CN112080510A - 靶向人源化gd2的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种靶向人源化GD2的嵌合抗原受体及其用途。具体而言，本发明提供一种核酸序列，选自：含有依次连接的人DAP12的编码序列、T2A的编码序列、人源化GD2单链抗体的编码序列、人TREM1跨膜和胞内区的编码序列。本发明还提供相关的融合蛋白、含所述编码序列的载体，以及所述融合蛋白、编码序列、载体的用途。

Description

靶向人源化GD2的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体领域，具体涉及靶向GD2的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
糖链不仅仅是生命体内的结构物质，同时也对细胞间及细胞内的信号传导起着重要作用，而糖基化的异常表达通常是肿瘤细胞转化的标志，某些肿瘤的糖基抗原被认为与肿瘤细胞的增殖、入侵、血管生成和转移紧密相关。1942年，德国生化学家Ernst Klenk从神经节细胞中分离得到一种富含糖链的糖脂化合物，随后被命名为神经节苷脂(GD2)。GD2是细胞膜上富含唾液酸的一类鞘糖脂，主要在内质网和高尔基体中合成：首先在内质网内，丝氨酸和脂肪酸辅酶A(CoA)合成母核神经酰胺，随后，其在高尔基体内经过一系列糖基转移酶的逐级加工，形成各种形式的神经节苷脂。神经节苷脂GD2属b-series神经节苷脂，含有两个唾液酸单位，在细胞黏附和识别相关的信号转导中起重要作用。在神经外胚层相关的肿瘤和肉瘤中，发现GD2的过量表达。同时，作为肿瘤抗原，GD2在非小细胞肺癌和骨肉瘤中显示具有提升肿瘤增殖和入侵的能力。
随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一[Schmitz M，et al.Chimeric antigen receptor-engineered T cellsforimmunotherapy of Cancer.J Biomed Biotechnol，2010，doi：10.1155/2010/956304.]。嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，CAR能针对所选择的免疫细胞重定向其特异性和反应性，因此赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较与正常T细胞受体(TCR)应答不同，不受MHC限制，具有活化和增殖的能力，因此具有高效的杀伤肿瘤细胞的能力。
嵌合抗原受体(CAR)在T细胞上表达合成蛋白，其将抗体的抗原识别片段(如抗体单链可变区片段)与胞内信号结构域融合。研究发现，以肿瘤特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCR的α，β链可变区，并将scFv直接和T细胞信号传导结构域连接，形成嵌合抗原受体(CAR)表达于T细胞表面，可通过scFv识别肿瘤特异性抗原，直接产生T细胞的活化信号，促进T细胞活化、增殖，特异性杀伤肿瘤细胞。该过程主要依赖CAR-T细胞表面的scFv对肿瘤抗原的特异性识别，免疫反应的特异性和杀伤性较强。
本发明对构建的靶向GD2的新型CAR，本发明采用的是人源化GD2(huGKT2.4)单链抗体，huGKT2.4具有高亲和力。huGKT2.4是靶向GD2的人源化形式的单克隆抗体，对肿瘤具有治疗和诊断作用。本发明对CAR-T细胞进行了修饰，针对GD2靶点发挥CAR-T细胞抗肿瘤作用。本发明为临床实验和临床治疗奠定良好的基础。
随着CAR-T细胞治疗经验的积累和不断完善，其在恶性肿瘤中的应用越来越受到各界关注。在此环境下，我们要加快步伐，利用自身已有的工作基础、研发团队、医疗团队申请开展临床试验，推动CAR-T细胞治疗在治疗恶性肿瘤的道路上快速前进。
发明内容
本发明第一方面提供一种核酸序列，所述核酸序列选自：
(1)含有依次连接的人自然杀伤激活受体相关蛋白(DAP12)的编码序列、T2A的编码序列、抗GD2单链抗体的编码序列、人髓样触发受体(TREM1)跨膜和胞内区的编码序列。
在一个或多个实施方案中，在所述抗GD2单链抗体的编码序列前的所述信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1第412-474位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GD2单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第481-1311位核苷酸序列所示。在一个或多个实施方案中，所述人DAP12的核酸序列如SEQ ID NO:1第1-339位核酸所示。在一个或多个实施方案中，所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:1第355-405位核酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人TREM1跨膜和胞内区的核酸序列如SEQ ID NO:1第1348-1485位核酸所示。本发明第二方面提供一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：
(2)含有依次连接的人DAP12、T2A、抗GD2单链抗体、人TREM1跨膜和胞内区的融合蛋白和限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的融合蛋白；
优选地，所述抗GD2单克隆抗体huGKT2.4。
在一个或多个实施方案中，所述核酸序列在所述抗GD2单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列。在一个或多个实施方案中，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNO:2第138-158位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述抗GD2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-437位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人DAP12的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-113位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第119-135位氨基酸所示。在一个或多个实施方案中，所述人TREM1跨膜和胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第450-494位氨基酸所示。
本发明第三方面提供一种核酸载体，所述核酸载体含有本文所述的核酸序列。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物为慢病毒载体，含有本文所述的核酸序列，以及任选的可选择的标记。
本发明第四方面提供一种慢病毒，所述慢病毒含有本文所述的核酸载体，优选含有所述慢病毒载体。
本发明第五方面提供一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有本文所述的核酸序列，或含有本文所述的核酸载体，或感染了本文所述的慢病毒，或稳定表达本文所述的融合蛋白。
本发明第六方面提供一种含本文所述的基因修饰的T细胞的药物组合物。
本发明第七方面提供本文所述的核酸序列、融合蛋白、核酸载体或慢病毒在制备活化的T细胞中的应用。
本发明第八方面提供本文所述的核酸序列、融合蛋白、核酸载体、慢病毒、或基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GD2介导的疾病的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述GD2介导的疾病为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌。在一个或多个实施方案中，所述GD2介导的疾病为神经母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌。
附图说明
图1：pELNS-GD2CAR慢病毒表达载体示意图。
图2：GD2-CAR结构示意图
具体实施方式
本发明提供一种靶向人源化GD2的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有依次连接的人DAP12、T2A、抗GD2单链抗体、人TREM1跨膜和胞内区。
适用于本发明的抗GD2单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗GD2单克隆抗体。
因此，在某些实施方案中，适用于本发明的抗GD2链抗体含有特异性识别人GD2。任选地，所述轻链可变区和重链可变区可通过接头序列连接在一起。可举例的这类单链抗体包括但不限于8B6、60C3。在某些实施方案中，所述单克隆抗体是huGKT2.4。
形成本发明的融合蛋白，如人DAP12、T2A、抗GD2单链抗体、人TREM1跨膜和胞内区等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有插入氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的融合蛋白(即所述CAR)的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明也包括第1-494位氨基酸序列所示的CAR或SEQID NO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在SEQ ID NO:2第1-494位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
本发明包括编码本发明融合蛋白的核酸序列。本发明的核酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的核酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
本文所述的核酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的核酸序列如SEQ ID NO:1第1-1485位核酸所示。
本发明也涉及核酸载体，该核酸载体含有本文所述的核酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的核酸序列可以多种方式被操作以保证所述融合蛋白(CAR)的表达。在将核酸载体插入载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸载体进行操作。利用重组DNA方法来改变核酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
本发明的核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，可被克隆入质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。进一步地，载体是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，MolecularCloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。
例如，在某些实施方案中，本发明使用慢病毒载体，该慢病毒载体含有本文所述的核酸序列，以及任选的可选择的标记。
合适的启动子的一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)启动子序列。合适的启动子的另一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的核酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将核酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。将感兴趣的核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。将核酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。
将核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用病毒载体，特别是慢病毒载体，这已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自逆转录病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多反转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方案中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。
因此，在某些实施方案中，本发明还提供用于活化T细胞的慢病毒，该病毒含有本文所述的慢病毒载体以及相应的包装基因，如gag、pol和vsvg。
因此，在某些实施方案中，本发明提供一种基因修饰的T细胞，该基因修饰的T细胞含有本文所述的核酸序列，或含有本文所述的慢病毒载体，或感染了本文所述的慢病毒，或采用本文所述的方法制备得到，或稳定表达本文所述的融合蛋白。
本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，本发明的CAR-T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
本发明还包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达本文所述的CAR，和CAR-T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
因此，可采用本发明的CAR、其编码序列、核酸载体、表达载体、病毒以及CAR-T细胞治疗的疾病优选为GD2介导的疾病。
具体而言，本文中，“GD2介导的疾病”尤其包括各种类型的脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌。在某些实施方案中，所述GD2介导的疾病为神经母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的CAR-T细胞，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗GD2介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1、嵌合抗原受体制备
本发明提供一种靶向人源化GD2嵌合抗原受体。设计依次含有DAP12、T2A、人源化GD2单链可变区、TREM1，其结构如图1所示。
pELNS-DAP12-T2A质粒由南京卡提医学科技有限公司保存，或者根据文献(EnxiuWang et al.Generation of Potent T-cell Immunotherapy for Cancer Using DAP12-Based,Multichain,Chimeric Immunoreceptors.2015,Cancer Immunology Research,3(7):815)公开的方法进行构建，GD2scFv-TREM1基因合成由生工生物工程(上海)股份有限公司生物科技公司合成并提供，将质粒pELNS-DAP12-T2A分别和合成的基因片段通过BamHI、SalI双酶切(购自Takara公司)，酶切反应按说明书进行，酶切后再连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体：
将5μL慢病毒载体转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中(购自南京安杰优生物科技有限公司)，37℃培养16h后挑取单克隆，挑取的单克隆在37℃条件下培养12h后用质粒抽提试剂盒(购自Takara公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
实施例2、慢病毒包装
本实施例包装慢病毒采用磷酸钙法，具体步骤如下：
293T细胞隔天传代，每个T150细胞瓶种植5×106个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。以1个T150细胞培养瓶为例，用约15ml的1×PBS轻柔地洗细胞两次，加入3ml0.25％胰酶-2.21mM EDTA，等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)FBS(购自Gibico)的DMEM培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中，收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm,离心10分钟，吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)FBS的DMEM培养液中。细胞计数，根据细胞浓度计算12×106个细胞所需要的体积，将细胞和25ml的10％(wt)FBS的DMEM培养液合并，放入T150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。
观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时就可以开始转染，在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液。混合质粒DNA和氯化钙溶液，以一个T150瓶为例，需要28ugpRSV.rev(购自Invitrogen公司)，28ug pGAG-Pol(购自Invitrogen公司)，11ug pVSVG(购自Invitrogen公司)，23ug重组慢病毒表达质粒mesoCAR-1/mesoCAR-2/mesoCAR-3/mesoCAR-4，加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀。将1.5ml BBS溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把DNA-氯化钙溶液混匀后滴加到BBS溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟。用5ml移液管把DNA-氯化钙-BBS混合物(购自上海碧云天生物技术有限公司)均匀逐滴加到T150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液。6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)FBS的DMEM培养液，继续培养。
将前一天转染的293T细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱。将事先预热的20ml 5％(wt)FBS的DMEM培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。4℃，12000-24000rpm离心过夜，离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)FBS的DMEM培养基重悬，进行病毒分装，迅速存放于-80℃冰箱备用。

Claims (9)

1.一种核酸序列，所述核酸序列选自：含有依次连接的人DAP12的编码序列、T2A的编码序列、抗GD2单链抗体的编码序列、人TREM1跨膜和胞内区的编码序列。
2.如权利要求1所述的核酸序列，其特征在于，所述核酸序列在所述抗GD2单链抗体的编码序列前还含有信号肽的核酸序列，优选地，所述信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:1第412-474位核酸所示；和/或所述抗GD2抗体的核酸序列如SEQ ID NO:1第481-1311位多核酸所示；和/或所述人DAP12的核酸序列如SEQ ID NO:1第1-339位多核酸所示；和/或所述T2A的核酸序列如SEQ ID NO:1第355-405位核酸所示；和/或所述人TREM1跨膜和胞内区的核酸序列如SEQ ID NO:1第1348-1485位核酸所示。
3.一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：含有依次连接的人DAP12、T2A、抗GD2单链抗体、人TREM1跨膜和胞内区的融合蛋白；和限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且保留活化T细胞活性的衍生的融合蛋白；优选地，所述抗人源化GD2单克隆抗体为huGKT2.4。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白具有以下一个或多个特征：所述融合蛋白在所述抗GD2抗体的N端还含有信号肽，优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第138-158位氨基酸所示；所述抗GD2单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第161-437位氨基酸所示；所述人DAP12的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-113位氨基酸所示；所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第119-135位氨基酸所示；所述人TREM1跨膜和胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第450-494位氨基酸所示。
5.一种核酸载体，所述核酸载体含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列；优选地，所述核酸载体为慢病毒载体，含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列。
6.一种慢病毒，所述慢病毒含有权利要求5所述的核酸载体，优选含有所述慢病毒载体。
7.一种基因修饰的T细胞或含该基因修饰的T细胞的药物组合物，其特征在于，所述细胞含有权利要求1-2中任一项所述的核酸序列，或含有权利要求5所述的核酸载体，或感染了权利要求6所述的慢病毒，或稳定表达权利要求4中任一项所述的融合蛋白。
8.权利要求1-2中任一项所述的核酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸载体或权利要求7所述的慢病毒在制备活化的T细胞中的应用。
9.权利要求1-2中任一项所述的核酸序列、权利要求3-4中任一项所述的融合蛋白、权利要求5所述的核酸载体、权利要求6所述的慢病毒、或权利要求7所述的基因修饰的T细胞或其药物组合物在制备治疗GD2介导的疾病的药物中的用途；优选地，所述GD2介导的疾病为脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌，优选为神经母细胞瘤、肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌。
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