CN115466331B

CN115466331B - 靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN115466331B
Application number: CN202111374219.4A
Authority: CN
Inventors: 白大勇; 张云龙; 张超; 吕璐璐; 周立; 王永增; 王瑞; 丁伟; 路佳兴; 张其猛
Original assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd
Current assignee: Heyuan Biotechnology Tianjin Co ltd
Priority date: 2021-11-18
Filing date: 2021-11-18
Publication date: 2023-05-30
Anticipated expiration: 2041-11-18
Also published as: WO2023088359A1; CN115466331A

Abstract

本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域；其中：所述胞外抗原识别结构域包含抗BCMA的scFv抗体，所述scFv抗体的VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

Description

靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

多发性骨髓瘤被定义为骨髓中浆细胞的恶性增殖，它是第二大常见的血液恶性肿瘤，占所有癌种的1％。研究表明，多发性骨髓瘤在60岁以上老年人中高发且近年来发病率稳步上升。对于大多数患者而言，多发性骨髓瘤是不可治愈的，最终都会发展成为复发/难治性多发性骨髓瘤。现有多发性骨髓瘤治疗方法(例如免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂、抗体类药物)均无效的复发/难治性多发性骨髓瘤患者的存活期仅约为13个月。

B细胞成熟抗原(B Cell Maturation Antigen，缩写为BCMA)是一个跨膜糖蛋白，它属于肿瘤坏死因子受体家族。BCMA在多发性骨髓瘤细胞上高度表达，在大多数其他细胞上不表达。恶性的肿瘤浆细胞通常都比正常的浆细胞BCMA表达水平要高，BCMA的上调促进了多发性骨髓瘤癌细胞的生长，而它的表达下调能够抑制多发性骨髓瘤癌细胞的生长。

嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括靶向部分(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。

2021年百时美施贵宝与蓝鸟生物共同宣布美国食品药品监督管理局(FDA)已批准其靶向BCMA的CAR-T细胞疗法(bb2121)，用于4线治疗后(包括免疫调节剂、蛋白酶体抑制剂以及抗体类药物治疗)的复发或难治性多发性骨髓瘤的成年患者，这是全球首款靶向BCMA的CAR-T细胞疗法。开发更多、效果更好的靶向BCMA的细胞治疗方法具有现实意义。

发明内容

本申请提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用。发明人利用多条靶向BCMA的scFv分别构建了嵌合抗原受体表达载体并制备了靶向BCMA的CAR-T细胞，还在细胞水平和动物水平验证BCMA CAR-T细胞具有良好的抑瘤功能并确定最优的靶向BCMA的嵌合抗原受体。

一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域；其中：所述胞外抗原识别结构域包含抗BCMA的scFv抗体，所述scFv抗体的VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述scFv抗体为人源化抗体，可选地所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，其VL序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述scFv抗体为兔源抗体，可选地所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，其VL序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述scFv抗体中VH和VL之间具有连接区，所述连接区选自以下的一种或多种：SEQ ID NOs：37-39。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述铰链区来源于IgGl、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，其中所述胞内信号传导区来源于CD3ζ、CD3γ、CD38、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α。

上述嵌合抗原受体在某些实施方式中，所述胞外抗原识别结构域还包含抗以下一种靶点的scFv抗体：CD138、NKG2D、CD38、CD19、SLAMF7、CD70、CD44v6、Lewis Y。

本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述嵌合抗原受体的核酸序列。

本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。

上述载体在某些实施方式中，为表达载体；在某些实施方式中，载体为病毒载体；在某些实施方式中，为慢病毒载体。

本申请还提供了一种经工程化的免疫效应细胞，其包含上述嵌合抗原受体、上述经分离的核酸分子，或上述载体。

上述免疫效应细胞在某些实施方式中，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T细胞、多能干细胞分化成的NK细胞、胚胎干细胞中的一种或多种。

上述免疫效应细胞在某些实施方式中，所述免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。

本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。

上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括保护剂。

上述药物组合物在某些实施方式中，药学上可接受的辅料包括细胞冻存液。

上述药物组合物在某些实施方式中，为静脉注射剂。

本申请还提供上述嵌合抗原受体、核酸分子、载体或免疫效应细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

上述应用在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

上述应用在某些实施方式中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以是自身免疫疾病。

上述应用在某些实施方式中，所述自身免疫疾病可以选自以下：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。

上述应用在某些实施方式中，所述药物为静脉注射剂。

本申请还提供了一种治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，包括以下步骤：将有效量的上述免疫效应细胞或药物组合物施用于具有治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的需求的受试者。

上述方法在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

上述方法在某些实施方式中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以是自身免疫疾病。

上述方法在某些实施方式中，所述自身免疫疾病可以选自以下：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。

上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为静脉注射。

上述方法在某些实施方式中，所述施用的方式为将有效量的免疫效应细胞或药物组合物以单次注射的方式施用于受试者。

上述方法在某些实施方式中，有效量的免疫效应细胞或药物组合物为1×10⁵至1×10⁷个细胞/kg的计量。

本申请还提供了上述免疫效应细胞或上述药物组合物，用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

上述免疫效应细胞或上述药物组合物在某些实施方式中，与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症；可选地，所述癌症是多发性骨髓瘤；进一步可选地，所述癌症是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。

上述免疫效应细胞或上述药物组合物在某些实施方式中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以是自身免疫疾病。

上述免疫效应细胞或上述药物组合物在某些实施方式中，所述自身免疫疾病可以选自以下：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。

附图说明

图1以BY-02G为例展示了CAR分子的基本结构。

图2表示了实施例2中BCMA CAR分子在CAR-T细胞表面的表达，其中：01G-CAR～05G-CAR代表转导CAR的T细胞，UTD代表未转导CAR的T细胞。在各图中，左侧峰代表UTD，右侧峰分别代表01G-CAR、02G-CAR、03G-CAR、04G-CAR、05G-CAR。

图3A表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中各组D0-D6的CAR阳性T细胞数量；图3B表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中各组D8-D14的CAR阳性T细胞数量；图3C表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中各组D2-D6的CAR MFI图3D表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中D8-D14的CAR MFI。

图4A表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中D0-D6的CAR阳性T细胞比例；图4B表示了实施例3中在多轮抗原刺激实验中D8-D14的CAR阳性T细胞比例。

图5表示了实施例4中BCMA CAR-T细胞多轮抗原刺激之后细胞表面免疫检查点蛋白PD1、Lag3、Tim3的表达率。对于各组细胞，从左至右依次代表PD1、Lag3、Tim3的表达率。

图6表示了实施例5中BCMA CAR-T细胞多轮抗原刺激之后CAR阳性细胞的AnnexinV阳性比例。

图7表示了实施例6中BCMA CAR-T细胞多轮抗原刺激之后的细胞因子IFN-γ的释放情况。针对K562细胞和MM.1S细胞，从左至右依次为未转导CAR的T细胞、BY-01G细胞、BY-02G细胞、BY-04G细胞和BY-05G细胞的细胞因子IFN-γ释放水平。

图8A表示了实施例7中RPMI8226细胞的皮下荷瘤动物实验中各组的肿瘤体积变化曲线；图8B表示了实施例7中MM.1S细胞在免疫缺陷小鼠进行尾静脉荷瘤动物实验中各组的平均荧光成像信号强度变化曲线；

图9A表示了实施例7低剂量BY-02G组与bb2121组的生存曲线；图9B表示了实施例7中剂量BY-02G组与bb2121组的生存曲线。

图10表示了实施例8中各组平均体重变化曲线。

图11表示了实施例9中BCMA CAR-T细胞对BCMA的特异性识别，图中每种靶细胞的第一行显示靶细胞表面BCMA蛋白的表达情况，第二行显示CD8阳性T细胞表面CD107a的表达情况。

图12表示了实施例9中BCMA scFv对BCMA的特异性识别。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。

以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体”(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域(例如，结合肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigen，TAA)的部分)、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T(ChimericAntigen Receptor T)细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。

在本申请中，术语“胞外抗原识别结构域”是指抗原识别结构域(AntigenRecognition Domain，ARD)。CAR细胞治疗产品(如CAR-T细胞)之所以能特异性识别和/或结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于胞外抗原识别结构域，到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区(Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv)、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体(Variable Lymphocyte Receptors，VLR)衍生而来。到目前为止，最为常见的来源就是抗体的scFv段，scFv包括抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，二者之间由一段肽链连接，如：由18个氨基酸组成的连接序列GSTSGSGKPGSGEGSTKG。

本申请中，术语“特异性识别和/或结合”是指CAR和特异性靶标之间的识别和/或结合，是以比CAR结合其它靶标更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合该靶标。

本申请中，术语“人源化抗体”也称为经过人源化改造的抗体，其通过将非人哺乳动物的抗体，例如小鼠抗体、大鼠抗体、兔抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的CDR中进行制备，制备人源化抗体的常规重组DNA技术是己知的(如：WO96/02576)。例如，在CDR获自兔抗体的情况下，可合成引物(参考WO98/13388中描述的方法可以获得相应引物)，将其用于将兔抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)连接。对于与CDR相连接的人抗体FR而言，要选择能使得CDR区形成良好的抗原结合位点的那些。

在本申请中，术语“铰链区”是指作用于胞外抗原识别结构域与跨膜结构域之间的连接段，这个区域通过给予抗原识别结构域一定的活动范围，允许CAR识别抗原。目前使用的铰链区主要来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种。此外，典型的铰链区还包含一些残基，这些残基参与CAR二聚化，有助于增强抗原的敏感性。

在本申请中，“跨膜区”是指连接着CAR结构的细胞内和细胞外成分的跨膜结构域。不同的跨膜结构域可以一定程度上影响CAR的表达和稳定性，但是并不直接参与信号传递，通过相互作用可以提高下游信号传递。所述跨膜区可以来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种。

在本申请内，术语“细胞内结构域”包括胞内信号传导区，还可以包括共刺激信号传导区。

在本申请中，术语“胞内信号传导区”是指负责表达CAR的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。所述胞内信号传导区可以来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。

在本申请中，术语“共刺激信号传导区”之所以存在，是因为除了抗原特异性信号的刺激之外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。在一些实施例中，CAR还可以包括一个或多个共刺激信号传导区，其中，共刺激信号传导区可以来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。

在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除从天然状态下经人工手段获得后，经过人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。

在本申请中，术语“引导肽”，是指胞外抗原识别结构域(如scFv序列)前的短肽，其作用是引导细胞内合成的重组蛋白质输出到细胞外。常用的引导肽有人CD8α信号肽，或者人GM-CSF受体α信号肽。

在本申请中，决定CAR免疫细胞治疗效果的关键因素之一是对肿瘤靶抗原的选择。在本申请中，术语“BCMA”是指B细胞成熟抗原，是肿瘤坏死因子受体超家族成员。人BCMA几乎排他性地在浆细胞和多发性骨髓瘤细胞中表达。BCMA可以是针对多发性骨髓瘤的免疫治疗剂的合适肿瘤抗原靶标。但由于多发性骨髓瘤细胞表面的特异性抗原具有异质性，对其抗原靶点的选择不一定是单一的。通过选择合适的靶点，能优化CAR-T细胞的抗肿瘤活性。因此胞外抗原识别结构域还可以包含靶向以下任一种靶点的胞外抗原识别结构域(如：scFv抗体)：CD138、NKG2D、CD38、CD19、SLAMF7、CD70、CD44v6、Lewis Y。

在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其可以是从其天然环境分离的或人工合成的类似物。

在本申请中，CAR基因转导/转染和靶基因表达时，基因转导/转染方法主要包括病毒和非病毒的方法。如：通过γ反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒相关病毒载体、质粒DNA依赖的载体、转座子依赖的基因转移、mRNA介导的基因转导。

术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。术语“转座子”是指不连续的DNA片段，具有在染色体位点之间迁移和携带基因信息的能力，如：睡美人SB系统和来源于鳞翅目昆虫的PB系统。在一些实施例中，还可以使用电转的方法将mRNA转导进T细胞。

在本申请中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫效应细胞可以选自以下组：T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T淋巴细胞、多能干细胞分化成的NK细胞、胚胎干细胞中的一种或多种。

在本申请中，术语“药物组合物”通常指适合施用于患者的药物组合物，其可以包含本申请所述的免疫效应细胞，还可以包含一种或多种药学上可接受的辅料，如：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂，如：细胞冻存液。在一些实施例中，本申请的药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。

在本申请中，术语“受试者”通常指人类或非人类动物，包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、兔、马、猪、牛、羊或猴。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下本领域技术人员可接受的波动范围，如：在±0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％或10％的范围内变动。

嵌合抗原受体、核酸、载体、免疫效应细胞、药物组合物

一方面，本申请提供一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域；其中：所述胞外抗原识别结构域包含抗BCMA的scFv抗体，所述scFv抗体的VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：1、SEQID NO：2、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包括SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述scFv抗体为人源化抗体；可选地，所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述scFv抗体为兔源抗体；可选地，所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述scFv抗体中VH和VL之间具有连接区，所述连接区选自以下的一种或多种：SEQ ID NOs：37-39。

在一些实施例中，所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示。

在一些实施例中，本申请还包含了上述任一项嵌合抗原受体的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸被取代、缺失、添加和/或插入，且其具有相当于上述任一项嵌合抗原受体的活性。本领域技术人员知晓，在人源化改造的过程中，scFv FR区中的氨基酸可被取代使得经过改造的抗体的CDR区能保有合适的抗原结合位点，因此本申请当然包括在基于本申请上述CDR的情况下，对scFv中的FR区进行人源化改造所获得的不同于SEQ ID NO：7、SEQID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。并且本领域技术人员还知晓，在人源化改造的过程中为了使得经过改造的抗体的CDR区能保有合适的抗原结合位点，如果必要，CDR中的1个、2个、3个或不超过10％的氨基酸序列可能被取代、缺失、添加和/或插入，这些内容也被包含在本申请中。

在一些实施例中，所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；可选地，所述铰链区的氨基酸序列来源于CD8α；进一步可选地，所述铰链区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；可选地，所述跨膜区的氨基酸序列来源于CD8a；进一步可选地，所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，其中所述细胞内结构域包含胞内信号传导区；可选地，还包括共刺激信号传导区；进一步可选地，其中所述胞内信号传导区来源于CD3ζ、CD3γ、CD36、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRB、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种；再更进一步可选地，所述胞内信号传导区来源于CD3ζ，如：所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上；可选地，共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB；进一步可选地，所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述嵌合抗原受体还包含位于所述嵌合抗原受体氨基酸序列N-末端的引导肽；可选地，其中所述引导肽来源于CD8α；进一步可选地，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，本发明的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。

在一些实施例中，所述胞外抗原识别结构域还包含抗以下任一种靶点的scFv抗体：CD138、NKG2D、CD38、CD19、SLAMF7、CD70、CD44v6、Lewis Y。

另一方面，本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述嵌合抗原受体的核酸序列。

另一方面，本申请提供一种编码嵌合抗原受体的分离的核酸分子，所述核酸分子包含如SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO：18所述的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性并且编码相同嵌合抗原受体的核苷酸序列。这种序列同一性是由于核酸密码子第三位碱基的摆动性(简并性)而产生的。可选地，所述核酸分子包含SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列。

另一方面，本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。

在一些实施例中，载体为表达载体；可选地，载体为病毒载体；进一步可选地，为慢病毒载体。

另一方面，本申请还提供了一种经工程化的免疫效应细胞，其包含上述嵌合抗原受体、上述经分离的核酸分子，或上述载体。

在一些实施例中，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、外周血单个核细胞(PBMC细胞)、多能干细胞、多能干细胞分化成的T细胞、多能干细胞分化成的NK细胞、胚胎干细胞中的一种或多种。

在一些实施例中，所述免疫效应细胞是T淋巴细胞；可选地，所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。

在一些实施例中，所述免疫效应细胞的表面可以表达本申请所述的嵌合抗原受体。

另一方面，本申请还提供了一种药物组合物，其包括上述经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。药学上可接受的辅料包括：载剂、保护剂、稳定剂、赋形剂、稀释剂、增溶剂、表面活性剂、乳化剂、防腐剂中的一种或多种。

在一些实施例中，药学上可接受的辅料包括保护剂，如：细胞冻存液。

在一些实施例中，药物组合物为细胞悬液或其冻存细胞。

在一些实施例中，药物组合物为静脉注射剂。

制备方法和用途

另一方面，本申请还提供了制备免疫效应细胞的方法，其包括以下的步骤：向免疫效应细胞中转导本申请所述的载体。

另一方面，本申请还提供了本申请所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

另一方面，本申请还提供了治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，所述方法包括向有治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症需要的受试者施用有效剂量的本申请所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞。

在一些实施例中，所述施用可以通过不同的方式进行，例如静脉内、瘤内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部或真皮内施用。例如，施用的方式可以通过静脉注射的方式施用于受试者。在一些实施例中，有效剂量的免疫效应细胞或药物组合物可以单次施用于受试者，也可以在一定期间内分次施用于受试者，如：每周施用一次、两周一次、三周一次、四周一次、一个月一次、3个月一次、或3-6个月一次。

在一些实施例中，针对不同的适应症，给药剂量可以不同；针对病情严重程度不同的患者，给药剂量也可以不同。施用剂量范围可以是1×10⁵个CAR阳性T细胞/kg至1×10⁷个CAR阳性T细胞/kg，例如，1×10⁵个CAR阳性T细胞/kg至1×10⁶个CAR阳性T细胞/kg、1×10⁶个CAR阳性T细胞/kg至1×10⁷个CAR阳性T细胞/kg。施用剂量还可以通过施用总剂量进行衡量，如：施用总剂量不超过5×10⁸个CAR阳性T细胞。在本申请中，施用剂量均是以CAR阳性T细胞计数，具体实施例中不再赘述。

在一些实施例中，所述受试者可以包括人类和非人类动物。例如，所述受试者可以包括但不限于小鼠、大鼠、猫、狗、马、猪、牛、羊、兔或猴。

另一方面，本申请还提供了所述的嵌合抗原受体、所述的核酸分子、所述的载体和/或所述的免疫效应细胞，其可以用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。

在一些实施例中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以包括非实体瘤，可选地，所述非实体瘤为血液瘤。

在一些实施例中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以包括多发性骨髓瘤。

在一些实施例中，所述多发性骨髓瘤为复发性或难治性多发性骨髓瘤。

在一些实施例中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症可以是自身免疫疾病。

在一些实施例中，所述自身免疫疾病可以选自以下：全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎、特发性血小板减少性紫癜、重症肌无力或自身免疫性溶血性贫血。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press。

实施例

实施例1、BCMA CAR-T细胞的获得

我们已有5条BCMA特异性的scFv序列(其scFv的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22所示，这5条scFv的氨基酸序列在本申请中也分别用编号BY-01G、BY-02G、BY-03G、BY-04G、BY-05G作为简称。编码上述BY-01G至BY-05G scFv的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：24、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26所示)。由于蛋白水平scFv的功能验证，不能反映其在细胞水平的功能，我们选择在二代CAR结构上对候选BCMA scFv序列进行筛选。CAR结构示意图如图1所示，我们采用CD8α引导链为信号肽，以BCMA scFv为胞外肿瘤抗原识别区域，铰链区和跨膜区采用CD8α的结构，以4-1BB为胞内共刺激信号，CD3ζ为T细胞激活信号。

1、慢病毒载体的构建

分别人工合成包含本申请中BY-01G～BY-05G scFv的CAR结构片段(其氨基酸序列分别如SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：31所示，编码上述CAR结构片段的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQID NO：35、SEQ ID NO：36所示)，并分别构建到经过改造的空慢病毒载体(厂家：SBI公司，货号：CD500-CD800，如WO2021/121227中记载的)中获得CAR表达载体，随后将CAR表达载体和三种包装质粒一起转染293T细胞，经过收集纯化之后得到有功能性的慢病毒载体。三种包装质粒分别是PMD2.0G(购自Biovector公司，产品号Biovector012259)，pMDLg-pRRE(购自Biovector公司，产品号Biovector012251)，pRSV-Rev(购自Biovector公司，产品号Biovector012253)。

2、通过慢病毒转导的方式制备相应5种BCMA CAR-T细胞

转导实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述转导步骤如下：

1)分选T细胞

从人单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞(PBMC)，然后从PBMC细胞中分选获得T细胞。

2)对T细胞进行激活处理

将分离的T细胞用完全淋巴细胞培养液(X-VIVO15培养基+5％FBS+300IU/ml IL-2或X-VIVO15培养基+5％FBS+5ng/ml IL-15+10ng/ml IL-7)进行重悬，使终浓度为(1～2)×10⁶个细胞/ml，并加入5～10μl的CD3/CD28磁珠刺激，混匀后置于培养箱培养，培养条件为37℃+5％CO₂，培养时间至少24小时。

3)慢病毒转导T细胞

取出激活培养的T细胞，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(polybrene)，混匀，并按MOI＝2缓慢加入慢病毒载体，混匀后将其置于离心机中，1500rpm，离心1.5小时。然后将其置于培养箱培养，培养条件为37℃+5％CO2，培养时间至少24小时。

4)转导后T细胞的扩增培养

取出转导后的细胞，监测细胞密度，使细胞维持在(0.5～1)×10⁶个细胞/ml，以备后续实施例使用。

将使用包含有BY-01G～BY-05G scFv的慢病毒转导T细胞后获得的T细胞分别命名为BCMA CAR-T细胞BY-01G～BY-05G。接下来，我们在细胞水平和动物水平对5条CAR结构进行筛选，以最终确定一个最优的候选scFv序列。

实施例2、BCMA CAR-T细胞BY-01G～BY-05G表面表达的CAR分子的检测

对实施例1中获得的5种BCMA CAR-T细胞表面表达的CAR蛋白分子进行检测。我们使用FITC标记的BCMA抗原(ACRO Biosystems Cat.No.BCA-HF254)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行检测分析。结果如图2所示，除了BCMA CAR-T细胞BY-03G的CAR阳性比例(10.25％)和CAR表达水平(图2中CAR阳性细胞的荧光强度横坐标值可以指代CAR表达水平)都非常低以外，BCMA CAR-T细胞BY-01G、BY-02G、BY-04G、BY-05G的CAR阳性比例和CAR表达水平都比较高，尤其是BCMA CAR-T细胞BY-02G的CAR阳性比例达到了96.6％。

另外，由于实验中使用了BCMA抗原进行染色，这一结果也提示了这些CAR蛋白特异识别BCMA抗原的能力有所区别。在后续实验中，我们会对表达较好的BCMACAR-T细胞BY-01G、BY-02G、BY-04G、BY-05G进行各方面的功能检测，而不对表达最差的BY-03G进行更多的研究。

实施例3、BCMA CAR-T细胞的持续增殖性

抗原刺激可以激活CAR-T细胞使CAR-T细胞增殖，而T细胞的持续激活会导致细胞耗竭，耗竭的T细胞的增殖能力和效应功能都会有所下降，同时一些免疫检查点基因的表达水平会上调。我们通过检测BCMA CAR-T细胞在多轮抗原刺激实验中的增殖情况，验证CAR-T细胞的持续性。

抗原刺激之前，各组BCMA CAR-T细胞的CAR阳性比例都利用未转导T细胞调整到了与CAR阳性比例最低的一组CAR-T细胞一致的水平。在多轮抗原刺激实验中，将各组BCMACAR-T细胞分别与BCMA阳性靶细胞MM.1S(人多发性骨髓瘤细胞)按照效靶比1∶1在24孔板中进行共培养，每孔2ml X-VIVO15培养基，每组细胞重复3孔。2天后取500μl细胞用荧光标记的CD3抗体(BioLegend Cat.No.317318)和BCMA抗原(同实施例2)进行CD3和CAR的染色，通过流式细胞术进行检测分析，显示CD3阳性细胞中CAR阳性细胞的比例、数量和荧光强度，还可以根据体积倍数的换算计算CD3阳性细胞中CAR阳性的细胞数(CD3是区分是否为T细胞的标记物)，然后根据计算结果各组再取出CAR-T细胞按照效靶比1∶1加入MM.1S细胞进行新一轮刺激，如此重复直到CAR-T细胞增殖出现停滞，结束抗原刺激。

经过多轮抗原刺激之后，各组BCMA CAR-T细胞都有明显的增殖(如图3A和图3B所示)。用流式细胞仪检测多轮抗原刺激后BCMA CAR-T细胞中CAR阳性细胞的CAR MFI值(平均荧光强度)以反映CAR的表达水平，结果如下：在经过7轮刺激后(第14天)，最终BCMA CAR-T细胞BY-02G组的CAR MFI值最高，显著高于BY-01G、BY-04G和BY-05G(结果如图3C和图3D所示)，说明经过多轮抗原刺激之后，BCMA CAR-T细胞BY-02G组的CAR表达水平最高。

在多轮抗原刺激之后，各组BCMA CAR-T细胞都能持续增殖，流式细胞术结果显示BCMA CAR-T细胞BY-02G组的CAR阳性比例最高，说明其特异性增殖最好。具体结果如下：在多轮抗原刺激之后，各组BCMA CAR-T细胞的CAR阳性比例发生了明显变化。从第3轮刺激(第6天)至第7轮刺激(第14天)，BCMA CAR-T细胞BY-02G的CAR阳性比例显著高于BY-01G、BY-04G和BY-05G，在经过7轮刺激后(第14天)，最终BCMA CAR-T细胞BY-02G的CAR阳性比例最高，显著高于BY-01G、BY-04G和BY-05G(结果如图4A和图4B所示)。

实施例4、持续增殖后的BCMA CAR-T细胞表面免疫检查点蛋白PD1、Lag3和Tim3的表达率

按照实施例3中的实验方法，在结束多轮抗原刺激之后(第14天)，我们还检测了免疫检查点蛋白在BCMA CAR-T细胞表面的表达情况，所述免疫检查点蛋白包括PD1、Lag3和Tim3，这些蛋白也可以作为细胞耗竭的标记，耗竭的T细胞中这些免疫检查点基因的表达水平会上调。我们用荧光标记的PD1抗体(BioLegend Cat.No.329914)、Lag3抗体(BioLegendCat.No.369306)、Tim3抗体(BioLegend Cat.No.345012)和BCMA抗原(同实施例2)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行检测分析。

结果如图5所示，结果显示了各组CAR阳性细胞中PD1、Lag3和Tim3的阳性比例。BCMA CAR-T细胞BY-02G有着最低的PD1比例以及较低的Lag3比例，可能预示着其具有更好的细胞功能。

实施例5、持续增殖后的BCMA CAR-T细胞的凋亡水平

有研究表明，抗原刺激之后的CAR-T细胞增殖会受到细胞凋亡的影响。在结束抗原刺激之后，我们也检测了各组BCMA CAR-T细胞的凋亡水平。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜磷脂双分子层的内侧，细胞发生凋亡早期，磷脂酰丝氨酸会由细胞膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲合力，被用于检测细胞凋亡。我们用荧光标记的Annexin V(BioLegend Cat.No.640920)和BCMA抗原(同上)对细胞进行染色，通过流式细胞术进行检测分析。

按照实施例3中的实验方法，在结束多轮抗原刺激之后(第14天)，我们还检测了各组BCMA CAR-T细胞中CAR阳性细胞的Annexin V阳性比例。结果如图6所示，BCMACAR-T细胞BY-02G中的Annexin V阳性比例在BY-01G、BY-02G、BY-04G、BY-05G中最低，预示着其细胞凋亡水平更低。

实施例6、持续增殖后的BCMA CAR-T细胞进行细胞因子释放实验和细胞杀伤实验

为了进一步验证BCMA CAR-T细胞功能的持续性，我们将按照实施例3中实验方法结束多轮抗原刺激的CAR-T细胞进行细胞因子释放实验和细胞杀伤实验。

1)将BCMA CAR-T细胞与靶细胞按照CAR阳性细胞比靶细胞的效靶比1∶1在X-VIVO15培养基中共培养24小时，靶细胞为MM.1S(这种细胞本身就是多发性骨髓瘤的细胞系，内源表达BCMA)。K562为阴性靶细胞对照。通过ELISA的方法检测细胞上清中细胞因子IFN-γ的浓度，细胞因子释放实验结果如图7所示。结果显示各组CAR-T细胞都有释放IFN-γ的能力，其中BCMA CAR-T细胞BY-02G在多轮抗原刺激实验之后释放IFN-γ的量最多，显著高于其他各组。

2)将各组BCMA CAR-T细胞与上述靶细胞分别按照效靶比1∶4在X-VIVO15培养基中共培养48小时，通过检测靶细胞中稳定表达的荧光素酶活性检测靶细胞存活比例，细胞杀伤实验结果显示在经过抗原反复刺激后，各组BCMA CAR-T细胞均可将BCMA阳性靶细胞MM.1S进行100％杀伤。CAR-T细胞对阴性靶细胞K562没有明显的杀伤效果。

综合以上的实验结果可以说明，我们研发的BCMACAR-T细胞可以在抗原反复刺激的条件下维持增殖和识别杀伤肿瘤细胞的能力，其中BCMA CAR-T细胞BY-02G比其他候选CAR-T表现更优，也预示着CAR-T细胞可以在体内肿瘤治疗的过程中具有较好的持续性。

实施例7、BCMA CAR-T细胞在小鼠体内的抗肿瘤活性

基于体外药效学检测结果，我们还进行了初步的体内药效学研究。在小鼠体内进行药效学检测，体内实验中我们选择了两种动物模型(人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞在免疫缺陷小鼠进行皮下荷瘤的动物模型及使用人多发性骨髓瘤MM.1S细胞在免疫缺陷小鼠进行尾静脉荷瘤的动物模型)。我们对BCMA CAR-T细胞BY-02G进行了进一步检测，并以蓝鸟生物的BCMA CAR-T细胞bb2121作为阳性对照(bb2121 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：41所示，除scFv序列以外，bb2121 CAR的构造中其余各组件的序列与BY-02G完全相同)，验证BCMA CAR-T细胞BY-02G是否具有良好的抑瘤功能。

使用RPMI8226细胞的皮下荷瘤动物实验中，我们设置了bb2121组和BY-02G组的中剂量(4×10⁶细胞/鼠)和高剂量(8×10⁶细胞/鼠)两个CAR-T的剂量梯度。在每只雄性NPI小鼠(体重为20±2g)皮下接种混合了等体积基质胶的5×10⁶RPMI8226细胞进行皮下荷瘤，当平均皮下肿瘤体积接近或达到110mm³时，进行CAR-T的单次尾静脉注射，此后，每周两次测量肿瘤体积的变化，肿瘤体积变化曲线如图8A所示。小鼠肿瘤体积变化结果显示，与未转导的T细胞相比，各实验组CAR-T均有很好的抑瘤作用，中剂量组在CAR-T注射27天左右，已经完全消除了大部分小鼠的皮下肿瘤，bb2121组和BY-02G组的中剂量和高剂量组均表现相当。

将MM.1S-GFP-Luc细胞(MM.1S-GFP-Luc细胞制备方法：构建包含绿色荧光蛋白GFP和荧光素酶Luc编码区的慢病毒表达载体，然后包装慢病毒，用慢病毒转导MM.1S细胞，利用GFP信号通过流式细胞仪分选阳性单克隆细胞，通过培养扩增、GFP表达鉴定，确定为单克隆之后，细胞制备完成)按照5×10⁶个/0.2ml/只尾静脉接种于雌性B-NDG小鼠(体重为20±2g)。细胞接种后第7天，组平均荧光强度达到1×10⁸左右，按照荧光信号强度和体重随机分组并回输CAR-T细胞，每组6只小鼠，共6组，分别为：G1：bb2121(低剂量6×10⁵)、G2：bb2121(中剂量3×10⁶)、G3：BY-02G(低剂量6×10⁵)、G4：BY-02G(中剂量3×10⁶)、G5：UTD、G6：PBS。分组后对肿瘤生长情况和小鼠体重分别观察，每周2次测量并记录测量值。在接种7天后，组平均荧光强度达到1×10⁸左右时，进行CAR-T的单次尾静脉注射的方式回输CAR-T细胞，此后，每周两次测量荧光信号强度的变化，至第28天荧光信号强度变化曲线如图8B所示(图8B中的D0是按照进行CAR-T单次注射的时间开始计算，即接种后7天)。结果显示，与未转导的T细胞相比，各实验组CAR-T均有很好的抑瘤作用，在D28时，低剂量组BY-02G和bb2121组表现相当，中剂量组中bb2121组表现略好，但中剂量组的BY-02G从生存期考虑相对于bb2121组具有更优秀的安全性(如图9B所示)。在生存期观察中，结果显示，在低剂量组，BY-02G组与bb2121组生存率相当(如图9A所示)，但在中剂量组，BY-02G组至实验终止时全部小鼠依然存活，而bb2121组的生存率已低于20％(如图9B所示)。

实施例8、BCMA CAR-T细胞的安全性

为进一步确定我们研发的BCMA CAR-T细胞的安全性，我们在CAR-T细胞注射后，对小鼠的体重进行监测。以CAR-T注射剂量更高的RPMI8226皮下荷瘤动物模型为例，结果显示(图10)，同未转导T细胞或PBS组相比，BCMACAR-T细胞注射的小鼠体重没有明显差别。动物可耐受剂量大于4×10⁸细胞/kg。

BCMA CAR-T细胞的安全性研究结果表明，在较高剂量处理中，与对照组未转导T细胞或PBS组相比，各实验CAR-T组的小鼠没有观察到异常体重下降，提示该CAR-T细胞在高剂量注射下的安全性。而在上述抑制肿瘤生长有效性的研究中，较低剂量下，我们的BCMACAR-T已经具有显著抑制肿瘤的效果，同时CAR-T细胞存续时间较长，说明我们研发的BCMACAR-T在体内良好的持续性。

实施例9、BCMACAR-T细胞的特异性

BCMA CAR-T细胞的scFv序列来源于以BCMA为抗原的单克隆抗体序列，我们需要BCMA CAR只能特异识别BCMA而不能识别其他蛋白，这样才能在保证有效性的同时确保安全性。我们通过CAR-T细胞与BCMA阴性靶细胞共培养之后检测CAR-T细胞的活性，验证BCMACAR-T细胞的特异性。

首先，使用荧光标记的BCMA特异性抗体(BioLegend Cat.No.357506)与相同荧光标记的同源非特异性IgG(BioLegend Cat.No.400322)对不同靶细胞(包括BCMA表达阴性的细胞系Huh-7、SK-MEL-1、Ovcar3、293T和Jurkat细胞，也包括BCMA表达阳性的细胞系MM.1S细胞)进行染色，通过流式细胞术进行检测分析，检测靶细胞表面BCMA蛋白的表达情况。然后，选取BCMA表达阴性的靶细胞与T细胞按照效靶比1∶2在X-VIVO15培养基中共培养，共培养4h后通过流式细胞术检测CD8阳性T细胞表面CD107a的表达情况，代表T细胞识别靶细胞之后的杀伤活性，BCMA阳性靶细胞与T细胞共培养之后的检测结果作为阳性对照。

如图11所示，在BCMA蛋白表达情况的检测结果中，各种靶细胞用BCMA特异性抗体染色结果与相同荧光标记的同源非特异性IgG染色结果相比，只有MM.1S细胞作为多发性骨髓瘤细胞系，有明显的BCMA蛋白表达(在MM.1S多发性骨髓瘤的图中出现BCMA特异性抗体染色和相同荧光标记的同源非特异性IgG染色的双峰)。在CD107a的检测结果中，BCMA阴性靶细胞与未转导的UTD组T细胞或BY-02G CAR-T细胞共培养之后，CD8阳性T细胞CD107a表达水平几乎完全一致，而MM.1S细胞与BY-02G CAR-T细胞共培养之后有很大比例的CD107a阳性T细胞，说明BY-02G CAR-T细胞不能识别BCMA阴性靶细胞，具有很好的靶点特异性。

同时，我们又用ELISA的方法，对BY-02G的scFv序列(SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列)的特异性做进一步的确认。我们选取两个与BCMA抗原一样同为B细胞表面抗原的蛋白(CD19和CD319)，进行孔板包被，然后用纯化的BY-02G scFv进行亲合力检测，结果如图12所示，BY-02G的scFv只能识别和结合BCMA抗原，显示出很好的抗体特异性。

综上，在体外药效学检测表明，BY-02G CAR在T细胞表面的表达优于其他候选；BCMA CAR-T细胞BY-02G在CAR-T持续增值性、细胞耗竭水平、细胞凋亡水平、细胞因子释放、体外细胞杀伤等方面，皆优于其他候选CAR-T。BY-02G scFv中，VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。BY-02G scFv中，VH序列为SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL序列为SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。

BCMA CAR-T细胞BY-02G在体内动物实验中，特异性识别、肿瘤抑制、安全性的方面也有非常优异的表现。我们的BCMACAR-T能有效识别特定抗原及靶细胞，表达并分泌大量IFN-γ和CD107a，从而介导相应的免疫反应。我们的BCMA CAR-T在高剂量注射下对小鼠具备较好的安全性。体内抗肿瘤活性研究结果显示，我们的BCMACAR-T在体内有较长时间的存续，且中剂量注射也能达到很好的抑瘤效果，提示中剂量即安全有效，我们的BCMACAR-T在体内动物荷瘤模型中，也有很好的识别和杀伤肿瘤细胞的能力，且在抗原的反复刺激下，我们的BCMA CAR-T细胞仍然可以保持较高的CAR阳性率、较好的细胞增殖能力和较低的凋亡水平，并且能保持对靶细胞的有效杀伤。

序列描述

SEQ ID NO：1：BY-02G scFv VH CDR1；

SEQ ID NO：2：BY-02G scFv VH CDR2；

SEQ ID NO：3：BY-02G scFv VH CDR3；

SEQ ID NO：4：BY-02G scFv VL CDR1；

SEQ ID NO：5：BY-02G scFv VL CDR2；

SEQ ID NO：6：BY-02G scFv VL CDR3；

SEQ ID NO：7：人源化BY-02G scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO：8：人源化BY-02G scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO：9：兔源BY-02G scFv VH氨基酸序列；

SEQ ID NO：10：兔源BY-02G scFv VL氨基酸序列；

SEQ ID NO：11：人源化BY-02G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：12：兔源BY-02G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：13：铰链区的氨基酸序列；

SEq ID NO：14：跨膜区的氨基酸序列；

SEQ ID NO：15：胞内信号传导区的氨基酸序列；

SEQ ID NO：16：共刺激信号传导区的氨基酸序列；

SEQ ID NO：17：引导肽(即信号肽)的氨基酸序列；

SEQ ID NO：18：编码BY-02G scFv氨基酸序列的核苷酸序列；SEQ ID NO：19：BY-01G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：20：BY-03G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：21：BY-04G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：22：BY-05G scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：23：编码BY-01G scFv氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：24：编码BY-03G scFv氨基酸序列的核苷酸序列；

SEq ID NO：25：编码BY-04G scFv氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：26：编码BY-05G scFv氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：27：BY-01G CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO：28：BY-02G CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO：29：BY-03G CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO：30：BY-04G CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO：31：BY-05G CAR氨基酸序列；

SEQ ID NO：32：编码BY-01G CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：33：编码BY-02G CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：34：编码BY-03G CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NO：35：编码BY-04G CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEq ID NO：36：编码BY-05G CAR氨基酸序列的核苷酸序列；

SEQ ID NOs：37-39：连接VH和VL的连接区的氨基酸序列；

SEQ ID NO：40：bb2121 scFv氨基酸序列；

SEQ ID NO：41：编码bb2121 scFv氨基酸序列的核苷酸序列。

序列表

<110> 合源生物科技（天津）有限公司

<120> 靶向BCMA的嵌合抗原受体及其应用

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 8

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His

1 5

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 2

Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr

1 5

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 3

Ala Arg Asp Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 7

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 4

Pro Ser Val Tyr Asn Asn Tyr

1 5

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 5

Glu Thr Ser

1

<210> 6

<211> 11

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 6

Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly Asp Arg Arg Ala

1 5 10

<210> 7

<211> 116

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

His Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 8

<211> 110

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 8

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 9

<211> 114

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 9

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His

20 25 30

Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Val Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp

85 90 95

Leu Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

100 105 110

Ser Ser

<210> 10

<211> 110

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 10

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ser Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 241

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 11

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His Met Thr

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile

165 170 175

Ser Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu

210 215 220

Asp Tyr Val Ile Asp Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

225 230 235 240

Ser

<210> 12

<211> 239

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 12

Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ser Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Asn

20 25 30

Tyr Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Glu Thr Ser Thr Leu Pro Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln

65 70 75 80

Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Thr Tyr Val Ser Gly

85 90 95

Asp Arg Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val

115 120 125

Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro Leu Thr Leu

130 135 140

Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr His Met Thr Trp

145 150 155 160

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Ser

165 170 175

Ser Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr

180 185 190

Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Met Thr Ser Leu

195 200 205

Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Leu Asp Tyr

210 215 220

Val Ile Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

225 230 235

<210> 13

<211> 45

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 13

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 14

<211> 24

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 14

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 42

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 16

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 17

<211> 21

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 17

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 18

<211> 723

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 18

gagatcgtga tgacccagtc cccaagtaca ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgatc 60

ataaactgtc aaagctcacc ctctgtttac aacaattacc tgtcttggta tcaacagaag 120

cccggtaagg cccccaaact gctcatttac gagacatcca ccctggcatc cggggtgcca 180

agccgcttct ccgggagtgg gtctggcgcc gagttcaccc tgaccatatc ttccctgcag 240

cccgacgact tcgcaacgta ctattgcgcc ggaacctatg taagtgggga tagacgcgcc 300

ttcgggcagg gcacgaagtt gaccgtgctg ggcggagggg gctcaggagg tggcggtagc 360

ggaggaggcg gctcagaagt gcagctggtg gagtccggcg gtggactggt gcaaccggga 420

ggctcactca gattgtcatg caccgcctct ggctttagtc tctccaccta tcatatgact 480

tgggtgaggc aggcacccgg caagggcctg gaatggatcg gcgtgatctc ttccagcggt 540

agcacctatt acgcctcttg ggcgaagggc aggtttacca tcagccgcga caacagcaag 600

aataccgttt acctgcagat gaatagcctg agggccgaag acacggcggt ctatttctgt 660

gcacgggacc ttgactacgt tattgacctg tggggccctg ggaccctcgt aactgtgagc 720

agc 723

<210> 19

<211> 250

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 19

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Arg Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala Phe Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Ala Asp Asn Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Ala Met Ser

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Met Ile

165 170 175

Ser Ser Ser Gly Ser Thr His Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Phe

210 215 220

Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Thr Tyr Leu Glu Tyr Gly Met Asp Leu Trp

225 230 235 240

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 20

<211> 252

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 20

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro Ser Val Tyr Asn Lys

20 25 30

Asn Trp Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Gly Gly Tyr Asn Ser

85 90 95

Asp Ser Glu Arg Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Ser Tyr

145 150 155 160

Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

165 170 175

Gly Cys Val Tyr Val Gly Ser Ser Asp Phe Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp

180 185 190

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val

195 200 205

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe

210 215 220

Cys Ala Arg Pro Tyr Pro Asp Trp Asn Ile Asp Ser Phe Arg Trp Asp

225 230 235 240

Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245 250

<210> 21

<211> 248

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 21

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Phe Ser Asn

20 25 30

Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Pro Thr Tyr Leu Ser

85 90 95

Gly Asp Trp Tyr Val Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Asn Tyr Tyr Gly

145 150 155 160

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

165 170 175

Ile Ile Ala Gly Asp Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Ala Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg

210 215 220

Gly Ser Tyr Ser Ser Thr Trp Asp Gly Ala Phe Asp Leu Trp Gly Pro

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 22

<211> 246

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 22

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Asp Ser Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Asp Glu Ser Ser Ile

85 90 95

Tyr Gly Ala Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln

115 120 125

Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ile Tyr Asp Met Ile

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ile Ile

165 170 175

Ile Tyr Gly Gly Ser Ala Ser Tyr Ala Asn Trp Ala Lys Gly Arg Phe

180 185 190

Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn

195 200 205

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Ala

210 215 220

Ser Ser Tyr Ser Tyr Ser Tyr Gly Phe Ser Leu Trp Gly Pro Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 23

<211> 750

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 23

gagatcgtga tgacccagtc cccaagtaca ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgatc 60

ataacctgtc aagcctctga gaatatctat aggaacctgg cctggtatca acagaagccc 120

ggtaaggccc ccaaactgct catttacgcc gccagcctgc tggcatccgg ggtgccaagc 180

cgcttctccg ggagtgggtc tggcgccgag ttcaccctga ccatatcttc cctgcagccc 240

gacgacttcg caacgtacta ttgccagaac gccttctaca gctctagcgc ggacaacccc 300

ttcgggcagg gcacgaagtt gaccgtgctg ggcggagggg gctcaggagg tggcggtagc 360

ggaggaggcg gctcagaagt gcagctggtg gagtccggcg gtggactggt gcaaccggga 420

ggctcactca gattgtcatg caccgcctct ggctttagtt tgtccagcta tgcgatgagc 480

tgggtgaggc aggcacccgg caagggcctg gaatggatcg gcatgatcag ctcctcaggt 540

tcaacccatt acgcaagttg ggcgaagggc aggtttacca tcagccgcga caccagcaag 600

aataccgttt acctgcagat gaatagcctg agggccgaag acacggcggt ctattactgt 660

gcacgggact tctatgtgta cagttccggg acgtacctcg agtatggcat ggacctgtgg 720

ggccagggga ccctcgtaac tgtgagcagc 750

<210> 24

<211> 756

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 24

gagatcgtga tgacccagtc cccaagtaca ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgatc 60

ataaactgtc agagctctcc ctccgtatat aataagaact ggttgagttg gtatcaacag 120

aagcccggta aggcccccaa actgctcatt tacaaagcct ctactctggc atccggggtg 180

ccaagccgct tctccgggag tgggtctggc gccgagttca ccctgaccat atcttccctg 240

cagcccgacg acttcgcaac gtactattgc gctggtggct ataatagcga tagcgagcgc 300

ggtaccttcg ggcagggcac gaagttgacc gtgctgggcg gagggggctc aggaggtggc 360

ggtagcggag gaggcggctc agaagtgcag ctggtggagt ccggcggtgg actggtgcaa 420

ccgggaggct cactcagatt gtcatgcacc gcctctggct ttagtctgag cagttcctac 480

tggatttgct gggtgaggca ggcacccggc aagggcctgg aatggatcgg ctgtgtgtac 540

gttgggtcat ccgactttac atattacgcg acatgggcga agggcaggtt taccatcagc 600

cgcgacaaca gcaagaatac cgtttacctg cagatgaata gcctgagggc cgaagacacg 660

gcggtctatt tctgtgcacg gccctatccc gactggaata ttgatagttt tagatgggat 720

ctgtggggcc ctgggaccct cgtaactgtg agcagc 756

<210> 25

<211> 744

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 25

gagatcgtga tgacccagtc cccaagtaca ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgatc 60

ataaactgtc aggctagtca gagcgtcttt agcaataact acttggcctg gtatcaacag 120

aagcccggta aggcccccaa actgctcatt tacagagcct ctaatctggc atccggggtg 180

ccaagccgct tctccgggag tgggtctggc gccgagttca ccctgaccat atcttccctg 240

cagcccgacg acttcgcaac gtactattgc caacccacgt acctctccgg ggactggtat 300

gtggcattcg ggcagggcac gaagttgacc gtgctgggcg gagggggctc aggaggtggc 360

ggtagcggag gaggcggctc agaagtgcag ctggtggagt ccggcggtgg actggtgcaa 420

ccgggaggct cactcagatt gtcatgcacc gcctctggct ttagtctcaa ctactatggt 480

atgggctggg tgaggcaggc acccggcaag ggcctggaat ggatcggcat cattgctggt 540

gaccgggaca catactatgc tacttgggcg aagggcaggt ttaccatcag ccgcgacaac 600

agcaagaata ccgtttacct gcagatgaat agcctgaggg ccgaagacac ggcggtctat 660

ttctgtgcac ggggttcata tagcagtaca tgggatggtg catttgacct gtggggccct 720

gggaccctcg taactgtgag cagc 744

<210> 26

<211> 738

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 26

gagatcgtga tgacccagtc cccaagtaca ctgagcgcct ccgtgggcga ccgcgtgatc 60

ataaactgtc aggcctccca gtctatcgac agctggttgt catggtatca acagaagccc 120

ggtaaggccc ccaaactgct catttacctg gcatccacac tggcatccgg ggtgccaagc 180

cgcttctccg ggagtgggtc tggcgccgag ttcaccctga ccatatcttc cctgcagccc 240

gacgacttcg caacgtacta ttgccaaagt aacgatgaga gtagcatcta cggtgccgcc 300

ttcgggcagg gcacgaagtt gaccgtgctg ggcggagggg gctcaggagg tggcggtagc 360

ggaggaggcg gctcagaagt gcagctggtg gagtccggcg gtggactggt gcaaccggga 420

ggctcactca gattgtcatg caccgcctct ggctttagtc tttcaattta cgacatgata 480

tgggtgaggc aggcacccgg caagggcctg gaatggatcg gcattattat ttacgggggc 540

agtgccagct acgcgaattg ggcgaagggc aggtttacca tcagccgcga caacagcaag 600

aataccgttt acctgcagat gaatagcctg agggccgaag acacggcggt ctatttctgt 660

gcacggggtg catcatcata cagttactct tatggcttct ccctgtgggg ccctgggacc 720

ctcgtaactg tgagcagc 738

<210> 27

<211> 494

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 27

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu

35 40 45

Asn Ile Tyr Arg Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Ala Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Ala

100 105 110

Phe Tyr Ser Ser Ser Ala Asp Asn Pro Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Thr Val Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

130 135 140

Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

145 150 155 160

Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu

180 185 190

Trp Ile Gly Met Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr His Tyr Ala Ser Trp

195 200 205

Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Val

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Arg Asp Phe Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Thr Tyr Leu Glu Tyr

245 250 255

Gly Met Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr

260 265 270

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

275 280 285

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

290 295 300

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

305 310 315 320

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

325 330 335

Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys

340 345 350

Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys

355 360 365

Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val

370 375 380

Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn

385 390 395 400

Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val

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Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg

420 425 430

Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys

435 440 445

Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

450 455 460

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys

465 470 475 480

Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

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<210> 28

<211> 485

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 28

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Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ile Ile Asn Cys Gln Ser Ser Pro

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Ser Val Tyr Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

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Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

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355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

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385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

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485

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<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 29

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Gly Gly Tyr Asn Ser Asp Ser Glu Arg Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr

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Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Cys Val Tyr Val Gly Ser Ser Asp Phe Thr

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210 215 220

Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

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290 295 300

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

305 310 315 320

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

325 330 335

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile

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Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp

355 360 365

Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

370 375 380

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

385 390 395 400

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

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<211> 492

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<400> 30

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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser

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Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

325 330 335

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355 360 365

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<211> 490

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Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro

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Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser

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180 185 190

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Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

275 280 285

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

290 295 300

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

305 310 315 320

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

325 330 335

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

340 345 350

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

355 360 365

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

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450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

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485 490

<210> 32

<211> 1485

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 32

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agccgcttct ccgggagtgg gtctggcgcc gagttcaccc tgaccatatc ttccctgcag 300

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cccttcgggc agggcacgaa gttgaccgtg ctgggcggag ggggctcagg aggtggcggt 420

agcggaggag gcggctcaga agtgcagctg gtggagtccg gcggtggact ggtgcaaccg 480

ggaggctcac tcagattgtc atgcaccgcc tctggcttta gtttgtccag ctatgcgatg 540

agctgggtga ggcaggcacc cggcaagggc ctggaatgga tcggcatgat cagctcctca 600

ggttcaaccc attacgcaag ttgggcgaag ggcaggttta ccatcagccg cgacaccagc 660

aagaataccg tttacctgca gatgaatagc ctgagggccg aagacacggc ggtctattac 720

tgtgcacggg acttctatgt gtacagttcc gggacgtacc tcgagtatgg catggacctg 780

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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 1080

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 1140

gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 1200

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<210> 33

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<212> DNA/RNA

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<400> 33

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<210> 34

<211> 1491

<212> DNA/RNA

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atcataaact gtcagagctc tccctccgta tataataaga actggttgag ttggtatcaa 180

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ctgcagcccg acgacttcgc aacgtactat tgcgctggtg gctataatag cgatagcgag 360

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cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960

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accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1491

<210> 35

<211> 1479

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 35

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggagatcg tgatgaccca gtccccaagt acactgagcg cctccgtggg cgaccgcgtg 120

atcataaact gtcaggctag tcagagcgtc tttagcaata actacttggc ctggtatcaa 180

cagaagcccg gtaaggcccc caaactgctc atttacagag cctctaatct ggcatccggg 240

gtgccaagcc gcttctccgg gagtgggtct ggcgccgagt tcaccctgac catatcttcc 300

ctgcagcccg acgacttcgc aacgtactat tgccaaccca cgtacctctc cggggactgg 360

tatgtggcat tcgggcaggg cacgaagttg accgtgctgg gcggaggggg ctcaggaggt 420

ggcggtagcg gaggaggcgg ctcagaagtg cagctggtgg agtccggcgg tggactggtg 480

caaccgggag gctcactcag attgtcatgc accgcctctg gctttagtct caactactat 540

ggtatgggct gggtgaggca ggcacccggc aagggcctgg aatggatcgg catcattgct 600

ggtgaccggg acacatacta tgctacttgg gcgaagggca ggtttaccat cagccgcgac 660

aacagcaaga ataccgttta cctgcagatg aatagcctga gggccgaaga cacggcggtc 720

tatttctgtg cacggggttc atatagcagt acatgggatg gtgcatttga cctgtggggc 780

cctgggaccc tcgtaactgt gagcagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 840

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 900

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 960

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 1020

ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 1080

caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 1140

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1200

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440

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<210> 36

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<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 36

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggagatcg tgatgaccca gtccccaagt acactgagcg cctccgtggg cgaccgcgtg 120

atcataaact gtcaggcctc ccagtctatc gacagctggt tgtcatggta tcaacagaag 180

cccggtaagg cccccaaact gctcatttac ctggcatcca cactggcatc cggggtgcca 240

agccgcttct ccgggagtgg gtctggcgcc gagttcaccc tgaccatatc ttccctgcag 300

cccgacgact tcgcaacgta ctattgccaa agtaacgatg agagtagcat ctacggtgcc 360

gccttcgggc agggcacgaa gttgaccgtg ctgggcggag ggggctcagg aggtggcggt 420

agcggaggag gcggctcaga agtgcagctg gtggagtccg gcggtggact ggtgcaaccg 480

ggaggctcac tcagattgtc atgcaccgcc tctggcttta gtctttcaat ttacgacatg 540

atatgggtga ggcaggcacc cggcaagggc ctggaatgga tcggcattat tatttacggg 600

ggcagtgcca gctacgcgaa ttgggcgaag ggcaggttta ccatcagccg cgacaacagc 660

aagaataccg tttacctgca gatgaatagc ctgagggccg aagacacggc ggtctatttc 720

tgtgcacggg gtgcatcatc atacagttac tcttatggct tctccctgtg gggccctggg 780

accctcgtaa ctgtgagcag caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840

accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900

gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960

gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020

aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc taa 1473

<210> 37

<211> 15

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 37

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 38

<211> 18

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 38

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 39

<211> 18

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 39

Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser Ser

<210> 40

<211> 246

<212> PRT

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 40

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly

1 5 10 15

Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu

20 25 30

Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp

65 70 75 80

Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg

85 90 95

Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly

100 105 110

Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly

130 135 140

Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp

165 170 175

Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp

180 185 190

Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala

195 200 205

Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe

210 215 220

Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Ser Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 41

<211> 738

<212> DNA/RNA

<213> 合成序列(Synthetic Sequence)

<400> 41

gacattgtgc tcactcagtc acctcccagc ctggccatga gcctgggaaa aagggccacc 60

atctcctgta gagccagtga gtccgtcaca atcttgggga gccatcttat tcactggtat 120

cagcagaagc ccgggcagcc tccaaccctt cttattcagc tcgcgtcaaa cgtccagacg 180

ggtgtacctg ccagattttc tggtagcggg tcccgcactg attttacact gaccatagat 240

ccagtggaag aagacgatgt ggccgtgtat tattgtctgc agagcagaac gattcctcgc 300

acatttggtg ggggtactaa gctggagatt aagggaagca cgtccggctc agggaagccg 360

ggctccggcg agggaagcac gaaggggcaa attcagctgg tccagagcgg acctgagctg 420

aaaaaacccg gcgagactgt taagatcagt tgtaaagcat ctggctatac cttcaccgac 480

tacagcataa attgggtgaa acgggcccct ggaaagggcc tcaaatggat gggttggatc 540

aataccgaaa ctagggagcc tgcttatgca tatgacttcc gcgggagatt cgccttttca 600

ctcgagacat ctgcctctac tgcttacctc caaataaaca acctcaagta tgaagataca 660

gccacttact tttgcgccct cgactatagt tacgccatgg actactgggg acagggaacc 720

tccgttaccg tcagttcc 738

Claims

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域，其中所述胞外抗原识别结构域包含抗BCMA的scFv抗体，所述scFv抗体的VH互补决定区CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL互补决定区CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列分别为SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗体为人源化抗体或兔源抗体。

3. 根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL序列包括如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。

4. 根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗体的VH序列包括如SEQ IDNO:9所示的氨基酸序列，所述scFv抗体的VL序列包括如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

5. 根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗体中VH和VL之间具有连接区，所述连接区选自以下的一种或多种：SEQ ID NO:37-39。

6. 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述scFv抗体的序列如SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区来源于IgG1、IgG4、CD4、CD7、CD28、CD84、CD8α中的一种或多种；

和/或，所述跨膜区来源于CD3、CD4、CD7、CD8α、CD28、CD80、CD86、CD88、4-1BB、CD152、OX40、Fc70中的一种或多种；

和/或，所述细胞内结构域包含胞内信号传导区。

8. 根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述铰链区的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列。

9. 根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜区的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:14所示的氨基酸序列。

10.根据权利要求7所述的嵌合抗原受体，其中所述细胞内结构域还包括共刺激信号传导区。

11.根据权利要求7中所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导区来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、FcRγ、FcRβ、CD66d、DAP10、DAP12、Syk中的一种或多种。

12.根据权利要求11中所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导区来源于CD3ζ。

13. 根据权利要求12中所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

14.根据权利要求10中所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导区来源于CD2、CD3、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD83、CD244、4-1BB、OX40、LFA-1、ICOS、LIGHT、NKG2C、NKG2D、DAP10、B7-H3、MyD88中的一种、两种或三种以上。

15.根据权利要求14中所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导区来源于CD28或4-1BB。

16. 根据权利要求15中所述的嵌合抗原受体，其中所述共刺激信号传导区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。

17.根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体还包含位于其氨基酸序列N-末端的引导肽。

18.根据权利要求17中所述的嵌合抗原受体，其中所述引导肽来源于CD8α。

19. 根据权利要求18中所述的嵌合抗原受体，所述引导肽的氨基酸序列包含如SEQ IDNO:17所示的氨基酸序列。

20. 根据权利要求1或6所述的嵌合抗原受体，其包含SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。

21. 根据权利要求1-6中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞外抗原识别结构域还包含抗以下靶点中一种的scFv抗体：CD138、NKG2D、CD38、CS1、CD19、SLAMF7、CD70、CD44v6、Lewis Y。

22.一种分离的核酸分子，其为编码权利要求1-21中任一项所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。

23. 根据权利要求22中所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子为SEQ IDNO:18所示的核苷酸序列、或与SEQ ID NO:18所述的核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性并且编码相同嵌合抗原受体的核苷酸序列。

24. 根据权利要求23中所述的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子为SEQ IDNO:33所示的核苷酸序列。

25.一种载体，其包含权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子。

26.根据权利要求25中所述的载体，其中所述载体为表达载体。

27.根据权利要求26中所述的载体，其中所述载体为病毒载体。

28.根据权利要求27中所述的载体，其中所述载体为慢病毒载体。

29.一种经工程化的免疫效应细胞，其包含权利要求1-21中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子，或权利要求25-28中任一项所述的载体。

30.根据权利要求29所述的经工程化的免疫效应细胞，其选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞、外周血单核细胞、多能干细胞中的一种或多种。

31.根据权利要求29所述的经工程化的免疫效应细胞，其选自多能干细胞分化成的T细胞或多能干细胞分化成的NK细胞。

32.根据权利要求29所述的经工程化的免疫效应细胞，其选自胚胎干细胞。

33.根据权利要求30所述的经工程化的免疫效应细胞，其中所述经工程化的免疫效应细胞是T淋巴细胞。

34.根据权利要求33所述的经工程化的免疫效应细胞，其中所述T淋巴细胞的来源为自体T淋巴细胞或同种异体T淋巴细胞。

35.一种药物组合物，其包含权利要求29-34中任一项所述的经工程化的免疫效应细胞和药学上可接受的辅料。

36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的辅料包括保护剂。

37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述保护剂包括细胞冻存液。

38.根据权利要求35所述的药物组合物，所述药物组合物为静脉注射剂。

39.权利要求1-21中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求22-24中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求25-28任一项所述的载体、或权利要求29-34中任一项所述的经工程化的免疫效应细胞用于制备治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的药物的用途，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症为癌症。

40.根据权利要求39所述的用途，所述癌症是多发性骨髓瘤。

41.根据权利要求40所述的用途，所述多发性骨髓瘤是难治性或复发性的多发性骨髓瘤。