CN113789304A

CN113789304A - 高亲和力tcr及其应用

Info

Publication number: CN113789304A
Application number: CN202111200167.9A
Authority: CN
Inventors: 王智鼎; 于力
Original assignee: Shenzhen University General Hospital
Current assignee: Shenzhen University General Hospital
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2021-12-14
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113789304B

Abstract

本发明提供了高亲和力TCR及其应用，本发明的TCR可用于诊断、治疗和预防癌性疾病。本发明还提出了编码本发明TCR的多核苷酸、包含这些多核苷酸的载体、细胞和组合物。

Description

高亲和力TCR及其应用

技术领域

本发明属于细胞免疫学、基因工程领域，涉及一种高亲和力TCR及其应用。

背景技术

TCR基因修饰T细胞的过继性免疫治疗克服了传统过继性免疫治疗的缺陷，研究者从能够特异性识别和杀伤肿瘤细胞的效应T细胞中克隆获得TCRα和β链基因片段，通过基因工程手段将基因片段插入逆转录病毒或慢病毒等基因转导载体中，通过不同基因转导技术将TCR基因转导至外周血T细胞，经大量扩增后回输患者，从而获得特异性TCR基因转染的T细胞。即通过对患者无能T细胞抗原特异性的再定向(redirect)，获得肿瘤反应性T细胞(Murphy A,Westwood JA,Teng MWL,et al.Gene modification strategies to inducetumor immunity[J].Immunity,2005,22:403-414.)。TCR基因修饰的T细胞过继性转移可以诱导某些特定的T细胞瞬时增殖，并允许引入T细胞池中没有的特异性TCR，使其表达抗原特异性TCR，成为能够特异性识别肿瘤抗原的CTL，分泌如IFN-y,IL-2和TNF-a等细胞因子，发挥细胞毒作用，增强免疫系统介导的对肿瘤细胞的消除，是近年来获得较高关注的一种特异性、无毒性的癌症新疗法，此方法对于治疗血液性和实体恶性肿瘤具有一定效果(Varela-Rohena A,Carpenito C,Perez EE,et al.Genetic engineering of T cellsfor adoptive immunotherapy[J].Immunol Res.,2008,42(1-3):166-181；HeemskerkMH.T cell receptor gene transfer for the treatment of leukemia and othertumors[J].Haematologica,2010,95(1):15-19.)。

虽然上述研究证明了TCR基因治疗的可行性和十分广阔的应用前景，但此方法所带来的副作用却不容忽视，临床有效率相对较低。目前，对转TCR基因进行优化以提高转TCR基因在T细胞免疫治疗中的功能成为热点。主要的策略包括提高TCR基因在转T细胞中的亲和力、优化其配对以及增强其表面表达效率。

大多数肿瘤相关抗原(TAA)也表达于正常组织细胞，T细胞对这些抗原的识别通常处于低亲和力状态以避免自身免疫，这是肿瘤细胞能够逃避机体的免疫攻击的机制之一。另外当肿瘤长期存在时，与未成熟或幼稚免疫活性细胞接触，就可能诱发机体对肿瘤抗原产生免疫耐受，也就是机体将肿瘤抗原当成是自身抗原。因此，寻找有效的肿瘤靶抗原，克隆出高亲和力的TCR，以及优化TCR的转化效率，对于过继性免疫治疗具有重要的意义。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供改造的TCR，当将该改造的TCR引入自体免疫细胞并再输注入患者时，其具有改善的治疗效果。

本发明第一方面提供了T细胞受体，包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO：9-11任一所示的氨基酸序列的β链CDR3。

进一步，所述T细胞受体还包含具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的α链CDR1和CDR2；和/或具有SEQ ID NO：5-7任一所示的氨基酸序列的β链CDR1和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的β链CDR2。

进一步，其中所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少80％、诸如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20的氨基酸序列具有至少80％、诸如81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少95％、诸如96％、97％、98％、99％或100％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的的氨基酸序列具有至少95％、诸如96％、97％、98％、99％或100％同一性的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的氨基酸序列所示的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的β链可变区。

进一步，所述T细胞受体为可溶性T细胞受体。

进一步，所述T细胞受体进一步包含可检测标记。

进一步，所述T细胞受体共价地结合治疗剂。

进一步，其中所述治疗剂是免疫毒素或化学治疗剂。

本发明第二方面提供了多价T细胞受体复合物，其包含多个根据本发明第一方面所述的T细胞受体。

进一步，所述多价T细胞受体包含2、3、4或更多个彼此结合的T细胞受体。

进一步，其中所述多价T细胞受体存在于脂质双层中、脂质体中，或连接至纳米颗粒。

进一步，所述T细胞受体经由接头分子彼此结合。

本发明第三方面提供了多肽，编码本发明第一方面所述的T细胞受体或本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物。

本发明第四方面提供了多核苷酸，编码本发明第三方面所述的多肽。

本发明第五方面提供了载体，编码本发明第一方面所述的T细胞受体或本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物。

进一步，编码T细胞受体的序列是在启动子的控制下。

进一步，所述载体是病毒载体。

进一步，所述病毒载体是逆转录病毒载体。

进一步，载体进一步编码接头结构域。

进一步，所述接头结构域位于α链和β链之间。

进一步，所述接头结构域包含一个或多个切割位点。

进一步，所述一个或多个切割位点是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点。

进一步，所述一个或多个切割位点被间隔物隔开。

本发明第六方面提供了细胞，被工程改造成表达本发明第一方面所述的T细胞受体或本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物中任一项所述的T细胞受体。

进一步，所述细胞是T细胞、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞或诱导的多能干细胞。

进一步，所述细胞是免疫细胞。

进一步，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞。

进一步，所述T细胞是调节性T细胞。

进一步，所述细胞是自体的。

进一步，所述细胞是同种异体的。

本发明第七方面提供了一种用于工程改造本发明第六方面所述的细胞的方法，包括使所述免疫细胞与本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物，或本发明第五方面所述的载体接触。

进一步，所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。

进一步，所述接触进一步为转染或转导。

进一步，所述免疫细胞是经刺激的淋巴细胞。

进一步，所述经刺激的淋巴细胞是人淋巴细胞。

进一步，所述方法进一步包括将免疫细胞分选以分离TCR工程改造的T细胞。

进一步，所述方法进一步包括通过连续稀释执行T细胞克隆。

进一步，所述方法进一步包括通过快速扩增方案来扩增T细胞克隆。

本发明第八方面提供了组合物，包括本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物，本发明第三方面所述的多肽，本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的载体或本发明第六方面所述的细胞。

本发明第九方面提供了如下任一项所述的应用:

(1)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物，本发明第三方面所述的多肽，本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的载体，本发明第六方面所述的细胞或本发明第八方面所述的组合物在制备治疗肿瘤、病原体感染或增强个体免疫的产品中的应用。

进一步，所述肿瘤为血液肿瘤。

进一步，所述血液肿瘤为白血病。

进一步，所述白血病为急性白血病。

进一步，所述白血病为急性髓系白血病。

(2)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物，本发明第三方面所述的多肽，本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的载体，本发明第六方面所述的细胞或本发明第八方面所述的组合物在抗原筛选、疫苗制备中的应用。

(3)本发明第一方面所述的T细胞受体，本发明第二方面所述的多价T细胞受体复合物，本发明第三方面所述的多肽，本发明第四方面所述的多核苷酸，本发明第五方面所述的载体，本发明第六方面所述的细胞或本发明第八方面所述的组合物在抗原检测中的应用。

附图说明

图1是TCR-T对白血病细胞NB4杀伤功能检测图。

发明详述

在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、免疫学实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

T细胞受体

在不同的方面，本文提供了T细胞受体(TCR)(例如，SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:12-20)。TCR的抗原结合区域可以作为包含抗原结合区的细胞外结构域包含在嵌合抗原受体(CAR)中。可以将TCR转染进细胞(例如，自体或同种异体细胞)中，所述细胞可以用在过继性细胞转移疗法中。在某些实施方案中，将CAR人源化以降低免疫原性(hCAR)。

在某些实施方案中，可以遗传工程改造本公开内容的宿主细胞，诸如T细胞(例如，CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、γδT细胞和Treg)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)、诱导的多能干(iPS)细胞，以表达抗原受体诸如经工程改造的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。例如，修饰自体细胞或同种异体细胞(例如，分离自脐带)以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，所述经工程改造的TCR具有α链CDR3和/或β链CDR3，所述α链CDR3与SEQ ID NO:3具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性，所述β链CDR3与SEQ ID NO:9-11任一氨基酸序列具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性。某些实施方案中，所述TCR具有α链和/或β链，所述α链与SEQ ID NO:4具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性，所述β链与SEQ ID NO:12-20任一氨基酸序列具有至少80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性。合适的修饰方法是本领域已知的。

在某些实施方案中，所述遗传工程改造的抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”表示这样的分子：其含有可变α和β链(分别也被称作TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(分别也被称作TCRy和TCRδ)，且其能够特异性地结合与MHC受体结合的抗原肽。在某些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。在某些实施方案中，所述经工程改造的TCR具有SEQ ID NO:3的α链CDR3和/或SEQ ID NO:9-11任一所示的β链CDR3。在某些实施方案中，所述TCR分别具有SEQ ID NO:4所示的α链和SEQ ID NO:12-20任一所示的β链。

一般来说，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以出现在细胞表面上或呈可溶形式。通常，TCR出现在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在那里它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在某些实施方案中，TCR也可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾巴例如，在某些方面，TCR的每条链可以具有一个N-端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区和一个在C-末端端部处的短细胞质尾巴。在某些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的恒定蛋白结合。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。因而，就本文的目的而言，对TCR的提及包括任何TCR或功能片段，例如与在MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可互换使用，表示这样的分子：其含有TCR的结构性结构域的一部分，但结合完全TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)。在某些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，诸如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常其中每条链含有三个互补性决定区。

在某些实施方案中，TCR链的可变结构域结合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补性决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点来赋予抗原识别和决定肽特异性并决定肽特异性。一般来说，与免疫球蛋白类似，CDR被框架区(FR)隔开在某些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已被证实与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。在某些实施方案中，β-链的可变区可以含有另一个高变异性(HV4)区域。

在某些实施方案中，所述TCR链含有恒定结构域。例如，与免疫球蛋白类似，TCR链(例如，α-链、β-链)的细胞外部分可以含有两个免疫球蛋白结构域、一个在N端的可变结构域、以及一个与细胞膜相邻的恒定结构域。例如，在某些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个近膜端恒定结构域和两个含有CDR的远膜端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。在某些实施方案中，TCR可以具有在α链和β链的每一个中的额外半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。

在某些实施方案中，所述TCR链可以含有一个跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域是带正电荷的。在某些情况下，所述TCR链含有一个细胞质尾巴。在某些情况下，所述结构允许TCR与其它分子(如CD3)结合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白锚定在细胞膜中并与CD3信号传导器或复合物的恒定亚基结合。

一般来说，CD3是可以具有三条不同链(γ、δ和ε)(在哺乳动物中)和δ链的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，所述复合物可以含有一个CD3γ链、一个CD3δ链、两个CD3ε链以及CD3δ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链结合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾巴各自含有单个保守基序(称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM)，而每个CD3δ链具有三个保守基序。通常，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从TCR传送到细胞中发挥作用。CD3链和δ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。

在某些实施方案中，所述TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异源二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在某些实施方案中，所述TCR是含有例如通过一个或更多个二硫键连接的两条独立链(α和β链或γ和δ链)的异源二聚体。在某些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在某些实施方案中，编码TCR的核酸可从多种来源获得，例如通过公众可得到的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在某些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其它公众可获得的来源。在某些实施方案中，T细胞可获自体内分离的细胞。在某些实施方案中，可以从患者分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在某些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在某些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。在某些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR。在某些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据TCR序列的知识合成地产生。

在某些实施方案中，所述经工程改造的抗原受体包括嵌合抗原受体(CAR)，包括活化性或刺激性CAR、共刺激性CAR和/或抑制性CAR。CAR通常包括在一些方面通过接头和/或跨膜结构域与一个或更多个细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或接近通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的这样的受体的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。在某些实施方案中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如从单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链衍生出的单链抗体片段(scFv)。

CAR的抗原结合结构域的排列可以是多聚体，诸如双体(diabody)或多聚体。通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成所谓的双体，可以形成多聚体。在某些实施方案中，可以缩短或排除CAR的铰链部分(即，产生仅包含抗原结合结构域、跨膜区和细胞内信号传导结构域的CAR)。多种铰链可以与本发明一起使用。在某些实施方案中，铰链区可以具有被保持的第一半胱氨酸或通过脯氨酸或丝氨酸置换而突变的第一半胱氨酸，或被截短直至第一半胱氨酸。可以从用作抗原结合区的scFv删除Fc部分，以产生根据本发明的CAR。在某些实施方案中，抗原结合区可以仅编码Fc结构域之一，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。一种还可以包括人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区域，其已被修饰以改善二聚化和寡聚化。在某些实施方案中，铰链部分可以包含8-14个氨基酸的肽(例如，12个氨基酸的肽)、CD8α的部分或IgG4 Fc，或者由8-14个氨基酸的肽(例如，12个氨基酸的肽)、CD8α的部分或IgG4Fc组成。在某些实施方案中，使用促进寡聚化的结构域诸如CD8α，可以从细胞表面悬挂抗原结合结构域。

CAR的胞内结构域或细胞内信号传导结构域通常可以引起或促进包含CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的激活。例如，胞内结构域可以促进T细胞的效应子功能，例如，细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在初始、记忆或记忆型T细胞中的效应子功能可以包括抗原依赖性增殖。术语“细胞内信号传导结构域”或“胞内结构域”表示CAR的可以转导效应子功能信号和/或指导细胞执行专门功能的部分。尽管通常整个细胞内信号传导结构域都可以包含在CAR中，但在某些情况下，可以包含胞内结构域的截短部分。通常，胞内结构域包括截短的胞内结构域，其中截短的胞内结构域保留在细胞中转导效应子功能信号的能力。

在某些实施方案中，胞内结构域包含T细胞受体的δ链或其任何同源物(例如，ε、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI、和信号传导分子的组合诸如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40以及它们的组合，以及其它相似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其它成员的细胞内信号传导部分，诸如FcγRIII和FcεRI。这些可选的跨膜和细胞内结构域的例子可以参见：例如，Gross等人(1992)，Stancovski等人(1993)，Moritz等人(1994)，Hwu等人(1995)，Weijtens等人(1996)和Hekele等人(1996)，将它们全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，胞内结构域可以包含人CD3δ细胞内结构域。

抗原特异性的细胞外结构域和细胞内信号传导结构域优选地通过跨膜结构域连接。在CAR中可以包含的跨膜结构域包括，例如，人IgG4 Fc铰链和Fc区、人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3δ结构域或半胱氨酸突变的人CD3δ结构域、或来自人跨膜信号传导蛋白的跨膜结构域，例如，CD16和CD8和促红细胞生成素受体。

在某些实施方案中，所述胞内结构域包含编码共刺激受体的序列，所述共刺激受体例如，经修饰的CD28细胞内信号传导结构域或CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10或4-1BB(CD137)共刺激受体。在某些实施方案中，由CD3δ引发的主要信号、由人共刺激受体提供的另外信号可以被包括在CAR中以更有效地激活转化的T细胞，这可以帮助改善过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功。胞内结构域或细胞内受体信号传导结构域可以包含单独的或与FcγRIII共刺激信号传导结构域(例如，CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB)组合的CD3的δ链。在某些实施方案中，所述胞内结构域包含TCRδ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40中的一个或多个的部分或全部。在某些实施方案中，胞内结构域可以包含1、2、3、4或更多个胞质结构域。例如，在某些CAR中已经观察到，融合在一起的至少两个或三个信号传导结构域可以产生累加或协同效应。

在某些方面，可以产生分离的核酸片段和表达盒，其包括编码CAR的DNA序列。可以使用多种载体。在某些优选的实施方案中，载体可以允许将编码CAR的DNA递送至免疫细胞诸如T细胞。CAR表达可以是在受调节的真核启动子(例如MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或泛素启动子)的控制下。并且，如果没有其它原因，载体可以包含选择标记，以促进其体外操作。在某些实施方案中，可以从体外从DNA模板转录的mRNA表达CAR。

嵌合抗原受体分子是重组的，并且通过经由存在于它们的细胞质尾巴中的免疫受体激活基序(ITAM)结合抗原并转导激活信号的能力而区分。利用抗原结合部分(例如，从单链抗体(scFv)产生)的受体构建体会提供成为“通用”的额外优点，因为它们可以以不依赖HLA的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，scFv构建体可以与编码CD3复合物的ζ链(ζ)、Fc受体γ链和sky酪氨酸激酶的细胞内部分的序列融合。已经在几种鼠和人抗原-scFv:ζ系统中记录了重定向的T细胞效应子机制，包括通过CTL的肿瘤识别和溶解。

在某些实施方案中，TCR作为抗原结合结构域(例如，作为scFv区)包含在CAR中，并且CAR进一步包含铰链区、跨膜区和胞内结构域。例如，TCR可以与铰链区、跨膜区和胞内结构域一起包括在CAR中。

在某些实施方案中，本公开内容提供了可溶性TCR，可溶性TCR不仅出于研究特定TCR-pMHC相互作用的目的是有用的，而且潜在地可用作检测感染或检测自身免疫病标志物的诊断工具。可溶性TCR还可应用于染色，例如用于针对在MHC背景下呈递的特定肽抗原的存在而对细胞染色。类似地，可溶性TCR可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈递特定抗原的细胞。可溶性TCR还可用于抑制T细胞，例如，与自身免疫肽抗原反应的那些。

在某些方面，本公开内容提供了一种可溶性的T细胞受体(sTCR)，其包含：(i)TCRα链的全部或部分(例如，SEQ ID NO:4)，除了其跨膜结构域之外，和(ii)TCRβ链的全部或部分(例如，SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20)，除了其跨膜结构域之外，其中(i)和(ii)各自包含TCR链的功能可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并且通过在天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接。

在某些方面，所述可溶性TCR包含借助于一对C-端二聚化肽(诸如亮氨酸拉链)而分别二聚到TCRβ或δ链细胞外结构域的TCRα或γ链细胞外结构域。

本公开内容的可溶性TCR(其优选是人的)可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其它蛋白的形式提供。

本公开内容的多种可溶性TCR可以以多价复合物提供。因此，在一个方面，本公开内容提供了多价T细胞受体(TCR)复合物，其包含多个如本文中所述的可溶性T细胞受体。所述多个可溶性TCR的每一个优选是相同的。

在其最简单的形式中，根据本发明的多价TCR复合物包含优选通过接头分子彼此结合(例如共价地或以其它方式连接)的两个或三个或四个或更多个T细胞受体分子的多聚体。合适的接头分子包括、但不限于多价附接分子，诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中和亲和素和extravidin，它们各自具有四个针对生物素的结合位点。因而，生物素化的TCR分子可以形成到具有多个TCR结合位点的T细胞受体的多聚体中。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于制造多聚体的接头分子的量相关的TCR的量，还取决于是否存在任何其它生物素化的分子。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体TCR复合物。

用于本发明方法中的合适的结构包括膜结构诸如脂质体，以及固体结构，其优选为颗粒，诸如珠子，例如胶乳珠子。可以在外部包被有T细胞受体分子的其它结构也是合适的。优选地，所述结构包被有T细胞受体多聚体而不是包被有单独T细胞受体分子。

在脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可以与膜附接或以其它方式与膜结合。用于此的技术是本领域技术人员众所周知的。

可以在本发明的多价TCR复合物中包括标记或另外的部分(例如毒性或治疗性部分)。例如，标记或另外的部分可以被包含在混合分子多聚体中。这样的多聚体分子的一个例子是四聚体，其含有三个TCR分子和一个过氧化物酶分子。这可以如下实现：以约3:1的摩尔比混合TCR和酶以产生四聚体复合物，并从任何不含有正确分子比例的复合物中分离所期望的复合物。这些经混合的分子可以含有任何分子的组合，前提条件是，空间位阻不会损害或不会显著地损害分子的期望功能。由于不太可能发生空间位阻，链霉抗生物素蛋白分子上的结合位点的定位适合用于混合四聚体。

可替换地或额外地，本公开内容的TCR(或其多价复合物)可以与治疗剂结合(例如与其共价地或以其它方式连接)，所述治疗剂可以是例如可用于细胞杀死中的毒性部分，或者免疫刺激剂(诸如白介素或细胞因子)。与非多聚体的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物可以具有增强的对TCR配体的结合能力。因此，根据本发明的多价TCR复合物特别有益于在体外或在体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作用于生产具有此类用途的另外多价TCR复合物的中间体。因此，TCR或多价TCR复合物可以提供在用于体内应用的药学上可接受的制剂中。

本公开内容还提供了用于将治疗剂递送至靶细胞的方法，所述方法包括在使TCR或多价TCR复合物与靶细胞附接的条件下使潜在的靶细胞与根据本公开内容的TCR或多价TCR复合物接触，所述TCR或多价TCR复合物对TCR配体具有特异性并且具有与之结合的治疗剂。

具体地，可溶性TCR或多价TCR复合物可以用于将治疗剂递送至呈递特定抗原的细胞的位置。这在许多情况下将是有用的，特别是针对肿瘤。可以递送治疗剂，以使其在局部但不仅在其结合的细胞上发挥其作用。因此，一种特定策略设想了与对肿瘤抗原特异的T细胞受体或多价TCR复合物连接的抗肿瘤分子。

许多治疗剂可用于该用途，例如放射性化合物、酶(例如，穿孔蛋白)或化学治疗剂(例如，顺铂)。为了改善在期望位置中的有限毒性效应，可以将毒素提供在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内部，使得化合物缓慢地释放。这可以减少在体内转运期间的损伤作用，并帮助限制毒素效应直到TCR与相关抗原呈递细胞结合之后。

核酸

在一个方面，本公开内容提供了编码分离的TCR、CAR或可溶性肽的核酸。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原特异性肽对应于肿瘤抗原蛋白的部分。术语“核酸”意图包括DNA和RNA，且可以是双链的或单链的。

载体

本发明提供了包含本发明核酸或者多核苷酸的载体。载体包括表达载体或重组表达载体。术语“重组表达载体”在本发明背景下系指允许在合适宿主细胞中表达mRNA、蛋白质或多肽的核酸构建体。

可以将编码本文中公开的核酸掺入到确保肽的良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括、但不限于粘粒、质粒或经修饰的病毒(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要所述载体适合于宿主细胞的转化。

“适合于宿主细胞的转化”的重组表达载体意指，该表达载体含有本发明的核酸分子和可操作地连接到所述核酸分子的基于要用于表达的宿主细胞而选择的调节序列。术语“操作性连接”或“可操作地连接”互换使用，并且意指所述核酸以允许所述核酸表达的方式连接至调节序列。

因此，本发明提供了一种载体或重组表达载体，其包含本发明所述的核酸以及用于转录和翻译所插入的蛋白序列的必需调节序列。合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌、真菌或病毒基因。

合适调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地实现。这样的调节序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，其包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其它序列(例如复制起点、其它DNA限制位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列)也可掺入到表达载体中。还应当理解，必需调节序列可以由天然蛋白和/或它的侧接区域提供。

重组表达载体还可以含有选择性标记基因，其有利于选择转化或转染的宿主细胞。选择性标记基因的例子是编码例如以下的基因：赋予针对某些药物的抗性的蛋白，如G418和潮霉素；β-半乳糖苷酶；氯霉素乙酰转移酶；或萤火虫荧光素酶。通过选择性标记蛋白诸如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶或萤火虫荧光素酶的浓度改变，监测选择性标记基因的转录。如果选择性标记基因编码赋予抗生素抗性(例如新霉素抗性)的蛋白，则可用G418选择转化体细胞。已经掺入选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡。这使得可能使重组表达载体的表达可视化和进行测定，并且具体地确定突变对表达和表型的影响。应当理解，可以将选择标记引入到与目标核酸分开的载体上。

可以将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化体宿主细胞。术语“转化体宿主细胞”意图包括已经用本发明的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用……转化”、“用……转染”、“转化”和“转染”意图包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞中。合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。例如，可以在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达本发明的蛋白。

还可以使用标准技术化学合成本发明的核酸分子。化学合成多聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成类似，已经在商购可得的DNA合成仪中完全自动化。

组合物或药物组合物

在选择的实施方案中，预期可以将表达如本文公开的TCR的细胞、含有TCR的可变区的蛋白、或编码本发明的TCR的可变区的DNA包含在组合物中，并施用给受试者以诱导所述受试者中的治疗性免疫应答。在受试者中用于药物用途的治疗组合物可以包含本文公开的TCR组合物，例如可溶性TCR(任选地连接至成像剂)和药学上可接受的载体。

短语“药物”、“药学上可接受的”、或“药理学上可接受的”表示，当适当地施用给动物例如人时，不会产生不利的、变应性或其它不良反应的分子实体和组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这样的类似材料及其组合，如本领域普通技术人员所公知的。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在本发明的疫苗组合物中的应用。

本文中使用的“保护性免疫应答”表示哺乳动物宿主的免疫系统对癌症的应答。保护性免疫应答可以为癌症的治疗提供治疗效果，例如减小肿瘤大小、增加生存期等。

医学领域的普通技术人员会明白，通过物理和生理学因素诸如体重、病症的严重程度、所治疗的疾病的类型、既往或同时的治疗干预、患者的特发症以及施用途径，可以确定施用给动物或人患者的治疗组合物的实际剂量。在任何情况下，负责施用的从业人员将确定组合物中的活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。

可以静脉内地、真皮内地、动脉内地、腹膜内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、局部地(topically)、肿瘤内地、肌肉内地、腹膜内地、皮下地、结膜下地、囊泡内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、口服地、外用局部地(topically)、局部地(locally)和通过吸入、注射、输注、连续输注、灌洗和局部灌注来施用本文中公开的治疗组合物。如本领域普通技术人员已知的，通过导管，在乳剂中，在脂质组合物中，通过弹道微粒递送，或通过其它方法或前述方法的任何组合，也可以将治疗组合物施用给受试者。

尽管本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可以用在本发明的药物组合物中，但是载体的类型将随施用模式而变化。对于胃肠外施用，诸如皮下注射，载体优选地包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服施用，可以采用上述载体或固体载体中的任一种，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球(例如聚乳酸半乳糖)也可用作本发明的药物组合物的载体。

在某些实施方案中，通过微结构化的透皮或弹道微粒递送，可以施用疫苗组合物。作为疫苗制剂的载体的微结构是疫苗应用的理想构型，并且在本领域中广为人知。在这些实施方案中，支持基底可以包括、但不限于微胶囊、微粒、微球、纳米囊、纳米颗粒、纳米球或它们的组合。

本文中公开的充当TCR(诸如可溶性TCR)的支持基底的微结构或弹道微粒可以由可生物降解的材料和不可生物降解的材料构成，并且这样的支持基底可以由合成的聚合物、二氧化硅、脂质、碳水化合物、蛋白质、凝集素、离子试剂、交联剂和本领域可获得的其它微结构组分构成。用于将本发明的肽固定化到由这样的材料组成的支持基底上的方案和试剂是在商业上和在本领域中可广泛获得的。

在其它实施方案中，疫苗组合物包含本文公开的固定化的或封装的TCR或可溶性TCR和支持基底。在这些实施方案中，支持基底可以包括，但不限于，脂质微球、脂质纳米颗粒、醇质体、脂质体、类脂囊泡、磷脂、鞘脂体、表面活性剂、转移体、乳剂或它们的组合。脂质体以及其它脂质纳米载体和微米载体制剂的形成和使用通常是本领域普通技术人员已知的，并且脂质体、微粒、纳米囊等的应用已被广泛用于治疗剂的递送

可以将TCR配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。

在任何情况下，所述组合物可以包含各种抗氧化剂以阻止一种或多种组分的氧化。另外，通过防腐剂例如各种抗细菌剂和抗真菌剂可以预防微生物的作用，所述防腐剂包括，但不限于，对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合。

如下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性肽与所需的上述各种其它成分一起掺入适当的溶剂中，然后过滤除菌。通常，如下制备分散体：将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和/或其它成分的无菌媒介物中。就用于制备无菌可注射溶液、混悬液或乳剂的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，该技术产生活性成分加来自先前无菌过滤的其液体介质的任何额外期望成分的粉末。如果必要的话，应当适当地缓冲液体介质，并在与足够的盐水或葡萄糖一起注射之前首先使液体稀释剂等渗。还考虑了用于直接注射的高浓缩组合物的制备，其中设想以DMSO用作溶剂导致极快的渗透，从而将高浓度的活性剂递送至小区域。

所述组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且保存以防微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。应当理解，应当将内毒素污染最小限度地保持在安全水平。

本文中所用的术语“治疗”和“预防”以及源自这些术语的词语并不一定意味着100％或完全治疗或预防。相反，存在不同程度的治疗或预防，而本领域普通技术人员认识到具有潜在的益处或治疗效果。就此而言，本发明的方法可为哺乳动物的病症提供任何治疗或预防水平的任意量。此外，本发明方法提出的治疗或预防可包括待治疗或预防病症(例如，癌症)的一种或多种病症或症状的治疗或预防。例如，治疗或预防可以包括促进肿瘤消退。此外，为了本文之目的，“预防”可以包括推迟疾病或其症状或病症的发作。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1高通量测序筛选TCR序列

1、RNA提取及质控

收集急性髓系白血病患者的外周血样本，患者无甲肝，乙肝，丙肝，戊肝，艾滋病，梅毒，淋病和结核感染。

在5mL Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min，磁珠分选T细胞。采用TRIzol法对处理的细胞样本进行RNA的提取，对提取后的RNA质量使用Qubit RNA HS Assay kits，经2100生物分析仪(安捷伦)检测RNA完整性。

2、反转录及文库制备

用Repertoire Analysis Kit(Human TCR alpha,beta)进行建库。将所有试剂置于冰上解冻，在配置mix之前，混匀和离心这些试剂。在冰上配置杂交引物需用的mix(表1)。充分混匀后离心，加热反转录引物杂交mix，65℃5min，冰上孵育至少2min。在冰上准备配制反转录mix(表2)，混匀后离心mix。

表1反应体系

组分	体积
		RT dNTP Mixture	1μl
RT Primer H TCRα/β	1μl
		RNA样本(100pg-1000ng)	最多到6.2μl
Nuclease-free water	补足至8.2μl

表2反转录体系

组分	体积
		RT buffer A	4μl
RT buffer B	1μl
		RT buffer C	3.8μl
RT Universal primer	1μl
		RNase inhibitor	1μl
Reverse Transcriptase	1μl
		总体积	11.8μl

将11.8μl的杂交buffer加到上一步反应的杂交RNA中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序(表3)：

表3反应条件

3、第一步PCR

准备第一步PCR需用的试剂(表4)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第一步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表4第一步PCR反应体系

每管中加入41μl的第一步PCR mix，加入9μl的第一链cDNA产物中混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表5第一步PCR反应条件

4、第二步PCR

准备第二步PCR需用的试剂(表6)，并在冰上解冻，混匀后瞬时离心，在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表6第二步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		Nuclease-free water	3μl
DNA polymerase	1μl
		总体积	39μl

准备一个新的PCR管，每管中加入1μl的第二步PCR引物，hTCRα#1-18(编号：A1-A18)，或者hTCRβ#1-18(编号：B1-B18)。加入39μl第二步反应的mix和10μl的第一步PCR产物混匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表7第二步PCR反应条件

5、第三步PCR

准备第三步PCR需用的试剂在冰上解冻(表9)，混匀后瞬时离心。在冰上配制第二步PCR反应的mix，配置好的mix用移液器混匀，然后离心。

表8第三步PCR反应体系

组分	体积
		PCR buffer	25μl
PCR dNTP Mixture	10μl
		3rd universal primer	2.5μl
Nuclease-free water	6.5μl
		DNA polymerase	1μl
总体积	45μl

准备一个新的PCR管，每管中加入45μl的第三步PCR mix，加入5μl的第二步PCR产物中，用手指肚弹匀，然后离心，在PCR仪(T100，Bio-RAD)上运行以下程序：

表9第三步PCR反应条件

6、琼脂糖凝胶电泳

配置1.5％的琼脂糖胶，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。hTCRɑ/β片段在650bp左右。

7、用AGENCOURT AMPure XP(BEACKMAN)磁珠纯化

准备nuclease-free 0.2mL的8连管，按照表10稀释文库。

表10稀释体系

组分	体积
		第三步PCR产物	30μl
Nuclease-free water	20μl
		总体积	50μl

配置DNase-free 70％乙醇(sigma)。磁珠使用前室温平衡30min，将22.5μl的磁珠加到稀释后文库中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单的离心。将8连管放置在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。将所有的上清转移到新的8连管中。再次混匀未使用过的磁珠，加17.5μl的磁珠到上清中，用移液器混匀至少10次。室温孵育5min，然后简单离心。将8连管放在96孔磁力架上磁吸5min，观察液体和磁珠分离。弃85μl的上清，保留5μl的上清以免吸到磁珠。不要将磁珠与磁力架分离。加200μl的70％的乙醇漂洗。室温30s，弃酒精，重复酒精洗涤步骤。弃所有上清，加30μl的10mM Tris-HCl到每个PCR管中，用移液器混匀至少10次。室温孵育2min然后简单离心。将离心管放置在磁力架上室温5min，分离液体和磁珠。将上清20μl转移至新的PCR管中。

8、文库浓度定量及质控

测定文库浓度用Qubit dsDNA HS kit(英潍捷基)，使用设备Qubit 2.0(life)，取2μl的样本用于测定。通常文库浓度集中在5-40ng/μl。如果样本浓度≥1.72ng/μl可用于Miseq测序。

9、文库目标片段质控

人的TCRα/β文库目标片段集中在650bp，使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳对文库片段进行质控，用1*TAE buffer和核酸染料(北京金博益)，DNA marker上样量为2μl，加1μl的6*loading buffer到PCR产物中，点样。100V电泳30-45min。使用凝胶到成像系统(1708195，Bio-RAD)，判断产物大小。

10、文库混库及质控

文库混样，是按此批次浓度最低的文库为标准，浓度最低文库乘以10μl为基准纳克数，其他文库按照此纳克数进行取样，确保每个文库的总量是一致的，混样后按照纳克与摩尔数之间的换算，稀释到8.58ng/μl(20nM，650bp)。

11、高通量测序

文库使用Miseq(Illumina)进行2×300bp双端测序，对上述混合完成的文库再次使用设备Qubit 2.0(life)进行文库定量，最终稀释到10pM，与10pM denatured PhiX进行混合(PhiX占比30％)，混合后的600μl进行上机测序。

12、数据分析

采用MiXCR进行初级分析，可以对高度个性化的TCR和免疫球蛋白序列进行分析。MiXCR可以针对不同的数据类型在参数上进行调整，并对分析结果和输出进行优化。进一步高级分析多个多样性指数，如香农指数(Shannon)、辛普森指数(Simpson)、Inverse-Simpson指数和基尼指数(Gini)等。采用VDJtools用于二级TCR profiling分析以及多样性评估。

13、噬菌体展示技术筛选高亲和力的TCR序列。

14、结果

通过噬菌体展示技术筛选出高亲和力的TCR，其α链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，其中CDR1-3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示。

TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：12-20所示，其中，CDR1的序列如SEQID NO：5-7任一所示；CDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，CDR3的序列如SEQ ID NO：9-11任一项所示。

实施例2 TCR-T的构建

1、利用高通量测序和数据分析结果，全合成相关序列，通过XbaI/SalI限制内切酶切点，连接到pCDH载体中。

2、TCR-T细胞制备

采集健康人外周血，在Ficoll中缓慢加入外周血，离心2000rpm，15min。吸取中间白膜层，加入0.9％生理盐水，计数单个核细胞数量，离心1000rpm，5min。磁珠分选T细胞。同时加入CD3/CD28抗体偶联磁珠刺激，24h及48h后加入病毒感染2次，病毒感染时加入IL-2，培养3-20天，获得TCR-T细胞。

实施例3 TCR-T杀伤功能检测

从本研究中所述的序列构建的TCR-T中任选一个进行功能检测。

计数靶细胞(NB4)和阴性参照靶细胞(Daudi)，分别标记Celltrace far red和CFSE染色。计数TCR-T(TCR的Vβ可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示)细胞作为效应细胞。按照计划效靶比(3：1，9：1，18：1)，重悬效应细胞和靶细胞至相应浓度。

圆底96孔板中每个效靶比分别铺入铺入组1效应细胞、组2靶细胞和组3效应细胞+靶细胞，每组4个复孔。培养2-24h，收细胞样本，分别收管A：组1效应细胞+组2靶细胞，管B：组3效应细胞+靶细胞，多聚甲醛液固定，流式上机。作Killing Rate与E:T Ratio曲线图。其中，

结果，如图1所示，相比对照组，本申请的TCR-T具有较好的杀伤效果。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 深圳大学总医院

<120> 高亲和力TCR及其应用

<141> 2021-10-14

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu Phe Trp

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Phe Leu Ser Tyr Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Cys Ala Val Met Asp Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp

1 5 10

<210> 4

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gly Gln Asn Ile Asp Gln Pro Thr Glu Met Thr Ala Thr Glu Gly Ala

1 5 10 15

Ile Val Gln Ile Asn Cys Thr Tyr Gln Thr Ser Gly Phe Asn Gly Leu

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln His Ala Gly Glu Ala Pro Thr Phe Leu Ser Tyr

35 40 45

Asn Val Leu Asp Gly Leu Glu Glu Lys Gly Arg Phe Ser Ser Phe Leu

50 55 60

Ser Arg Ser Lys Gly Tyr Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Glu Leu Gln Met

65 70 75 80

Lys Asp Ser Ala Ser Tyr Leu Cys Ala Val Arg Cys Ala Val Met Asp

85 90 95

Ser Ser Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys

100 105 110

Pro

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met Tyr

1 5

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys

1 5 10

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ser Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 11

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Gly Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe

1 5 10 15

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ser

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Ala Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ser

85 90 95

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100 105 110

<210> 17

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg Met Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

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Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

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100 105 110

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Ala

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 19

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

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65 70 75 80

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100 105 110

<210> 20

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His Asn Ala Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu Ile His Tyr

35 40 45

Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro Asp Gly Tyr

50 55 60

Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr Leu Ala Ser

65 70 75 80

Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Asp Gly

85 90 95

Ser Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr Val Leu

100 105 110

Claims

1.T细胞受体，其特征在于，包含具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO：9-11任一所示的氨基酸序列的β链CDR3；

优选地，所述T细胞受体还包含具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的α链CDR1和CDR2；和/或具有SEQ ID NO：5-7任一所示的氨基酸序列的β链CDR1和SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的β链CDR2。

2.根据权利要求1所述的T细胞受体，其特征在于，其中所述T细胞受体包含与SEQ IDNO:4所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12～20任一所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一所示的氨基酸序列具有至少95％同一性的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少99％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:12-20任一的氨基酸序列具有至少99％同一性的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQID NO:12-20的氨基酸序列所示的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列所示的α链可变区，和/或与SEQID NO:12的氨基酸序列所示的β链可变区；

优选地，所述T细胞受体为可溶性T细胞受体；

优选地，所述T细胞受体进一步包含可检测标记；

优选地，所述T细胞受体共价地结合治疗剂；

优选地，其中所述治疗剂是免疫毒素或化学治疗剂。

3.多价T细胞受体复合物，其特征在于，其包含多个根据权利要求1-2中任一项所述的T细胞受体；

优选地，所述多价T细胞受体包含2、3、4或更多个彼此结合的T细胞受体；

优选地，其中所述多价T细胞受体存在于脂质双层中、脂质体中，或连接至纳米颗粒；

优选地，所述T细胞受体经由接头分子彼此结合。

4.多肽，其特征在于，包含权利要求1-3任一项所述的T细胞受体多肽。

5.多核苷酸，其特征在于，编码权利要求4所述的多肽。

6.载体，其特征在于，编码权利要求1-3任一项所述的T细胞受体；

优选地，编码T细胞受体的序列是在启动子的控制下；

优选地，所述载体是病毒载体；

优选地，所述病毒载体是逆转录病毒载体；

优选地，载体进一步编码接头结构域；

优选地，所述接头结构域位于α链和β链之间；

优选地，所述接头结构域包含一个或多个切割位点；

优选地，所述一个或多个切割位点是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点；

优选地，所述一个或多个切割位点被间隔物隔开。

7.细胞，其特征在于，被工程改造成表达权利要求1-3中任一项所述的T细胞受体；

优选地，所述细胞是T细胞、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞或诱导的多能干细胞；

优选地，所述细胞是免疫细胞；

优选地，所述T细胞是CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞或γδT细胞；

优选地，所述T细胞是调节性T细胞；

优选地，所述细胞是自体的；

优选地，所述细胞是同种异体的。

8.一种用于工程改造权利要求7所述的细胞的方法，其特征在于，包括使所述免疫细胞与权利要求1或2所述的TCR，或权利要求6所述的载体接触；

优选地，所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞；

优选地，所述接触进一步为转染或转导；

优选地，所述免疫细胞是经刺激的淋巴细胞；

优选地，所述经刺激的淋巴细胞是人淋巴细胞；

优选地，所述方法进一步包括将免疫细胞分选以分离TCR工程改造的T细胞；

优选地，所述方法进一步包括通过连续稀释执行T细胞克隆；

优选地，所述方法进一步包括通过快速扩增方案来扩增T细胞克隆。

9.组合物，其特征在于，包括权利要求1或2所述的T细胞受体，权利要求3所述的多价T细胞受体复合物，权利要求4所述的多肽，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体或权利要求7所述的细胞。

10.如下任一项所述的应用:

(1)权利要求1-2任一项所述的T细胞受体，权利要求3所述的多价T细胞受体复合物，权利要求4所述的多肽，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体，权利要求7所述的细胞或权利要求9所述的组合物在制备治疗肿瘤、病原体感染或增强个体免疫的产品中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液肿瘤；

优选地，所述血液肿瘤为白血病；

优选地，所述白血病为急性白血病；

优选地，所述白血病为急性髓系白血病；

(2)权利要求1-2任一项所述的T细胞受体，权利要求3所述的多价T细胞受体复合物，权利要求4所述的多肽，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体，权利要求7所述的细胞或权利要求9所述的组合物在抗原筛选、疫苗制备中的应用；

(3)权利要求1-2任一项所述的T细胞受体，权利要求3所述的多价T细胞受体复合物，权利要求4所述的多肽，权利要求5所述的多核苷酸，权利要求6所述的载体，权利要求7所述的细胞或权利要求9所述的组合物在抗原检测中的应用。