CN109777784B - 一种增强向肿瘤部位迁移的嵌合抗原受体载体构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了表达CXCR3的CAR‑NK92细胞、制备方法及其应用。具体地，本发明提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向NKG2DL的嵌合抗原受体CAR和CXCR3。CXCR3不仅可以帮助靶向NKG2DL的CAR‑NK细胞向肿瘤细胞的迁移，还可以提高靶向NKG2DL的CAR‑NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。尤其是本发明表达含有NKG2D胞外区的CAR和CXCR3的NK细胞，能够有效地杀伤肿瘤细胞，显著提高疗效和减少复发和副作用。

Description

一种增强向肿瘤部位迁移的嵌合抗原受体载体构建方法与 应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域。具体地，本发明涉及表达CXCR3的 CAR-NK92细胞，及其制备方法和应用。

背景技术

细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。近些年，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法在治疗白血病取得了显著的效果。

然而CAR-T也带来了很多副反应，比如细胞因子风暴，脱靶效应。此外，CAR-T 对实体瘤治疗效果不佳。NK细胞作为固有免疫细胞，能够快速发挥细胞毒性抵抗肿瘤细胞或病毒感染的细胞。NK相比T细胞有许多免疫优势：NK细胞不受HLA限制；NK细胞还可通过CD16与抗体Fc片段结合，诱发ADCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用)的特异性杀伤作用；NK细胞很少产生细胞因子风暴。

虽然CAR-T和CAR-NK在血液瘤取得了很好的治疗效果，然而对实体瘤治疗效果不佳。尤其肿瘤微环境的阻碍，免疫细胞很难浸润到微环境中发挥功能。因此，如何克服CAR-T和CAR-NK技术的弊端以及如何能赋予免疫细胞对实体瘤细胞的精准识别与特异杀伤，成为免疫细胞治疗亟待解决的问题。

因此，本领域迫切需要开发出一种能够更高效地向肿瘤部位迁移的、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的细胞免疫技术。

发明内容

本发明的目的就是提供一种能够更高效地向肿瘤部位迁移的、特异性好、副作用小地治疗肿瘤的细胞免疫技术。

本发明的主要目的是提供一种制备表达CXCR3的CAR-NK92细胞的方法，得到的CAR-NK92细胞可以特异性的识别NKG2DL阳性的肿瘤细胞，同时CAR-NK92 表达的趋化因子受体CXCR3可以帮助CAR-NK92细胞向肿瘤细胞的迁移和提高 CAR-NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，可在制备和治疗肿瘤的药物中进行应用。

在本发明的第一方面，提供了一种工程化的免疫细胞，所述工程化的免疫细胞表达靶向NKG2DL的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞，较佳地为NK细胞，更佳地为NK92细胞。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR定位于所述免疫细胞的细胞膜。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR含有靶向NKG2DL的抗原结合结构域。

在另一优选例中，所述嵌合抗原受体CAR的结构如式II示：

L-S-B-T (II)

式中，

“-”为连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向NKG2DL的抗原结合结构域；

B为无或MYC标签；

T为信号传导结构域。

在另一优选例中，所述L为选自下组的蛋白来源的信号肽：CD8、GM-CSF，或其组合。

在另一优选例中，所述L为CD8α信号肽。

在另一优选例中，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示。

在另一优选例中，所述CD8α信号肽的多核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在另一优选例中，所述S中，所述靶向NKG2DL的抗原结合结构域为NKG2D 胞外区。

在另一优选例中，所述NKG2D来源于人。

在另一优选例中，所述NKG2D胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述NKG2D胞外区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述MYC标签的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

在另一优选例中，所述信号传导结构域T的结构如式III所示：

H-TM-C-CD3ζ (III)

式中，

“-”为连接肽或肽键；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞内信号传导序列。

在另一优选例中，所述H为选自下组的蛋白来源的铰链区：CD8、CD28、 CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述H为CD8α铰链区。

在另一优选例中，所述CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示。

在另一优选例中，所述CD8α铰链区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示。

在另一优选例中，所述TM为选自下组的蛋白来源的跨膜区：CD8、CD28、 NKG2D、CD137，或其组合。

在另一优选例中，所述TM为CD28跨膜区。

在另一优选例中，所述CD28来源于人。

在另一优选例中，所述CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。

在另一优选例中，所述CD28跨膜区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。

在另一优选例中，所述C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28、 4-1BB(CD137)、NKG2D，或其组合。

在另一优选例中，所述C为CD28胞内区。

在另一优选例中，所述CD28来源于人。

在另一优选例中，所述CD28胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示。

在另一优选例中，所述CD28胞内区的多核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

在另一优选例中，所述CD3ζ的胞内信号传导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。

在另一优选例中，所述CD3ζ的胞内信号传导序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。

在另一优选例中，所述信号传导结构域T的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述信号传导结构域T的核酸如SEQ ID NO:6示。

在另一优选例中，所述工程化的免疫细胞表达如式I所示的融合蛋白：

CAR-A-Q (I)

式中，

“-”为连接肽或肽键；

CAR为嵌合抗原受体；

A为连接肽；

Q为趋化因子受体。

在另一优选例中，所述A选自P2A或T2A。

在另一优选例中，所述A为P2A，所述P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。

在另一优选例中，所述Q选自下组的趋化因子受体：CXCR3、CXCR2、CCR4。

在另一优选例中，所述Q为趋化因子受体CXCR3。

在另一优选例中，所述趋化因子受体CXCR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。

在另一优选例中，所述趋化因子受体CXCR3的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10 所示。

在本发明的第二方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向NKG2DL 的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体，从而获得本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述趋化因子受体为CXCR3。

在另一优选例中，在步骤(A)中，还包括分离和/或激活待改造的免疫细胞。

在另一优选例中，在步骤(B)中，包括(B1)将表达所述靶向NKG2DL的CAR的第一表达盒导入所述免疫细胞；和(B2)将表达趋化因子受体的第二表达盒导入所述免疫细胞；其中所述的步骤(B1)可在步骤(B2)之前、之后、同时、或交替进行。

在另一优选例中，在步骤(B)中，将所述第一表达盒和/或第二表达盒导入所述免疫细胞的细胞核中。

在另一优选例中，当步骤(A)中的待改造的免疫细胞已经表达所述CAR时，则步骤(B1)可以省略。

在另一优选例中，所述免疫细胞为NK细胞或T细胞。

在另一优选例中，所述的第一表达盒含有编码所述的嵌合抗原受体CAR的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的第二表达盒含有编码趋化因子受体的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一表达盒、第二表达盒位于同一载体。

在另一优选例中，所述的载体为病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、其他基因转移系统、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第三方面，提供了一种用于制备本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和

(2)第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列含有用于表达所述CXCR3的第二表达盒。

在另一优选例中，所述的第一、第二多核苷酸序列为独立的或相连的。

在另一优选例中，所述的第一、第二多核苷酸序列位于相同或不同的容器内。

在另一优选例中，所述的第一、第二多核苷酸序列位于相同或不同的载体上。

在另一优选例中，所述的第一、第二多核苷酸序列位于同一载体。

在另一优选例中，当所述的第一、第二多核苷酸序列位于同一载体时，在所述第一、第二多核苷酸序列之间，还包括第三多核苷酸序列，所述第三多核苷酸序列含有用于表达连接肽的第三表达盒。

在另一优选例中，所述连接肽为P2A。

在本发明的第四方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型包括注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第五方面，提供了如本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合；优选地，所述肿瘤为实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B 细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种预防和/或治疗疾病的方法，包括步骤：给需要的对象施用本发明第一方面所述的工程化的免疫细胞。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

在另一优选例中，所述需要的对象为人或非人哺乳动物。

在本发明的第七方面，提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含靶向NKG2DL 的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体。

在另一优选例中，所述CAR和趋化因子受体通过连接肽连接。

在另一优选例中，所述连接肽为2A肽或IRES，较佳地为T2A或P2A。

在另一优选例中，所述趋化因子受体为CXCR3或CXCR2，优选地为CXCR3。

在另一优选例中，所述融合蛋白的结构如下式II所示：

L-S-B-H-TM-C-CD3ζ-A-Q (II)

式中，所述“-”连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向NKG2DL的抗原结合结构域；

B为无或MYC标签；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽，较佳地为T2A或P2A；

Q为CXCR3。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

在本发明的第八方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明第七方面所述的融合蛋白。

在另一优选例中，所述多核苷酸选自下组：

(a)编码如SEQ ID NO:1所示融合蛋白的多核苷酸；

(b)序列如SEQ ID NO:2所示的多核苷酸；

(c)核苷酸序列与(b)所示序列的同源性≥75％(较佳地≥85％，更佳地≥95％)的多核苷酸；

(d)如(b)所示多核苷酸的5’端和/或3’端截短或添加1-60个(较佳地1-30，更佳地1-10个)核苷酸的多核苷酸；

(e)与(a)-(d)任一所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明的第九方面，提供了一种载体，所述载体包括如本发明第八方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA、RNA。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第八方面的多核苷酸的载体。

在另一优选例中，所述载体用于表达如本发明第七方面所述的融合蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例) 中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了慢病毒质粒载体CAR-NKG2D-P2A-CXCR3示意图。

图2显示了CAR-NKG2D-P2A-CXCR3载体琼脂糖凝胶电泳检测图。

图3显示了CAR-NKG2D-P2A-CXCR3载体转染NK-92细胞流式检测图。

图4显示了CCK-8方法检测CAR-NKG2D NK-92和CAR-NKG2D-CXCR3 NK-92细胞对K562细胞的杀伤效应的对比图。

图5显示了CAR-NKG2D NK-92和CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞的体外迁移率的对比图。

图6显示了CAR-NKG2D-P2A-CXCR3的质粒图谱。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现靶向NKG2DL的CAR-NK 细胞和趋化因子受体CXCR3具有协同作用，CXCR3不仅可以帮助靶向NKG2DL的 CAR-NK细胞向肿瘤细胞的迁移，还可以提高靶向NKG2DL的CAR-NK细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。尤其是本发明表达含有NKG2D抗原结合结构域的CAR和CXCR3 的NK细胞，能够有效地杀伤肿瘤细胞，显著提高疗效和减少复发和副作用。在此基础上完成了本发明。

术语

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“给予”、“施用于”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptors，CARs)由胞外抗原识别区域，通常是scFv(single-chain variable fragment)，跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。CARs的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI 分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CARs在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CARs相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CARs基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CARs。

CARs的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC 限制方式识别。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和/或ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用的，术语“接头”、“铰链区”可互换使用，通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在免疫细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和/或ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28信号传导结构域和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

如本文所用，本发明嵌合抗原受体的基础结构包括：肿瘤相关抗原结合区，胞外铰链区，跨膜区和胞内信号区。肿瘤相关抗原的选择直接影响其对肿瘤的治疗效果。在本发明中，本发明的嵌合抗原受体靶向NKG2DL。

NKG2D作为NK细胞表面激活受体，能够识别多种配体，例如MICA/B， ULBP1-6。NKG2DLs在正常细胞中几乎不表达，当细胞受到恶性转化，病毒感染，基因毒性药物，低氧等压力下，NKG2DLs表达升高。已经证明NKG2DLs在多种肿瘤中表达。2个NKG2D蛋白募集4个DAP10蛋白，形成6聚体。当NKG2D与其配体结合，DAP10发生磷酸化，募集和激活下游信号分子发挥激活NK细胞。

在本发明的一个优选例中，选择人NKG2D的胞外区作为本发明CAR中靶向 NKG2DL的抗原结合结构域。

在一个优选的实施方式中，选取的人NKG2D的胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，可以高效的与NKG2DL结合。

在本发明中，本发明的靶向NKG2DL的抗原结合结构域还包括NKG2D胞外区的保守性变异体，指与本发明NKG2D胞外区的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3 个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

在一个实施方式中，本发明CAR的结构为NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ。优选地，本发明CAR的序列如SEQ ID NO.:1的第1-420位所示。

CXCR3

趋化因子受体CXCR3的又名G蛋白偶联受体9(GPR9)和CD183。

人体中存在三种CXCR3同种型：CXCR3-A，CXCR3-B和趋化因子受体3替代物(CXCR3-alt)。CXCR3-A与CXC趋化因子CXCL9(MIG)、CXCL10(IP-10) 和CXCL11(I-TAC)结合；而CXCR3-B除CXCL9、CXCL10和CXCL11外还可与 CXCL4结合。

CXCR3主要在活化的T淋巴细胞和NK细胞和一些上皮细胞上表达。CXCR3和 CCR5优先在Th1细胞上表达，而Th2细胞有利于CCR3和CCR4的表达。吸引Th1细胞的CXCR3配体可伴随阻断Th2细胞响应CCR3配体的迁移，从而增强效应T细胞募集的极化。

在功能方面，CXCR3与CXCL9、CXCL10和CXCL11的结合能够引起细胞内 Ca2++水平的增加并激活磷酸肌醇3-激酶和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)；CXCR3 能够调节白细胞运输；CXCR3与趋化因子的结合诱导各种细胞反应，最显著的是整联蛋白活化，细胞骨架改变和趋化性迁移；CXCR3-配体相互作用吸引Th1细胞并促进Th1细胞成熟。

作为趋化因子诱导的细胞脱敏(磷酸化依赖性受体内化)的结果，细胞反应通常快速并且持续时间短。在细胞内受体去磷酸化并随后再循环到细胞表面后，细胞反应性恢复。此外，CXCL9、CXCL10和CXCL11通常由炎性病变中的局部细胞产生，表明CXCR3及其趋化因子参与炎症细胞的募集。并且，CXCR3与伤口愈合有关。

趋化因子是一类分子量大约8-16KD的G蛋白偶联受体，他们能诱导白细胞趋药性，促进淋巴细胞分化和增殖。CXCL9、-10、-11/CXCR3轴主要调控免疫细胞迁移，分化和激活，例如细胞毒性淋巴细胞，NK，NKT，巨噬细胞。CXCL9、-10、 -11是CXCR3的配体，通常情况下，他们以低水平保持恒定状态。CXCL9、-10、-11 主要由单核细胞、上皮细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞分泌，受INF-γ刺激表达上调。

CXCR3作为一个受体主要表达在单核细胞，T细胞，NK细胞，DC和肿瘤细胞。研究发现，CXCL9,-10,-11在一些肿瘤细胞中表达升高。因此增加免疫细胞表达 CXCR3，能够促进免疫细胞浸润到肿瘤微环境。

在本发明中，表达趋化因子CXCR3的免疫细胞可以增强其浸润到肿瘤微环境中，可以克服CAR-T或CAR-NK对实体瘤治疗效果不佳的问题。

NK细胞

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。在自身免疫性疾病中，NK细胞失衡(减少) 是导致自身免疫病发病的重要机制，NK细胞减少导致其非特异性抑制B细胞分泌抗体的功能降低。

NK92细胞系是经过单克隆化，可永久生存的大颗粒淋巴细胞。它几乎缺失了所有的KIRs，但同时又表达一系列激活性受体，表达丰富的颗粒酶和穿孔素，识别靶细胞没有MHC限制，可在无预先致敏的情况下杀伤肿瘤细胞，是临床细胞过继治疗的理想选择，也是唯一被美国FDA批准应用于临床I期和II期的NK细胞系。而且NK92细胞的细胞毒能力很强，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者并没有对NK92细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险。

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第一方面所述的CAR-NK细胞。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有以下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

融合蛋白

如本文所用，术语“融合蛋白”、“本发明融合蛋白”、和“本发明的多肽”具有相同的含义，均具有本发明第七方面所述的结构。

在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，术语“融合蛋白”还包括具有上述活性的、SEQ ID NO.:1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：1-3个(通常为1-2个，更佳地1个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为3个以内，较佳地为2个以内，更佳地为1个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C 末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的结构和功能。此外，所述术语还包括单体和多聚体形式的本发明多肽。该术语还包括线性以及非线性的多肽(如环肽)。

本发明还包括上述融合蛋白的活性片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明融合蛋白的功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合于此多肽序列而形成的多肽(与前导序列、分泌序列或6His等标签序列融合而形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

一类优选的活性衍生物指与本发明的氨基酸序列相比，有至多3个，较佳地至多2个，更佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

最初的残基	代表性的取代	优选的取代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu	Glu
			Cys(C)	Ser	Ser
Gln(Q)	Asn	Asn
			Glu(E)	Asp	Asp
Gly(G)	Pro；Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe	Leu
			Leu(L)	Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg
			Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
Phe(F)	Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Leu
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Ser	Ser
Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala	Leu

本发明还提供本发明融合蛋白的类似物。这些类似物与SEQ ID NO.:1所示的多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

MALPVTALLLPLALLLHAARPASLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNN CYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIP TNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV EFGGEQKLISEEDLRSALSNSIMYFSHFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEASRPAAGGAVHTRGLDVKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRS KRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSGRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKD KMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRGSGAT NFSLLKQAGDVEENPGPMVLEVSDHQVLNDAEVAALLENFSSSYDYGENESDS CCTSPPCPQDFSLNFDRAFLPALYSLLFLLGLLGNGAVAAVLLSRRTALSSTDTF LLHLAVADTLLVLTLPLWAVDAAVQWVFGSGLCKVAGALFNINFYAGALLLA CISFDRYLNIVHATQLYRRGPPARVTLTCLAVWGLCLLFALPDFIFLSAHHDERL NATHCQYNFPQVGRTALRVLQLVAGFLLPLLVMAYCYAHILAVLLVSRGQRRL RAMRLVVVVVVAFALCWTPYHLVVLVDILMDLGALARNCGRESRVDVAKSV TSGLGYMHCCLNPLLYAFVGVKFRERMWMLLLRLGCPNQRGLQRQPSSSRRD SSWSETSEASYSGL(SEQID NO:1)

其中，第1-21位是CD8α信号肽区；第24-158位是靶向NKG2DL的抗原结合结构域；第175-236位是CD8α铰链区；第238-266位是CD28跨膜区；第267-307位是 CD28胞内区共刺激信号分子；第309-420位是CD3ζ；第421-442位是P2A；第443-810 位是CXCR3。

编码序列

本发明还涉及编码根据本发明的融合蛋白的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与编码SEQ ID NO.:1所示的多肽的序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO.:1所示的多肽，但相应编码区序列有差别的核酸序列。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码本发明融合蛋白的功能。

编码本发明的融合蛋白的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

在本发明的一个实施方式中，所述融合蛋白的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggctagcttattcaacc aagaagttcaaattcccttgaccgaaagttactgtggcccatgtcctaaaaactggatatgttacaaaaataactgctaccaattttt tgatgagagtaaaaactggtatgagagccaggcttcttgtatgtctcaaaatgccagccttctgaaagtatacagcaaagagga ccaggatttacttaaactggtgaagtcatatcattggatgggactagtacacattccaacaaatggatcttggcagtgggaagat ggctccattctctcacccaacctactaacaataattgaaatgcagaagggagactgtgcactctatgcctcgagctttaaaggct atatagaaaactgttcaactccaaatacgtacatctgcatgcaaaggactgtggaattcggtggcgaacaaaagttgatttctgaa gaagatttgagatctgccctgagcaactccatcatgtacttcagccacttcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacg acgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgagccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacgtcaagcccttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctgg cttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatg aacatgactccccgccgcccagggcctacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgct ccggaagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaat ctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaagga agaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcg agcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcac atgcaggccctgccccctcgcggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccct ggacctatggtccttgaggtgagtgaccaccaagtgctaaatgacgccgaggttgccgccctcctggagaacttcagctcttcc tatgactatggagaaaacgagagtgactcgtgctgtacctccccgccctgcccacaggacttcagcctgaacttcgaccgggc cttcctgccagccctctacagcctcctctttctgctggggctgctgggcaacggcgcggtggcagccgtgctgctgagccggc ggacagccctgagcagcaccgacaccttcctgctccacctagctgtagcagacacgctgctggtgctgacactgccgctctg ggcagtggacgctgccgtccagtgggtctttggctctggcctctgcaaagtggcaggtgccctcttcaacatcaacttctacgc aggagccctcctgctggcctgcatcagctttgaccgctacctgaacatagttcatgccacccagctctaccgccgggggcccc cggcccgcgtgaccctcacctgcctggctgtctgggggctctgcctgcttttcgccctcccagacttcatcttcctgtcggccca ccacgacgagcgcctcaacgccacccactgccaatacaacttcccacaggtgggccgcacggctctgcgggtgctgcagct ggtggctggctttctgctgcccctgctggtcatggcctactgctatgcccacatcctggccgtgctgctggtttccaggggccag cggcgcctgcgggccatgcggctggtggtggtggtcgtggtggcctttgccctctgctggaccccctatcacctggtggtgct ggtggacatcctcatggacctgggcgctttggcccgcaactgtggccgagaaagcagggtagacgtggccaagtcggtcac ctcaggcctgggctacatgcactgctgcctcaacccgctgctctatgcctttgtaggggtcaagttccgggagcggatgtggat gctgctcttgcgcctgggctgccccaaccagagagggctccagaggcagccatcgtcttcccgccgggattcatcctggtctg agacctcagaggcctcctactcgggcttgtga(SEQ ID NO:2)

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术在所述NK细胞上表达本发明融合蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明融合蛋白的NK细胞。一般来说包括步骤：将本发明所述的第一表达盒和/或第二表达盒转导入NK细胞内，从而获得所述NK细胞。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明融合蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA 合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，枯草芽胞杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如毕赤酵母、酿酒酵母细胞；植物细胞；果蝇S2 或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择NK细胞为宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用 CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的蛋白质可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

载体

本发明还提供了含有本发明多核苷酸的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常通过可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、 5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

所述表达盒或核酸序列可被克隆入许多类型的载体。例如，该表达盒或核酸序可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584； WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启 动转录。

合适的启动子的一个例子为早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物(如人T细胞)、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

制备方法

本发明还提供了制备本发明第一方面所述的工程化免疫细胞的方法，所述制备方法如本发明第二方面所述。

在一个具体实施方式中，本发明提供了一种工程化免疫细胞的制备方法，包括如下步骤：

S1:以CD3ζ作为CAR的胞内信号段，以CD28跨膜区作为跨膜区，CD28胞内区作为共刺激因子，人NKG2D胞外结合区来识别NKG2DL，构成一个特异性识别 NKG2DL的嵌合抗原受体,并人工合成对应的核苷酸序列： NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ，同时通过P2A的核苷酸序列将CAR与CXCR3的核苷酸序列连接起来，构成一个融合基因：NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ-P2A-CXCR3。

S2：将所述融合基因片段插入到慢病毒表达质粒中，得到目的质粒。包装成携带NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ-P2A-CXCR3的慢病毒。

S3：将NK-92细胞密度调整至1×10⁵个/ml，按体积比(病毒浓缩液：培养基＝ 1:5-10)添加病毒浓缩液，同时添加polybrene 8ug/ml。24小时后，将细胞离心，继续按体积比(病毒浓缩液：培养基＝1:5-10)添加病毒浓缩液，同时添加polybrene 8ug/ml第二次感染NK-92细胞。48小时后，将细胞离心，使用正常培养基培养NK-92 细胞，每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2-3×10⁵/ml。72h后进行anti-myc磁珠分选NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ-P2A-CXCR3NK-92细胞，继续培养 NKG2D-CD8α-CD28-CD3ζ-P2A-CXCR3NK-92阳性细胞并扩大培养。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞 /ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括含本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，NK细胞)进行的治疗性应用。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NK细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明第一方面所述的免疫细胞，如表达CXCR3的靶向NKG2DL的CAR-NK细胞。

在一个实施方式中，本发明CAR-NK就可以治疗表达该抗原的所有癌症。另外， CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰NK细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗NKG2DL CAR-NK细胞引起抗表达NKG2DL的细胞的特异性免疫应答。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤、或其组合。

本发明的CAR-NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生： i)扩展细胞，ii)将本发明表达盒引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用含本发明表达盒的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。本发明CAR-NK细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

通常地，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。因此，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的NK细胞。

本发明的CAR-NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的 NK细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞 /kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。NK细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等， NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的 NK细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的NK细胞组合物优选通过i.v.注射施用。NK细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将NK 细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合 (例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对 PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的NK细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合 (例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁵个至1×10¹⁰个本发明经修饰的NK细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

1)将非特异性的免疫细胞改造为能够识别肿瘤表面相关抗原，并表达趋化因子受体CXCR3。

2)将免疫细胞富集在特定部位并对特定肿瘤细胞靶向杀伤。

3)增强免疫细胞向肿瘤浸润的能力，克服传统免疫细胞难以浸润到肿瘤中。

4)抗原靶向特异性和免疫细胞迁移特异性，降低了脱靶副作用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。

实施例1：CAR-NKG2D-P2A-CXCR3载体合成

在本实施例中，通过全基因合成的方法，合成了人NKG2D胞外段，人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人CD3ζ胞内信号区，通过P2A与人CXCR3 串联构成的基因片段，并且在两端分别连接Xba I和BamH I酶切位点。

实施例2：构建重组CAR-NKG2D-P2A-CXCR3慢病毒载体

在本实施例中，将实施例1得到的CAR-NKG2D-P2A-CXCR3(SEQ ID NO:2) 基因片段克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒载体上，如图1所示。采用限制性内切酶Xba I和BamH I，分别酶切 pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒载体及CAR-NKG2D-P2A-CXCR3 基因片段，得到酶切后线性化的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒载体以及酶切后的CAR-NKG2D-P2A-CXCR3基因片段，采用T4DNA连接酶体系，在 16℃下孵育过夜。然后转化Stbl3感受态细胞，筛选阳性菌落，提取阳性菌落的质粒，得到CAR-NKG2D-P2A-CXCR3-pCDH表达载体。

1.双酶切pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒载体

双酶切反应体系如下(50μl)：

酶切条件为37℃，30min。

2.双酶切CAR-NKG2D-P2A-CXCR3基因片段

双酶切反应体系如下(50μl)：

酶切条件为37℃，30min。

3.连接pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-Puro慢病毒载体和 CAR-NKG2D-P2A-CXCR3基因片段

连接反应体系如下：

连接反应条件：16℃过夜

实施例3：慢病毒表达载体质粒制备

用实施例2中获得的连接表达载体转化Stbl3大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，Xba I和BamH I双酶切鉴定，获得 CAR-NKG2D-CXCR3-pCDH慢病毒转染质粒，质粒载体构建图见图1，双酶切鉴定图见图2。

实施例4：慢病毒制备

在本实施例中，进行慢病毒的制备，主要步骤如下：

(1)转染前6小时，以每皿约8.5×10⁶将293T细胞接种至10cm培养皿中。确保转染时细胞在80％左右的汇合度且均匀分布于培养皿中。

(2)准备溶液A和溶液B：

溶液A：4ml 2×HEPES buffer缓冲液(8个10cm培养皿一起包装的量)。溶液B：分以加入以下质粒的混合物：72ug CAR-NKG2D-CXCR3(target plasmid)； 37.04ug PLP1；34.8ug PLP2；24.08ug PLP-VSVG；400μl 2.5M钙离子溶液。溶液B 总体积：4ml。

充分混匀溶液B，轻轻涡旋溶液A的同时，逐滴加入溶液B，静置3-5分钟。轻轻涡旋上述A和B的混合溶液，逐滴加入含293T细胞的培养皿中，每个10cm培养皿加入1ml A和B的混合液，轻轻前后晃动培养皿使DNA与钙离子的混合物均匀分布(不要旋转培养皿)，放置于培养箱中培养12-16小时。更换新鲜培养基，继续培养， 48小时后收集含病毒的上清液。1500rpm/min,离心5分钟,使用0.45μm过滤。将已过滤的含慢病毒的上清液转移至超速离心管中。在离心管底部小心铺上一层20％蔗糖 (每8ml上清液加1ml蔗糖)。以PBS平衡离心管，27600rpm/min，4℃离心2小时。小心取出离心管，倒掉上清液，倒置离心管去掉残余液体。加入150μl PBS，使用移液枪在管底部，轻轻吹打几次，溶解病毒，浓缩的病毒分装于离心管，置于-80℃保存。

实施例5：CAR-NKG2D-P2A-CXCR3NK-92细胞制备

将NK-92细胞密度调整至1×10⁵个/ml，按体积比(病毒浓缩液：培养基＝1:5-10)添加病毒浓缩液，同时添加polybrene 8ug/ml。24小时后，将细胞离心，继续按体积比(病毒浓缩液：培养基＝1:5-10)添加病毒浓缩液，同时添加polybrene 8ug/ml 第二次感染NK-92细胞。48小时后，将细胞离心，使用正常培养基培养NK-92细胞，每隔1-2天进行补液，使维持细胞密度在2-3×10⁵/ml。72h后进行anti-myc磁珠分选 CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞，继续培养CAR-NKG2D-CXCR3NK-92阳性细胞并扩大培养。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。

结果如图2所示。A-C流式检测结果:A图流式检测进样的样品为普通NK92细胞，区域圈出的CAR载体感染效率，该群细胞作为阴性对照；B图流式检测进样的样品为CAR-NKG2DNK-92细胞，区域圈出的为CAR-NKG2D NK-92细胞；C图流式检测进样的样品为CAR-NKG2D-P2A-CXCR3NK-92细胞，区域圈出的为CAR-NKG2D-P2A-CXCR3NK-92细胞。

A/B/C图，用FITC荧光通道分析的细胞GFP。由于A图分析的是未经转染的 NK-92细胞，所以以此做对照画门，方框内表示CAR分子染色阳性，方框左侧区域表示CAR分子检测阴性。B/C图为转染后的CAR NK-92细胞检测，检测发现其细胞分布在方框内，表示细胞表面表达CAR结构，证明CAR NK-92细胞制备成功。

实施例6：CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞体外活性检测

在本实施例中，使用CCK-8方法进行检测，即检测CAR-NKG2D NK-92和 CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞对K562细胞的杀伤效应。

具体步骤如下：

(1)在96孔板中加入100μl K562细胞悬液(1X10⁴个/孔)。每孔加入100μl效应细胞，效应细胞与靶细胞数目的比例按照为1:1，5:1，10:1。

(2)培养基对照孔只加200μl培养基，单独效应细胞或靶细胞孔，用培养基补至200μl；每个实验置五个复孔。效应细胞与靶细胞共孵育4小时。

(3)每孔加入10ul CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4h。

(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

(5)杀伤率＝[1-(As-Acn)/(Ack-Ab)]×100％

As：试验孔(含有K562细胞的培养基、CARNK-92或NK-92、CCK-8)

Ack：K562对照孔(含有K562细胞的培养基、CCK-8)

Acn：NK-92对照孔(含有CAR NK-92或NK-92细胞的培养基、CCK-8)

Ab：空白对照(不含细胞的培养基、CCK-8)。

如图4所示实验结果显示，制备的CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞能够提高对 K562靶细胞的杀伤能力，并且CXCR3不影响CAR-NKG2D NK-92细胞的杀伤效果。

实施例7：CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞体外迁移实验

预先在24孔板加入600μl 50ng/ml CXCL10培养基或者不含CXCL10的培养基，放入直径6.5mm，孔径5μm的transwell嵌套，上部加入体积100μl含1.5×10⁵个CAR NK-92或者未经修饰的NK-92细胞，培养板放回37℃培养箱，培养5个小时。对下层细胞计数。

细胞迁移率计算公式：

迁移率＝[(实验组-自发(下层仅培养基)/最大数(1.5×10⁵)-自发]×100％

如图5所示实验结果显示，制备的CAR-NKG2D-CXCR3NK-92细胞迁移率显著提高，更易向分泌CXCR3配体的肿瘤细胞迁移。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海尚泰生物技术有限公司

<120> 一种增强向肿瘤部位迁移的嵌合抗原受体载体构建方法与应用

<130> P2019-0112

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 810

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro

20 25 30

Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr

35 40 45

Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu

50 55 60

Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr

65 70 75 80

Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp

85 90 95

Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp

100 105 110

Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys

115 120 125

Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn

130 135 140

Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Phe

145 150 155 160

Gly Gly Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Arg Ser Ala Leu

165 170 175

Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro

180 185 190

Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

195 200 205

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro

210 215 220

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Val Lys Pro Phe

225 230 235 240

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

245 250 255

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

260 265 270

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

275 280 285

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

290 295 300

Tyr Arg Ser Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

305 310 315 320

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

325 330 335

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

340 345 350

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

355 360 365

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

370 375 380

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

385 390 395 400

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

405 410 415

Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln

420 425 430

Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Val Leu Glu Val Ser

435 440 445

Asp His Gln Val Leu Asn Asp Ala Glu Val Ala Ala Leu Leu Glu Asn

450 455 460

Phe Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Gly Glu Asn Glu Ser Asp Ser Cys Cys

465 470 475 480

Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gln Asp Phe Ser Leu Asn Phe Asp Arg Ala

485 490 495

Phe Leu Pro Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Phe Leu Leu Gly Leu Leu Gly

500 505 510

Asn Gly Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Ser Arg Arg Thr Ala Leu Ser

515 520 525

Ser Thr Asp Thr Phe Leu Leu His Leu Ala Val Ala Asp Thr Leu Leu

530 535 540

Val Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ala Val Asp Ala Ala Val Gln Trp Val

545 550 555 560

Phe Gly Ser Gly Leu Cys Lys Val Ala Gly Ala Leu Phe Asn Ile Asn

565 570 575

Phe Tyr Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Cys Ile Ser Phe Asp Arg Tyr

580 585 590

Leu Asn Ile Val His Ala Thr Gln Leu Tyr Arg Arg Gly Pro Pro Ala

595 600 605

Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Val Trp Gly Leu Cys Leu Leu Phe

610 615 620

Ala Leu Pro Asp Phe Ile Phe Leu Ser Ala His His Asp Glu Arg Leu

625 630 635 640

Asn Ala Thr His Cys Gln Tyr Asn Phe Pro Gln Val Gly Arg Thr Ala

645 650 655

Leu Arg Val Leu Gln Leu Val Ala Gly Phe Leu Leu Pro Leu Leu Val

660 665 670

Met Ala Tyr Cys Tyr Ala His Ile Leu Ala Val Leu Leu Val Ser Arg

675 680 685

Gly Gln Arg Arg Leu Arg Ala Met Arg Leu Val Val Val Val Val Val

690 695 700

Ala Phe Ala Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His Leu Val Val Leu Val Asp

705 710 715 720

Ile Leu Met Asp Leu Gly Ala Leu Ala Arg Asn Cys Gly Arg Glu Ser

725 730 735

Arg Val Asp Val Ala Lys Ser Val Thr Ser Gly Leu Gly Tyr Met His

740 745 750

Cys Cys Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ala Phe Val Gly Val Lys Phe Arg

755 760 765

Glu Arg Met Trp Met Leu Leu Leu Arg Leu Gly Cys Pro Asn Gln Arg

770 775 780

Gly Leu Gln Arg Gln Pro Ser Ser Ser Arg Arg Asp Ser Ser Trp Ser

785 790 795 800

Glu Thr Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Gly Leu

805 810

<210> 2

<211> 2433

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggctagct tattcaacca agaagttcaa attcccttga ccgaaagtta ctgtggccca 120

tgtcctaaaa actggatatg ttacaaaaat aactgctacc aattttttga tgagagtaaa 180

aactggtatg agagccaggc ttcttgtatg tctcaaaatg ccagccttct gaaagtatac 240

agcaaagagg accaggattt acttaaactg gtgaagtcat atcattggat gggactagta 300

cacattccaa caaatggatc ttggcagtgg gaagatggct ccattctctc acccaaccta 360

ctaacaataa ttgaaatgca gaagggagac tgtgcactct atgcctcgag ctttaaaggc 420

tatatagaaa actgttcaac tccaaatacg tacatctgca tgcaaaggac tgtggaattc 480

ggtggcgaac aaaagttgat ttctgaagaa gatttgagat ctgccctgag caactccatc 540

atgtacttca gccacttcgt gccggtcttc ctgccagcga agcccaccac gacgccagcg 600

ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 660

gcgagccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggacgt caagcccttt 720

tgggtgctgg tggtggttgg tggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 780

tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 840

atgactcccc gccgcccagg gcctacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 900

gacttcgcag cctatcgctc cggaagagtg aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg 960

taccagcagg gccagaacca gctctataac gagctcaatc taggacgaag agaggagtac 1020

gatgttttgg acaagagacg tggccgggac cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag 1080

aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg cagaaagata agatggcgga ggcctacagt 1140

gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt 1200

ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1260

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 1320

ggacctatgg tccttgaggt gagtgaccac caagtgctaa atgacgccga ggttgccgcc 1380

ctcctggaga acttcagctc ttcctatgac tatggagaaa acgagagtga ctcgtgctgt 1440

acctccccgc cctgcccaca ggacttcagc ctgaacttcg accgggcctt cctgccagcc 1500

ctctacagcc tcctctttct gctggggctg ctgggcaacg gcgcggtggc agccgtgctg 1560

ctgagccggc ggacagccct gagcagcacc gacaccttcc tgctccacct agctgtagca 1620

gacacgctgc tggtgctgac actgccgctc tgggcagtgg acgctgccgt ccagtgggtc 1680

tttggctctg gcctctgcaa agtggcaggt gccctcttca acatcaactt ctacgcagga 1740

gccctcctgc tggcctgcat cagctttgac cgctacctga acatagttca tgccacccag 1800

ctctaccgcc gggggccccc ggcccgcgtg accctcacct gcctggctgt ctgggggctc 1860

tgcctgcttt tcgccctccc agacttcatc ttcctgtcgg cccaccacga cgagcgcctc 1920

aacgccaccc actgccaata caacttccca caggtgggcc gcacggctct gcgggtgctg 1980

cagctggtgg ctggctttct gctgcccctg ctggtcatgg cctactgcta tgcccacatc 2040

ctggccgtgc tgctggtttc caggggccag cggcgcctgc gggccatgcg gctggtggtg 2100

gtggtcgtgg tggcctttgc cctctgctgg accccctatc acctggtggt gctggtggac 2160

atcctcatgg acctgggcgc tttggcccgc aactgtggcc gagaaagcag ggtagacgtg 2220

gccaagtcgg tcacctcagg cctgggctac atgcactgct gcctcaaccc gctgctctat 2280

gcctttgtag gggtcaagtt ccgggagcgg atgtggatgc tgctcttgcg cctgggctgc 2340

cccaaccaga gagggctcca gaggcagcca tcgtcttccc gccgggattc atcctggtct 2400

gagacctcag aggcctccta ctcgggcttg tga 2433

<210> 3

<211> 135

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly

1 5 10 15

Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe

20 25 30

Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser

35 40 45

Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu

50 55 60

Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro

65 70 75 80

Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn

85 90 95

Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala

100 105 110

Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr

115 120 125

Ile Cys Met Gln Arg Thr Val

130 135

<210> 4

<211> 405

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60

aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120

gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180

gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240

acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300

attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360

aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405

<210> 5

<211> 246

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe

1 5 10 15

Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser

35 40 45

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Val Lys

50 55 60

Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser

65 70 75 80

Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg

85 90 95

Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro

100 105 110

Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe

115 120 125

Ala Ala Tyr Arg Ser Gly Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

130 135 140

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

145 150 155 160

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

165 170 175

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

180 185 190

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

195 200 205

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

210 215 220

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

225 230 235 240

Gln Ala Leu Pro Pro Arg

245

<210> 6

<211> 738

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gccctgagca actccatcat gtacttcagc cacttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 60

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 120

ctgtccctgc gcccagaggc gagccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 180

ctggacgtca agcccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 240

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 300

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgcccagggc ctacccgcaa gcattaccag 360

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctccg gaagagtgaa gttcagcagg 420

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 480

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 540

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 600

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 660

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 720

caggccctgc cccctcgc 738

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 9

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

Met Val Leu Glu Val Ser Asp His Gln Val Leu Asn Asp Ala Glu Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Leu Glu Asn Phe Ser Ser Ser Tyr Asp Tyr Gly Glu Asn

20 25 30

Glu Ser Asp Ser Cys Cys Thr Ser Pro Pro Cys Pro Gln Asp Phe Ser

35 40 45

Leu Asn Phe Asp Arg Ala Phe Leu Pro Ala Leu Tyr Ser Leu Leu Phe

50 55 60

Leu Leu Gly Leu Leu Gly Asn Gly Ala Val Ala Ala Val Leu Leu Ser

65 70 75 80

Arg Arg Thr Ala Leu Ser Ser Thr Asp Thr Phe Leu Leu His Leu Ala

85 90 95

Val Ala Asp Thr Leu Leu Val Leu Thr Leu Pro Leu Trp Ala Val Asp

100 105 110

Ala Ala Val Gln Trp Val Phe Gly Ser Gly Leu Cys Lys Val Ala Gly

115 120 125

Ala Leu Phe Asn Ile Asn Phe Tyr Ala Gly Ala Leu Leu Leu Ala Cys

130 135 140

Ile Ser Phe Asp Arg Tyr Leu Asn Ile Val His Ala Thr Gln Leu Tyr

145 150 155 160

Arg Arg Gly Pro Pro Ala Arg Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Val Trp

165 170 175

Gly Leu Cys Leu Leu Phe Ala Leu Pro Asp Phe Ile Phe Leu Ser Ala

180 185 190

His His Asp Glu Arg Leu Asn Ala Thr His Cys Gln Tyr Asn Phe Pro

195 200 205

Gln Val Gly Arg Thr Ala Leu Arg Val Leu Gln Leu Val Ala Gly Phe

210 215 220

Leu Leu Pro Leu Leu Val Met Ala Tyr Cys Tyr Ala His Ile Leu Ala

225 230 235 240

Val Leu Leu Val Ser Arg Gly Gln Arg Arg Leu Arg Ala Met Arg Leu

245 250 255

Val Val Val Val Val Val Ala Phe Ala Leu Cys Trp Thr Pro Tyr His

260 265 270

Leu Val Val Leu Val Asp Ile Leu Met Asp Leu Gly Ala Leu Ala Arg

275 280 285

Asn Cys Gly Arg Glu Ser Arg Val Asp Val Ala Lys Ser Val Thr Ser

290 295 300

Gly Leu Gly Tyr Met His Cys Cys Leu Asn Pro Leu Leu Tyr Ala Phe

305 310 315 320

Val Gly Val Lys Phe Arg Glu Arg Met Trp Met Leu Leu Leu Arg Leu

325 330 335

Gly Cys Pro Asn Gln Arg Gly Leu Gln Arg Gln Pro Ser Ser Ser Arg

340 345 350

Arg Asp Ser Ser Trp Ser Glu Thr Ser Glu Ala Ser Tyr Ser Gly Leu

355 360 365

<210> 10

<211> 1107

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

atggtccttg aggtgagtga ccaccaagtg ctaaatgacg ccgaggttgc cgccctcctg 60

gagaacttca gctcttccta tgactatgga gaaaacgaga gtgactcgtg ctgtacctcc 120

ccgccctgcc cacaggactt cagcctgaac ttcgaccggg ccttcctgcc agccctctac 180

agcctcctct ttctgctggg gctgctgggc aacggcgcgg tggcagccgt gctgctgagc 240

cggcggacag ccctgagcag caccgacacc ttcctgctcc acctagctgt agcagacacg 300

ctgctggtgc tgacactgcc gctctgggca gtggacgctg ccgtccagtg ggtctttggc 360

tctggcctct gcaaagtggc aggtgccctc ttcaacatca acttctacgc aggagccctc 420

ctgctggcct gcatcagctt tgaccgctac ctgaacatag ttcatgccac ccagctctac 480

cgccgggggc ccccggcccg cgtgaccctc acctgcctgg ctgtctgggg gctctgcctg 540

cttttcgccc tcccagactt catcttcctg tcggcccacc acgacgagcg cctcaacgcc 600

acccactgcc aatacaactt cccacaggtg ggccgcacgg ctctgcgggt gctgcagctg 660

gtggctggct ttctgctgcc cctgctggtc atggcctact gctatgccca catcctggcc 720

gtgctgctgg tttccagggg ccagcggcgc ctgcgggcca tgcggctggt ggtggtggtc 780

gtggtggcct ttgccctctg ctggaccccc tatcacctgg tggtgctggt ggacatcctc 840

atggacctgg gcgctttggc ccgcaactgt ggccgagaaa gcagggtaga cgtggccaag 900

tcggtcacct caggcctggg ctacatgcac tgctgcctca acccgctgct ctatgccttt 960

gtaggggtca agttccggga gcggatgtgg atgctgctct tgcgcctggg ctgccccaac 1020

cagagagggc tccagaggca gccatcgtct tcccgccggg attcatcctg gtctgagacc 1080

tcagaggcct cctactcggg cttgtga 1107

<210> 11

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 11

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu

1 5 10

<210> 13

<211> 62

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe

1 5 10 15

Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Ser

35 40 45

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

50 55 60

<210> 14

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 14

gccctgagca actccatcat gtacttcagc cacttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 60

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 120

ctgtccctgc gcccagaggc gagccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 180

ctggac 186

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

1 5 10 15

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 16

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

aagccctttt gggtgctggt ggtggttggt ggagtcctgg cttgctatag cttgctagta 60

acagtggcct ttattatttt ctgggtg 87

<210> 17

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 17

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 18

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgccca 60

gggcctaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120

tcc 123

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 20

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 20

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (15)

1.一种工程化的免疫细胞，其特征在于，所述工程化的免疫细胞表达一融合蛋白，所述的融合蛋白包含靶向NKG2DL的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体；

其中，所述融合蛋白的结构如下式I所示：

L-S-B-H-TM-C-CD3ζ-A-Q(I)

式中，所述“-”连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向NKG2DL的抗原结合结构域；

B为无或MYC标签；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽P2A；

Q为CXCR3；

并且，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，并且所述的免疫细胞是NK92细胞。

2.一种制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(A)提供一待改造的免疫细胞；和

(B)对所述的免疫细胞进行改造，从而使得所述的免疫细胞表达靶向NKG2DL的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体，从而获得权利要求1所述的工程化的免疫细胞。

3.一种用于制备权利要求1所述的工程化的免疫细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有容器，以及位于容器内的：

(1)第一多核苷酸序列，所述第一多核苷酸序列含有用于表达所述CAR的第一表达盒；和

(2)第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸序列含有用于表达所述CXCR3的第二表达盒。

4.一种制剂，其特征在于，所述制剂含有权利要求1所述的工程化的免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

5.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂的剂型包括注射剂。

6.如权利要求4所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml。

7.如权利要求6所述的制剂，其特征在于，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

8.如权利要求1所述的工程化的免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

11.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、肺鳞癌、肛门癌、头颈部肿瘤、或其组合。

12.一种融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含靶向NKG2DL的嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体，所述融合蛋白的结构如下式II所示：

L-S-B-H-TM-C-CD3ζ-A-Q(II)

式中，所述“-”连接肽或肽键；

L为无或信号肽序列；

S为靶向NKG2DL的抗原结合结构域；

B为无或MYC标签；

H为无或铰链区；

TM为跨膜结构域；

C为共刺激信号分子；

CD3ζ为源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

A为连接肽P2A；

Q为CXCR3；

其中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

13.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求12所述的融合蛋白。

14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

15.一种载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求13所述的多核苷酸。

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