KR20040083429A - 생체분자 전달 모티브 Mph-1-BTM 및 이것의 이용 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 생체분자 전달 모티프 (BTM)인 Mph-1 펩티드에 관한 것이다. Mph-1 펩티드는 생체내 및 시험관내에서 원핵 세포 또는 진핵 세포의 세포질, 세포 소기관 또는 핵내로 수많은 생물학적 반응 개질제를 효과적으로 전달할 수 있다. 또한 본 발명은 Mph-1 BTM을 사용하는 방법에 관한 것이다. 상기 Mph-1 BTM은 약물 전달 시스템, 새로운 재조합 단백질 백신 또는 DNA/RNA 백신의 개발, 유전자 및 단백질 치료법, 약리학적으로 또는 의학적으로 유용한 단백질의 생산 또는 약리의학적 약물 치료에 사용될 수 있다.
Description
일반적으로 살아있는 세포는 단백질과 핵산과 같은 거대분자에 대해서 불투과성이다. 일부 작은 크기의 물질들만이 매우 낮은 비율로 살아있는 세포의 세포막을 통과하여 세포 내의 세포질, 세포소기관 (organelle), 또는 핵으로 들어갈 수 있는 반면에 대부분의 거대분자는 세포내로 들어갈 수 없으며, 이는 이와 같은 거대분자를 이용한 치료, 예방 및 진단에 있어 제한요인이 되고 있다. 한편, 치료, 예방 및 진단을 목적으로 제조되는 물질들은 그 실질적인 유효량이 세포내로 전달되어야 하므로 이들을 세포 외부나 표적 세포의 표면에서 작용시켜 세포 내로 전달시키기 위한 다양한 방법들이 개발되었다.
생체 외에서 세포 내로 거대분자를 전달하는 방법에는, 전기충격(electroporation), 리포솜을 이용한 막 융합, 표면에 DNA가 코팅된 미세투사체를 이용한 고농도 투사법, 칼슘-인-DNA 침전체를 이용한 배양법, DEAE-덱스트란을 이용한 트렌스펙션 (transfection), 변형된 바이러스 핵산을 이용한 감염, 단일 세포로 직접 미세 주입하는 방법 등이 있다. 또한 최근에는 세포 내로 전달하고자 하는 거대분자를 나노입자 (nanoparticale) 를 이용하여 생체내 및 생체 외에서 세포 내 전달을 시도하고 있으나 기술적인 측면 및 임상적인 효과면에서 아직 초기 단계에 있다. 또한, 이러한 방법들은 전형적으로 거대분자를 도입시키고자 하는 전체 세포 중 단지 일부에만 전달할 수 있을 뿐이며, 이들을 세포 내로 전달하는 시간 및 효율이 아직 임상적으로 적용할 수 있는 단계에 도달하지 못하고 있다. 또한, 목적세포가 아닌 다른 많은 수의 세포에 바람직하지 않은 작용을 줄 수 있다.
따라서, 생체 내 및 생체 외 모두에서 세포를 손상시키지 않고 생리활성을 지닌 거대분자를 효과적으로 전달하는 일반적인 방법이 요구되었다[참고문헌: L.A Sternson,Ann. N.Y. Acad. Sci., 57, 19-21 (1987)]. 이러한 예로서, 지질 펩타이드의 화학적인 추가[참고문헌: P. Hoffmann et al.Immunobiol.,177, 158-170(1988)] 또는 폴리라이신이나 폴리아르기닌 같은 염기성 중합체를 사용하는 방법[참고문헌: W-C. Chen et al.,Proc. Natl. Acad. Sci., USA.75, 1872-1876(1978)] 등이 제공된 바 있으나, 이들 방법은 아직 검증되지 않았다. 수송체로서 사용되는 엽산[참고문헌: C. P. Leamon and Low,Proc. Natl. Acd. Sci, USA.88, 5572-5576(1991)]은 엽산-염 결합체로서 세포 내로 이동된다는 사실이 보고되었으나, 세포질 안으로까지 전달되는 지는 아직 확인된 바가 없다. 또한, 슈도모나스 외독소(Pseudomonas Exotoxin)도 수송체의 한 종류로 사용되고 있다[참고문헌: T. I. Prior et al.,Cell,64, 1017-1023(1991)].
그러나, 이 시스템에서도 생물학적으로 활성화된 목적하는 물질의 세포 내로의 이동에 관한 효과와 기초 의학적 및 임상적 적용 가능성에 대해서는 명확하지 않다. 따라서, 살아있는 세포의 세포질이나 핵 내로 생물학적으로 활성화된 물질을 보다 더 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 방법이 계속적으로 요구되고 있다.
또한, 단백질과 같은 거대분자 뿐만 아니라, 생체 내부 또는 외부에서 세포내로의 DNA 및/또는 RNA 전달 역시 생명공학의 기초연구분야 및 의약학적 응용분야에서 매우 중요한 필수기술로 여겨지고 있다. DNA 및/또는 RNA의 세포 내로의 전달은 유전자 치료 및 유전자가 생체 내부 또는 외부에서 생성하는 단백질의 기능을 밝혀내는 기초연구 및 이들을 이용한 새로운 치료제의 개발에 결정적인 역할을 하고 있다. 그러나 DNA 및/또는 RNA 역시 세포막을 효과적으로 통과하지 못하기 때문에 이 같은 문제의 해결이 유전자를 이용한 기초 및 임상연구에서 해결해야 할 가장 커다란 과제 중의 하나 이다.
이에, 생체 내부 또는 외부에는 DNA 및/또는 RNA의 세포 내 전달을 위하여 리포솜, 나노입자 및 바이러스 벡터 등이 개발이 되어 그 이용 가능성에 대해 연구되었으나, 이들의 효능 및 부작용에 대하여 개선해야 할 부분이 많이 존재하고 있는 실정이다. 특히, 리포솜을 이용한 경우 세포에 대한 부작용 및 세포독성 (cytotoxicity)의 문제가 심각하여 세포주를 이용한 기초연구에 국한되어 왔으며, 나노입자의 경우 최근 많은 관심이 집중되고 있으나, 생체내에서 운반입자(carrier particle)의 분해, 전달 효능 및 이들에 대한 생체내에서의 면역반응에 대하여 더 많은 연구가 필요한 실정이다. 현재 기초연구 및 임상적 효능면에서 중요한 레트로 바이러스 벡터를 이용하는 경우 높은 역가의 바이러스 입자를 만들어 내는 데에 한계가 있고 분열하지 않는 세포에는 감염이 되지 않는다는 단점이 대두되고 있으며, 아데노바이러스 및 아데노부속 바이러스(adeno-associated virus)를 이용하는 경우에도 임상적인 이용이 매우 제한적인 것으로 알려져 있다. 또한 이들 두가지의 바이러스 벡터의 경우 잔존하고 있는 바이러스 단백질에 대한 생체 내에서의 면역반응이 유도되어 치료 효과에 의문점이 많이 제시되고 있다. 따라서, 생체 내부 또는 외부에서 DNA 및/또는 RNA를 세포 내로 전달함에 있어 보다 더 효과적이고 부작용이 적은 새로운 세포 내 전달 방법이 계속하여 요구되고 있다.
한편, 생체의 많은 생리적 현상들을 조절하는 의약학적 용도의 단백질들은 E. coli 등의 박테리아에서 생산되는 재조합 단백질의 형태로 제작되어 최근 까지 다양한 질병의 치료에 사용되고 있다. 그러나, 박테리아에서 생산된 의약학적 용도의 단백질들은 생체 내의 세포 내에서 생산되는 자연상태의 단백질과 비교하여 그 실질적인 구조 및 기능에 있어 매우 비효율적이어서 이들 단백질들을 효모 (yeast), 곤충 세포 또는 동물 세포에서 생산하거나 박테리아에서 생산된 재조합 단백질을 리폴딩 (refolding)하여 사용하거나, 유전자전이 동물 (transgenic animal)을 이용하여 생산하려는 연구가 꾸준히 있어 왔다. 그러나, 이같은 새로운 시도는 많은 분자 세포생물학적 중간단계가 필요하고 수율이 매우 낮으며, 생산비용면에서의 경제성 등이 문제점으로 제기되고 있다. 따라서 박테리아에서 생산된재조합 의약학단백질을 경제적고 용이하게 자연상태의 기능과 구조를 지닌 단백질로 변환 시키는 것은 질환의 진단, 치료 및 예방을 위한 새로운 단백질 약물의 개발에 결정적인 역할을 할 것으로 생각된다.
이러한 몇가지 중요한 기초연구 및 임상적 요구에 대한 연구의 결과로서 제시된 것이 PTD(Protein Transduction Domain) 이다. 이중 가장 많은 연구가 진행된 것은 인간 면역 결핍 바이러스-1 (Human Immunodeficiency Virus-1, HIV-1)의 전사인자인 Tat 단백질로서 [참고문헌; Schwarze SR et al, 3:285(5433):1569-1572, 1999 Science], 이 단백질은 세포막을 통과함에 있어 86개의 아미노산으로 구성된 완전한 형태일 때 보다 양전하를 갖는 아미노산들이 집중적으로 분포되어 있는 47 번째부터 57번째 아미노산 (YGRKKRRQRRR)으로 구성된 형태일 경우가 더욱 효과적임이 밝혀졌다[참고문헌:Fawell S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 664-668(1994)]. 이와 같이, PTD 로서의 효과가 확인된 다른 예로는 HSV-1 (Herpes Simplex Virus type 1)의 VP22 단백질의 267번째부터 300번째까지의 아미노산 [참고문헌: Elliott G. et al. Cell, 88,223-233(1997)], 및 드로소필라 (Drosophila)의 ANTP (Antennapedia) 단백질의 339번째부터 355번째까지의 아미노산 [참고문헌: Schwarze S.R. et al. Trends Pharmacol Sci. 21, 45-48(2000)] 등이 있다. 본 발명자들은 상기 PTD들의 아미노산의 서열을 비교하여 보면, 라이신과 아르기닌을 많이 포함하고 있으며, 특히 아르기닌이 세포내 물질전달에 중요한 것으로 생각되었다. 이 같은 사실은 전기적으로 양성인 아미노산들을 나열한 인위적인 펩타이드의 경우도 물질전달효과가 확인됨으로써 증명되었다 [참고문헌: Laus R. et al.Nature Biotechnol. 18, 1269-1272(2000)].
이 같은 PTD를 이용한 거대분자의 세포 내 전달 작용 기작으로는 세포 표면의 세포막을 파괴하여 세포 내로 전달한다는 가설과 PTD가 세포 외부에 존재하는 거대분자를 세포막의 일부를 이용하여 세포 내로 새로운 소포 (vesicle)를 형성하여 이동시키고 세포 내에서 방출한다는 두 개의 가설이 존재한다. 또한 거대분자의 세포 내 전달을 가능하게 하는 PTD는 작은 크기의 펩타이드이나 자체 내의 구조적 특성을 가지고 있어 세포막에 새로운 채널을 형성할 수 있다는 가설도 제시되고 있다 [참고문헌: Becker-Hapak M, et al, 2001, Jul:24(3):247-256].
그러나, 9 내지 12개의 아르기닌 또는 9 내지 12개의 라이신에 의하여 특정 단백질이 세포 내로 전달되었다는 결과 [참고문헌: Rothbard JB, et al, Nature Med. 2000 Nov:6(11):1253-1257]는 PTD 자체에 아르기닌 또는 라이신이 특정 위치에 존재하여 채널 구조를 형성한다는 위의 가설이 맞지 않을 수도 있다는 가능성을 제시하고 있으며, PTD와 공유 또는 비공유결합에 의하여 결합된 목적단백질만이 세포 내로 전달된다는 본 연구진의 결과는 세포막을 파괴하여 거대분자를 세포 내로 전달한다는 가설도 신빙성이 없다는 것을 말하여 준다. 또한, 본 연구간의 연구결과에서 PTD에 의한 세포내 물질전달은 37℃와 4℃ 모두에서 효과적으로 일어났으며, 이는 PTD 자체가 채널구조를 형성한다는 가설과 세포 내로 새로운 소포체를 형성하여 전달이 일어난다는 가설이 맞지 않음을 나타내고 있다.
최근 종래 PTD와는 다른 성격을 가진 새로운 PTD인 MTS가 합성, 제작되었으며[참고문헌:DaeWoong Jo et al., Nat. Biotech. Vol. 19, 2001] 이들의 아미노산의 서열은 FGF (Fibroblast Growth Factor)의 시그날 펩타이드의 아미노산서열을 기초로 하여 합성되었다. 그러나 시그날 펩타이드의 아미노산은 아래와 같은 다양한 특성을 가지고 있고, [(a)3-5 개의 아르기닌 또는 라이신이 세린 또는 쓰레오닌과 같이 비연속적으로 존재하고 글루타민산 또는 아스파라긴산은 존재하지 않음. (b) 한 개이상의 배이식 아미노산과 6-12개의 하이드로포빅 아미노산, (c) 세린과 트레오닌, 작은크기의 하이드로포빅 아미노산이 많이 있고 글루타민과 아스파라긴산이 적음, (d) C 터미널부분에 세린, 라이신 및 류신이 많음, (d)한 개 또는 두개의 베이식 아미노산이 모여있고 이들의 사이에는 무작위의 아미노산이 10개가 존재] 위의 기존의 PTD 아미노산과는 상당히 다른 특성을 가지고 있다. 즉 MTS와 같은 PTD는 아미노산구성의 특성이 없다.
따라서, 본 발명자들은 위의 두가지 다른 종류의 PTD가 가진 특성과 본 발명자의 기초연구결과를 기반으로 하여 PTD에 대한 새로운 작용기작에 대한 가설과 PTD 구성 아미노산의 요건을 찾아내었다: 1) 폴딩되지 않은 상태의 단백질이 원래의 복잡한 3차구조를 가진 단백질보다 훨씬 효과적으로 전달된다는 연구결과, 폴딩되지 않은 상태의 단백질이 세포 내 및 세포 내 소기관으로 전달된 다음, 세포외부 또는 세포 내 소기관 밖으로 배출되지 않는다는 본 연구진의 연구결과 및 PTD가 수용체를 이용한 엔도사이토시스 또는 파고사이토시스를 이용하지 않는 다는 연구결과로부터 세포 표면에 존재하는 채널을 이용한 것임. 따라서 알라닌과 발린과 같은 소수성 (hydrophobic)아미노산이 존재해야 함; 2) PTD의 경우 핵 내로도 단백질을 효과적으로 전달할 수 있으므로 이것은 세포질 내에 존재하고 있는 전사인자가 핵내로 이동하는 작용기작과 유사할 것으로 생각이 되어 PTD가 전사인자에 많이 존재할 것임. 따라서 PTD도 트랜스로콘이라는 세포내 소기관으로 단백질을 이동시키는데 사용하는 채널과 비슷한 채널에 의하여 세포내로 이동할 것임.
이 같은 새로운 두개의 가설과 구성요건을 가지고 본 연구를 수행하였다. 즉, 기존의 PTD의 특징인 라이신과 아르기닌이 많다는 구성요건으로 유전자은행을 검색하여 10,000개의 유전자를 찾아내였고, 시그날 펩타이드의 구성요건을 이용하여 500여개의 유전자를 골라내었고, 본 발명자가 찾아낸 새로운 가설과 구성요건인 알라닌과 발린을 가진 유전자를 100개 찾아내였으며, 마지막으로 전사인자라는 요건을 이용하여 20개를 찾아낸 후, 이들의 세포내 전달효과를 실험하여 새로운 이들 후보 PTD들과 b-galactosidase와의 융합단백질을 제작 및 분리정제를 하여 Jurkat T 세포 내로의 전달효과를 비교 분석한 결과 마우스 전사인자인 Mph-1. (유전자은행의 번호: U63386)의 858번째부터 868번째까지의 아미노산으로 이루어진 새로운 물질전달 펩타이드를 발견하여 이를 Mph-1-BTM (Biomolecule Transduction Morif) 이라고 명명하였다.
본 발명자들은 마우스 Mph-1 전사인자의 858번째부터 868번째까지의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 세포 내 물질전달 펩타이드로써 사용하여 생체 내 및 생체 외에서 목적단백질, 핵산, 지방, 탄수화물 또는 화학화합물을 진핵 또는 원핵세포의 세포질, 세포내소기관 또는 핵 내로 효과적으로 전달할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 목적거대분자를 전달하고자 하는 장기 및 세포의 표면에 존재하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외부분, 이들장기 및 세포에 선택적으로 발현하는 MMP의 절단부위 및 Mph-1 BTM을 이용하여, 생체 내부 또는 외부에서 목적거대분자를 특정한 장기 및 세포로 전달할 수 있는 밝혔다. 또한 특정한 DNA 및/또는 RNA 결합서열과 결합할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 결합 도메인 (DBD및/또는 RBD)과 Mph 1 BTM 이용하여, DNA 및/또는 RNA 결합 도메인과 결합할 수 있는 특정한 DNA 및/또는 RNA 염기서열을 5개 가지고 있는 발현벡터, 또는 이 발현벡터에 특정한 장기, 티슈 또는 세포에 선택적으로 유전자를 발현시킬 수 있는 프로모터를 포함한 조절 엘리먼트(elements)를 가진 발현벡터를 생체내부 또는 외부에서 특정한 장기 또는 세포로 전달 또는 발현할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 또한, Mph-1-BTM을 이용한 세포 내 전달 기술은 박테리아에서 생산된 재조합 의약학적 단백질들을 원하는 동물세포내로 전달시킨 후 다시 분리 정제하여 자연상태의 구조와 기능을 가진 의약용단백질의 생산을 가능하게 하였다.
본 발명은 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 생체 내 (in vivo) 및 생체 외 (in vitro)에서 진핵 또는 원핵세포 내부의 세포질, 세포소기관, 또는 핵내로 효과적으로 전달할 수 있는 세포내 물질전달용 펩타이드 및 이것은 이용 방법에 관한 것이다.
도 1A는 본 발명의 Mph-1-BTM을 이용한 발현벡터 p Mph-1-β -gal의 구조를 나타낸 것이다.
도 1B는 도 1A의 발현벡터를 제한효소로 처리한 후의 아가로스겔(agarose gel)을 나타낸 것이다.
도 2는 발현벡터 p Mph-1-β -gal 융합단백질의 코우마쉬 블루 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 3A는 Mph-1-β-gal 융합단백질의 세포 내 전달 효과를 나타낸 결과이다.
도 3B는 4℃ 및 37℃에서 Mph-1-β -gal(1mg/ml) 융합단백질의 효과적인 세포내 전달을 나타낸 것이다.
도 4A는 발현벡터 pTat-β -gal의 구조를 나타낸 것이다.
도 4B는 Mph-1-β -gal 융합단백질과 Tat-β -gal 융합단백질의 세포 내로의 물질전달 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 5A는 Mph-1-BTM에 의한 β -gal의 다양한 장기 내로의 전달효과를 나타낸 것이다.
도 5B는 Mph-1-BTM에 의한 eGFP의 비장세포내로의 전달 효과를 나타낸 것이다.
도 5C는 Mph-1-BTM을 이용하여 β -gal 단백질을 생체 내에서 다양한 투여경로를 통해 혈액내 T세포에 전달한 결과를 나타낸 것이다.
도 6A는 재조합 발현벡터 p Mph-1-β -gal-B7.1의 구조를 나타낸 것이다.
도 6B는 목적단백질인 β -gal이 T세포에 특이적으로 전달된 것을 나타낸 것이다.
도 7은 재조합 발현벡터 p Mph-1-Gal4의 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 재조합 발현벡터 pCD8-ξ -5XGBS (Gal4 결합서열)의 구조를 나타낸 것이다.
도 9A는 Mph-1 BTM에 의한, 발현벡터 pCD8-ξ -5XGBS의 T세포 내로의 전달을 나타낸 것이다.
도 9B는 Mph-1-BTM에 의한 생체 내에서 혈액내 T세포 및 항체형성세포(splenocyte)로의 발현벡터 pCD8-ξ -5XGBS의 전달 및 발현효과를 나타낸 것이다.
도 10A는 재조합 발현벡터 p Mph-1-Gal4-B7.1의 구조를 나타낸 것이다.
도 10B는 재조합 발현벡터 pLCD8-ξ -5XGBS의 구조를 나타낸 것이다.
도 10C는 Mph-1 BTM에 의한 발현벡터 pCD8-ξ-5XGBS의 생체 내 T세포 특이적 전달 효과를 나타낸 것이다.
도 10D는 Mph-1 BTM에 의한 발현벡터 pLCD8-ξ -5XGBS의 생체 내 T세포 특이적 발현 효과를 나타낸 것이다.
도 11A는 Mph-1-BTM과 면역억제제 토토마이세틴 (TMC)를 연결하는 pH 감수성 화학적 링커의 구조를 나타낸 것이다.
도 11B는 Mph-1-BTM에 의한 TMC의 주르캐트 T세포 내로의 전달을 나타낸 것이다.
도 12는 Mph-1 BTM에 의한 발현벡터 p Mph-1-zA1A2(a)와 p Mph-1-CTLA-4(b)의 구조를 나타낸다.
도 13은 분리정제된 Mph-1-zA1A2(a)와 Mph-1-CTLA-4(b) 융합 단백질에 대한 코우마쉬 불루 염색결과를 나타낸다.
도 14는 Mph-1-BTM을 이용한 β-gal 단백질의 식물 칼루스 (calus) 세포 내로의 전달 효과를 나타낸다.
도 15는 Mph-1-BTM을 이용한 β -gal 단백질의 박테리아, 살모넬라, 스트렙토코커스, 및 결핵균 내로의 전달효과를 나타낸다.
도 16은 Mph-1-BTM과 인슐린의 융합단백질의 제작을 위한 발현벡터 p Mph-1-인슐린의 구조를 나타낸다.
도 17A는 분리정제된 융합단백질 Mph-1-인슐린과 Mph-1-인슐린-PR에 대한 코우마쉬 블루 염색결과를 나타낸다.
도 17B는 융합단백질 재조합 인슐린 Mph-1-인슐린 및 Mph-1-인슐린-PR에 의한 주르캐트 Ti세포 내로의 전달효과를 나타낸다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 더 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 기술 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
본 발명은 생체 내 및 생체 외에서 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 근육내 (intramascular), 복막내 (intraperitoneal), 정맥내 (intravein), 비내 (nasal), 피하 (subcatenaous), 피내 (intradermal), 점막 (mucosal), 흡입(inhalation) 및 경구 (oral) 등을 포함하는 다양한 경로를 통해 진핵 또는 원 핵세포의 세포질 또는 핵 내로 효과적으로 전달할 수 있는 신규한 물질전달 펩타이드인 서열번호: 1의 Mph-1-BTM를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 Mph-1-BTM을 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 사용하여형질전환된 미생물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주세포에서 발현시켜 물질전달 펩타이드와 목적 단백질이 융합된 융합단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Mph-1-BTM을 이용하여 생체 내 및 생체 외에서 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포질, 세포소기관, 또는 핵 안으로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Mph-1-BTM을 포함하는 재조합 백신. Mph-1 BTM을 이용하여 DNA 및/또는 RNA를 세포 내로 전달하는 기술을 이용한 DNA 및/또는 RNA 백신을 제공하고, 유전자 치료 및 단백질을 이용한 치료 또한 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Mph-1-BTM을 유전자 치료 및 단백질을 이용한 치료에 이용하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Mph-1-BTM과 바이러스 또는 박테리아, 곰팡이 등을 포함하는 감염원 및 다양한 암 세포에 특이적인 DNA 및/또는 RNA 및 단백질 항원을 이용하여 새로운 백신의 개발을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 Mph-1 BTM을 이용하여 생체 내부 및 외부에서 생체기능을 조절하는 유전자의 DNA 및/또는 RNA의 전달을 가능하게 하여, 유전자치료제의 개발을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 Mph-1-BTM을 이용하여 박테리아에서 생산된 재조합 단백질을 원하는 동물세포 내로 전달하여 자연상태의 구조 및 기능을 가진 단백질 구조로 변환하여 질병의 진단, 치료 및/또는 예방을 위한 단백질약물을 제공하는것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 진핵 또는 원핵세포의 세포질, 세포소기관 또는 핵 내로 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 전달하기 위한 펩타이드 또는 이것의 활성 단편을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 서열번호: 1의 아미노산 서열의 일부가 결실 또는 치환되거나, 또는 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형거나 아미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D- 아미노산으로 치환된 진핵 또는 원핵세포의 세포질, 세포소기관 또는 핵 내로 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 전달하기 위한 펩타이드 또는 이것의 활성 단편을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 물질전달 펩타이드를 코딩하는 DNA, 및 목적하는 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터 및 이를 사용하여 형질전환시킨 대장균 DH5α Mph-1 (KCCM-10345)을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 펩타이드 또는 상기 펩타이드와 목적단백질이 결합된 융합단백질과 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질 (예컨데, chemical drug 또는 chemical prodrug)의 결합체를, 생체 내 또는 생체 외에서 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 및 흡입 등을 포함하는 다양한 경로를 통하여 진핵 또는 원핵세포와 접촉시켜 상기 물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포질, 세포소기관 또는 핵 안으로 전달하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서, "생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질"이란 생체내의 모든 생리현상을 조절하는 물질을 의미하는 것으로서 예를 들어, DNA, RVA, 단백질, 지방 탄수화물 및 화학화합물 (chemical compound) 등을 포함한다.
본 명세서에서, "활성 단편"이란 서열번호: 1의 아미노산의 단편 또는 서열번호: 1의 아미노산 중 일부가 치환 또는 결실되거나, 또는 아미노산 서열의 일부가 생체 내에서 안정성을 증가시킬 수 있는 구조로 변형거나 이미노산의 일부 또는 전부가 L- 또는 D- 아미노산으로 치환되거나, 또는 아미노산의 일부가 변형된 단편으로서, 세포 내 물질전달 기능을 보유하는 펩타이드 단편을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서, "거대분자 (macromolecule)"는 단백질, 지방, 핵산, 탄수화물 또는 화학화합물을 포함하는 것으로서 이해된다.
본 명세서에서, 물질전달 펩타이드 " Mph-1-BTM의 유사체"는, Mph-1-BTM의 물질전달 활성을 갖는 것으로서, 서열번호: 1의 아미노산 서열 중 일부 아미노산이 구조적 및 기능적으로 유사한 아미노산으로 치환된 변이 서열, 아미노산 서열의 일부가 결실된 변이 서열, 또는 생체 내부 또는 외부에서 물질전달 펩타이드 또는 그 복합체의 안전성을 증가시킬 수 있도록 변형된 것, 또는 아미노산의 일부 또는 전체가 L - 또는 D- 아미노산으로 된 서열을 함유하는 펩타이드 및 이것의 활성 단편을 포함하는 것으로 정의된다.
본 명세서에서, 융합단백질은 물질전달 펩타이드 Mph-1-BTM과 화학적, 물리적 공유 또는 비공유결합에 의하여 직접적으로 연결되거나 다른 매개체를 이용하여 간접적으로 연결된 단백질로 정의된다.
본 명세서에서 화학화합물은 세포의 기능을 조절할 수 있는 화학물질 예를 들어, 항암제, 면역질환 치료제, 항바이러스 치료제, 동물의 성장, 발달 또는 분화인자 등이 포함된다.
본 발명의 세포 내 물질전달 모티프는, 마우스 전사인자인 Mph-1의 N-말단 858번째에서 868번째 아미노산에 해당하는 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드로서, 여기서 아르기닌과 알라닌과 밸린은 세포표면에 존재하는 물질전달 채널 수용체 (channel receptor)와 결합 및 통과에 중요한 역할을 할 것으로 생각된다.
또한, 서열번호: 1의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드에서 아르기닌, 밸린 및 알라닌 부분을 포함하는 상기 펩타이드의 일부 위치의 아미노산이, 기능적 구조적으로 유사한 아미노산 예를 들어, 발린으로 치환된 변이 서열을 갖는 펩타이드 역시 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은 또한 상기 서열번호: 1의 아미노산 서열 또는 이것의 일부 아미노산이 구조적 및 기능적으로 유사한 아미노산으로 치환 또는 일부 아미노산이 생체 내에서 안정성을 증가시키기 위한 변형된 형태 또는, L- 또는 D- 아미노산으로 치환된 변이 서열의 변이 서열로 구성된 펩타이드, 또는 이들의 활성 단편으로 구성된 물질전달 펩타이드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA, 및 세포 내로 주입시키고자 하는 목적 생리기능조절물질 및/또는 목적단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 물질전달 재조합 발현벡터를 제공한다. 상기 재조합 발현벡터는 융합단백질의 정제를 용이하게 하는 태그 (tag) 서열 예를 들어, 연속된 히스티딘 코돈, 헤마글루티닌 코돈, Myc 코돈, 말토우즈 바인딩 단백질 코돈 등을 포함할 수 있고, 융합단백질의 가용성 (solubility)을 증가시키기 위한 융합파트너 (partner), 예를 들어 리이신 RNA 합성효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 융합단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성 (flexibility)을 위하여 1개 이상의 글라이신, 아미노산 AAY를 포함하는 스페이서 (spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 또한 융합단백질의 불필요한 부분을 제거하기 위하여 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열, 발현조절서열 및 세포 내 전달을 확인하기 위한 마아커 (marker) 또는 리포터 유전자 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 재조합 발현벡터에 사용되는 발현 조절 서열은 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직, 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인 (regulatory domain)으로 구성될 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 세포 내 물질전달 펩타이드를 포함하는 재조합 발현 벡터인 p Mph-1-β -gal은 서열번호: 1의 아미노산으로 구성된 펩티드를 코딩하는 DNA, 숙주세포에서 발현된 단백질의 정제를 위한 6개의 연속된 히스티딘 코돈, 에테로키나제에 의해 특이적으로 절단되는 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 서열 또는 Tev 에 의해 특이적으로 절단되는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly 및 세포 내로 융합단백질이 전달되었음을 확인하기 위한 마아커로서 β-갈락토시다제를 코딩하는 DNA를 포함한다.
본 발명의 p Mph-1-β -gal은 벡터는 pIND/lacZ 벡터 (Invitrogen사로부터입수)를 주형으로 하여 통상의 PCR (polymerase chain reaction) 방법에 의해 간단히 제조될 수 있다. 또한, 본 발명에서는 재조합 발현벡터 내 β -갈락토시다제 유전자를 적합한 제한효소를 이용하여 제거하고, 세포 내로 전달 시키고자 하는 목적단백질을 코딩하는 DNA를 삽입함으로써 물질전달 재조합 발현벡터를 재조할 수 있다. 목적단백질은 생리기능조절단백질, 또는 생리기능조절단백질과 이 단백질을 전달하고자 하는 세포, 조직 (tissue) 또는 장기 (organ)등에 특이적으로 전달하기 위한 수용체 (receptor)와 선택적으로 결합하는 리간드 (ligand)의 세포외부분을 화학적 또는 물리적 방법에 의해 연결된 융합단백질일 수 있으며, 이들 리간드 또는 수용체는 단백질, 지방, 탄수화물, 화학화합물 또는 이들의 복합체일 수 있다. 상기 목적단백질이, HIV, HBV, HCV, 및 인플루엔자를 포함하는 감염성 바이러스로부터 선택된 하나 이상의 바이러스 특이적 단백질, 또는 간암 또는 위암 세포를 포함하는 종양세포에 특이적으로 발현하는 종양 특이적 단백질인 경우, 재조합 발현벡터는 생체 내에서, 항원 프로세싱 중에 MHC 클래스 Ⅱ 매개 경로를 MHC 클래스 Ⅰ 매개 경로 전환시켜 CTL (cytotoxic leukocyte)을 유도할 수 있으며 바람직하게는 1개 이상의 유비퀴틴 (ubiquitin)을 코딩하는 DNA를 추가로 포함한다.
본 발명의 재조합 발현벡터를 이용하여 대장균 등 적절한 숙주세포를 형질전환시키고, 수득된 형질전환체를 적절한 조건 하에서 배양하여 융합단백질을 생산한 다음, 공지된 통상의 단백질 정제 방법 예를 들어, 폴리히스티딘과 Ni2+-NTA간의 결합을 사용한 방법 등을 이용함에 의해 목적단백질을 분리, 정제할 수 있다. 또한,본 발명에서는 상기 재조합 발현벡터를, 생물학적 활성을 갖는 생리기능조절물질을 전달하고자 하는 세포와 함께 배양함으로써, 세포질, 세포 소기관 또는 핵 내로 기능 조절 물질을 효과적으로 전달하는 방법이 제공된다.
보다 구체적으로, 본 발명은 물질전달 펩타이드 Mph-1-BTM 또는 이것의 유사체, 및 세포 내로 전달하고자 하는 목적 DNA 또는 RNA가 지닌 DBS 및/또는 RBS (DNA 및/또는 RNA 결합 서열)와 선택적으로 결합하는 DNA 및/또는 RNA 결합 단백질을 코딩하는 DNA를 포함하는 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에서 발현시켜 수득한 융합단백질과 상기 DNA 및/또는 RNA 결합 단백질과 결합하는 DNA 또는 RNA 염기서열을 목적 DNA 또는 RNA의 3' 끝에 가지고 있는 목적 DNA 및/또는 RNA를 결합반응 시켜 결합체를 수득하는 단계; 및 상기 결합체를 목적하는 세포의 배양물과 혼합배양 하여 세포내로 목적 DNA 및/또는 RNA를 전달하는 단계를 포함하는 세포 내 물질전달 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 물질전달 펩타이드 Mph-1-BTM 또는 이것의 유사체 또는 물질전달 펩타이드와 목적단백질과의 융합단백질을 결합 유도체로 활성화시키고 이것을 목적 화합물과 결합반응 시켜 결합체를 수득하는 단계, 및 상기 수득한 결합체를 목적 화합물을 전달하고자 하는 세포의 배양물과 혼합배양 함에 의해 세포 내로 목적 화합물을 전달하는 단계를 포함하는 물질전달 방법을 제공한다. 상기 결합유도체에는, 물질전달 펩타이드 또는 물질전달 펩타이드와 목적단백질의 융합단백질을, DNA, RNA, 탄수화물, 지방, 단백질 또는 화합물과 화학적 및/또는 물리적 방법에 의해 결합시키는 결합시약 예를 들어, BMOE (Pierce Cat. No 22323), DSP (PierceCat. No 22585), pH 감수성 링커 [참고문헌: Rothbard JB, et al, Nat. Med. 2000, Nov:6(11):1253-1257] 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 물질전달 펩타이드 Mph-1-BTM 또는 이것의 유사체 또는 물질전달 펩타이드와 생체 내의 생리현상을 조절하는 생리활성조절단백질인 목적단백질과의 융합단백질을 박테리아에서 다량 발현시켜 분리 정제한 다음, 이들 재조합 융합단백질을 원래 생체 내에서 이들 목적단백질을 생산하는 세포 또는 이와 동등한 수준의 단백질 프로세싱 (processing) 및 수정 (modification)을 할 수 있는 세포 내로 전달시켜 이들 세포 내로 전달된 목적단백질이 세포 내의 단백질 폴딩 기작에 의해 자연상태의 구조와 기능으로 변환되어, 이들 세포로부터 융합단백질을 재분리, 정제 하므로써 기초 및 임상적 치료제로 사용할 수 있는 의약학적 용도의 단백질을 생산할 수 있는 방법을 제공한다.
또한, 상기 목적 DNA, 목적 RNA, 또는 목적 화학화합물을 세포 내로 전달함에 있어, 이것을 물질전달 펩타이드와 목적단백질의 융합단백질과 물리적 화학적으로 결합시켜 특정한 세포, 조직 또는 장기로 전달하고자 하는 경우, 상기 목적단백질은 이것이 전달되는 특정 세포, 조직, 장기에 특이적으로 발현하는 수용체와 선택적으로 결합할 수 있는 리간드의 세포외 부분 단백질, 또는 이들수용체 또는 리간드와 특이적으로 결합할 수 있는 단클론항체 (mAb) 및 mAb의 변형된 형태 예를 들어, Fab 단편, F(ab') 단편, 단일가닥 Fv 또는 인간화된 단클론항체와 결합되어 물질전달복합체를 형성할 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 i) 세포내로 전달하고자 하는 목적 DNA 및/또는RNA, 특정 DNA 및/또는 RNA 염기서열과 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 결합단백질이 선택적으로 결합하는 상기 특정 DNA/RNA 염기배열을 1개 이상 중복하여 함유하는 DNA 및/또는 RNA 단편, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 제 1 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; ii) 서열번호: 1의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편, 상기 단계 i)의 세포 내로 전달하고자 하는 목적 재조합 발현벡터 중의 DNA 및/또는 RNA 단편에 포함된 특정 DNA 및/또는 RNA 염기서열과 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 결합단백질을 코딩하는 DNA, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 제 2 재조합 발현벡터를 제조하는 단계, iii) 상기 제 2 재조합 발현벡터를 숙주세포 중에 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계; iv) 상기 단계 iii)의 융합단백질과 단계 i)의 제 1 재조합 발현벡터를 결합반응 시켜, 융합단백질 및 목적 DNA 및/또는 RNA의 결합체를 수득하는 단계; 및 v) 상기 결합체를 목적 DNA 및/또는 RNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합 배양 및 접촉시키는 단계를 포함하여, 목적 DNA 및/또는 RNA를 세포 내로 전달하는 방법을 포함한다. 본 발명에 따라 생리기능조절물질을 세포 내로 전달함에 있어, 인터루킨-4, 인터루킨-2, 인터루킨-12 또는 N-인터페론을 포함하는 사이토카인 및 케모카인. 또는 성장 인자 (EGF)등과 같이 목적 DNA 및/또는 RNA의 발현 및 기능을 조절할 수 있는 생리기능조절인자가 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 목적단백질은 바람직하게는 트랜스레이션 후에 유비퀴틴화(ubiquitination), 포스포릴화 (phosphorylation), 아실화 (fatty acylation) 예컨데, 팔미토일레이션 (palmitoylation) 또는미리스토일레이션(myristoylation), 또는 파네실레이션 (farnesylation)등을 포함하는 번역 후 변형 (post-translation modification)에 의해 변형되며, 상기 아실화에는 예를 들어, Lck 단백질의 아미노산 서열의 일부 (Met-Gly-Cys-Val-Cys-Ser-Ser-Asn-Pro-Glu-Asp-Asp-Trp-Met-Glu-Asn)가 이용될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 융합단백질을 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 경로를 통해, 생체 내외에서 도입하고자 하는 세포와 접촉시키는 단계를 포함하여 생리기능조절물질을 진핵세포 또는 원핵세포의 세포질, 세포소기관 또는 핵 내로 전달되는 경우, 이들의 구조 및 기능, 안정성을 증가시키기 위하여 클로로퀸 (chloroquine), 모넨신(monensin), 아만타딘 (amantadine) 및 메틸아민 (methylamine)으로 구성된 군으로부터 선택된, 라이소조모트로픽 (lysosomotrophic) 제제를 가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 세포 내 물질전달 펩타이드는 매우 작은 크기의 펩타이드이므로 혹시 발생할 수 있는 활성물질에 대한 생물학적 간섭을 최소화할 수 있다.
실시예 1: 물질전달 펩타이드
Mph-1
-BTM을 포함하는 발현벡터 제조
마우스 전사인자인 Mph-1 (GeneBank Code: U63386)의 N-말단으로부터 858번째 아미노산인 타이로신으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌까지의 펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 리포터로서 사용될 β -갈락토시다제를 코딩하는 염기서열을 결합시키기 위하여, Mph-1의 N-말단으로부터 858번째 아미노산인 타이로신으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌까지의 서열과, 클로닝을 위한 제한효소BamHI에 해당하는 서열번호: 2의 프라이머, 및 β -갈락토시다제 3' 말단에 해당하는 서열과 클로닝을 위한 제한효소 Bgl II에 해당하는 서열번호: 3의 프라이머를 합성하고, β-갈락토시다제 단백질의 전체 유전자가 포함되어 있는 pIND/lacZ 벡터 (입수처: invitrogen사)를 주형으로 하여 pfu turbo DNA 폴리머라아제 (Stratagene, cat.# 600252-51)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR에서 수득한 반응생성물을 제한효소 BamHI과BglII 절단한 후, 퀴아퀵(Quiaquick) PCR 정제키트 (QIAGEN, cat.# 28104)를 사용하여 정제한 다음, 겔추출 방법으로 정제한 pTrcHis B (입수처: Invitrogen, Cat.No. V360-20B)의 BglII 위치에 클로닝하여 제조합 발현벡터를 제조하고 이를 p Mph-1-β -gal이라 명명하었다. 도 1A는 본 발명의 발현벡터 p Mph-1-β -gal의 구조를 나타내고, 발현벡터 p Mph-1-β -gal를 제한효소 Xba I과 HindIII로 절단한 후 1% 아가로즈 겔에서 전기영동하고 에티디움 브로마이드로 염색하여 도 1B에 나타내었다. 여기서 제 2열은 본 발명의 발현 벡터 p Mph-1-β -gal을 나타내고, 제 1열은 표준 크기의 DNA를 나타낸다.
실시예 2 : 대장균 형질전환체의 제조 및 융합단백질의 발현 및 정제
실시예 1에서 제조된 발현벡터 p Mph-1-β -gal를 사용하여 대장균 DH5α (ATCC No. 53863)를 열충격 형질전환방법 (heat shock transformation)으로 형질전환 시킨 다음, 형질전환된 대장균을 100㎖의 LB 배지에 2㎖의 양으로 접종하고 12시간 동안 37℃에서 교반하면서 전 배양하였다. 다음, 이를 다시 각각 1000㎖의 LB 배지 (카세인의 팬크리아틱 다이제스트 10g, 이스트 익스트랙트 5g, 소디움 클로라이드 10g) 에 접종하고 37℃에서 4시간 동안 배양한 후, 1mM 농도의 IPTG (이소프로필 β -D-티오갈락토피라노사이드, GibcoBRL cat.# 15529-019)를 첨가하여 lac오페론의 발현을 유도하고 8시간 동안 배양하여 융합단백질의 발현을 유도하였다. 상기 배양액을 4℃에서 6,000rpm으로 20분간 원심분리하여 펠렛만 남기고 상등액을 제거한 후, 1mg/㎖의 리소자임 (Sigma, cat.# L-7651)이 포함된 10㎖의 완충용액 1 (50mM NaH2P04, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH 8.0)로 펠렛을 풀어준 다음, 얼음에서 30분간 방치한 후, 초음파 분쇄기 (Heat systems. ultrasonic processor XL)를 사용하여 300W의 세기로 10초간 초음파를 주입하고 10초간 냉각하는 과정을 반복하여 누적 초음파 주입시간이 3분이 되게 하였다. 용출액을 4℃에서 12,000rpm으의 20분간 원심분리 하여 대장균의 파쇄물을 제거하고 순수한 용출액만을 분리하였다. 분리된 용출액에 2.5㎖의 50% Ni2+-NTA 아가로스 슬러리 (Qiagen, cat# 30230)를 넣고 4℃에서 200rpm으로 1시간 동안 교반하여 융합단백질과 Ni2+-NTA 아가로즈를 결합시키고, 이 혼합액을 크로마토그래피용 0.8×4 cm 칼럼 (BioRad, cat.# 731-1550)에 넣어 흘려주었다. 4㎖의 완충용액 2 (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH 8.0)를 사용하여 두 차례 세척을 한 후, 0.5㎖의 완충용액 3(50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH 8.0)으로 네 차례에 나누어 융합단백질을 분획하고, 분리정제된 Mph-1-β -gal 융합단백질을 SDS-PAGE 실시한 후 코우마쉬 블루 염색법으로 확인하여 도 2에 나타내었다. 도 2에서, 제 1열은 표준분자량 단백질이고, 제 2열은 융합단백질 Mph-1-β -gal이다.
실시예 3: 융합단백질의 세포 내 전달
10% FBS (Fetal Bovine Serum) DMEM에 배양한 HUVEC (ATCC:CRL-1730), HeLa(ATCC:CCL-2), 293 (ATCC:CRL-1573)는 Lab-tek II chamber slide에, 10% FBS RPMI 에 배양한 주르캐트 세포 (ATCC:CRL-10915)를 폴리-L-라이신 코팅된 슬라이드에 각각 2X105씩 분주하고 상기 방법으로 정제된 Mph-1-β -galactosidase 단백질을 0.5μ M 농도로 37℃에서 30분간 5% CO2인큐베이터에서 처리한 후 상등액을 제거했다. 얼음-냉각 PBS로 4회 세척한 후 2% 포름알데히드 용액으로 10분간 고정시켰다. 고정액을 제거한 후 다시 얼음-냉각 PBS로 4회 세척한 후 β -갈락토시다아제 염색 용액 (Ro che. Co.)을 700 μ 1 첨가한 후 37℃에서 45분간 5% CO2인큐베이터에서 반응시킨 후 다시 상등액을 제거하고 얼음-냉각 PBS로 4회 세척했다. 이후 70% 글리세롤로 마운팅(mounting)을 실시한 후 현미경으로 관찰하여 사진 촬영하고 그 결과를 도 3A에 나타내었다. 그 결과 Mph-1와 융합결합된 β-gal는 효과적으로 상기 네가지 세포 내로 매우 효율적으로 전달되었으나, Mph-1와 결합되지 않은 β-gal 단백질을 전혀 세포 내로 전달이 되지 않았다. 또한 이같은 Mph-1-β-gal의 세포 내 전달이 수용체-매개 엔도사이토시스에 의한 것인 지를 구분하기 위하여 37℃ 및 4℃에서 융합단백질이 세포 내로 효과적으로 전달되는 지를 조사하였다.
10% FBS (Fetal Bovine Serum) RPMI 배지에 배양한 3X106의 주르캐트 세포를 얼음-냉각 PBS로 2회 세척한 후 10% FBS (Fetal Bovine Serum) RPMI 배지로 현탁시키고 60mm 디쉬에 분주한 다음, 1mg/ml Mph-1-β -갈락토시다제 단백질을 처리한 후 30분간 4℃ 및 37℃에서 5% CO2인큐베이터에서 반응시켰다. 이후 처리된 주르캐트 세포를 얼음-냉각 PBS로 2회 세척한 후 1% NP-40 용해 완충액(1% NP-40 150mM NaCl, 10mM Tris-HCl, 400μM EDTA, 1mM Na3VO4, 1mM NaF, 10μg 아프로티닌, 10μg 루펩틴 (leupeptin))로 용해시켰다. 4℃에서 20분간 원심분리 후 BCA 단백질 정량 키트 (PIERCE)로 정량하여 이중 20 μg의 샘플을 β -갈락토시다아제 분석 완충액 (100×Mg2+용액 3μl, ONPG (o-니트로페닐 β-D-갈락토피라노시드) 용액 66 μl 및 0.1M 인산나트륨 (sodium phosphate))와 함께 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 1M Na2CO3를 가하여 반응을 종결시켰다. 420nm에서 마이크로플레이트 리더 (Molecular devices)를 이용하여 흡광도를 측정한 결과를 도 3B에 나타내었다. 이 결과는 3회 실험한 것의 표준격차를 포함하여 나타낸 것이다. 이 결과에서 Mph-1-β -gal 융합단백질은 37℃에서 뿐만 아니라 4℃에서도 매우 효과적으로 전달되었으며, 이는 본 발명의 물질전달 펩타이드에 의한 목적단백질의 세포 내로의 전달이 수용체-매개 엔도사이토시스 (receptor-mediated endocytosis) 또는 파고사이토시스 (phagocytosis)에 의한 것이 아님을 명백히 하였다.
실시예 4: Tat과
Mph-1
의 세포 내 전달 효과의 비교
기존의 PTD인 Tat과 본 발명의 Mph-1에 의한 단백질의 세포 내 전달효과를 비교하기 위하여 pTat-β-gal DNA구조를 제작하였다. HIV의 Tat 단백질의 N-말단으로부터 47번째 아미노산인 타이로신으로부터 57번째 아미노산인 아르기닌까지의 펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 리포터로서 사용될 β -갈락토시다제를 코딩하는 염기서열을 결합시키기 위하여, Tat의 N-말단으로부터 47번째 아미노산인 타이로신으로부터 57번째 아미노산인 아르기닌까지의 염기서열과 클로닝을 위한 제한효소BamHI에 해당하는 서열번호: 4를 합성하고, β -갈락토시다제의 3' 말단에 해당하는 염기서열과 Bgl II 제한효소에 해당하는 서열번호: 3의 프라이머를 이용하여 β -갈락토시다제 단백질의 전체 유전자가 포함되어있는 pIND/lacZ 벡터 (입수처 : invitrogen사)를 주형으로 하여 pfu turbo DNA 폴리머라아제 (Stratagene, cat.# 600252-51)를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR에서 수득한 반응생성물을 제한효소 BamHI과BglII으로 절단한 후, 퀴아퀵 (Quiaquick) PCR 정제키트 (QIAGEN, cat.# 28104)를 사용하여 정제한 다음, 겔 추출방법으로 정제한 플라스미드 pTrcHis B (입수처: Invitrogen, Cat. No V360-20B)의 BglII 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하고 이를 pTat-β-gal이라 명명하였다. 도4A는 그 구조를 나타낸 도면이다. 실시예 2에 제시된 방법에 의하여 Tat-β -gal 융합단백질을 분리 정제한 후, 실시예 3에 제시된 방법에 의하여 0.1 ug/ml 과 0.5 ug/ml의 두가지 다른 농도에서 주르캐트 T세포 내에 Tat-β-gal 과 Mph-1-β-gal의 전달효과를 비교하였다. 도 4B에 나타난 바와 같이 위의 두가지 다른 농도에서 Mph-1가 Tat보다 훨씬 더 효과적으로 β -gal을 세포 내로 전달되었으며, 특히 0.1 ug/ml의 낮은 농도에서 전달효과의 차이가 뚜렷하였다.
실시예 5: 생체 내에서
Mph-1
에 의한 목적단백질의 세포 내 전달
Mph-1에 의한 목적단백질의 세포 내 전달효과를 생체 내에서 확인하기 위하여 실시예 2에서 분리 정제된 Mph-1-β -gal 융합단백질을 6주령의 C57BL/6 마우스에게 750 μg의 Mph-1-β-갈락토시다아제 단백질을 PBS와 혼합하여 500μl의 부피로 복강 내로 1회/1일로 3일간 주입하고 대조 마우스에는 동량의 PBS만을 복강으로 주사하였다. 최종 복강 주사 후 4시간 경과하여 마우스를 해부하고 각 장기를 2mM MgCl2를 포함하는 PBS로 세척 한 뒤 얼음-냉각 5% 포르말린에서 고정시켰다. 고정 후 PBS로 5회 세척하고 각 장기를 β-gal 염색 용액 (Roche. Co.)에 담가 12시간 후 색의 변화를 관찰하였다. 도 5A에 제시된 바와 같이, 신장, 뇌, 콩팥, 간, 허파 및 심장에 효과적으로 β-gal 단백질이 전달되었음을 나타내는 것으로 보아, Mph-1 BTM에 의하여 생체내에서도 목적단백질이 효과적으로 각 장기내로 전달됨을 확인하였다.
한편, Mph-1 BTM에 의하여 각 장기로 전달된 β-gal 단백질이 장기의 표면이 아니라 장기를 구성하고 있는 세포 내로 전달되었음을 확인하기 위해, 마우스 전사인자 Mph-1 (유전자은행 코드: U63386)의 N-말단으로부터 858번째 아미노산인 타이로신으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌까지의 펩타이드를 코딩하는 염기서열 및 리포터로서 사용될 eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein)를 코딩하는 염기서열을 결합시키기 위하여, Mph-1의 N-말단으로부터 858번째 아미노산인 타이로신으로부터 868번째 아미노산인 아르기닌과 클로닝을 위한 제한효소BamHI에 해당하는 서열번호: 2의 프라이머, 및 eGFP의 3' 말단과 클로닝을 하기 위한 제한효소 Bgl II에 해당하는 서열번호: 5의 프라이머를 합성하고 eGFP 단백질의 전체 유전자가 포함된 pEGFP-MI벡터(입수처: invitrogen사)를 주형으로 하여 pfu turbo DNA 폴리머라아제 (Stratagene, cat.# 600252-51)를 사용하여 PCR을 수행하였다.
PCR에서 수득한 반응생성물을 제한효소 BamH I과BglII으로 절단한 후, 퀴아퀵(Quiaquick) PCR 정제키트 (QIAGEN, cat.# 28104)를 사용하여 정제한 다음, 겔 추출방법으로 정제한 플라스미드 pTrcHis B (입수처: invitrogen, Cat. No V360-20B)의 Bgl II 위치에 클로닝하여 재조합 발현벡터를 제조하고 이를 p Mph-1-eGFP 이라 명명하였다. 상기 실시예 2에서와 같이 DH5a에서 발현된 Mph-1-eGFP 단백질을 분리 정제한 후, 생체 내로 복강주사 한 다음 4시간 경과 후 비장을 제거하였다. 제거된 비장을 분쇄한 다음, 항체형성세포(splenocyle)를 분리하여 이들 세포 내로 전달된 eGFP를 FACS분석을 통하여 조사하고 그 결과를 도 5B에 나타내었다. 도 5B에 나타낸 바와 같이, Mph-1 BTM에 의하여 비장에 전달된 eGFP가 비장을 구성하고 있는 항체형성세포에도 효과적으로 전달되었다.
생체 내에서 Mph-1 BTM에 의해 혈액 내로 전달되어 체내의 각 장기로 전달되는지를 다양한 투여경로를 통하여 조사하기 위하여, 분리정제된 Mph-1-β -gal 융합단백질을, 6주령의 C57BL/6 마우스에 750 μg의 Mph-1-β-gal 단백질과 PBS을 혼합하여 500 μl의 부피로 복강주사, IV, 피부, 또는 비내 (nasal) 경로를 통하여 1회/1일로 3일간 주입하고 대조 마우스에는 같은 양의 PBS만을 복강으로 주사하였다. 융합단백질이 투여된 마우스로부터 혈액을 채취하여 T세포를 MACS와 안티-CD3 mAb를 이용하여 분리한 후, 상기 실시예 3에서와 같이 이들 T세포에 전달된 β-갈락토시다아제 효소의 활성을 측정 한 결과를 도 5C에 나타내었다. 이 결과에서 생체 내의 복강, IV, 피부 및 비내 등의 다양한 투여경로를 통하여서도 물질전달 모티프인 Mph-1 BTM에 의하여 혈액내의 T세포 내로 효과적으로 융합단백질이 전달됨을 확인하였다.
실시예 6: Mph-1와 목적단백질의 융합단백질의 세포 특이적 전달
실시예 2에서 제조된 목적단백질 Mph-1 -β-gal을 특정 세포에만 선택적으로 전달하기 위하여, 전달하고자 하는 세포, 조직 또는 장기에 특이적으로 존재하는 리간드 또는 수용체를 이용하였다. 그 예로써 목적단백질을 T세포에 특이적으로 전달하기 위하여 Mph-1 -β-gal의 3' 부분에 세포의 세포외 기질(extracellular matrix)에 존재하면서 세포막에 부착되어있는 매트릭스메탈로 프로테아제 (MatrixMetalloprotease, MMP)의 절단부위 아미노산서열을 넣고 다시 그 3' 뒤쪽에 T세포에 특이적으로 존재하는 수용체인 CD28의 리간드인 B7.1을 클로닝하여 삽입한 발현벡터 p Mph-1 -β-gal-B7.1을 제작하였다. 제한효소 BamH 1 과 B7.1의 N 말단 서열을 포함하는 서열번호: 6의 프라이머와 제한효소 Bgl II와 B7.1의 C 말단 서열을 포함하는 서열번호: 7의 프라이머를 이용하여, 본 연구실에서 제작한 사람 일차(primary) T cell의 cDNA 혼합물을 주형으로 하여 상기 실시예 1에서와 같이 PCR과 분자 클로닝 방법을 이용하여 발현벡터 p Mph-1 -β -gal-B7.1를 제작하였으며, 도 6A는 발현벡터 p Mph-1 -β-gal-B7.1의 구조를 나타내는 도면이다. p Mph-1 -β-gal-B7.1 발현벡터를 사용하여 상기 실시예 2에서와 같이 박테리아 DH5a를 형질전환 시킨 다음, 이들 박테리아를 배양하여 Mph-1 -β-gal-B7.1 융합단백질을 분리정제하였다. 이 융합 단백질을 실험용 마우스에 I.P. 방법으로 주사한 후 4시간후에 혈액으로부터 T세포를 분리하여 β-gal의 활성을 조사하였다. 도 6B에 제시된 결과와 같이 T세포에서 높은 β-gal의 활성이 나타났으나, B세포에서는 거의 활성이 나타나지 않았다. 이 같은 결과는 융합단백질의 B7.1과 T세포의 CD28 또는 CTLA-4가 결합한 후 T세포 표면에 존재하고 있는 MMP에 의하여 융합단백질이 절단된 후, Mph-1 -β-gal 융합단백질이 T 세포 내로 선택적으로 전달되었음을 제시한다.
실시예 7:
Mph-1
BTM에 의한 DNA (CD8-ξ)의 세포 내 전달
(단계 1)Mph-1와 Gal4가 융합된 유전자를 포함하는 발현벡터 제조
실시예 1에서 제작된 p Mph-1 -β-gal 벡터를 제한효소XbaI 및BglII로 처리하여 β-갈락토시다제 유전자를 떼어내고, DNA 결합 단백질인 GAL4의 N 말단의 서열과 XbaI 제한효소를 가진 서열번호: 8의 프라이머와 GAL4의 C 말단 서열과 Bgl II 제한효소를 가진 서열번호: 9의 프라이머를 이용하여 발현벡터 pcDNAGal4를 주형으로 하여 실시예 1에서와 같이 통상적인 PCR과 분자 클로닝 방법으로 p Mph-1 -Gal4 플라스미드를 제작하였다. 도 7은 발현벡터 p Mph-1 -Gal4의 구조를 나타낸다.
(단계 2) DNA 결합단백질이 Gal4가 선택적으로 결합하는 DNA 염기서열 (GBS)을
포함하는 발현벡터 pCD8-z-5XGBS의 제조
CD8-ξ가 pcDNA3 발현벡터 (입수처: invtrogen사)의XbaI 및BamHI 제한효소 인식부위에 삽입된 pcDNA3-CD8-z의 Stu I 제한효소 인식부위에, Gal4가 선택적으로 결합하는 염기서열인 GBS (Gal4 결합서열)가 5번 반복되도록 클로닝한 pCD8-z-5XGBS를 제작하여, 이 발현벡터가 상기 단계 1애서의 Mph-1-Gal4와의 결합을 효율적으로 하였다.
즉, GBS에 해당하는 염기서열을 프라이머로 합성하여 이들을 하이브리다이징시킨 후, 키나아제로 5' 오버헹잉 (overhanging)을 인산화시킨 후 pCD8-ξ의 3'에 있는 StuI에 클로닝시켰다. 도 8은 발현벡터 PCD8-ξ-5XGBS의 구조를 나타낸 것이며 , 서열번호: 10은 GBS의 염기서열을 나타낸다.
(단계 3)Mph-1에 의한 CD8-ξ DNA의 세포 내 전달확인
상기 단계 1에서 제조된 발현벡터 p Mph-1 -Gal4를 이용하여 실시예 2와 같은 방법으로 발현 및 정제된 Mph-1 -Gal4 융합단백질에 상기 단계 2에서 제조된 pCD8-ξ-5XGBS DNA를 상온에서 결합시켜 Mph-1 -Gal4 융합단백질의 Gal4와 pCD8-ξ-5XGBS이 갖는 5개의 Gal4 결합부위인 GBS가 상호결합되도록 하였다.
연결된 결합체를 PBS에서 섞은 후 107프라이머리 T세포를 접종하여 반응시킨 후, 37℃에서 48시간 동안 배양하여 세포 내로 전달된 DNA 구조에 의한 CD8-ξ 융합체의 과다 발현을 유도하였다. 세포 표면에 CD8-ξ 융합단백질의 과다발현 여부를 확인하기 위하여 CD8 분자에 대한 단클론항체인 OKT8 (입수처: ATCC No CRL-8014)를 사용하여 FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter) 분석법(참고문헌: Current Protocol for Immunology)으로 발현을 조사하여 그 결과를 도 9A에 나타내었다. 도 9A에 제시된 바와 같이, Mph-1 물질전달 펩타이드가 융합된 CD8-ξ 단백질이 세포 내에서 전달되었음을 확인 할 수 있었다. 음성 대조구로서, pCD8-ξ-5XGBS를 포함하지 않는 Mph-1 -Gal4 융합단백질 또는 pCD8-ξ-5XGBS 자체만 반응시킨 T세포에서 CD8-ξ키메라 분자 (chimeric molecule)의 발현을 FACS로 분석하였다. 이 결과에서 보는 바와 같이 Mph-1 BTM과 융합된 DNA 결합 단백질 (binding protein)은 세포 내로 전달하고자 하는 DNA 구조에 인위적으로 삽입시킨 DNA 결합 단백질 결합서열과 상호결합을 이루어, Mph-1 BTM에 의하여 목적DNA구조를 세포 내로 효율적으로 전달하여 발현시킬 수 있음을 알 수 있다.
이와 같은 Mph-1 BTM에 의한 DNA의 세포 내로의 전달이 생체 내에서도 가능한지를 조사하기 위하여 상온에서 결합이 유도된 Mph-1 -Gal4 융합단백질과 pCD8-ξ-5XGBS와의 결합체를 실시예 5에서와 같이 복강 내로 주사 한 다음, 48시간이 지난 후, 혈액 내의 T세포를 T세포에 선택적으로 결합하는 안티-CD2 mAb와 MACS를 이용하여 분리하고 비장의 항체형성세포를 분리한 다음 이들 세포의 표면에 발현하고 있는 CD8-ξ키메라단백질의 발현정도를 FACS를 이용하여 조사하여 그 결과를 도 9B에 나타내었다. 그 결과, Mph-1 BTM과 Gal4에 의하여 생체 내로 전달된 발현벡터 pCD8-ξ-5XGBS는 혈액 내의 T세포 뿐만 아니라 비장의 항체형성세포 내로 효율적으로 전달되었음을 확인 할 수 있었다.
실시예 8: pCD8-ξDNA의 T세포 특이적 전달 및 선택적 발현
(단계 1)Mph-1, Gal4과 B7.1이 융합된 유전자를 포함한 발현벡터의 제조
물질전달 펩타이드 Mph-1 을 이용하여 pCD8-ξ DNA를 T세포에 특이적으로 전달하기 위하여 실시예 7에서 제조된 발현벡터 p Mph-1 -Gal4의 3'부분에 실시예6에서와 같이 T세포에 선택적으로 존재하는 매트릭스메탈로프로테아제 절단 부위를 클로닝 한 후, B7.1의 세포외 부분을 서열번호: 6 및 7의 프라이머를 이용하여 본 연구실에서 제작한 T세포 cDNA 혼합물을 주형으로 하여, 상기 실시예 1와 같이 통상적인 PCR과 분자 클로닝 방법을 이용 클로닝하여 삽입한 pMph-1-Gal4-B7.1 DNA 구조를 제작하였으며, 도 10A는 그 구조를 나타낸다.
(단계 2) T세포에 특이적인 프로모터 Lck, pLCD8-ξ및 5개의 GBS를
포함하는 발현벡터의 제조
실시예 7의 단계 2에서 제작된 pLCD8-ξ-5XGBS의 프로모터인 CMV 프로모터대신 T세포에 특이적으로 유전자를 발현하게 하는 lck 프로모터를 HindIII 제한효소위치를 이용하여 통상의 분자 클로닝 방법으로 치환하였다. 도 10B는 그 발현벡터인 pLCD8-ξ-5XGBS의 구조를 나타내는 도면이다.
(단계 3)Mph-1에 의한 pCD8-ξ -5XGBS DNA의 T세포 특이적인 전달
상기 단계 1에서 제조된 발현벡터 p Mph-1 -Gal4-B7.1 DNA를 이용하여 상기 실시예 7의 단계 2에서 제작된 발현벡터 pCD8-ξ-5XGBS를 생체 내에서 T세포에 선택적으로 전달시키기 위하여, 실시예 7와 같은 방법으로 발현 및 정제된 Mph-1 -Gal4-B7.1 융합단백질과 발현벡터 pCD8-ξ-5XGBS의 결합체를 상온에서 유도하였다. 연결된 결합체를 PBS에서 섞은 후 복강 내로 주사한 다음 48시간이 지난 후, 혈액내의 T세포와 B세포를 각각 안티-CD2 mAb와 안티-B220 mAb와 MACS를 이용하여 분리한 다음 이들 세포에서 발현하고 있는 표면 키메라 분자인 CD8-ξ의 발현 정도를 안티-CD8 mAb인 OKT8과 FACS를 이용하여 분석한 결과를 도 10C에 나타내었다. 이 결과에서 MPh-1 와 Gal4를 이용하여 생체 내로 전달된 발현벡터 pCD8-ξ-5XGBS는융합단백질 Mph-1 -Gal4-B7.1의 B7.1의 세포외 부분과 T세포의 표면에 존재하는 CD28 또는 CTLA-4와 결합에 의하여 T세포 주위로 이동한 후, T세포의 표면에 선택적으로 존재하는 MMP에 의하여 절단된 다음 Mph-1 -Gal4와 pCD8-ξ-5XGBS의 결합체가 주위에 많이 존재하는 T세포 내로 전달되어 발현하고 있음을 나타내었다. 그러나 B 세포에서는 발현벡터가 전달되지 않아 CD8-z 키메라 분자가 거의 발현하지 않았다.
(단계 4)Mph-1에 의한 pLCD8-ξ-5XGBS DNA의 T세포 선택적인 발현
상기 실시예 7의 단계 2에서 제조된 Mph-1 -Gal4 융합단백질을 이동하여 상기 단계 2에서 제작된 발현벡터 pLCD8-ξ-5XGBS를 T세포에 특이적으로 발현시키기 위하여, 상기 단계 3에서와 같이 실온에서 결합 유도된 Mph-1 -Gal4와 pLCD8-ξ-5XGBS의 결합체를 생체 내로 전달한 다음, 48시간 지난 후 혈액 내의 B 세포와 T세포를 분리하여 이들 세포의 표면에 발현하는 표면 키메라 단백질인 CD-ξ의 발현정도를 OKT8과 FACS를 이용하여 분석한 결과를 도 10D에 나타내었다. 이 결과에서 T세포에 선택적으로 발현을 유도하는 Lck 프로모터에 의하여 생체 내로 전달된 발현벡터 pLCD8-ξ-5XGBS는 T세포에 만 선택적으로 발현 하고 있음을 알 수 있다.
실시예 9:
Mph-1
과 T 세포 선택적으로 작용하는 면역억제제인 TMC와의
융합구조의 세포내 전달
생체 내의 다양한 생리작용을 조절할 수 있는 화학화합물을 Mph-1 BTM에 의하여 생체 내로 효과적으로 전달하기 위해, Mph-1 와 B7.1의 세포외 부분과의 융합단백질을 제작하기 위하여, BamHI 제한효소, Mph-1 의 BTM 및 B7의 N 말단 염기서열에 해당하는 서열번호: 11의 프라이머, 제한효소 BglII의 서열과 B7의 C 말단 염기서열에 해당하는 서열번호: 12의 프라이머를 사용하고 본 연구실에서 제작한 마우스 T세포 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 발현벡터 p Mph-1 -B7.1을 제작하였다. Mph-1 와 B7.1의 사이에 T세포에 선택적으로 발현하는 MMP에 의한 절단 부위를 삽입하였다. DH5a에서 발현하여 분리정제된 융합단백질 Mph-1 -B7.1을 도 11A에 나타낸 pH 감수성 화학적 링커를 이용하여 TMC와 화학적으로 연결된 구조를 제작하였다. TMC- Mph-1 -B7.1(0.1 ug/ml) 결합구조를 주르캐트 T세포에 처리한 다음 5시간 후, TMC에 의하여 유도된 주르캐트 T세포의 세포유도사를 PI 염색 [참고문헌: I. Schmidet. alCytometry 13:204-208 (1992)]과 FACS를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 11B에 나타내었다. 이로부터 Mph-1 -B7 융합단백질에 의하여 주르캐트 T세포 내부로 전달된 TMC는 효과적으로 세포유도사를 일으킴을 확인하였다.
주르캐트 T세포에서 효과적으로 세포유도사를 일으키는 TMC- Mph-1 -2-B7.1이 생체 내에서도 T세포에 선택적으로 전달되어 세포유도사를 유도 함으로써. 면역억제효과를 나타낼 수 있는 지를 분석하기 위하여, 이종심장 타가이식래트 (rat heterocardiac allograft) 장기이식거부반응의 동물모델을 이용하여 [참고문헌: Jae-Hyuck Sim et al, PNAS vol. 99, no. 16, 10617-10622, 2002)면역억제효과를조사하고 그 결과를 하기 표 1에 나타냈다.
장기이식거부반응 동물 모델에서, 종래의 면역억제제인 사이클로스포린 A (CsA)를 복강으로 투여하였을 경우 이식된 장기는 100일 이상 작동한 반면에, 상기 작제하 TMC- Mph-1 -B7.1 융합구조를 0.05ug/ml의 농도로 복강으로 투여하였을 경우 또는 0.03ug/ml의 농도로 피부를 통하여 투여하였을 경우 모두 160일 이상 작동하므로써 효과적인 생체 내에서의 면역억제효과를 제시하였다. 그러나 크레모포 (cremophor)만을 투여하였을 경우 이식된 심장은 단지 9 내지 10일 정도 밖에 작동하지 못하였다.
실시예 10:
Mph-1
-zA1A2 및
Mph-1
-CTLA-4 단백질약물에 의한
생체 내에서의 면역억제효과
상기 모든 실시예에서 확인된 바와 같이, Mph-1 BTM은 생체 내의 생리현상들을 조절하는 생리조절단백질, DNA 및/또는 RNA 및 화학적 약물을 공유 또는 비공유결합에 의하여 결합시켜 생체 내부 및 외부에서 효과적으로 각종 장기 및 장기 내의 세포 내로 전달시킬 수 있음이 밝혀 졌다. 따라서 Mph-1 BTM을 이용하여 생체내의 면역반응을 조절할 수 있는 세포 내 신호전달조절단백질의 야생형 (wild type) 또는 변형된 형태를 세포 내에 전달함으로써, 생체 내의 면역반응을 조절할 수 있는 새로운 단백질약물의 제작을 시도 하였다.
T세포에 의한 면역반응을 저해하여 면역억제효과를 나타낼 수 있는 목적단백질로서, 생체 내로 들어온 항원의 일부 펩타이드와 MHC 분자의 복합구조를 인식하여 세포 내로 활성화 신호를 전달하는데 가장 중요한 역할을 하는 TcR 복합체의 신호전달 사슬 (chain)인 z 사슬의 세포질 도메인(cytoplasmic domain)을 선택하였다. 본 발명자들은 기초 연구를 통하여 TcRz 사슬의 세포질 도메인 중 제 1 ITAM에 존재하는 타이로신 아미노산을 페닐알라닌으로 변화시킨 구조인 zA1A2의 형태를 세포 내에서 과다 발현하였을 경우 효과적으로 T세포의 활성화 신호를 차단하는 것으로 밝혀내었다 [참고문헌: Wook-Jin Chae et al. JBC 2003]. 이같은 기초연구결과를 이용하여 Mph-1 BTM과 TcR z 사슬의 zA1A2 형태를 융합시킨 발현벡터를 제작하여 그 구조를 도 12의 (a)에 나타내었다. 이 발현벡터를 제작하기 위하여 Xba I 제한효소, Mph-1 BTM의 서열, TcR z 사슬의 세포질 도메인의 N 말단에 해당하는 서열을 포함하는 서열번호: 13의 5' 프라이머를 제작하였고, z사슬의 C 말단에 해당하는 서열과 Hind III를 포함하는 서열인 서열번호: 12의 3' 프라이머를 제작하여, 본 연구실에서 제작한 pcDNA3-zA1A2 발현벡터[참고문헌: Wook-Jin Chae et al. JBC 2003 submitted]를 주형으로 하여 통상적인 PCR과 분자 클로닝 방법을 이용하여 단백질을 가용성 형태로 효과적으로 발현할 수 있는 발현벡터인 pGELysRS의 ATG-LysRS의 5' 에 존재하는 또 한개의 Xba I 제한효소를 제거한 pGELysRS(2) 발현벡터의 Xba I과 Hind III 위치에 클로닝하여 p Mph-1 -2-zA1A2 발현벡터를 제작하였다.
Mph-1 BTM을 이용하여 생체 내의 면역반응을 조절할 수 있는 다른 목적단백질을 제작하기 위해 T세포의 활성화 과정에서 음성 조절자 (negative regulator) 역할을 하는 CTLA-4 단백질의 세포질 도메인을 Mph-1 BTM과의 융합파트너로 선택하였다. CTLA-4는 활성화된 T세포의 표면에 존재하는 세포막 단백질로서, 항원제시세포 (Antigen Presenting Cell)의 표면에 존재하는 B7 군의 단백질과 결합하여 T세포의 활성을 저해하는 역할을 하는 단백질로 알려져 있다. Mph-1 BTM과 CTLA-4의 세포질 도메인과의 융합단백질을 제작하기 위하여 발현벡터인 p Mph-1 -CTLA-4를 제작하였으며, 그 구조는 도 12의 (b)에 나타내었다. 상기 pMph-1-zA1A2 발현벡터의 제작에서와 같이 XbaI 제한효소, Mph-1 BTM, CTLA-4의 N 말단 염기서열에 해당하는 서열번호: 15의 5' 프라이머와 Hind III 제한효소 서열 및 CTL4-4의 C 말단 서열을 포함하는 서열번호: 13의 3' 프라이머를 이용하여 본 연구실에서 제작한 일차 T세포의 cDNA 혼합물을 주형으로 하여 통상적인 PCR과 분자 클로닝 방법을 이용하여 단백질을 가용성 형태로 효과적으로 발현할 수 있는 발현벡터인 pGELysRS의 ATG-LysRS의 5' 에 존재하는 또 한개의 Xba I 제한효소를 없앤 pGELysRS(2) 발현벡터의 XbaI과 HindIII 위치에 클로닝하여 p Mph-1 -CTLA-4 발현벡터를 완성하였다.
제작된 p Mph-1 -zA1A2 와 p Mph-1 -CTLA-4 발현벡터를 사용하여 대장균 BL21(invitrogen, cat.no. : c7010-03) 을 열충격 형질전환 방법 (Heat shock transformation)으로 형질 변환 시킨 다음, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로 융합단백질을 발현 및 분리정제하여 SDS-PAGE를 실시한 후 코우마쉬 블루 염색법으로확인하여 도 13의 (a)와 (b)에 각각 나타내었다.
분리 정제된 Mph-1 -zA1A2와 Mph-1 -CTLA-4 융합단백질들의 생체 내에서의 면역억제효과를 실험하기 위해 상기 실시예 9에서와 같이 이종심장 타가이식 래트라는 장기이식거부반응 동물모델을 이용하여 [참고문헌: Jae-Hyuck Sim et al. PNAS vol. 9, no. 16, 10617-10622, 2002) 면역억제효과를 조사하였다.
그 결과는 하기 표 2와 같다.
장기이식거부반응의 동물모델에서 종래 면역억제제인 CsA를 복강으로 투여하였을 경우 이식된 장기는 100일 이상 작동하였고, 본 발명에서 제작된 Mph-1-zA1A2와 Mph-1 -CTLA-4 융합단백질들을 각각 0.05ug/ml 또는 0.04ug/ml의 농도로 복강 또는 피부으로 투여하였을 경우 모두 160일 이상 작동하여 효과적인 생체내에서의 면역억제효과를 나타내는 것으로 분석되었다.
그러나, 크레모포만을 투여하한 경우 이식된 심장은 단지 9-10일 정도 밖에 작동하지 못하였다. 이 같은 결과는 Mph-1 BTM에 의하여 TcR z 사슬의 변형된 형태인 zA1A2와 CTLA-4가 생체 내의 T세포 내로 효과적으로 전달되어 T세포의 활성화를억제함으로써 면역억제효과가 나타남을 제시했다.
실시예 11:
Mph-1
BTM에 의한 식물 세포 칼루스(calus) 내로의
거대분자의 전달
Mph-1 BTM에 의하여 동물세포가 아닌 다른 세포 내로 목적단백질의 효과적인 전달을 조사하기 위하여, 배양된 식물 세포 칼루스 (calus)에 10uM 농도의 Mph-1 -β-gal 융합단백질을 넣은 다음 1시간 경과 후 식물 칼루스 내로의 β-갈락토시다아제의 효과적인 전달을 현미경 (confocal microscope)으로 분석하고, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 식물 칼루스의 배양은 담배 잎을 채취한 다음 옥신과 사이토카인을 포함하는 칼루스 유도 배지에서 배양한 후, 생성된 식물의 칼루스를 아가 (agar)를 포함하지 않은 MS배지에서 배양(suspension culture) 하여 준비하였다. 그 결과, Mph-1 BTM에 의하여 융합단백질을 넣은 후 15분이 지난 다음부터 식물 칼루스 내로 β-갈락토시다아제가 효과적으로 전달되었으며, 특히 화살표에 표시된 바와 같이 핵 내로도 효과적으로 전달되었음을 나타내었다.
실시예 12:
Mph-1
BTM에 의한 다양한 박테리아 내로의 거대분자의 전달
Mph-1 BTM에 의한 다양한 박테리아 세포 내로의 목적단백질의 효과적인 전달을 조사하기 위해, 배양된 박테리아 세포로서 살모넬라 티피미리움(Salmonella typhymirium), 리스테리아 모노사이토지네시스 (Listeria monocytogenesis), 스트렙토 코커스 아우레우스 (Streptococcus aureus), 및 결핵균에 1uM의 Mph-1-β-gal 융합단백질을 넣은 다음 1시간 경과 후 세포 내로 전달된 β-갈락토시다아제의 활성을 기질을 이용하여 측정하고 그 결과를 도 15에 나타내었다. 이로부터 Mph-1BTM을 이용하여 거대분자 β-갈락토시다아제가 효과적으로 다양한 박테리아 세포 내로 전달되었음을 확인하였다.
실시예 13:
Mph-1
BTM을 이용하여 자연상태의 구조와 기능을
가진 의약학적 용도의 단백질 생산
박테리아 세포에서 발현하여 분리정제한 Mph-1 BTM와 생체 내의 생리활성조절단백질과의 융합단백질을, 생체 내에서 생산된 생리활성조절단백질의 자연상태의 구조 및 기능을 가진 단백질로 변환시키기 위하여, 박테리아에서 생산되어 분리 정제한 이 융합단백질을 다시 CHO(Chinese hamster ovary) 세포 내로 전달한 다음 CHO 세포 내에서 자연상태의 구조와 기능을 나타내기 위한 완전한 단백질 폴딩이 이루어진 단백질을 재분리정제하여 이 두 융합단백질에 대해 생체 내의 생리현상조절능력의 차이를 조사하였다. 이 실험을 위하여 Mph-1 BTM과 사람 인슐린과의 융합단백질 제작을 위한 발현벡터인 p Mph-1 -인슐린을 제작하였다. Xba I의 염기서열, Mph-1 BTM 및 사람 인슐린의 N 말단에 해당되는 서열번호: 17의 5' 프라이머와 Hind 제한효소 서열 및 사람 인슐린의 C 말단 서열을 포함하는 서열번호: 18의 3' 프라이머를 제작하여 본 연구실에서 제작한 사람 췌장(pancease) beta 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 통상적인 PCR과 분자 클로닝 방법에 의하여 상기 실시예 10와 같이 단백질을 가용성 형태로 효과적으로 발현할 수 있는 발현벡터인 pGELysRS의 ATG-LysRS의 5' 에 존재하는 또 한개의 Xba I 제한효소를 없앤 pGELysRS(2) 발현벡터의 XbaI과 HindIII 위치에 클로닝하여 p Mph-1 -인슐린 발현벡터를 완성하여 도 16에 나타내었다. 제작된 p Mph-1 -인슐린을 사용하여 대장균BL21을 열충격 형질전환방법 (Heat shock transformation)으로 형질변환 시킨 다음, 상기 실시예 2에서와 같은 방법으로 융합단백질을 발현 및 분리정제하여 Mph-1 -인슐린 융합단백질을 제작하였다. 박테리아에서 발현되어 분리정제된 Mph-1 -인슐린 융합단백질 (1mg/ml)을 CHO 세포 내로 다시 전달시킨 후, 이들 CHO 세포 내에 존재하는 단백질 폴딩 기작을 이용하여 자연상태의 구조와 기능을 가질 것으로 생각되는 Mph-1 -인슐린 융합단백질을 재분리정제하여 이 융합단백질을 Mph-1 -인슐린-PR이라 명명하였다. 이들 2개의 융합단백질을 SDS-PAGE 실시한 후 코우마쉬 블루 염색법으로 확인하여 도 17A에 나타내었다. 이들 2개의 융합단백질들이 Mph-1 BTM에 의하여 주르캐트 T세포 내로 효과적으로 전달되는지를 조사하기 위하여, 상기 실시예 3에서와 같이 이들 융합단백질들과 Mph-1 BTM이 없는 재조합 인슐린으로 배양된 주르캐트 T세포를 처리한 후 인슐린 단백질의 세포 내 전달효과를 인슐린에 대한 mAb를 이용하여 세포 내 염색 (intracellular staining)으로 비교하고 그 결과를 도 17B에 나타내었다. 이 결과에서 보여지는 바와 같이, Mph-1 BTM을 가지고 있지 않은 재조합 인슐린의 경우 주르캐트 T세포 내로 거의 전달되지 않은 반면에, Mph-1 BTM과 연결된 두 개의 융합단백질 Mph-1 -인슐린, Mph-1 -인슐린-PR은 둘 모두 세포 내로 효과적으로 전달되었다.
실시예 14 :
Mph-1
와 연결된 인슐린 융합단백질에 의한
생체 내 혈당저하효과
상기 실시예 14에서 제작된 재조합 인슐린, Mph-1 -인슐린 및 Mph-1 -인슐린-PR의 생체 내에서의 혈당저하효과를 분석하기 인하여 인슐린 의존성 당뇨병의 동물모델인 STZ (Streptozotocin) 유도 당뇨마우스를 사용하였다. STZ (Sigma Chemical Co, St Louis, USA) (60 mg/kg)를 3일 동안 금식을 시킨 후, 정맥주사를 이용하여 투여 하였다. 폴리유리아 및 다른 당뇨병 증상과 함께 혈당이 20 mmol/L 또는 그 이상이 되는 경우를 인슐린 의존성 당뇨 마우스로 분류하였다. 모든 생체 내의 실험을 당뇨병이 유도된 후 2 주일이 지난 뒤 실시하였다. 상기 실시예 13의 재조합 인슐린, Mph-1-인슐린 및 Mph-1 -인슐린-PR를 복강주사를 통하여 1-10 mM의 농도로 상기 당뇨마우스에 투여한 후 혈액 내의 글루코즈의 농도를 조사하였다. 혈당의 분석은 마취 시킨 마우스로부터 0.2 ml 정도의 혈액을 채취하여 3분동안 13,000 rpm의 속도로 원심분리 한 후, 15 ml 정도의 혈장을 1.5 ml의 글루코스 키트 시약 (BiosystemSA, Barcelona, Spain)에 첨가한 다음 37℃의 수조에 10분 정도 인큐베이션 하였다. 혈당 분석은 분석기(Quik-Lab, Ames, Miles Inc. Elkart, Indiana, USA)를 이용하여 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다
표 3에서 확인되는 바와 같이, 재조합 인슐린의 경우 혈당을 약 50% 정도, Mph-1 -인슐린의 정도 70% 감소시켰으나, CHO 세포 내로 전달되어 자연상태의 구조와 기능을 가질 것으로 추측되는 Mph-1 -인슐린-PR의 경우 90% 이상의 혈당을 감소시키는 효과를 나타내었다. 이와같이 Mph-1 BTM에 의하여 동물세포 내로 전달된 융합단백질은 세포 내의 단백질 폴딩 기작 (folding machinery)에 의하여 자연상태의 구조와 기능으로 변환될 것으로 생각되며, Mph-1 BTM을 이용하여 다양한 의약학적 용도의 단백질을 박테리아로부터 다량 생산한 다음, 이들 재조합 단백질을 원래 생체 내에서 이들 단백질을 생산하는 세포 내로 Mph-1 BTM을 이용하여 전달시킨 후 다시 이들 세포로부터 재분리 정제하여 기초 및 임상적 치료제로 사용하였을 경우 탁월한 효과를 나타낼 것으로 기대된다.
이와 같이, 본 발명의 서열번호: 1의 아미노산 서열을 깆는 펩타이드 Mph-1 은 생물학적 활성을 갖는 기능 생리기능조절물질을 생체 내 및 생체 외에서 진핵 또는 원핵세포 내부의 세포질, 세포소기관 또는 핵내로, 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 및 흡입 등을 포함한 다양한 경로를 통하여 효과적으로 전달할 수 있으므로, 질환치료용 단백질 신약의 개발, 재조합 백신의 개발, DNA 또는 RNA 백신 개발, 유전자 및 단백질, 탄수화물, 지방 치료법 자연상태의 구조와 기능을 가진 의약학 단백질의 생산, 약물전달 시스템 및 약학적 약물 치료 기술에 유용하게 사용할 수 있다.
SEQUENCE LIST
<110> LEE, SANG KYOU
<120> BIOMOLECULE TRANSDUCTION MOTIF MPH-1-BTM AND THE USE THEREOF
<130> PN-22868-PCT
<150> KR 10-2002-0003183
<151> 2002-01-19
<160> 18
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Biomolecule transduction motif
<400> 1
Tyr Ala Arg Val Arg Arg Arg Gly Pro Arg Arg
1 5 10
<210> 2
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for Mph-1
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> BamHI site
<220>
<221> misc_feature
<222> (43)..(48)
<223> XbaI site
<400> 2
cgcggatcct atgcacgtgt tcggaggcgt ggaccccgcc gctctagaga tcccgtcgtt 60
ttacaacgtg ac 72
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for beta-gal
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Bg1II site
<400> 3
gaagatcttt atttttgaca ccagac 26
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for tat
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> BamHI site
<400> 4
cgcggatcct atggaaggaa gaagaagcgg agacaaagac gacgatctag agatcccgtc 60
gttttacaac gtgac 75
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for eGFP
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Bg1II site
<400> 5
gaagatcttt tacttgta 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for B7.1
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> BamHI site
<400> 6
cgcggatccg gccacaca 18
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for B7.1
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Bg1II site
<400> 7
gaagatcttt acagggcg 18
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for Gal4
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> XbaI site
<400> 8
cgctctagaa agctactgtc t 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for Gal4
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> HindIII site
<400> 9
cccaagcttc ggcgatacag t 21
<210> 10
<211> 119
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Gal4 binding sequence
<400> 10
ctcgaggaca gtactccgct cggaggacag tactccgatc cgtcgactct agagggtata 60
taatgcgcca gctcgaattc atcagcttgg cgagattttc aggagctaag gaagctaaa 119
<210> 11
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> N terminal of BamHI-Mph-1-B7
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> BamHI site
<400> 11
cgcggatcct atgcacgtgt tcggaggcgt ggaccccgcc gcggccacac a 51
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C terminal of BgIII and B7
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(8)
<223> Bg1II site
<400> 12
gaagatcttt acagggcg 18
<210> 13
<211> 87
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for Mph-1-A1A2
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> BamHI site
<400> 13
cgcggatcct atgcacgtgt tcggaggcgt ggaccccgcc gcgggtctag attcctgaga 60
gtgaagttca gcaggagcgc agagccc 87
<210> 14
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for Mph-1-A1A2
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> HindIII site
<400> 14
cccaagcttc ttgtcatagt cgtccttgta gtcgcggccg ccgcgagggg gcagggcctg 60
catgtgaagg gc 72
<210> 15
<211> 75
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for Mph-1-CTLA4
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> BamHI site
<400> 15
cgcggatcct atgcacgtgt tcggaggcgt ggaccccgcc gcgggtctag aaaaatgcta 60
aagaaaagaa gccct 75
<210> 16
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for Mph-1-CTLA4
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> HindIII site
<400> 16
cccaagcttc ttgtcatagt cgtccttgta gtcgcggccg ccattgatgg gaataaaata 60
aggctgaaat tg 72
<210> 17
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 5' primer for Mph-1-insulin
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> BamHI site
<400> 17
cgcggatcct atgcacgtgt tcggaggcgt ggaccccgcc gcgggcaggg ttccagggtg 60
gctggacccc agg 73
<210> 18
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 3' primer for Mph-1-insulin
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(9)
<223> HindIII site
<400> 18
cccaagcttc ttgtcatagt cgtccttgta gtcgcggccg cgctggttca agggctttat 60
tccatctctc tcggtgc 77
Claims (37)
- 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 생리기능조절물질을 전달하기 위한, 서열번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드 또는 이것의 활성 단편.
- 제 1항에 있어서, 서열번호: 1의 아미노산 서열 중 아르기닌, 밸린 및 알라닌 중 하나 이상이 구조적 및/또는 기능적으로 유사한 아미노산에 의해 치환됨을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이것의 활성 단편.
- 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 생리기능조절물질이 단백질, DNA, RNA, 탄수화물, 지방 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질임을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이것의 활성 단편.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 근육내 (intramuscular), 복막내(Intraperitoneal), 정맥내(Intravein), 경구(Oral), 비내(nasal), 피하(subcutaneous), 피내(intradermal), 점막(mucosal) 또는 흡입(inhale)을 포함하는 투여 경로에 의해, 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달됨을 특징으로 하는 펩타이드 또는 이것의 활성 단편.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편을 코딩하는 DNA, 세포의 생리기능조절에 관여하는 동종 또는 이종의 하나이상의 목적단백질을 코딩하는 DNA, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편, 특정 DNA 및/또는 RNA 염기서열과 결합하는 DNA 및/또는 RNA 결합단백질을 코딩하는 DNA 및/또는 RNA, 또는 세포 내로 전달하고자 하는 목적 DNA 및/또는 RNA, 특정 DNA 및/또는 RNA 결합단백질과 선택적으로 결합하는 특정 염기서열을 1개 이상 중복하여 함유하는 DNA 및/또는 RNA 단편, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합 발현벡터.
- 제 6항에 있어서, 발현 조절 서열이, 목적 DNA 및/또는 RNA가 선택적으로 전달 또는 발현되는 세포, 조직 또는 장기에 특이적인 프로모터를 포함하는 조절 도메인 (regulatory domain)을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로에 의해, 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달됨을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면에 존재하는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단되는 핵산 염기서열; 및 목적단백질이 선택적으로 전달되는 세포, 조직 또는 장기에 특이적으로 존재하는 수용체(receptor)와 결합가능한 리간드의 세포외 부분을 코딩하는 DNA, 또는 상기 수용체와 선택적으로 결합하는 단클론항체 (mAb)를 코딩하는 DNA를 추가로 포함함을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 9항에 있어서, 프로테아제가 MMP (MatrixMetalloProtease)를 포함하는 세포표면에 존재하는 프로테아제임을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 단클론항체 (mAb)가 Fab 단편, F(2b') 단편, 단일가닥 Fv 또는 인간화된 단클론항체임을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 5항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 목적단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 태그 (tag) 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 12항에 있어서, 6개의 연속된 히스티딘 코돈을 코딩하는 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 세포내로 전달된 목적단백질로부터, 물질전달펩타이드를 포함하여 생리기능조절에 불필요한 부분을 제거하기위하여, 세포내 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- 제 14항에 있어서, 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열이, 엔테로키나제 또는 테브 에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열 (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, 또는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly)임을 특징으로 하는 재조합발현벡터.
- 제 5항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 융합단백질의 전체적 구조와 기능의 안정 또는 각 유전자가 코딩하는 단백질의 유연성(flexibility)을 위하여 1개 이상의 글라이신, 아미노산 AAY를 포함하는 스패이서 (spacer) 아미노산 또는 염기서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 재조합 발현벡터.
- i) 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편; 및ii) 단백질, DNA, RNA, 탄수화물, 지방 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생리기능조절물질이 융합되거나, 화학적 및/또는 물리적 방법에 의해 결합된 물질전달복합체.
- i) 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편;ii) 생체 내 (in vivo) 또는 생체 외 (in vitro)에서 세포의 생리기능조절에 관여하는 동종 또는 이종의 하나 이상의 목적단백질 및 세포 표면에 존재하는 프로테아제에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열의 융합단백질: 및iii) 목적단백질이 선택적으로 전달되는 세포, 장기 또는 조직에 특이적으로 존재하는 수용체와 선택적으로 결합하는 리간드의 세포외 부분 또는 단클론항체가, 화학적 공유 또는 비공유결합, 또는 물리적 방법에 의하여 연결된 물질전달복합체.
- 제 18항에 있어서, 프로테아제가 MMP (MatrixMetalloProtease)포함하는 세포표면에 존재하는 프로티아제임을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 18항 또는 제 19항에 있어서, 단클론항체 (mAb)가 Fab 단편, F(ab') 단편, 단일가닥 Fv 또는 인간화된 단클론항체임을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 18항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 융합단백질의 정제를 용이하게 하기 위한 태그 (tag) 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 21항에 있어서, 6개의 연속된 히스티딘 코돈을 코딩하는 유전자를 추가로 포함함을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 21항에 있어서, 융합단백질로부터 세포내의 생리기능조절에 불필요한 부분을 제거하기 위하여, 세포내, 세포내 소기관들 또는 핵내에 존재하는 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 23항에 있어서, 효소에 의해 특이적으로 절단되는 서열이 엔테로키나제 또는 테브에 의해 특이적으로 절단되는 아미노산 서열 (Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, 또는 Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly) 임을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 23항 또는 제 24항에 있어서, 목적단백질이 트랜스레이션 후에 유비퀴틴화 (ubiquitination), 포스포릴화 (phosphorylation), 파네실레이션(farnesylation), 또는 아실화 (fatty acylation)을 포함하는 번역 후 변형(Post Translational Modification)에 의해 변형됨을 특징으로 하는 물질전달복합체.
- 제 5항 내지 제 16항에 따른 재조합 발현벡터에 의해, 진핵 또는 원핵세포를 포함하는 숙주세포에서 발현된 융합단백질.
- 제 26항에 있어서, Mph-1-zA1A2 또는 Mph-CTLA-4임을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 26항에 있어서, 화학적 및/또는 물리적 방법에 의하여 DNA, RNA, 탄수화물, 지방 또는 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 생리기능조절물질과 결합됨을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 28항에 있어서, 화학적 및/또는 물리적 방법이 공유결합 또는 비공유결합에 의한 직접결합 또는 매개체를 이용한 간접결합임을 특징으로 하는 융합단백질.
- 제 3항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편을, 근육내, 복막내, 정맥내, 경구, 비내, 피하, 피내, 점막 또는 흡입을 포함하는 투여 경로에 의해, 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달하는 방법.
- 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항의 물질전달복합체를, 세포의 배양물과 혼합 배양하는 단계를 포함하는, 단백질, DNA, RNA, 탄소화물, 지방 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 생리기능조절물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달하는 방법.
- 제 26항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 융합단백질을, 세포의 배양물과 혼합 배양하는 단계를 포함하는, 단백질, DNA, RNA, 탄소화물, 지방 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달하는 방법.
- i) 세포 내로 전달하고자 하는 목적 DNA 및/또는 RNA, 특정 DNA 및/또는 RNA 염기서열과 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 결합단백질이 선택적으로결합하는 상기 특정 DNA/RNA 염기배열을 1개 이상 중복하여 함유하는 DNA 및/또는 RNA 단편, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 제 1 재조합 발현벡터를 제조하는 단계;ii) 서열번호: 1의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편, 상기 단계 i)의 세포 내로 전달하고자 하는 목적 재조합 발현벡터 중의 DNA 및/또는 RNA 단편에 포함된, 특정 DNA 및/또는 RNA 염기서열과 선택적으로 결합할 수 있는 DNA 및/또는 RNA 결합단백질을 코딩하는 DNA, 및 작동적으로 결합된 발현 조절 서열을 포함하는 제 2 재조합 발현벡터를 제조하는 단계.iii) 상기 제 2 재조합 발현벡터를 숙주세포 중에 발현시켜 융합단백질을 수득하는 단계;iv) 상기 단계 iii)의 융합단백질과 단계 i)의 제 1 재조합 발현벡터를 결합반응 시켜, 융합단백질 및 목적 DNA 및/또는 RNA의 결합체를 수득하는 단계; 및v) 상기 결합체를 목적 DNA 및/또는 RNA를 전달하고자 하는 세포와 혼합 배양 및 접촉시키는 단계를 포함하여, 목적 DNA 및/또는 RNA를 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달하는 방법.
- 제 32항에 있어서, 인터루킨-4, 인터루킨-4, 인터루킨-12, 인터루킨-10 또는 인터페론등을 포함하는 사이토카인 및 케모카인, 또는 성장인자(Egf)를 포함하는 생리활성인자가 함께 전달됨을 특징으로하는, 단백질, DNA, RNA, 탄소화물, 지방 및 화학화합물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질을 진핵 또는 원핵세포의 세포 내로 전달하는 방법.
- i) 제 1항 또는 제 2항의 펩타이드 또는 이것의 활성 단편과 목적 단백질의 융합단백질을 제 1 숙주세포로부터 수득하는 단계; 및ii) 상기 단계 i)의 융합단백질을 제 2 숙주세포에 전달하는 단계를 포함하여, 제 2 숙주세포로부터 자연상태의 구조 및 기능을 갖는 목적단백질을 생산하는 시스템.
- 제 35항의 시스템으로부터 분리정제된 자연상태의 구조 및 기능을 갖는 목적 단백질.
- 제 27항의 융합단백질을 포함하는 면역질환치료제.
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