JP4960454B2 - 細胞膜透過伝達ペプチド及びこれを含む生物製剤 - Google Patents
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Description
ヒトGタンパク質アルファ12(GenBank寄託番号、AAH87537、BC087537)の全381アミノ酸配列の中で、29番目アラニンから39番目アルギニンまでの11個アミノ酸配列(GNP−TDPペプチド)をコードするDNA配列を含む配列番号3に記載される一本鎖のオリゴマーと、それと相補的な配列を有する配列番号4に記載されるオリゴマーとを結合させることによって、GNP−TDPペプチドをコードする塩基配列を含む二重鎖DNAを製造した。具体的に、上記DNAオリゴマーは、GNP−TDPをコードする33個塩基を有する配列番号2に記載されるDNA配列と、制限酵素NdeIとBamHIの認識部位を含む全57bpのDNAと、これに相補的な配列のDNAである。上記オリゴマーを80℃で15分間処理した後、室温に放置し、2オリゴマーを結合させることによって、57bpの二重鎖DNAを製造した。上記反応から増幅された増幅産物について、2%アガロースゲル電気泳動で確認した。その結果、57bpのDNA断片が増幅されたことを確認した(図1)。
上記実施例1で製造された57bpDNA断片を用いて、大腸菌株発現用pGNP組換えベクターを製作した。具体的に、上記57bpDNA断片を2%アガロースゲルで電気泳動した後、QIAquick PCR精製キット(Qiagen, Germany)を使用してDNAを分離した。分離されたDNA断片を制限酵素NdeIとBamHIに消化し、pET28aベクター(Novagen, USA)ベクターも同じ制限酵素で消化した後、T4 DNAリガーゼ(Promega, USA)で反応させて、本発明のペプチドをコードするDNA断片が挿入された新しいプラスミドベクターを製造し、これを“pGNP”と命名した(図2)。
上記実施例2で製造されたpGNPベクターでGNP−TDPの細胞内への伝達効率を直接確認するために、標的タンパク質として選択したEGFP遺伝子をpGNPベクター内に挿入させた。上記EGFP遺伝子は、全体DNA配列が含まれているpEGFP−N1(BD Biosciences, USA)ベクターを鋳型としてPCR反応を遂行して得た。この時、使われたPCR反応のためのプライマーとして配列番号5に記載される上流プライマー及び配列番号6に記載される下流プライマーを使用しており、これらはそれぞれ制限酵素EcoRI、XhoI認識部位が含まれた配列である。PCR反応は、95℃で1分間鋳型を熱変性し、58℃で1分間鋳型とプライマーの結合し、72℃で1分間延長反応することを1周期とし、35周期を、PCR反応器を利用して遂行した。上記反応から増幅された約720bpのDNA断片に対して、1%アガロースゲル電気泳動を遂行して確認した後、QIAquick PCR精製キットを使用して分離した。分離されたDNA断片を制限酵素EcoRIとXhoIで消化し、同じ制限酵素で消化したpGNPベクターにT4 DNAリガーゼで反応させて挿入することによって、標的タンパク質をコードするEGFP遺伝子が挿入された新しいプラスミド“pGNP−EGFP”を製造した。
上記実施例3で製造されたベクターpGNP−EGFPを用いて大腸菌菌株で融合タンパク質GNP−EGFPを製造した。組換えベクターpGNP−EGFPをタンパク質過発現用大腸菌菌株BL21(pLysS)に導入し、形質転換させた後、抗生剤であるカナマイシン(50μg/mL)とクロラムフェニコール(34μg/mL)が添加されたLB平板培地で形成されたコロニーをLB液状培地に接種した後、37℃で16時間培養し、十分な培養液を得て、これを新しいLB液状培地に接種した。同温度で振盪培養した後、600nm波長で吸光度が0.6になれば、タンパク質の過発現のために最終濃度が0.5mMになるように、IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)を添加した後、4時間さらに培養した。時間単位に、サンプリングした培養液を12%SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動を遂行した結果、組換えタンパク質GNP−EGFPが発現されたことを確認した(図4)。
上記実施例4で分離精製された組換えタンパク質をラットの筋芽細胞H9c2細胞株(ATCC CRL−1446)内に伝達し、その効率を確認した。H9c2細胞をDMEM培地(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco, USA)を使用して培養し、6−ウェルプレート(Nalge Nunc, USA)に細胞数を6×105で分注した後、プレート面積の70%程成長した時、10%FBSが含まれた新しい培地に交替した。そこに、GNP−EGFP組換えタンパク質を濃度単位(0〜2.0μM)で2時間、または0.5μMの濃度で2時間、細胞に処理した。対照群としてはGNPペプチドが融合されていない天然型EGFPタンパク質を使用した。決まった時間後に、細胞をPBS緩衝溶液(phosphate-buffered saline)で2回洗浄した後、EDTAが入っていないトリプシン(Gibco-BRL, USA)を10分間処理することによって、細胞表面に付着され得るタンパク質を除去し、再びPBSで洗浄した。
Claims (6)
- 配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチド。
- 請求項1に記載の細胞膜透過伝達ペプチドをコードする核酸。
- 配列番号2に記載される塩基配列を有することを特徴とする請求項2に記載の核酸。
- 請求項2に記載の核酸を含む組換えベクターであって、標的タンパク質が配列番号1に記載のアミノ酸配列を有する細胞膜透過伝達ペプチドと融合して発現される態様で、上記組換えベクター内に上記標的タンパク質をコードする遺伝子が挿入されている、組換えベクター。
- 請求項4に記載の組換えベクターの導入によって形質転換された形質転換体。
- 請求項5に記載の形質転換体を培地で培養することを特徴とする、請求項1に記載の細胞膜透過伝達ペプチドと融合された標的タンパク質を発現する方法。
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