(constitutive) 또는 유도성(inducible)일 수 있으며, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주세포를 선택하기 위한 선택마커를 포함하고, 복제가 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서는, FGF를 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭한 후 증폭된 FGF 유전자를 MBP 유전자를 가지고 있는 벡터에 클로닝하여 MBP의 카르복실 말단에 FGF 유전자가 연결된 재조합 유전자 단편을 포함하는 발현벡터를 제조한다. 이와 같이 제조된 본 발명의 재조합 발현벡터는, 예를 들면 pMAL-c2X-FGF2일 수 있다. 상기 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2는 pMAL-c2X 벡터(New England Biolabs) 내 MBP 유전자의 카르복실 말단의 전사해독틀(open reading frame, ORF) 부위에 PCR로 증폭된 FGF 유전자가 삽입된 벡터를 의미한다.

이와 같이 제조된 재조합 발현벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 형질전환 세 균을 수득한다. 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 숙주세포로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.) 등과 같은 원핵세포를 예로 들 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예컨대, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.) 등), 효모(예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등)의 효모와 같은 하등 진핵세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균일 수 있으며, 대장균을 본 발명의 재조합 발현벡터로 형질전환시킨 후, 형질전환 대장균으로부터 대량의 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질을 발현시킬 수 있다. 형질전환은 핵산을 숙주세포에 도입하는 어떠한 방법도 포함되며, 당업자에게 공지된 형질전환 기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 전기충격 유전자 전달법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method) 등이 포함되나, 이로 제한되지 않는다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서는, MBP의 카르복실 말단에 FGF가 융합된 재조합 유전자 단편을 포함하는 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2를 대장균(E. coli) K12 TB1에 형질전환시켜 MBP-FGF 재조합 단백질을 발현하는 형질전환 세균을 제조하고, 이를 2009년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11505BP로 기탁하였다.

본 발명은 또한, 상기 형질전환 세균을 적절한 조건 하에서 배양한 후, 배양액으로부터 재조합 단백질을 회수하는 것을 포함하는, 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질의 생산방법을 제공한다.

상기 생산방법은 본 발명의 형질전환 세균에 도입된 재조합 발현벡터에서 본 발명의 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 형질전환 세균을 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것에 의해 수행된다. 상기 형질전환 세균을 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 형질전환 세균이 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 후, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건, 예컨대 유전자 발현 유도제인 아이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG)의 존재 하에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 세포의 성장과 생존에 필수적인 모든 영양소를 함유해야 한다. 상기 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 배양이 완료되면, 상기 배양물로부터 실질적으로 순수한 재조합 단백질을 회수할 수 있다. 본 발명에서 용어 "실질적으로 순수한"은 본 발명의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 숙주세포로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

상기 형질전환 세균에서 발현된 재조합 단백질의 회수는 당해 기술 분야에 공지된 다양한 분리 및 정제방법을 통해 수행할 수 있으며, 통상적으로 세포 조각(cell debris), 배양 불순물 등을 제거하기 위하여 세포 용해물을 원심분리한 후, 침전, 예를 들어, 염석(황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전) 등을 수행할 수 있고, 투석, 전기영동 및 각종 칼럼 크로마토그래피 등을 수행할 수 있다. 상기 크로마토그래피로는 이온교환 크로마토그래피, 겔-침투 크로마토그래피, HPLC, 역상-HPLC, 친화성 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 병용하여 이용할 수 있다(Maniatis 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA, 1990).

본 발명의 바람직한 일 실시태양에서는, MBP-FGF 재조합 단백질에서 MBP의 특성을 이용하여 말토오스와 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예컨대 아밀로스 수지를 이용한 친화 칼럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)를 이용하여 상기 재조합 단백질을 분리하고 정제한다. 상기 과정에 의해 MBP와의 재조합 단백질 형태로 발현된 FGF는 MBP와의 결합에는 아미노 말단이 참여하고 FGF의 활성 을 유지하는데 중요한 역할을 하는 카르복실 말단은 외부로 노출되어 있기 때문에 본래의 생물학적 활성을 그대로 유지할 수 있다.

본 발명에서 "생물학적 활성을 유지한다"는 것은 폴리펩티드 링커에 융합된 FGF가 융합된 후에도 본래의 생물학적 활성 또는 기능을 50% 이상, 바람직하게는 60% 이상, 더욱 바람직하게는 70% 이상 유지하는 것을 의미한다. 더욱 더 바람직하게는 융합된 FGF는 본래의 생물학적 활성 또는 기능의 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상을 유지한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시태양에서는, 폴리펩티드 링커와의 재조합 단백질 형태로 발현, 정제된 FGF가 본래의 생물학적 활성 또는 기능을 99% 이상 유지한다.

따라서 본 발명에 따른 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질은 MBP로 인해 소수성 표면에 자발적인 물리적 흡착이 가능하고, FGF로 인해 줄기세포와의 세포접착을 유도할 수 있으므로, 줄기세포의 분화 및 증식 연구뿐만 아니라 이를 이용한 세포치료 및 조직공학과 같은 재생의료 분야에 유용하게 적용될 수 있다.

본 발명은 상기와 같이 수득된 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질을 이용하여 줄기세포를 배양하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에 따른 줄기세포의 배양방법은,

1) 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단에 폴리펩티드 링커가 융합된 재조합 단백질을 상기 폴리펩티드 링커의 아미노 말단을 이용하여 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시켜 생물활성 표면(bioactive surface)을 제조하는 단계; 및

2) 상기 재조합 단백질이 고정된 배양용기에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 단계를 포함한다.

단계 1)은 본 발명에 따라 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 FGF의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 폴리펩티드 링커-FGF 융합 단백질을 제공하는 단계로, 상기 재조합 단백질은 당업계의 통상적인 화학적 합성 또는 유전자 재조합 기술 등을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일 실시태양에서는, 재조합 단백질로서 말토오스 결합 단백질(MBP)의 카르복실 말단에 섬유아세포 성장인자(FGF)의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질을 사용한다.

단계 2)는 단계 1)에서 수득된 재조합 단백질을 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시켜 줄기세포에 대한 줄기세포에 대한 접착활성이 우수한 생물활성 표면을 제조하는 단계로, 상기 고정화는 특별한 처리를 요구하지 않고 재조합 단백질에서 링커의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인을 링커로 이용한 소수성 표면과의 물리적 흡착에 의해 자발적으로 이루어진다.

본 발명에서 "생물활성 표면(bioactive surface)"은 FGF가 본래의 생물학적 활성을 그대로 유지하면서 폴리펩티드 링커로 이용하여 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정화됨으로써, FGF가 외부로 노출되어 있어 줄기세포와의 상호작용이 직접적으로 이루어질 수 있는 표면을 의미한다. 즉, 상기 고정화 방법에 따라 줄기세포의 배양에 요구되는 FGF를 폴리펩티드 링커를 이용하여 소수성 재질의 세포 배양용기 표면에 고정화하고 이 배양용기에 줄기세포를 배양하면, 줄기세포와 FGF와의 상호작용이 직접적으로 이루어져 줄기세포가 FGF에 접착된 상태로 배양이 원 활하게 이루어질 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 바람직한 일 실시태양으로서 MBP-FGF 재조합 단백질을 적합한 완충용액, 예컨대 인산염 완충용액 (buffered phosphate saline, PBS), 트윈20/PBS, 트리스-HCl 완충용액, 중탄산염 완충용액(bicarbonate buffer) 등에 1 ng/㎖ 내지 0.5 ㎎/㎖의 농도로 희석한 후 이 희석액을 소수성 표면에 첨가하고 4 내지 25℃에서 1 내지 24시간 동안 반응시키면, MBP의 아미노 말단에 위치한 소수성 도메인과 상기 소수성 표면의 물리적 흡착에 의해 재조합 단백질이 소수성 표면에 고정된다. 이때, 소수성 표면에 고정되는 MBP-FGF 재조합 단백질의 농도는 5 내지 100 ㎍/㎖가 바람직하다.

본 발명에 적합한 소수성 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자(예컨대, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 테플론, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리에스테르 함유 생분해성 고분자 등) 표면, 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면일 수 있다.

단계 2)는 단계 1)에서 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질이 고정된 생물활성 표면에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 단계로, 이 단계에 사용될 수 있는 줄기세포는 특정한 세포로 분화가 진행되지 않은 채 유지되다가 필요할 경우 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 가능성을 갖춘 세포로서, 특히 본래 자신이 있던 조직과 같은 성격의 조직에서만 활성화하는 다분화능 성체줄기세포가 바람직하다. 이러한 줄기세포의 예로서 지방줄기세포, 중간엽줄기세 포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 등을 들 수 있다.

상기 생물활성 표면에 고정된 재조합 단백질은 세포 인식에 중요한 FGF가 외부로 노출되어 있어 줄기세포의 세포막에 존재하는 FGF 수용체 또는 HSPG에 용이하게 결합하여 세포의 기능을 조절하는데 중요한 역할을 담당할 수 있다. 따라서 줄기세포의 배양에 요구되는 FGF를 폴리펩티드 링커를 이용하여 소수성 재질의 세포 배양용기 표면에 고정시킨 후 상기 배양용기에서 줄기세포를 배양하면 줄기세포와 FGF와의 직접적인 상호작용에 의해 배양이 원활하게 이루어질 수 있다. 이때, 본 발명에 따른 폴리펩티드 링커-FGF 재조합 단백질과 함께 콜라겐, 피브로넥틴, 라미닌 등과 같은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 단백질을 소수성 표면에 고정시키면 줄기세포에 대한 접착활성을 향상시킬 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<참조예 1> 제한효소를 이용한 DNA의 절단 및 절편 회수

사용된 제한효소와 완충용액은 엔자이노믹스(Enzynomics)사로부터 구입하였으며 멸균된 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 보통 반응부피가 20 내지 30 ㎕가 되도록 하여 37℃의 반응온도에서 4 내지 5시간 동안 반응시켰다. 제한효소 반응에 사용 된 10× 완충용액의 조성은 다음과 같다.

1) 10× 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼Ⅰ: 100 mM 트리스-HCl(pH 7.5, 25℃), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 0.025% 트리톤 X-100

2) 10× 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼 Ⅱ: 10 mM 트리스-HCl(pH 7.5, 25℃), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 다이티오트레이톨(dithiothreitol)

DNA 절편의 회수는 전기영동된 아가로즈 겔을 UV 투과조명기(transilluminator, Avegene)로 조사하여 원하는 절편을 절단한 후 겔 추출 키트(gel extraction kit, Qiagene)를 사용하여 분리하였다.

<참조예 2> 세균성 알칼라인 포스파타제(bacterial alkaline phosphatase) 처리

세균성 알칼라인 포스파타제(bacterial alkaline phosphatase, BAP) 처리 시 사용한 BAP 용액은 퍼맨타스(Fermentas)사에서 구입하였으며, 멸균된 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 보통 반응부피가 50 ㎕가 되도록 하여 60 내지 65℃의 반응온도에서 1시간 동안 반응시켰다. BAP 반응에는 1 M 트리스-HCl 완충용액(Bioneer, pH 8.0)을 사용하였다.

<참조예 3> 접합반응(ligation reaction)

접합반응은 DNA 접합 키트(DNA Ligation Kit Ver 2.1, Takara)를 사용하여 벡터와 삽입물(insert)의 비율을 1:3 정도로 혼합하고 반응부피를 10 내지 20 ㎕가 되도록 한 후 16℃에서 적어도 12시간 이상 반응시켜 수행하였다.

<참조예 4> 대장균 형질전환

형질전환을 위한 대장균 숙주세포로는 E.coli K12 TB1(New England Biolabs)을 사용하였다. 상기 세포를 60 ㎖의 액체배지(10 g/L 박토-트립톤[bacto-tryptone], 5 g/L 효모 추출물, 10 g/L NaCl)에 접종한 후 흡광도(OD₆₀₀) 값이 0.4 내지 0.6이 될 때까지 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양된 세포를 1.5 ㎖ 에펜도르프 튜브에 분주하고 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 수확된 세포에 50 mM CaCl₂를 300 ㎕씩 첨가하고 약하게 볼텍싱(vortexing) 한 후 다시 원심분리를 통해 세포를 수확하였다. 다시 수확된 세포에 50 mM CaCl₂를 300 ㎕씩 첨가하여 세포를 균일하게 분산시킨 후 0℃에서 30분간 정치시켰다. 이 정치액을 다시 원심분리하여 상층액은 버린 후, 50 mM CaCl₂에 15% 글리세롤이 첨가된 차가운 용액을 남은 세포에 150 ㎕씩 첨가하여 균일하게 분산시키고 냉동 보관하였다.

<참조예 5> 올리고 뉴클레오티드의 합성

목적하는 FGF를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위한 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)에 사용되는 프라이머 쌍은 바이오니아사(Bioneer)의 올리고 뉴클레오티드 합성 서비스를 이용하여 제작하였다.

<참조예 6> 중합효소 연쇄반응

주형 50 ng와 정방향 및 역방향 프라이머 각각 10 μM 에 증류수를 첨가하여 총 부피가 10 ㎕가 되도록 한 후 핫 스타트 PCR 프리믹스(Hot Start PCR Premix, Bioneer)를 첨가하였다. 온도순환기(T-gradient thermo block, Applied Biometra)를 이용하여 상기 반응 혼합물을 95℃에서 1분간 변성시킨 후, 94℃에서 30초; 55℃에서 30초; 및 68℃에서 1분간의 반응을 31회 반복하였고, 최종적으로 72℃에서 5분간 증폭시켰다. 이로부터 증폭된 반응산물을 PCR 정제 키트(PCR purification kit, Bioneer)를 사용하여 정제하고 아가로즈 겔에 전기영동한 후 UV 투과조명기(Avegene)로 조사하여 원하는 절편을 절단하였다. 회수된 겔 절편으로부터 겔 추출 키트(gel extraction kit, Qiagene)를 사용하여 증폭된 DNA를 분리하였다.

<참조예 7> 지방조직에서 다분화능 줄기세포의 분리

가톨릭대학교 성형외과 연구실에서 분양받은 정상인의 피하 지방조직을 2% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 PBS로 3회 세척하여 오염된 혈액을 제거한 후 수술용 가위로 잘게 조각내었다(chopping). 이 지방조직을 미리 준비한 조직용해액(무혈청 DMEM + 1% BSA(w/v) + 0.3% 콜라게나제 타입 1)에 담그고 2시간 동안 37℃에서 교반한 후 1,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액과 펠렛을 분리하였다. 상층액은 버리고 바닥에 남은 펠렛을 회수하여 PBS로 세척한 후 1,000 rpm으로 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 100 ㎛ 메쉬(mesh)로 여과하여 조직파편들(debris)을 제거한 후 PBS로 세척하였다. 이로부터 분리된 세포 들을 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지(WelGENE Inc.)에 배양하였다. 배양 24시간 후 접착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하여 제거하였고, 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지를 2일마다 교체하면서 배양하여 인간 피하 지방조직 유래 줄기세포를 수득하였다.

<참조예 8> 폴리아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)의 제조

미니-프로테안 3 전기영동 세트(Mini-protean 3 Electrophoresis Set, Bio-rad)를 이용하여 7.5% 폴리아크릴아마이드 겔을 제조하였다. 먼저 1.0 ㎜ 유리판(glass plate)을 틀에 고정시켜 주조 틀(casting frame)을 형성하였다. 50 ㎖ 코니칼 튜브에 증류수 4.94 ㎖과 1.5 M 트리스-HCl 완충용액 2.5 ㎖, 30% 아크릴아마이드 용액 2.5 ㎖, 10% 과황산나트륨(ammonium persulfate, APS) 50 ㎕ 및 TEMED(N,N,N',N'-tetra methyl ethylene diamine) 10 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 상기 1.0 ㎜ 유리판에 4.5 ㎖씩 넣어 해상도 겔(resolution gel)을 만들었다. 그 후 겔이 마르지 않게 500 ㎕의 증류수를 부어준 후 해상도 겔이 완벽하게 굳으면 겔 위의 증류수를 제거하였다. 스태킹 겔(stacking gel)을 제조하기 위해 50 ㎖ 코니칼 튜브에 증류수 3.05 ㎖, 0.5 M 트리스-HCl 완충용액 1.25 ㎖, 30% 아크릴아마이드 용액 0.67 ㎖, 10% APS 25 ㎕ 및 TEMED 5 ㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후 1.0 ㎜ 유리판에 끝까지 붓고 15-웰(20 ㎕) 주형을 꽂은 뒤 굳혔다. 폴리아크릴아마이드 겔에 사용된 시약들의 조성은 다음과 같다.

1) 1.5 M 트리스-HCl 완충용액: 트리스 염기 18.17 g(Invitrogen), 20% SDS(Amersham Pharmacia Biotech) 2 ㎖, 증류수 80 ㎖,(pH 8.8)

2) 0.5 M 트리스-HCl 완충용액: 트리스 염기 6.06 g(Invitrogen), 20% SDS(Amersham Pharmacia Biotech) 2 ㎖, 증류수 80 ㎖,(pH 6.8)

3) 30% 아크릴아마이드 용액: 29% 아크릴아마이드(Sigma), 1% 비스-아크릴아마이드(Sigma)

<실시예 1> 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터의 제조

<1-1> FGF2 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드의 제조

FGF2 유전자가 클로닝된 플라스미드를 제조하기 위해, 서열번호: 7의 염기서열을 갖는 정방향 프라이머 bFGF-F(EcoRI) 및 서열번호: 8의 염기서열을 갖는 역방향 프라이머 FGF2-R(HindⅢ)을 합성하였다.

상기 프라이머 쌍을 사용하여 인간 섬유아세포(human fibroblast)에서 추출한 전체 유전자를 주형으로 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하여 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factors, FGF2) 부분만을 증폭하였다.

pGEM-T 벡터 시스템 Ⅰ(Promega)에 포함되어 있는 2× 접합 완충용액(rapid ligation buffer) 5 ㎕에 상기에서 증폭된 FGF2 유전자 단편 4 ng, pGEM-T 벡터 50 ng 및 T4 DNA 라이게이즈(ligase) 1 ㎕를 첨가한 후 총 부피가 10 ㎕가 되도록 증류수를 첨가하고 상온에서 1시간 동안 방치한 후 이어서 16℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 접합물을 대장균 E.coli K12 TB1에 형질전환시키고 이로부터 목적하는 유전자가 클로닝된 재조합 플라스미드를 선별하여 pGEM-FGF2라 명명하였다.

<1-2> MBP-FGF2 재조합 유전자 단편이 클로닝된 재조합 발현벡터의 제조

링커로서 말토오스 결합 단백질(MBP)과 FGF2 유전자를 융합시키기 위해, 상기 실시예 <1-1>에서 제조된 재조합 플라스미드 pGEM-FGF2에 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼 Ⅰ을 첨가하고 제한효소 EcoRⅠ을 처리한 후, 완충용액 Ez 버퍼 Ⅱ를 첨가하고 제한효소 HindⅢ를 처리한 다음, 아가로즈 겔 상에서 FGF2 유전자 절편을 분리하였다. 이후의 접합반응을 용이하게 수행하기 위하여 분리된 FGF2 유전자를 BAP로 처리하였다. BAP 처리는 완충용액(1 M 트리스-HCl, pH 8.0, Bioneer) 7.5 ㎕ 및 BAP 용액(Fermentas) 1 ㎕를 넣은 후 최종 부피가 50 ㎕가 되도록 FGF2 유전자를 첨가하고 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응물을 아기로스 겔에서 전기영동한 후 UV 투과조명기(Avegene)로 조사하여 원하는 부분을 절단한 후 겔 추출 키트(gel extraction kit, Qiagene)를 사용하여 FGF2 유전자 단편을 분리하였다.

한편, 접합반응에 사용될 MBP 유전자를 가지고 있는 벡터 pMAL-c2X(New England Biolabs)에 엔자이노믹스 완충용액 Ez 버퍼 Ⅰ을 첨가하고 제한효소 EcoRⅠ을 처리한 후, 완충용액 Ez 버퍼 Ⅱ를 첨가하고 제한효소 HindⅢ를 처리한 다음, 아가로즈 겔 상에서 MBP 유전자 함유 벡터 절편을 분리하였다.

상기에서 분리된 FGF2 유전자 9 ㎕, 절단된 벡터 절편 pMAL-c2X 3 ㎕ 및 DNA 접합 키트(DNA Ligation Kit Ver 2.1, Takara)에 포함된 효소 용액 Ⅰ(enzyme solution Ⅰ) 12 ㎕를 혼합하고 총 부피가 20 ㎕가 되도록 증류수를 가한 다음 16℃에서 16시간 동안 반응시켜 접합반응(ligation)을 수행하였다. 반응이 종결된 후, 접합물을 대장균 K12 TB1에 형질전환시키고, 이로부터 MBP와 FGF2의 융합 유전자가 클로닝된 재조합 발현벡터를 스크리닝하여 pMAL-c2X-FGF2라 명명하였다. 상기 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2로 대장균 K12 TB1을 형질전환시켜 수득된 형질전환 세균인 대장균 K12 TB1/pMAL-bFGF를 2009년 4월 28일자로 한국생명공학연구원 내 유전자은행에 기탁번호 KCTC-11505BP로 기탁하였다.

염기서열 분석 결과, MBP의 카르복실 말단에 FGF의 아미노 말단이 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 MBP-FGF 재조합 단백질은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 가지며, 이는 서열번호: 5의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다.

<실시예 2> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 및 정제

<2-1> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 유도

상기 실시예 <1-2>에서 수득된 MBP-FGF2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2를 대장균 E.coli K12 TB1에 형질전환시키고 37℃의 LB(Luria-Bertani) 고체 배지에서 하루 동안 배양하였다. 다음날 배지 위에 형성된 콜로니(colony)를 취하여 60 ㎍/㎖ 농도의 암피실린을 함유하는 3 ㎖의 RB(rich medium + glucose) 액체배지에 접종하고 37℃에서 약 2시간 동안 배양하였다. 여기에 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)를 최종 농도 3 mM이 되도록 첨가하고 다시 37℃에서 2시간 동안 더 배양하였다. 배양이 끝난 후 1 ㎖의 배양액을 취하여 원심분리기를 통해 세포 침전물을 얻었다. 상기 세포 침전물에 20 ㎕의 1× 시료 로딩 완충용액(sample loading buffer)을 첨가하고 잘 혼합하였다. 이 혼합물을 95℃에서 5분간 끓였다가 상온으로 냉각시킨 후 15 ㎕를 취하여 10% SDS-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 수행하였다. 전기영동이 종결된 후 폴리아크릴아마이드 겔을 쿠마시 블루(coomassie brilliant blue)로 염색하고 항-MBP 및 항-FGF 항혈청(New England Biolabs)을 이용한 웨스턴 블롯팅을 통해 MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 여부를 관찰하였다.

<2-2> MBP-FGF2 재조합 단백질의 발현 및 정제

상기 실시예 <2-1>에서 재조합 발현벡터 pMAL-c2X-FGF2로 형질전환된 대장균 세포를 암피실린이 60 ㎍/㎖ 첨가된 RB 배지에 접종한 후 37℃에서 밤새 배양하였다. 상기 배양액 10 ㎖을 1 ℓ의 RB 배지에 첨가하고 37℃에서 계속 진탕 배양하였고, 배양액의 흡광도가 650 ㎚의 파장에서 약 0.6 정도가 될 때 3 mM의 최종 농도로 IPTG를 첨가하였다. IPTG를 첨가하고 약 2시간 후에 배양을 멈춘 후 배양액을 4000× g에서 20분간 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 세포 침전물을 수거하였다. 이 세포 침전물에 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖) 50 ㎖를 첨가하여 현탁시킨 후, 최종 농도가 1 mM이 되도록 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)와 PMSF(phenylmethanesulphonyl fluoride)를 첨가하였다. 상기 세포 혼합물을 정제에 앞서 -20℃에서의 냉동 및 해동을 반복하여 세포 파쇄가 쉽게 일어나도록 하였다. 그 후 세포 혼합물을 얼음 중탕 SO에서 초음파 분쇄기(Fisher Scientific Model 500 Sonic Dismembrator)를 이용하여 10% 출력으로 약 10초간 초음파 처리하여 세포를 파쇄한 후 30초간 얼음 중탕 안에서 방치하였다. 상기와 같은 과정을 2회 반복하여 세포를 완전히 파쇄하였다. 이렇게 얻은 세포 균질액을 9000× g에서 1시간 동안 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 가용성 단백질이 녹아있는 상층액을 얻은 후 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA, 2 ㎖)으로 5배 희석하였다.

한편, 대장균 형질전환체로부터 발현된 MBP-FGF2 재조합 단백질을 분리하기 위하여, 아밀로오스 수지(amylose resin, New England Biolabs)를 이용한 친화성 칼럼 크로마토그래피를 준비하였다. 상기 칼럼을 미리 약 8× 베드 볼륨의 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖)으로 세척하여 평형화시켰다. 평형화된 아밀로오스 수지 친화성 칼럼 크로마토그래피에 상기에서 얻은 가용성 단백질이 녹아있는 상층액을 분당 1 ㎖의 속도로 로우딩하였다. 이어서 12× 베드 볼륨 이상의 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7g, 0.5 M EDTA 2 ㎖)을 상기 칼럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 그 다음 10 mM 말토오스 용출 완충용액(1 M 트리스-HCl 20 ㎖, pH 7.5, NaCl 11.7 g, 0.5 M EDTA 2 ㎖, 10mM 말토오스)을 첨가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질을 분당 1 ㎖의 속도로 용출시켜 회수하였다. 이로부터 회수된 단백질을 10% 폴리아크릴아마이드 겔에 전기영동(Bio-rad)하여 정제된 단백질의 대략적인 분자량과 순도를 확인하였다. 그 결과 정제된 단백질의 순도는 95% 이상이었으며 대략적인 분자량은 60,000 Da 정도로 나타났다.

상기 단백질 시료를 투석막(dialysis membrane, MWCO12-14,000, Spectrum laboratories, Inc.)에 담아 PBS로 3일간 투석하여 말토오스가 제거된 단백질만을 수득하였다. 그 뒤 원심분리 여과기(Centrifugal Filter, Amicon Ultra-15 MWCO 5,000, Millipore)를 이용하여 4000× g에서 45분간 원심분리(Combi-514R, 한일)하여 단백질을 농축하였다. 상기 과정에 따라 최종적으로 농축된 단백질을 MBP-FGF2라 명명하였다.

도 1은 상기에서 분리, 정제된 MBP-FGF2 재조합 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이다. 도 1에서, A는 SDS-PAGE 겔을 쿠마시-블루로 염색한 결과이고, B는 상기 겔에 대해 항-MBP를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이고, C는 상기 겔에 대해 항-FGF를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행한 결과이다. A, B 및 C에서 레인 1은 MBP 단독; 레인 2는 MBP-FGF2 융합단백질; 레인 3은 FXa로 처리한 MBP-FGF2 융합단백질; 및 레인 4는 FGF2 단독을 나타낸다. 도 1에 나타난 바와 같이, MBP-FGF2 재조합 단백질이 MBP 및 FGF2 단독보다 높은 분자량을 가지며, MBP-FGF2 재조합 단백질 20 ㎍에 FXa 1 ㎍을 첨가한 후 상온에서 4시간 동안 반응시킨 결과 MBP와 FGF2로 분리되는 것으로 보아, 본 발명에 따른 대장균 형질전환체로부터 MBL-FGF2 재조합 단백질이 발현되어 성공적으로 분리, 정제되었음을 확인하였다.

<실시예 3> MBP-FGF2 재조합 단백질의 활성 측정

MBP-FGF2 재조합 단백질의 활성을 측정하기 위하여 HUVEC 세포(인간 유래 태반 정맥 혈관내피세포, Modern Cell & Tissue Technologies)를 대상으로 하기 실험을 수행하였다. HUVEC 세포는 FGF2 수용체인 FGFR1을 발현하는 세포로 FGF2의 활 성도 측정 등에 이용되고 있다. HUVEC 세포를 내피 성장 배지-2(endothelial growth medium-2, EGM-2, Lonza)에 현탁하여 96-웰 배양기에 2× 10³의 세포 농도로 이식하였다. 세포 이식 4시간 후, 배지를 FGF2 미함유 EGM-2(기본배지), 또는 HUVEC 세포를 자극하기 위하여 각각 FGF2(R&D Systems) 및 본 발명의 MBP-FGF2 재조합 단백질이 EGM-2에 0, 55, 138, 277, 555, 832 및 1100 pmol의 농도로 첨가된 배지로 교환하고 3일간 더 배양하였다. 배양이 종결된 후, 증식된 세포수를 세포 계수 키트(Cell counting kit, Dojindo Laboratories)를 이용하여 분석하였다.

도 2는 3일 후 처리된 단백질 농도에 따라 증식된 세포수를 상대적으로 비교한 그래프로서, FGF2 및 MBP-FGF2의 처리 농도가 증가함에 따라 세포수가 증가함을 알 수 있다. 도 3은 FGF2 및 MBP-FGF2 각각을 1100 pmol로 첨가한 배지에서 3일간 배양한 세포의 사진으로, 기본배지에서 배양한 경우는 세포가 거의 증식하지 않은 반면, MBP-FGF2를 첨가한 경우는 FGF2를 첨가한 경우와 유사한 정도로 세포가 증식하였음을 알 수 있다. 이러한 결과는 본 발명에 따라 FGF2가 MBP와의 재조합 단백질 형태로 발현되어 정제되더라도 본연의 FGF2 활성을 그대로 유지하고 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 4> MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에서 지방줄기세포의 접착활성

MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에 대한 지방줄기세포의 접착활성을 조사하기 위해, 먼저 상기 실시예 2에서 분리, 정제한 MBP-FGF2 재조합 단백질을 무균작업대(Sanyo)에서 0.22 ㎛ 주사기 필터(Millex GV, Millipore)를 이용해 여과한 후 1, 5, 10, 50 및 100 ㎍/㎖의 농도로 100 ㎕씩 폴리스티렌 재질의 96-웰 플레이트(비-조직 배양용, Falcon)에 첨가하고 플레이트 표면에 고정되도록 무균작업대 안에서 4시간 동안 방치하였다. 그 후 상기 96-웰을 PBS 200 ㎕로 3회 세척하고, MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 웰 표면과 지방줄기세포와의 비특이적 결합을 방지하기 위해 일부 웰에는 1% BSA(bovine serum albumin, Sigma) 200 ㎕를 첨가하고 무균작업대 안에서 2시간 동안 더 처리한 후 PBS 200 ㎕로 3회 세척하였다.

MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 96-웰에 웰당 지방줄기세포를 8×10³ 세포의 농도로 파종하였다. 이때 사용된 배지는 DMEM/F12(WelGENE Inc.) 무혈청 배지를 사용하였다. 이식된 세포는 37℃ 배양기(Thermo)에서 1시간 동안 배양한 후 접착된 지방줄기세포의 단백질 양을 BCA(Bicinchoninic Acid) 단백질 분석법으로 측정하여 세포의 접착 정도를 정량화하였다.

도 4는 본 발명의 MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에서 고정된 재조합 단백질의 농도에 따른 지방줄기세포의 접착율을 측정한 결과로, 지방줄기세포는 재조합 단백질이 10 ㎍/㎖ 이상의 농도로 고정된 표면에서 최대 접착율을 나타냄을 알 수 있다.

도 5는 다양한 배양 표면에 대한 지방줄기세포의 접착율을 배양시간에 따라 비교한 결과로서, MBP 및 MBP-VEGF 재조합 단백질이 고정된 표면에서는 파종 4시간 이후에도 지방줄기세포의 접착율이 30% 정도로 낮았다. 본 발명에 따른 MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에서는 배양 초기에는 피브로넥틴(fibronectin, FN)이 고정된 표면에서의 지방줄기세포 접착율의 60% 수준이었으나, 배양시간이 경과함에 따라 4시간 후에는 약 80% 정도로 증가된 접착율을 나타내었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 MBP-FGF2 재조합 단백질이 지방줄기세포에 특이적인 접착활성을 나타냄을 알 수 있다.

도 6은 본 발명의 MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 소수성 표면에서 혈청 부재 하에 2시간 동안 배양된 지방줄기세포의 형태 변화를 위상차 현미경(Nikon)으로 관찰한 결과이다. 도 6에 나타난 바와 같이, 지방줄기세포가 상업용 조직세포 배양용기 표면(TCP)에서 배양된 경우에는 원형의 세포 주위로 위족(pseudopodia)이 형성되어 있고, 천연 ECM 성분인 피브로넥틴(FN)이 고정된 표면에서 배양된 경우에는 세포가 완벽하게 퍼져있으며(spreading), MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에서 배양된 경우에는 세포의 형태가 원형으로 유지됨을 관찰할 수 있었다. 상기 결과는 본 발명에 따른 MBP-FGF2 재조합 단백질의 배양용기 표면에의 고정화가 지방줄기세포가 형태를 유지하면서 증식하는데 중요한 역할을 담당하고 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 5> MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에서 골수-유래 중간엽줄기세포의 접착활성

MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에 대한 인간 골수-유래 중간엽줄기세포(연세대학교, 의과대학, 줄기세포치료센터로부터 분양)의 접착활성을 조사하기 위해, 상기 실시예 4에서와 같이 표면에 MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 96-웰 플레이트를 준비하였다.

MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 96-웰에 웰당 골수-유래 중간엽줄기세포를 1×10⁴ 세포의 농도로 파종하였다. 이때 사용된 배지는 고 포도당(high glucose) DMEM(WelGENE Inc.) 무혈청 배지를 사용하였다. 이식된 세포는 37℃ 배양기(Thermo)에서 1시간 동안 배양한 후 접착된 골수유래 중간엽줄기세포의 단백질 양을 BCA(Bicinchoninic Acid) 단백질 분석법으로 측정하여 세포의 접착 정도를 정량화하였다.

도 7은 본 발명의 MBP-EGF2 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에서 상기 재조합 단백질의 흡착 농도에 따른 골수-유래 중간엽줄기세포의 접착율을 비교한 결과로서, 골수-유래 중간엽줄기세포는 실시예 4와 유사하게 재조합 단백질이 10 ㎍/㎖ 이상의 농도로 고정된 표면에서 최대 접착율을 나타내었다. 이때 본 발명의 MBP-FGF2 재조합 단백질이 고정된 표면에서 골수-유래 중간엽줄기세포의 접착율은 피브로넥틴(Fn)이 고정된 표면에서의 접착율의 60% 수준이었고, 실시예 4의 지방줄기세포의 접착율과 유사한 경향을 보였다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 MBP-FGF2 재조합 단백질이 골수-유래 중간엽줄기세포에 특이적인 접착활성을 나타냄을 알 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상 의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명에 따른 말토오스 결합 단백질(MBP)과 섬유아세포 성장인자(FGF2)의 재조합 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과이고,

도 2는 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질로 처리된 HUVEC 세포에서 상기 재조합 단백질의 처리 농도에 따른 세포의 증식율을 나타낸 그래프이고,

도 3은 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질 처리(C), FGF2 단독 처리(B), 및 무처리(A) 하에서 HUVEC 세포를 3일간 배양한 후 세포를 위상차 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 4는 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에 대한 지방줄기세포의 접착율을 고정된 재조합 단백질의 농도에 따라 나타낸 그래프이고,

도 5는 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에 대한 지방줄기세포의 접착율을 다양한 다른 표면에 대한 접착율과 비교한 그래프이고,

도 6은 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에서 무혈청 배지 조건으로 배양된 지방줄기세포의 형태 변화를 위상차 현미경으로 관찰한 사진이고,

도 7은 본 발명에 따른 MBP-FGF 재조합 단백질이 고정된 폴리스티렌 표면에 대한 인간 골수-유래 중간엽줄기세포의 접착율을 고정된 재조합 단백질의 농도에 따라 비교한 그래프이다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> FIBROBLAST GROWTH FACTOR RECOMBINANT PROTEIN WITH ADHESIVE ACTIVITY TO STEM CELLS AND METHOD OF CULTURING STEM CELLS USING THE SAME <130> KC090054 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 465 <212> DNA <213> human fibroblast growth factor cDNA sequence <400> 1 atggcagccg ggagcatcac cacgctgccc gccttgcccg aggatggcgg cagcggcgct 60 tcccgcccgg ccacttcaag gaccccaagc ggctgtactg caaaaacggg ggcttcttct 120 gcgcatccac cccgacggcc gagttgacgg ggtccgggag aagagcgacc ctcacataag 180 ctacaacttc aagcagaaga gagaggagtt gtgtctatca aaggagtgtg tgctaaccgt 240 tacctggcta tgaaggaaga tggaagatta ctggcttcta aatgtgttac ggatgagtgt 300 ttcttttttg aacgattgga atctaataac tacaatactt accggtcaag gaaatacacc 360 agttggtatg tggcactgaa acgaactggg cagtataaac ttggatccaa aacaggacct 420 gggcagaaag ctatactttt tcttccaatg tctgctaaga gctga 465 <210> 2 <211> 155 <212> PRT <213> human fibroblast growth factor amino acid sequence <400> 2 Met Ala Ala Gly Ser Ile Thr 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cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttca 1167 <210> 4 <211> 389 <212> PRT <213> maltose-binding protein amino acid sequence <400> 4 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 370 375 380 Glu Gly Arg Ile Ser 385 <210> 5 <211> 1654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-FGF recombinant protein <400> 5 atgaaaatcg aagaaggtaa actggtaatc tggattaacg gcgataaagg ctataacggt 60 ctcgctgaag tcggtaagaa attcgagaaa gataccggaa ttaaagtcac cgttgagcat 120 ccggataaac tggaagagaa attcccacag gttgcggcaa ctggcgatgg ccctgacatt 180 atcttctggg cacacgaccg ctttggtggc tacgctcaat ctggcctgtt ggctgaaatc 240 accccggaca aagcgttcca ggacaagctg tatccgttta cctgggatgc cgtacgttac 300 aacggcaagc tgattgctta cccgatcgct gttgaagcgt tatcgctgat ttataacaaa 360 gatctgctgc cgaacccgcc aaaaacctgg gaagagatcc cggcgctgga taaagaactg 420 aaagcgaaag gtaagagcgc gctgatgttc aacctgcaag aaccgtactt cacctggccg 480 ctgattgctg ctgacggggg ttatgcgttc aagtatgaaa acggcaagta cgacattaaa 540 gacgtgggcg tggataacgc tggcgcgaaa gcgggtctga ccttcctggt tgacctgatt 600 aaaaacaaac acatgaatgc agacaccgat tactccatcg cagaagctgc ctttaataaa 660 ggcgaaacag cgatgaccat caacggcccg tgggcatggt ccaacatcga caccagcaaa 720 gtgaattatg gtgtaacggt actgccgacc ttcaagggtc aaccatccaa accgttcgtt 780 ggcgtgctga gcgcaggtat taacgccgcc agtccgaaca aagagctggc aaaagagttc 840 ctcgaaaact atctgctgac tgatgaaggt ctggaagcgg ttaataaaga caaaccgctg 900 ggtgccgtag cgctgaagtc ttacgaggaa gagttggcga aagatccacg tattgccgcc 960 actatggaaa acgcccagaa aggtgaaatc atgccgaaca tcccgcagat gtccgctttc 1020 tggtatgccg tgcgtactgc ggtgatcaac gccgccagcg gtcgtcagac tgtcgatgaa 1080 gccctgaaag acgcgcagac taattcgagc tcgaacaaca acaacaataa caataacaac 1140 aacctcggga tcgagggaag gatttcagaa ttccccgcct tgcccgagga tggcagccgg 1200 gagcatcacc acgctgcccg ccttgcccga ggatggcggc agcggcgctt cccgcccggc 1260 cacttcaagg accccaagcg gctgtactgc aaaaacgggg gcttcttctg cgcatccacc 1320 ccgacggccg agttgacggg gtccgggaga agagcgaccc tcacataagc tacaacttca 1380 agcagaagag agaggagttg tgtctatcaa aggagtgtgt gctaaccgtt acctggctat 1440 gaaggaagat ggaagattac tggcttctaa atgtgttacg gatgagtgtt tcttttttga 1500 acgattggaa tctaataact acaatactta ccggtcaagg aaatacacca gttggtatgt 1560 ggcactgaaa cgaactgggc agtataaact tggatccaaa acaggacctg ggcagaaagc 1620 tatacttttt cttccaatgt ctgctaagag ctga 1654 <210> 6 <211> 543 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MBP-FGF recombinant protein <400> 6 Met Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr 20 25 30 Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe 35 40 45 Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala 50 55 60 His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile 65 70 75 80 Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp 85 90 95 Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu 100 105 110 Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys 115 120 125 Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly 130 135 140 Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro 145 150 155 160 Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys 165 170 175 Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly 180 185 190 Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp 195 200 205 Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala 210 215 220 Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys 225 230 235 240 Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser 245 250 255 Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro 260 265 270 Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp 275 280 285 Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala 290 295 300 Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala 305 310 315 320 Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln 325 330 335 Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala 340 345 350 Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Asn 355 360 365 Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile 370 375 380 Glu Gly Arg Ile Ser Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu 385 390 395 400 Pro Glu Asp Gly Gly Ser Gly Ala Phe Pro Pro Gly His Phe Lys Asp 405 410 415 Pro Lys Arg Leu Tyr Cys Lys Asn Gly Gly Phe Phe Leu Arg Ile His 420 425 430 Pro Asp Gly Arg Val Asp Gly Val Arg Glu Lys Ser Asp Pro His Ile 435 440 445 Lys Leu Gln Leu Gln Ala Glu Glu Arg Gly Val Val Ser Ile Lys Gly 450 455 460 Val Cys Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu 465 470 475 480 Ala Ser Lys Cys Val Thr Asp Glu Cys Phe Phe Phe Glu Arg Leu Glu 485 490 495 Ser Asn Asn Tyr Asn Thr Tyr Arg Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr 500 505 510 Val Ala Leu Lys Arg Thr Gly Gln Tyr Lys Leu Gly Ser Lys Thr Gly 515 520 525 Pro Gly Gln Lys Ala Ile Leu Phe Leu Pro Met Ser Ala Lys Ser 530 535 540 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bFGF-F forward primer <400> 7 ccgaattccc cgccttgccc gaggatggc 29 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FGF2-R reverse primer <400> 8 caaagctttc agctcttagc agacattgga ag 32

Claims (21)

1) 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)의 아미노 말단에 폴리펩티드 링커가 융합되어 줄기세포에 대한 접착활성을 갖는 FGF-폴리펩티드 링커의 재조합 단백질을 제조하는 단계;

2) 상기 재조합 단백질을 폴리펩티드 링커의 아미노 말단을 이용하여 소수성 표면을 갖는 배양용기에 고정시키는 단계; 및

3) 상기 재조합 단백질이 고정된 배양용기에 줄기세포를 접착시켜 배양하는 단계를 포함하는, 고정된 섬유아세포 성장인자(immobilized FGF)를 이용한 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 1)에서 재조합 단백질이 폴리펩티드 링커로 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein, MBP)을 FGF의 아미노 말단에 융합시킨 MBP-FGF 재조합 단백질인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제2항에 있어서,

상기 MBP-FGF 재조합 단백질이 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제2항에 있어서,

단계 2)에서 MBP-FGF 재조합 단백질을 5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 소수성 표면에 고정시키는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 2)에서 소수성 표면이 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 또는 금속 표면인 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제5항에 있어서,

상기 고분자가 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 테플론, 폴리테트라플루오로에틸렌, 및 폴리에스테르 함유 생분해성 고분자로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제5항에 있어서,

상기 금속이 스테인레스 스틸, 티탄, 금 및 백금으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 2)에서 재조합 단백질과 소수성 표면의 자발적인 물리적 흡착에 의해 상기 재조합 단백질이 상기 소수성 표면에 고정되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제8항에 있어서,

상기 물리적 흡착이 재조합 단백질과 소수성 표면을 4 내지 25℃에서 1 내지 24시간 동안 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 2)에서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정된 FGF가 소수성 표면의 외부로 향하게 노출되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 2)에서 재조합 단백질 형태로 소수성 표면에 고정된 FGF가 본래의 생물학적 활성 또는 기능을 50% 이상 유지하는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

제1항에 있어서,

단계 3)에서 줄기세포가 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 골수줄기세포, 제대혈줄기세포 및 신경줄기세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 줄기세포의 배양방법.

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