CN114729328B - Tmem59蛋白二聚体或嵌合表达受体改善t细胞功能 - Google Patents

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Abstract

涉及一种免疫细胞，所述免疫细胞包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段和嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，以及所述免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。还提供了促进免疫细胞增殖的方法和促进记忆性细胞产生的方法。

Description

TMEM59蛋白二聚体或嵌合表达受体改善T细胞功能
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种嵌合抗原受体T淋巴细胞在制备用于治疗肿瘤的组合物中的用途和方法。
背景技术
恶性肿瘤是严重威胁人类生命的主要疾病。目前大部分的恶性肿瘤缺少有效的治愈手段，存在疾病复发性，病死率高，严重威胁患者身体健康、显著降低生活质量。
嵌合抗原受体T淋巴细胞疗法是近年来兴起的过继性免疫疗法。通过靶向肿瘤特异性抗原的单克隆抗体衍生来的单链抗体可变区，与共刺激分子(如4-1BB、CD28蛋白等)和T淋巴细胞信号传导区胞内段CD3zeta组成一个嵌合抗原受体蛋白，跨细胞膜表达于T淋巴细胞表面。当单链抗体可变区识别肿瘤细胞表面的特异性抗原时，激活共刺激分子和CD3zeta，传导T淋巴细胞激活信号，直接激活T淋巴细胞活化所依赖的第一和第二信号，促进T淋巴细胞活化、T淋巴细胞增殖和增强免疫杀伤功能，达到对肿瘤细胞的免疫调节和杀伤，从而达到清除肿瘤的目的。
提升效应T淋巴细胞在患者体内存活时间，是优化嵌合抗原受体T疗法治疗效果和延长有效时间的重要途径。临床试验显示，嵌合抗原受体T淋巴细胞疗法治疗获得长期疾病缓解，与嵌合抗原受体T淋巴细胞长期在患者体内存活和持续是密切相关的。效应T淋巴细胞虽然有强力的裂解肿瘤的能力，但是效应T淋巴细胞在患者体内存活时间较短。而记忆性T淋巴细胞，包括效应记忆T淋巴细胞和中央记忆T淋巴细胞能够有在体内长时间的扩增，拥有强大的增殖能力，同时具有分化为效应T淋巴细胞的潜能，能够持续提供效应T淋巴细胞。
因此，亟需延长存活时间的嵌合抗原受体T淋巴细胞，以维持其药效。
发明内容
本申请提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段和嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，以及所述免疫细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。本申请还提供了促进免疫细胞增殖的方法和促进记忆性细胞产生的方法。本申请所述的免疫细胞含有以下一种有益效果：(1)能够提高记忆性淋巴细胞的数量，例如，与不包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段的CAR T细胞相比，可以提高至少50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％或200％以上；(2)能够增强淋巴细胞的增殖能力，例如，与不包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段的CAR T细胞相比，可以至少增强10％、20％、30％40％或50％以上；(3)增强淋巴细胞对靶细胞的杀伤率，例如，与不包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段的CAR T细胞相比，可以至少增强10％、20％、30％或更高；以及，(4)抑制肿瘤细胞生长，和/或提高患有肿瘤的受试者的存活率。
一方面，本身请提供了一种免疫细胞，其包含位于细胞膜上的TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
在某些实施方式中，所述免疫细胞经改造而在细胞膜上包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
在某些实施方式中，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段为人TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
在某些实施方式中，所述TMEM59蛋白的跨膜区包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述TMEM59蛋白的铰链区包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件。
在某些实施方式中，所述CAR包括跨膜区。
在某些实施方式中，所述CAR的跨膜区选自：TMEM59蛋白的跨膜区和CD8的跨膜区。
在某些实施方式中，所述CAR的跨膜区包含SEQ ID NO.1和37中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包括铰链区。
在某些实施方式中，所述CAR的铰链区选自：TMEM59蛋白的铰链区和CD8的铰链区。
在某些实施方式中，所述CAR的铰链区包含SEQ ID NO.2和38中任一项所示的氨基苷酸序列。
在某些实施方式中，所述CAR包含细胞内结构域，所述CAR的细胞内结构域包括信号传导结构域和/或共刺激结构域。
在某些实施方式中，所述信号传导结构域包含CD3ζ的信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述共刺激结构域包含4-1BB的共刺激结构域。
在某些实施方式中，所述CAR包含靶向部分。
在某些实施方式中，所述靶向部分包括ScFv。
在某些实施方式中，所述靶向部分特异性结合和/或识别肿瘤抗原。
在某些实施方式中，所述靶向部分特异性结合和/或识别选自下组的靶标：CD19、CD22和GPC3。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包含所述CAR以及所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段，且其中所述CAR不包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
在某些实施方式中，所述CAR包含所述的靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域，其中所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
在某些实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO.49、51、55和56中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包含所述CAR以及所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段，且其中所述CAR包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
在某些实施方式中，所述CAR包含所述的靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域，其中所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
在某些实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO.43、57和44中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包括T淋巴细胞。
另一方面，本申请提供了一种药物组合物，其包括所述的免疫细胞及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本申请提供了所述的免疫细胞或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述所述肿瘤包括B淋巴白血病和/或肝癌。
另一方面，本申请提供了促进免疫细胞增殖的方法，所述方法包括：使免疫细胞在其细胞膜上表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
另一方面，本申请提供了促进记忆性免疫细胞产生的方法，所述方法包括：使免疫细胞在其细胞膜上表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
另一方面，本申请提供了一种增强免疫细胞对肿瘤杀伤能力的方法，所述方法包括：使所述免疫细胞在其细胞膜上表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。
在某些实施方式中，所述表达包括使所述免疫细胞包含编码所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的核酸。
在某些实施方式中，所述表达包括将包含编码所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的核酸的质粒转染所述免疫细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包括T淋巴细胞。
在某些实施方式中，所述免疫细胞包含编码所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的核酸。
在某些实施方式中，所述核酸位于病毒载体中。
另一方面，本申请提供了一种抑制肿瘤细胞增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：使所述的免疫细胞与肿瘤细胞接触。
在某些实施方式中，所述方法包括体外方法或离体方法。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
在某些实施方式中，所述肿瘤包括B淋巴白血病和/或肝癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是H63 CAR-T淋巴细胞中记忆性细胞的数量；
图2显示的是H63 CAR-2A-TMEM59 T淋巴细胞中记忆性细胞的数量；
图3显示的是21D4 CAR-2A-GFP T淋巴细胞中记忆性细胞的数量；
图4显示的是21D4 CAR-2A-TMEM59 T淋巴细胞中记忆性细胞的数量；
图5显示的是本申请所述T淋巴细胞的增殖数量；
图6显示的是本申请所述T淋巴细胞对靶细胞的杀伤率；
图7显示的是肿瘤小鼠体内的生物荧光强度变化趋势；
图8显示的是肿瘤小鼠的存活率随时间的变化趋势；
图9显示的是肿瘤小鼠的活体成像图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，并包括将人工特异性移植至特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可用于将单克隆抗体的特异性赋予T细胞，从而允许大量特异性T细胞产生，例如以用于过继性免疫细胞疗法。在某些情形中，CAR可以将细胞的特异性引导至肿瘤相关抗原。CAR可以包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。例如，CAR可包括融合了衍生自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的融合物，其被融合至CD3ζ的跨膜区和胞内结构域。在另一些情况下，CAR还可包含用于另外的共刺激信号传导的结构域诸如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAPlO和/或0X40。在一些情况下，可将分子与CAR，共表达，所述分子可包括共刺激分子、用于成像(例如，用于正电子发射断层摄影术)的报告基因、在添加前药后有条件地消除T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
在本申请中，术语“抗体”通常是指特异性结合抗原的、源自免疫球蛋白分子的蛋白质或多肽序列。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的、或完整免疫球蛋白，并可以来源于天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。术语“抗体片段”通常是指指完整抗体的至少一部分或其重组变体，并可以指完整抗体的抗原结合结构域，例如，抗原性决定可变区，其足以赋予抗体片段对靶标(例如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的例子包括，但不限于，抗原结合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白、VHH结构域、和从抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”通常是指，包含至少一个含有轻链可变区的抗体片段和至少一个含有重链可变区的抗体片段的融合蛋白，其中轻链可变区和重链可变区可通过短的柔性肽接头连续连接，能够表达为单链多肽，并且其中scFv保持其所源自的完整抗体的特异性。除非特别指出，否则在本申请中scFv可以以任何一种顺序具有VL和VH可变区，例如相对于多肽的N端和C端，scFv可以包含VL-接头-VH或可以包含VH-接头-VL。本申请的CAR中包含抗体或其抗体片段的部分可以以各种形式存在，包括例如，单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)和人源化抗体(Harlow等，1999，In：Using Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，NY；Harlow等，1989，In：Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等，1988，Science 242：423-426)，其中抗原结合结构域作为连续多肽链的一部分表达。在某些情形中，本申请CAR的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一些情形中，CAR可包含含有scFv的抗体片段。
在本申请中，术语“scFv”通常是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链可变区和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头，例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。在本申请中，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区。所述scFv分子具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。
在本申请中，术语“TMEM59”通常是指跨膜蛋白59、其功能变体和/或其功能片段。TMEM59序列是本领域已知的。例如，编码本申请的人TMEM59蛋白和/或其功能性片段的核苷酸序列可包含如SEQ ID NO.4的核苷酸序列。本申请的人TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含如SEQ ID NO.3的氨基酸序列。
在本申请中，术语“共刺激分子”通常是指T细胞上的关连结合性配偶体，其特异性结合共刺激配体，由此介导T细胞的共刺激反应，例如，但不限于，增殖。共刺激分子是有效免疫反应所需的、非抗原受体的细胞表面分子或其配体。共刺激分子包括但不限于，MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-I(CD18)和4-1BB(CD137)。
在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指4-1BB(CD137)的任何序列，其包括，例如，4-1BB的刺激信号传导结构域。其可包括4-1BB的同系物、变体、异构体或功能片段。
在本申请中，术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能部分。信号传导结构域可产生促进含有CAR的细胞例如表达CAR的细胞，例如T细胞或NK细胞的免疫效应功能的信号。例如，在CAR表达细胞中，免疫效应功能的实例可包括溶细胞活性和辅助活性，辅助活性可包括细胞因子的分泌。在某些情形中，信号结构域转导的效应子功能信号并引导细胞执行专门的功能。尽管可以使用整个细胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用整个结构域的完整链。在使用细胞内信号传导结构域的截短部分的程度上，可以使用这种截短部分代替完整链，只要其转导效应子功能信号。因此术语“信号传导结构域”可包括足以转导所需功能信号的信号传导结构域的任何截短部分。
在本申请中，术语“跨膜区”通常是指能够跨越细胞质膜的肽、多肽或蛋白质的结构域。可采用这些结构域将抗体或其片段锚定在细胞膜上。
在本申请中，术语“编码”通常指的是多核苷酸比如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特定序列充当模板来合成生物学过程中的其它多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一种和由其产生的生物学性质。因而，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列具有同一性并且通常在序列表中提供的编码链，和用作基因或cDNA转录的模板的非编码链两者，都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。在本申请中，术语“编码元件”通常是指包含编码蛋白质(如，嵌合抗原受体CAR)的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。
在本申请中，术语“肿瘤抗原”通常是指在肿瘤细胞上表达(或与肿瘤细胞发育相关)、已知或被认为对肿瘤细胞的致瘤特性有作用的任何分子。这些抗原通常具有细胞外部分，可被呈现在细胞表面上，还具有与细胞外部分连接在一起的跨膜部分和胞质部分。这些抗原有时可仅在肿瘤细胞表面呈现而不在正常细胞表面呈现。肿瘤抗原可专门地在肿瘤细胞上表达，或与正常细胞相比具有肿瘤特异性突变。在这种情况下，它们被称为肿瘤特异性抗原(TSA)。TSA为对肿瘤细胞唯一的，并不发生在身体的其他细胞上。肿瘤抗原可以不只在肿瘤细胞表达，在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的病症下，也可以在正常细胞上进行表达，它们被称为肿瘤相关性抗原(TAA)。与正常细胞相比，TAA可在肿瘤细胞上过表达，或因为肿瘤组织与正常组织相比具有较不紧凑的结构而容易在肿瘤细胞中与抗体结合。
在本申请中，术语“特异性结合”通常是指识别并结合存在于样品中的同源结合配体蛋白的抗体或配体，但所述抗体或配体基本上不识别或结合样品中的其他分子。
在本申请中，术语“CD19”通常是指分化簇19蛋白，其是可在白血病前体细胞上检测的抗原决定簇。人和鼠CD19的氨基酸和核酸序列可以在公共数据库中找到，例如GenBank，UniProt和Swiss-Prot。例如，人CD19的氨基酸序列可以在UniProt/Swiss-Prot登录号P15391找到，编码人CD19的核苷酸序列可以在NCBI登录号NM_001178098中找到。CD19在大多数B系癌症上表达，它也是B细胞祖细胞的早期标志。在本申请中，“CD19”可包括包含突变的蛋白质，例如全长野生型CD19的点突变，片段，插入，缺失和剪接变体。
在本申请中，术语“不包含”通常是指排除某种行为、结构或结构的可能性。例如，A不包含B通常是指排除B在A中出现的可能性。
在本申请中，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，通常是指由肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且可以包含蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽可包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。在本申请中，该术语是指两个短链，其也在本领域中通常被称为肽，寡肽和寡聚体，例如长链，其在本领域中通常称为蛋白质，其中存在很多类型。“多肽”包括例如生物活性片段，基本上同源的多肽，寡肽，同二聚体，异二聚体，多肽的变体，修饰的多肽，衍生物，类似物，融合蛋白等。多肽包括天然肽，重组肽或其组合。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“载体”通常是指含有重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列有效连接的表达控制序列。所述载体包含足以实现表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。所述载体可包括可以掺入所述重组多核苷酸的本领域已知的所有表达载体，包括粘粒、质粒(例如裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、和腺相关病毒)。术语“慢病毒”指慢病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们能将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，由此它们是最为有效的基因递送载体方法之一。HIV、SIV和FIV均是慢病毒的例子。术语“慢病毒载体”通常是指源自慢病毒基因组的至少一个部分的载体，包括尤其Milone et al.，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中提供的自失活慢病毒载体。可以在临床上使用的慢病毒载体的其它例子包括但不限于，例如Oxford BioMedica的基因递送技术、Lentigen的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类的慢病毒载体也可以获得，并是本领域技术人员已知的。
在本申请中，术语“受试者”通常是指可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物，人)。
在本申请中，术语“治疗”通常是指由于施用一种或多种疗法(例如一种或多种治疗剂比如本申请的CAR)减慢或改善增生性病症的进展、严重程度和/或持续时间，或改善增生性病症的一种或多种症状(例如，一种或多种可辨别的症状)。在本申请中，术语“治疗”还可指改善增生性病症的至少一种可测量的物理参数比如肿瘤生长，不必是患者可辨别的。本申请中的术语“治疗”还可指通过例如稳定可辨别的症状以物理方式、通过例如稳定物理参数以生理学方式或两者抑制增生性病症的进展。在某些情形中，术语“治疗”可以指减小或稳定肿瘤尺寸或癌细胞计数。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
一方面，本申请提供一种免疫细胞，其可包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件。
靶向部分
本申请所述免疫细胞的CAR可包含靶向部分。所述靶向部分可以是抗原结合结构域，靶向部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数量。在一个方面，通过将特异性结合所需抗原的抗原结合结合结构域工程化到CAR中，可将CAR介导的T细胞应答导向目的抗原。在某些情形中，所述靶向部分可特异性结合和/或识别肿瘤抗原。所述肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。根据所期望靶向的肿瘤抗原，本申请的CAR可被工程改造以包括对期望抗原特异性的适当的抗原结合部分。所述靶向部分可以是：包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人抗体、人源化抗体及其功能性片段，包括但不限于单结构域抗体，比如重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和骆驼科来源的纳米抗体的可变结构域(VHH)。在某些情形中，本申请所述靶向部分可以是抗体单链可变区scFv。通常为了有利于实际应用，CAR的靶向部分可以包含人类或人源化的用于抗体或抗体片段的抗原结合结构域的残基。
在某些情形中，本申请所述CAR的靶向部分可以靶向CD19靶标。例如，本申请所述CAR的靶向部分可以是人源化CD19单克隆抗体单链可变区，例如，所述人源化CD19单克隆抗体单链可变区可包含SEQ ID NO.41所示的氨基酸序列，又例如，所述人源化CD19单克隆抗体单链可变区可由包含SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列编码。或者，靶向部分也可以是全人源CD19单克隆抗体单链可变区。例如，所述全人源CD19单克隆抗体单链可变区其可包含SEQ ID NO.42所示的氨基酸序列，又例如全人源CD19单克隆抗体单链可变区其可由包含SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列编码。
在另一些情形中，本申请所述CAR的靶向部分可以靶向CD22靶标。例如，所述靶向CD22的靶向部分可由包含SEQ ID NO.48所示的氨基酸序列编码。例如，所述靶向CD22的靶向部分可由包含SEQ ID NO.35所示的核苷酸序列编码。
在另一些情形中，本申请所述CAR的靶向部分可以靶向GPC3靶标。例如，所述靶向GPC3的靶向部分可包含SEQ ID NO.54所示的核苷酸序列。例如，所述靶向GPC3的靶向部分可包含SEQ ID NO.36所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述CAR的靶向部分可以特异性结合和/或识别选自下组的靶标：CD19、CD22和GPC3。
本申请所述CAR的靶向部分可以特异性结合和/或识别一种或一种以上(例如，两种或两种以上)靶标的靶向部分。在某些情形中，本申请所述CAR可包含对一种靶标具有结合和/或识别特异性的靶向部分，所述靶标可选子下组：CD19、CD22和GPC3。在另一些情形中，本申请所述CAR的靶向部分可以包含对第一靶标具有结合和/或识别特异性的第一靶向部分，和对第二靶标具有结合和/或识别特异性的第二靶向部分，所述靶标可选自下组：CD19和CD22、CD19和GPC3以及CD22和GPC3。
跨膜区
本申请所述免疫细胞的CAR可包含跨膜区。在某些情形中，所述铰链区可以是与CAR中的一个结构域自然相关联的跨膜区。在另一些情况中，跨膜区可通过氨基酸修饰，以避免这样的结构域与相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最小化与受体复合体的其它成员的相互作用。跨膜结构域可以是天然来源的或合成来源的。在来源是天然的情况下，该结构域可以衍生自任何的膜结合或跨膜蛋白质。本申请中特定用途的跨膜结构域可以是或可以衍生自本领域中可行的那些。跨膜结构域也可以为合成的，在这种情况下，其主要可包括主要疏水的氨基酸残基。在某些情形中，所述跨膜区可以是TMEM59蛋白的跨膜区，例如，所述TMEM59蛋白的跨膜区可包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。又例如，所述TMEM59蛋白的跨膜区可由包含SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列编码。在另一些情形中，所述跨膜区可以是CD8的跨膜区，例如，所述CD8的跨膜区可包含SEQ ID NO.37所示的氨基酸序列，又例如，所述CD8的跨膜区可由包含SEQ ID NO.34所示的核苷酸序列编码。
铰链区
在某些情况下，跨膜区可以经由铰链连接至CAR的胞外区域，例如CAR的靶向部分。本申请所述免疫细胞的CAR可包括铰链区。在某些情形中，所述铰链区可以是TMEM59蛋白的铰链区，例如，所述TMEM59蛋白的铰链区可包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列，又例如，所述TMEM59蛋白可由包含SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列编码。在另一些情形中，所述铰链区可以是CD8的铰链区。例如，所述CD8的铰链区可包含SEQ ID NO.38所示的氨基酸序列，又例如，所述CD8的铰链区可由包含SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列编码。
胞内结构域
在本申请中，所述免疫细胞的CAR还可包含细胞内结构域。细胞内结构域可包含信号传导结构域。可用于本申请的CAR中的胞内信号传导结构域的例子通常可包括共同作用以在抗原受体衔接之后引发信号转导的T细胞受体(TCR)和共同受体的细胞质序列，以及这些序列的任意衍生物或变体和具有相同功能性能力的任一重组序列。
已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可认为由两种不同类的细胞质信号传导序列介导：通过TCR开始的抗原-依赖性初级活化的信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原-非依赖性方式起作用的以提供次级或共刺激信号的信号传导序列(次级细胞质信号传导序列，例如共刺激结构域)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可包含信号传导基序，例如基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。本申请中可使用的作为初级细胞质信号传导序列的ITAM可包括本领域中任何可行的信号传导结构域。在某些情形中，本申请所述的信号传导结构域可以是CD3ζ的信号传导结构域，其可包含SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列。
在某些情形中，本申请所述CAR的细胞内结构域可包括CD3ζ信号传导结构域。或者，如果对本申请所述CAR的功能的发挥有用的话，所述信号传导结构域也可与其他任何可行的一个或多个胞内结构域联合。例如，CAR的胞内结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激结构域。共刺激结构域通常是指CAR中包含的共刺激分子的胞内结构域的部分。共刺激分子通常是指淋巴细胞对抗原的有效应答所需的除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子。适用于本申请的共刺激分子的例子可包括本领域中可行的那些。在某些情形中，本申请所述的共刺激结构域可包含4-1BB的共刺激结构域。例如，所述4-1BB共刺激结构域可包含SEQ IDNO.10所示的核苷酸序列。
TMEM59蛋白和/或其功能性片段
本申请所述免疫细胞，其可包含位于细胞膜上的TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
在某些情形中，本申请所述免疫细胞可包含TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。在某些情形中，所述TMEM59蛋白可以为人TMEM59蛋白。例如，所述TMEM59蛋白的跨膜区可包含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。例如，所述TMEM59蛋白的铰链区可包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述免疫细胞可包含TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。在某些情形中，所述功能性片段可以为人TMEM59蛋白和/或其功能性片段。例如，所述TMEM59蛋白的跨膜区可包含SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。例如，所述TMEM59蛋白的铰链区可包含SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
在某些情形中，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可位于所述免疫细胞的细胞膜上。在另一些情形中，所述免疫细胞可经改造而在细胞膜上包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。
本申请所述CAR还可包括信号肽。在某些情形中，所述信号肽可包含CD8信号肽。例如。所述CD8信号肽可包含SEQ ID NO.46所示的氨基酸序列，例如，所述CD8信号肽可由包含SEQ ID NO.16所示的核苷酸序列编码。
本申请所述免疫细胞可包含所述CAR以及所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。在某些情形中，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可位于所述免疫细胞的细胞膜上。
嵌合抗原受体联合表达TMEM59
在某些情形中，所述CAR可不包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。在一些具体的情形中，所述CAR可包含所述靶向部分、所述铰链区、所述跨膜区、所述信号传导结构域和所述共刺激结构域。所述CAR可包含所述靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。在某些情形中，所述CAR可联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。在某些情形中，所述CAR的胞内结构域可与所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段直接或间接地相连。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.49、51、55和56中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.19、21、25和28中任一项所示的核苷酸序列编码。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.1-3中任一项所示的氨基苷酸序列。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可由包含SEQ ID NO.4-6中任一项所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含人源化CD19单克隆抗体单链可变区靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQID NO.49所示的氨基酸序列。又例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.19所示的核苷酸序列编码。在某些情形中，所述CAR可联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列。又例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可由包含SEQ ID NO.4中所示的氨基酸序列。本申请所述CAR联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的蛋白质可包含SEQ ID NO.50或52所示的氨基酸序列，又例如，本申请所述CAR联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的蛋白质可由包含SEQ ID NO.20、32、36和29中任一项所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含全人源CD19单克隆抗体单链可变区靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQID NO.51所示的氨基酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.21所示的核苷酸序列编码。在某些情形中，所述CAR可联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可由包含SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含GPC3靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.55所示的氨基酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.25所示的核苷酸序列编码。在某些情形中，所述CAR可联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.3中所示的核苷酸序列。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可由包含SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列编码。例如，所述CAR可包含CD19和CD22靶向部分、CD8的铰链区、CD8的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.28所示的核苷酸序列。在某些情形中，所述CAR可联合表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可包含SEQ ID NO.3中所示的氨基酸序列编码。例如，所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可由包含SEQ ID NO.4中所示的核苷酸序列编码。
在本申请中，所述CAR与所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可通过剪切肽联合表达。例如，所述剪切肽可以是2A序列。又例如，所述2A序列可包含SEQ ID NO.47所示的氨基酸序列，又例如，所述2A序列可由包含SEQ ID NO.17所示的核苷酸序列编码。在本申请中，所述CAR与所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段可通过IRES序列联合表达。又例如，所述IIRES序列可包含SEQ ID NO.18所示的核苷酸序列。
TMEM59改造的嵌合抗原受体
在另一些情形中，所述CAR可包含所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段。在一些具体的情形中，所述CAR可包含所述靶向部分、所述铰链区、所述跨膜区、所述信号传导结构域和所述共刺激结构域。在某些情形中，所述CAR可包含所述靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、所述信号传导结构域和所述共刺激结构域。例如，所述CAR可包含所述靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。
例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.43、57和44中任一项所示的氨基酸序列。例如。所述CAR可由包含SEQ ID NO.13、14、31、32和33中任一项所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含全人源CD19单克隆抗体单链可变区靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.44所示的氨基酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.7或33所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含CD19和CD22靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQ IDNO.57所示的氨基酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.31或32所示的核苷酸序列编码。
例如，所述CAR可包含GPC3靶向部分、TMEM59蛋白的铰链区、TMEM59蛋白的跨膜区、CD3ζ的信号传导结构域和4-1BB的共刺激结构域。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO.43所示的核苷酸序列。例如，所述CAR可由包含SEQ ID NO.13或14所示的核苷酸序列编码。
载体，细胞和制备方法
一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸，其可编码所述CAR多肽或其部分。通常，通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可为合适的。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如利用标准技术，可通过从表达基因的细胞中筛选文库，也可通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可以把核酸克隆到载体中，例如，可以把核酸克隆到包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒的载体中。特别地，目的载体可包括表达载体、复制载体、产生探针的载体和测序载体。
另一方面，本申请提供了包含本申请的核酸或载体的细胞。在某些情形中，所述细胞可以是体外细胞，其包含编码包含本申请所述的CAR的核酸。在其他情形中，本申请所述的细胞，例如体外细胞，可包含由本申请所述的CAR编码的多肽。
对于本申请所述的核酸、载体或多肽，任何细胞可以用作宿主细胞。在一些实施方案中，细胞可以为原核细胞、真菌细胞、酵母细胞或高等真核细胞例如哺乳动物细胞。适合的原核细胞包括但不限于，真细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。在某些情形中，细胞可以是人细胞。在另一些情形中，细胞可以是免疫细胞。本申请所述免疫细胞可选自下组：T淋巴细胞、B淋巴细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、TCR表达细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞、粒细胞、先天淋巴样细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、胸腺细胞和髓样细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可以包括T淋巴细胞。在另一些情形中，T淋巴细胞可以为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体T淋巴细胞、工程化自体T淋巴细胞(eACTTM)、同种异体T细胞、异源T细胞，或它们的任何组合。在某些情形中，可以从供体受试者获得T淋巴细胞。可以通过本领域已知的任何来源获得本申请所述的细胞。例如，T淋巴细胞可以在体外从造血干细胞群分化，或者可以从受试者获得T淋巴细胞。T淋巴细胞可以从例如外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织以及肿瘤获得。此外，T淋巴细胞可以源自本领域中可获得的一个或多个T淋巴细胞系。T细胞也可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术(例如FICOLLTM分离和/或单采术(apheresis))从受试者收集的血液样品种获得。
将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。可以使用本领域中的任何方法将载体引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可通过物理、化学或生物学手段将表达载体转移入宿主细胞。
将核酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的(可参见例如Sambrook等，2001，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold SpringHarborLaboratory，New York和其它病毒学和分子生物学手册)。将核酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。将感兴趣的核酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。目前广泛使用的将基因插入哺乳动物(例如人细胞)的方法可以利用病毒载体，用作载体的病毒包括，但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选的标记物。
药物组合物
本申请提供了一种药物组合物，其包括所述的免疫细胞及任选地药学上可接受的载体。在某些情形中，所述药物组合物可包含药学上可接受的载体、稀释剂、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂。在另一些情形中，药物组合物可包含赋形剂。在另一些情形中，药物组合物可包含编码包含本申请所述的的CAR的多核苷酸。在另一些情形中，所述药物组合物可包含含有由本申请的多核苷酸编码的CAR。在另一些情形中，所述组合物可包含含有CAR的T细胞。
本申请的药物组合物可制备以用于肠胃外递送、用于吸入或用于通过消化道递送，例如口服。制备此类药学上可接受的组合物在本领域技术人员的能力范围内。在某些情形中，缓冲液用于将该药物组合物维持在生理pH或稍低的pH，通常在约5至约8的pH范围内。在某些情形中，当考虑肠胃外施用时，药物组合物为无热原、肠胃外可接受的水溶液形式。在某些情形中，可将本申请所述的药物组合物配制成经适当保存的无菌的等张溶液。在某些实施方案中，可制备具有提供产品受控或持续释放的聚合化合物、珠或脂质体的所需分子的制剂，然后该制剂经由贮存注射(depot injection)来递送。在某些情形中，可使用可植入的药物递送装置来导入所需分子。
用途，方法
一方面，本申请提供了促进免疫细胞增殖的方法，所述方法包括：使免疫细胞在其细胞膜上表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。可以通过流式细胞测量术测量抗原刺激后CAR-T细胞的体外扩增，也可以测量在不存在再刺激下保持的CAR-T细胞扩增(可参见，例如Milone等人，MolecularTherapy 17(8)：1453-1464(2009)。)。另一方面，也可通过在合适的条件下培养所述免疫细胞，使其表达所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段，再对免疫细胞进行计数(例如，使用细胞计数仪计数)。
本申请所述免疫细胞可以包括T淋巴细胞。例如，T细胞可以为肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体T细胞、工程化自体T细胞(eACTTM)、同种异体T细胞、异源T细胞，或它们的任何组合。在某些情形中，可以从供体受试者获得T细胞。在另一些情形中，供体受试者可以为患有癌症或肿瘤的人类患者。在其他情形中，供体受试者可以为未患有癌症或肿瘤的人类患者。
另一方面，本申请提供了促进记忆性免疫细胞产生的方法。在某些情形中，本申请所述的免疫细胞可经历稳固的体内T淋巴细胞扩张过程，并可延长持续存在的时间。在另一些情形中，本申请所述的免疫细胞可以发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形式或生长的记忆性免疫细胞。例如，本申请的免疫细胞可经历强大的体内T细胞扩张，在血液和骨髓中以高水平形成特异性的记忆T细胞，并提升持续存在的时间，延长嵌合抗原受体T淋巴细胞的存活时间。
另一方面，本申请提供了所述的免疫细胞或所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。在某些情形中，所述肿瘤可包括实体瘤和/或非实体瘤。所述实体瘤通常为不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。非实体瘤可以是诸如血液学肿瘤。血液学癌症为血液或骨髓的癌症，例如白血病和淋巴瘤。例如，所述肿瘤可包括B淋巴白血病和/或肝癌。
另一方面，本申请还提供了一种增强免疫细胞对肿瘤杀伤能力的方法，所述方法包括：使所述免疫细胞在其细胞膜上表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，其中所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区。在某些情形中，所述表达包括使所述免疫细胞包含编码所述TMEM59蛋白和/或其功能性片段的核酸，在适合的条件下用本申请所公开的核酸转导细胞。例如，用用编码CAR的核酸转导细胞。又例如，用包含编码CAR的核酸的载体转导细胞。
本申请还提供了一种抑制肿瘤细胞增殖和/或杀伤肿瘤细胞的方法，所述方法包括：使所述的免疫细胞与肿瘤细胞接触。其中所述方法包括体外方法或离体方法。在某些情形中，可以将所述免疫细胞与肿瘤细胞可以按照从1∶500至500∶1或其间的任何数量比值进行接触。在某些情形中，所述免疫细胞与肿瘤细胞数量的比值可以是从1∶100至100∶1的范围内和其间任何比值。例如，可以是从20∶1至1∶20。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1.嵌合抗原受体序列的确定
H63表示人源化CD19单克隆抗体单链可变区，序列结构如SEQ ID NO：11所示；21D4表示全人源CD19单克隆抗体单链可变区，序列结构如SEQ ID NO：12所示；GPC3靶向部分序列结构如SEQ ID NO：36所示；CD22靶向部分序列结构如SEQ ID NO：35所示；绿色荧光蛋白(GFP)序列结构如SEQ ID NO：15所示。
1.1嵌合抗原受体联合表达TMEM59序列的确定
嵌合抗原受体联合表达TMEM59序列结构：CD8信号肽-肿瘤特异性抗原结合单链可变区-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES序列或2A序列-TMEM59蛋白全长基因序列。从美国国立医学图书馆基因数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)检索CD8信号肽、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和TMEM59基因全长序列。并且对密码子进行优化，以有利于在人类细胞中表达。
其中，CD8信号肽可包含如SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列，人CD8铰链区可包含如SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列，人CD8跨膜区可包含如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，人4-1BB共刺激结构域可包含如SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列，CD3ζ信号传导结构域可包含如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，TMEM59基因全长序列可包含如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
将上述基因序列依次按照CD8信号肽、肿瘤特异性抗原结合单链可变区、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域、2A(SEQ ID NO：17)或IRES(SEQ ID NO：18)、TMEM59蛋白全长基因序列进行连接，通过全基因合成连接进入慢病毒载体(来自Clontech 631988)。
嵌合抗原受体联合表达TMEM59序列结构如下，
H63 CAR-2A-TMEM59序列结构：CD8信号肽-H63-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-2A-TMEM59蛋白全长基因序列，核苷酸序列如SEQID NO：20所示；
21D4 CAR-2A-TMEM59序列结构：CD8信号肽-21D4-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-2A-TMEM59蛋白全长基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：22所示；
GPC3 CAR-IRES-TMEM59序列结构：CD8信号肽-GPC3-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-TMEM59蛋白全长基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示；
CD19CD22 CAR-IRES-TMEM59序列结构：CD8信号肽-CD19CD22-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-TMEM59蛋白全长基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。
1.2 TMEM59改造嵌合抗原受体序列的确定
TMEM59改造嵌合抗原受体序列结构：CD8信号肽-肿瘤特异性抗原结合单链可变区-人TMEM59铰链区-人TMEM59跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域基因序列。从美国国立医学图书馆基因数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)检索CD8信号肽、人CD8铰链区、人CD8跨膜区、人4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和人TMEM59铰链区、人TMEM59跨膜区序列。并且对密码子进行优化，以有利于在人类细胞中表达。将上述基因序列依次按照CD8信号肽、肿瘤特异性抗原结合单链可变区、人TMEM59铰链区、人TMEM59跨膜区、人4-1BB共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域序列进行连接，通过全基因合成连接进入慢病毒载体(来自Clontech)。
其中，人TMEM59铰链区可包含如SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列，人TMEM59跨膜区可包含如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。TMEM59改造嵌合抗原受体序列结构如下，
21D4-59TM CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-21D4-人TMEM59铰链区-人TMEM59跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-GFP基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；
GPC3-59TM CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-GPC3-人TMEM59铰链区-人TMEM59跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-GFP基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；
CD19CD22-59TM CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-CD19CD22-人TMEM59铰链区-人TMEM59跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-GFP基因序列，核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。
CD19CD22-59TM CAR序列结构：CD8信号肽-CD19CD22-人TMEM59铰链区-人TMEM59跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。
1.3对照序列的确定
将下述序列结构通过全基因合成连接进入慢病毒载体(来自Clontech 631988)。
H63 CAR序列结构：CD8信号肽-H63-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：19所示；
21D4 CAR-2A-GFP序列结构：CD8信号肽-21D4-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-2A-绿色荧光蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；
21D4 CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-21D4-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-绿色荧光蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示；
GPC3 CAR序列结构：CD8信号肽-GPC3-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示；
GPC3 CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-GPC3-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-绿色荧光蛋白，核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示；
CD19CD22 CAR序列结构：CD8信号肽-CD19CD22-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域，核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示；
CD19CD22 CAR-IRES-GFP序列结构：CD8信号肽-CD19CD22-人CD8铰链区-人CD8跨膜区-人4-1BB共刺激结构域-CD3ζ信号传导结构域-IRES-绿色荧光蛋白，核苷酸序列如SEQID NO：30所示。
实施例2.过表达慢病毒的制备
2.1转染液的配制
将293T细胞(ATCC CRL-3216)铺于T25培养瓶，培养液为DMEM培养液，添加10％胎牛血清(Gibco，10099-141)和1％青霉素/链霉素溶液(Gibco，15140-122)。放置于培养箱里培养至细胞密度达80-90％可进行转染
按如下分别配置A反应液和B反应液，充分混匀，静置。
A反应液如表1配置：
表1反应体系
试剂 数量
实施例1质粒 3.33μg
psPAX2质粒(丰晖生物) 2.50μg
pMD2.G质粒(丰晖生物) 1.67μg
Opti-MEM 100μl
B反应液如表2配置：
表2反应体系
试剂 体积
PEIpro转染试剂 15μl
Opti-MEM 100μl
将B反应液滴加到A反应液，混匀后，静置15分钟。
从培养箱中取出293T细胞，均匀地滴加混合的反应液到细胞液体表混匀后放于培养箱37℃条件下培养。16-24h后更换培养液。
2.2病毒的浓缩
吸取培养于T25培养瓶的转染反应液质粒293T细胞上清液5ml，转移至离心管中。4℃条件下以台式离心机4800转数/分钟离心10分钟。吸取上清液到新的离心管中，按照体积比1∶3 Lenti-X Concentrator(TaKaRa，631231)充分混合。4℃条件下以台式离心机1500xg离心45分钟。弃去上清液，加入250μl PBS充分混匀，分装，-80℃条件下保存。
实施例3.病毒的感染激活的T淋巴细胞
经过CD3抗体和CD28抗体激活后的人T淋巴细胞(上海赛笠生物科技有限公司)，培养于12孔细胞培养板。吸去培养液，加入含有不同嵌合抗原受体序列的病毒液。放于培养箱37℃条件下培养。培养2天后，吹起人T淋巴细胞转移到T25培养瓶，补充5ml T淋巴细胞培养液悬浮培养。得到CD19靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞：H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-T淋巴细胞和21D4-2A-TMEM59 CAR-T淋巴细胞，CD19靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞，以及对照CAR-T淋巴细胞：H63 CAR-T淋巴细胞和21D4-2A-GFP CAR-T淋巴细胞。
实施例4.CD19靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性检测
分别充分悬浮实施例3得到的H63 CAR-T淋巴细胞、H63 CAR-2A-TMEM59 CAR-T淋巴细胞、21D4-2A-GFP CAR-T淋巴细胞和21D4-2A-TMEM59 CAR-T淋巴细胞，计数后取细胞总量1×106个，转移到流式管。使用磷酸缓冲盐溶液洗2次离心参数为室温下400xg离心5分钟。弃去上清液，保留100μl液体，加入1μg生物素-蛋白L(ACROBIOSYSTEMS，RPL-P814R)，1μl/管。避光条件下4℃孵育30分钟。使用磷酸缓冲盐溶液洗2次，保留100μl液体，加入1μlPE-链霉素(BD，554061)、5μl CD45 RA抗体(Biolegend，304122)和5μl CD 62L抗体(BD，565535)，避光条件下4℃孵育30分钟。使用使用磷酸缓冲盐溶液洗2次后加入400μl磷酸缓冲盐溶液悬浮充分。使用流式仪进行流式检测。通过蛋白L标记CAR蛋白的单链可变区的轻链部分，表示阳性嵌合抗原受体T淋巴细胞。CD45RA和CD62L是T淋巴细胞表面记忆性标记，CD45RA和CD62L表达水平增高，意味着T淋巴细胞记忆性增强。
结果如图1-4和下表3所示。表3反应的是记忆细胞的数量。H63 CAR-2A-TMEM59 T淋巴细胞(图2)相比较于H63 CAR-T淋巴细胞(图1)，记忆性细胞比例从30.66％(图1B)上升到48.50％(图2B)。类似地，21D4 CAR-2A-TMEM59 T淋巴细胞(图4)相比较于21D4CAR-2A-GFP T淋巴细胞(图3)，记忆性细胞比例从18.90％(图3B)上升到48.80％(图4B)。说明在CD19 CAR-T淋巴细胞额外表达TMEM59蛋白，能够提升CD19 CAR-T淋巴细胞的记忆性细胞数量。
表3淋巴细胞数量
样品 CAR阳性细胞％(蛋白L阳性) 纯真T淋巴细胞％
H63 CAR-T淋巴细胞 82.71 30.66
H63 CAR-2A-TMEM59-T淋巴细胞 83.22 48.50
21D4 CAR-2A-GFP-T淋巴细胞 41.72 18.90
21D4 CAR-2A-TMEM59-T淋巴细胞 56.37 48.80
实施例5.CD19靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的增殖能力检测
将实施例3得到的CAR-T细胞放于培养箱37℃条件下培养。培养2天后，吹起细胞转移到T25培养瓶，补充5ml T淋巴细胞培养液悬浮培养。培养第4天，补充5ml T淋巴细胞培养液。用1ml枪头吹匀细胞，充分悬浮细胞，立即取20μl细胞悬液，注入到计数板加样孔中，通过Cellometer Auto 2000细胞计数仪计数。计数完成后总10ml细胞液，丢弃5ml细胞悬液，补充培养液5ml新鲜培养液。24小时后重复以上步骤，细胞计数，直至第8天。
细胞增值数量如图5所示。H63 CAR-2A-TMEM59-T淋巴细胞相比较于H63 CAR-T淋巴细胞，细胞数增加。相似地，21D4 CAR-2A-TMEM59-T淋巴细胞相比较于21D4 CAR-2A-GFP-T淋巴细胞，细胞数增加。说明在培养条件下，TMEM59有助于提高CART淋巴细胞的增殖能力。
实施例6.CD19靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性检测
根据实施例4的方法使用流式仪检测实施例3得到的CD19靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性。
结果显示，21D4 59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞相比较于21D4 CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞，记忆性细胞数量比值上升，说明经过TMEM59改造的CD19 CAR-T淋巴细胞能够提升CD19 CAR-T淋巴细胞的记忆性细胞数量。
实施例7.CD19靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞对靶细胞NALM-6杀伤能力检测(荧光素酶法)
培养慢病毒感染的T淋巴细胞，与NALM-6细胞(Imanis LIFE SCIENCE，CL151)按照效应细胞(T淋巴细胞)：靶细胞(NALM-6细胞)比值为10∶1、5∶1、2.5∶1，铺于96孔圆底板中，其中NALM-6细胞的量为1×104/孔。培养体系为含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，每孔共200ul细胞混悬液。
样品分组如下表4所示，每组3个平行：
表4效应细胞和靶细胞比例
将96孔培养板放于培养箱37℃条件下培养4小时。按照荧光素酶试剂盒(promega，E2920)使用说明进行检测。取出培养4小时的96孔培养板，吸取175μl细胞混合液，加入透明底黑色平板96孔培养板的孔中，加入25μl/孔荧光素酶底物。室温下，避光孵育10分钟。酶标仪检测。
结果如图6所示，本实施例以NALM-6细胞表达的荧光素酶活性反映NALM-6细胞存活数量。CD19(21D4)靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞(21D4-59TM CAR-IRES-GFP)和CD19(21D4)靶向性嵌合抗原受体T淋巴细胞(21D4 CAR-IRES-GFP)均能使NALM-6细胞裂解，并且21D4-59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞对NALM-6细胞裂解能力小幅高于21D4CAR-2A-GFP-T淋巴细胞。
实施例8.GPC3靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的增殖能力检测
根据实施例5的方法检测实施例3得到的GPC3靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的增殖能力。
结果显示，GPC3靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞(GPC3 CAR-IRES-TEME59-T淋巴细胞)相比较于GPC3 CAR-T淋巴细胞和GPC3 CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞，细胞数增加。
实施例9.GPC3靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性检测
根据实施例4的方法使用流式仪检测实施例3得到的GPC3靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性。
结果显示，GPC3-59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞相较于GPC3 CAR-IRES-GFP T淋巴细胞，记忆性细胞数量比值上升，说明经过TMEM59改造的GPC3 CAR-T淋巴细胞能够提升GPC3 CAR-T淋巴细胞的记忆性细胞数量。
实施例10.GPC3靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞对靶细胞Huh7杀伤能力检测(荧光素酶法)
根据实施例7的方法检测实施例3得到的GPC3靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞对靶细胞Huh7杀伤能力检测。样品分组如下表5所示，每组3个平行：
表5效应细胞和靶细胞比例
结果显示，GPC3靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞(GPC3-59TM CAR-IRES-GFP)和GPC靶向性嵌合抗原受体T淋巴细胞(GPC3 CAR-2A-GFP)均能使Huh7细胞裂解，并且GPC3-59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞对Huh7细胞裂解能力高于GPC3 CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞。
实施例11.CD19 CD22靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的增殖能力检测
根据实施例5的方法检测实施例3得到的CD19 CD22靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞的增殖能力。
结果显示，CD19 CD22靶向性嵌合抗原受体联合表达TMEM59蛋白嵌合抗原受体T淋巴细胞(CD19CD22 CAR-IRES-TEME59-T淋巴细胞)相比较于CD19CD22 CAR-T淋巴细胞和CD19CD21 CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞，细胞数增加。
实施例12.CD19 CD22靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性检测
根据实施例4的方法使用流式仪检测实施例3得到的CD19 CD22靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞的记忆性。
结果显示，CD19CD22-59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞相较于CD19CD22 CAR-IRES-GFP T淋巴细胞，记忆性细胞数量比值上升，说明经过TMEM59改造的CD19CD22 CAR-T淋巴细胞能够提升CD19CD22 CAR-T淋巴细胞的记忆性细胞数量。
实施例13.CD19 CD22靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞对靶细胞NALM-6杀伤能力检测(荧光素酶法)
根据实施例7的方法检测实施例3得到的CD19 CD22靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞对靶细胞NALM-6杀伤能力检测。样品分组如下表6所示，每组3个平行：
表6效应细胞和靶细胞比例
结果显示，CD19 CD22靶向性TMEM59改造嵌合抗原受体T淋巴细胞(CD19 CD22-59TM CAR-IRES-GFP)和CD19 CD22靶向性嵌合抗原受体T淋巴细胞(CD19 CD22 CAR-2A-GFP)均能使NALM-6细胞裂解，并且CD19 CD22-59TM CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞对NALM-6细胞裂解能力高于CD19 CD22 CAR-IRES-GFP-T淋巴细胞。
实施例14.嵌合抗原受体联合表达TMEM59和TMEM59改造嵌合抗原受体嵌合抗原受体T淋巴细胞对小鼠体内肿瘤生长的抑制
14.1小鼠荷瘤模型的建立
使用自行构建的表达有萤光素酶的靶肿瘤细胞，接种于NSG小鼠皮下注射成瘤。将2×105上述靶细胞重悬于100μl磷酸缓冲盐溶液中，皮下注射。
或，使用自行构建的表达有萤光素酶的靶肿瘤细胞Nalm-6细胞，，接种于NSG小鼠静脉注射成瘤。将2.5×105上述靶细胞重悬于100μl磷酸缓冲盐溶液中，鼠尾静脉注射。
14.2活体成像
成瘤3天后，在小鼠腹膜内注射萤光素酶底物Luciferin，注射用量为3mg/只，将小鼠麻醉后置于小动物活体成像仪中成像。Nalm细胞注射7天后，将表达CD19CD22-59TM CAR(核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示)的T淋巴细胞用PBS洗涤后用无血清培养液重悬，调整细胞密度为2×106/ml。每只小鼠尾静脉注射2×106个细胞，共200μl。设置不进行处理的小鼠为对照组。实验完成后，定期进行活体成像，收集瘤体消除效果；每3-7天进行生物荧光检测，并在第60天对CAR-T给药组注射2.5×105个NALM6肿瘤细胞进行复发模型挑战。
14.3瘤体积测量
注射细胞后，每周称量体重两次，以注射细胞当天为第0天。
14.4小鼠体重测量
注射细胞后，每周测量瘤体积两次，以注射细胞当天为第0天。瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm3)＝0.5×肿瘤长径×肿瘤短径2。
14.5瘤重测量
试验结束后将荷瘤小鼠安乐死并剥瘤称重。
结果显示，与对照组小鼠相比，注射了CAR-T细胞的小鼠肿瘤体积减小，瘤重减轻，体重增长趋势减缓。图7显示的是生物荧光强度，体现了肿瘤细胞的数量，结果显示，与生物荧光强度不断增强的未转染CAR的T细胞组相比，转染了CD19CD22-59TM CAR的T细胞组的小鼠体内的肿瘤细胞数量显著减少，荧光强度约在105至106之间，且第60天重新注射肿瘤细胞后也没有增长。图8显示的是实验组与对照组的存活实验动物百分比，作为对照的未转染CAR的T细胞组的小鼠，约从30天时存活率下降，至约45天存活率降至0，但是转染了CD19CD22-59TM CAR的T细胞组的小鼠在90天后存活率仍保持100％。图9显示的是小鼠活体成像结果，未转染CAR的T细胞组的小鼠在第10天和第37天光强度并未下降，第37天时由于死亡数量小鼠数量减少；转染了CD19CD22-59TM CAR的T细胞组的小鼠第10天时光强度明显降低，第37天后检测不到光强度，说明肿瘤已消除。
治疗期间均无动物死亡，没有表现明显的药物毒性，耐受良好。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。
序列表
<110> 上海医药集团股份有限公司
<120> TMEM59蛋白二聚体或嵌合表达受体改善T细胞功能
<130> 0124-PA-003CN
<160> 57
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59跨膜区氨基酸序列
<400> 1
Gly Trp Ile Leu Thr Thr Thr Leu Val Leu Ser Val Met Val Leu Leu
1 5 10 15
Trp Ile Cys Cys Ala
20
<210> 2
<211> 50
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59铰链区氨基酸序列
<400> 2
Pro His Leu Glu Gln Glu Pro Thr Asn Leu Arg Glu Ser Ser Leu Ser
1 5 10 15
Lys Met Ser Ser Asp Leu Gln Met Arg Asn Ser Gln Ala His Arg Asn
20 25 30
Phe Leu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Gly Phe Leu Arg Cys Leu Ser Leu
35 40 45
Asn Ser
50
<210> 3
<211> 324
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59蛋白和/或其功能性片段氨基酸序列
<400> 3
Met Ala Ala Pro Lys Gly Ser Leu Trp Val Arg Thr Gln Leu Gly Leu
1 5 10 15
Pro Pro Leu Leu Leu Leu Thr Met Ala Leu Ala Gly Gly Ser Gly Thr
20 25 30
Ala Ser Ala Glu Ala Phe Asp Ser Val Leu Gly Asp Thr Ala Ser Cys
35 40 45
His Arg Ala Cys Gln Leu Thr Tyr Pro Leu His Thr Tyr Pro Lys Glu
50 55 60
Glu Glu Leu Tyr Ala Cys Gln Arg Gly Cys Arg Leu Phe Ser Ile Cys
65 70 75 80
Gln Phe Val Asp Asp Gly Ile Asp Leu Asn Arg Thr Lys Leu Glu Cys
85 90 95
Glu Ser Ala Cys Thr Glu Ala Tyr Ser Gln Ser Asp Glu Gln Tyr Ala
100 105 110
Cys His Leu Gly Cys Gln Asn Gln Leu Pro Phe Ala Glu Leu Arg Gln
115 120 125
Glu Gln Leu Met Ser Leu Met Pro Lys Met His Leu Leu Phe Pro Leu
130 135 140
Thr Leu Val Arg Ser Phe Trp Ser Asp Met Met Asp Ser Ala Gln Ser
145 150 155 160
Phe Ile Thr Ser Ser Trp Thr Phe Tyr Leu Gln Ala Asp Asp Gly Lys
165 170 175
Ile Val Ile Phe Gln Ser Lys Pro Glu Ile Gln Tyr Ala Pro His Leu
180 185 190
Glu Gln Glu Pro Thr Asn Leu Arg Glu Ser Ser Leu Ser Lys Met Ser
195 200 205
Ser Asp Leu Gln Met Arg Asn Ser Gln Ala His Arg Asn Phe Leu Glu
210 215 220
Asp Gly Glu Ser Asp Gly Phe Leu Arg Cys Leu Ser Leu Asn Ser Gly
225 230 235 240
Trp Ile Leu Thr Thr Thr Leu Val Leu Ser Val Met Val Leu Leu Trp
245 250 255
Ile Cys Cys Ala Thr Val Ala Thr Ala Val Glu Gln Tyr Val Pro Ser
260 265 270
Glu Lys Leu Ser Ile Tyr Gly Asp Leu Glu Phe Met Asn Glu Gln Lys
275 280 285
Leu Asn Arg Tyr Pro Ala Ser Ser Leu Val Val Val Arg Ser Lys Thr
290 295 300
Glu Asp His Glu Glu Ala Gly Pro Leu Pro Thr Lys Val Asn Leu Ala
305 310 315 320
His Ser Glu Ile
<210> 4
<211> 975
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59蛋白和/或其功能性片段核苷酸序列
<400> 4
atggcggcgc cgaaggggag cctctgggtg aggacccaac tggggctccc gccgctgctg 60
ctgctgacca tggccttggc cggaggttcg gggaccgctt cggctgaagc atttgactcg 120
gtcttgggtg atacggcgtc ttgccaccgg gcctgtcagt tgacctaccc cttgcacacc 180
taccctaagg aagaggagtt gtacgcatgt cagagaggtt gcaggctgtt ttcaatttgt 240
cagtttgtgg atgatggaat tgacttaaat cgaactaaat tggaatgtga atctgcatgt 300
acagaagcat attcccaatc tgatgagcaa tatgcttgcc atcttggttg ccagaatcag 360
ctgccattcg ctgaactgag acaagaacaa cttatgtccc tgatgccaaa aatgcaccta 420
ctctttcctc taactctggt gaggtcattc tggagtgaca tgatggactc cgcacagagc 480
ttcataacct cttcatggac tttttatctt caagccgatg acggaaaaat agttatattc 540
cagtctaagc cagaaatcca gtacgcacca catttggagc aggagcctac aaatttgaga 600
gaatcatctc taagcaaaat gtcctcagat ctgcaaatga gaaattcaca agcgcacagg 660
aattttcttg aagatggaga aagtgatggc tttttaagat gcctctctct taactctggg 720
tggattttaa ctacaactct tgtcctctcg gtgatggtat tgctttggat ttgttgtgca 780
actgttgcta cagctgtgga gcagtatgtt ccctctgaga agctgagtat ctatggtgac 840
ttggagttta tgaatgaaca aaagctaaac agatatccag cttcttctct tgtggttgtt 900
agatctaaaa ctgaagatca tgaagaagca gggcctctac ctacaaaagt gaatcttgct 960
cattctgaaa tttaa 975
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59跨膜区核苷酸序列
<400> 5
gggtggattt taactacaac tcttgtcctc tcggtgatgg tattgctttg gatttgttgt 60
gca 63
<210> 6
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人TMEM59铰链区核苷酸序列
<400> 6
ccacatttgg agcaggagcc tacaaatttg agagaatcat ctctaagcaa aatgtcctca 60
gatctgcaaa tgagaaattc acaagcgcac aggaattttc ttgaagatgg agaaagtgat 120
ggctttttaa gatgcctctc tcttaactct 150
<210> 7
<211> 2796
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4-59TM CAR-IRES-GFP
<400> 7
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct caccacattt ggagcaggag cctacaaatt tgagagaatc atctctaagc 840
aaaatgtcct cagatctgca aatgagaaat tcacaagcgc acaggaattt tcttgaagat 900
ggagaaagtg atggcttttt aagatgcctc tctcttaact ctgggtggat tttaactaca 960
actcttgtcc tctcggtgat ggtattgctt tggatttgtt gtgcaaaacg gggcagaaag 1020
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa ggatcccgcc cctctccctc ccccccccct 1500
aacgttactg gccgaagccg cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgttattt 1560
tccaccatat tgccgtcttt tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg 1620
acgagcattc ctaggggtct ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc 1680
gtgaaggaag cagttcctct ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt 1740
tgcaggcagc ggaacccccc acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta 1800
taagatacac ctgcaaaggc ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg 1860
gaaagagtca aatggctctc ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag 1920
gtaccccatt gtatgggatc tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag 1980
tcgaggttaa aaaaacgtct aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa 2040
acacgatgat aagcttgcca caacccacaa tctagaatgg tgagcaaggg cgaggagctg 2100
ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc 2160
agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct gaagttcatc 2220
tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc 2280
gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc 2340
atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag 2400
acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc 2460
atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc 2520
cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc 2580
cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc 2640
atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg 2700
agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc 2760
gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaa 2796
<210> 8
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8铰链区核苷酸序列
<400> 8
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 9
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域核苷酸序列
<400> 9
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa aagaagaggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 10
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人4-1BB共刺激结构域核苷酸序列
<400> 10
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaact g 141
<210> 11
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化CD19单克隆抗体单链可变区H63
<400> 11
caagtgcagc tcgtccaaag cggcggagga gtggtgcagc ccggaagaag cctcagactc 60
agctgtgctg ccagcggagt cagcctcccc gactacggag tgagctgggt gagacaagcc 120
cccggcaagg gactggaatg ggtcgccgtg atttggggca gcgagaccac ctactacaac 180
tccgctctga agtctagatt cacaatctcc agagataatt ccaaaaatac cctctatctg 240
caaatgaact ctctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgctaa gcactactac 300
tatggcggca gcttcgccat ggattactgg ggacaaggca cactggtgac cgtctcctcc 360
ggaagcacca gcggaagcgg aaagcccggc agcggcgagg gctccacaaa aggagacatc 420
cagatgacac aatccccttc ctctctgagc gcttccgtcg gcgacagagt caccatcaca 480
tgcagagcca gccaagacat cagcaagtat ctgaactggt accagcagaa gcccggcaag 540
gccatcaaac tgctgatcta ccacacatct agactgcaca gcggagtgcc ctccagattc 600
tccggcagcg gcagcggcac cgactttaca ctgaccatta gctctctgca gcccgaggac 660
tttgctacct actactgtca gcaaggcgcc acactgccct atacctttgg ccccggcaca 720
aaggtggaca tcaag 735
<210> 12
<211> 792
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人源CD19单克隆抗体单链可变区21D4
<400> 12
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct ca 792
<210> 13
<211> 1467
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3-59TM CAR
<400> 13
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagcc cacatttgga gcaggagcct acaaatttga gagaatcatc tctaagcaaa 840
atgtcctcag atctgcaaat gagaaattca caagcgcaca ggaattttct tgaagatgga 900
gaaagtgatg gctttttaag atgcctctct cttaactctg ggtggatttt aactacaact 960
cttgtcctct cggtgatggt attgctttgg atttgttgtg caaaacgggg cagaaagaaa 1020
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaa 1467
<210> 14
<211> 2785
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3-59TM CAR-IRES-GFP
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagcc cacatttgga gcaggagcct acaaatttga gagaatcatc tctaagcaaa 840
atgtcctcag atctgcaaat gagaaattca caagcgcaca ggaattttct tgaagatgga 900
gaaagtgatg gctttttaag atgcctctct cttaactctg ggtggatttt aactacaact 960
cttgtcctct cggtgatggt attgctttgg atttgttgtg caaaacgggg cagaaagaaa 1020
ctcctgtata tattcaaaca accatttatg agaccagtac aaactactca agaggaagat 1080
ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc 1140
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtacaag cagggccaga accagctcta taacgagctc 1200
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 1260
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 1320
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 1380
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt 1440
cacatgcagg ccctgccccc tcgctaaccc ctctccctcc ccccccccta acgttactgg 1500
ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt 1560
gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa acctggccct gtcttcttga cgagcattcc 1620
taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc 1680
agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg 1740
gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc 1800
tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa 1860
atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg gctgaaggat gcccagaagg taccccattg 1920
tatgggatct gatctggggc ctcggtgcac atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa 1980
aaaacgtcta ggccccccga accacgggga cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata 2040
agcttgccac aacccacaat ctagaatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt 2100
ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg 2160
cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg 2220
caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt 2280
cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg 2340
ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga 2400
ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa 2460
ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta 2520
tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat 2580
cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg 2640
ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc 2700
caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct 2760
cggcatggac gagctgtaca agtaa 2785
<210> 15
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GFP靶向部分
<400> 15
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 16
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8信号肽核苷酸序列
<400> 16
atgctgctgc tcgtgacctc tctgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attccc 66
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2A序列
<400> 17
gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57
<210> 18
<211> 574
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> IRES序列
<400> 18
cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 60
tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 120
gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 180
aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 240
aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 300
ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 360
cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 420
ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 480
cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaaacgt ctaggccccc cgaaccacgg 540
ggacgtggtt ttcctttgaa aaacacgatg ataa 574
<210> 19
<211> 1470
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H63 CAR
<400> 19
atgctgctgc tcgtgacctc tctgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attccccaag tgcagctcgt ccaaagcggc ggaggagtgg tgcagcccgg aagaagcctc 120
agactcagct gtgctgccag cggagtcagc ctccccgact acggagtgag ctgggtgaga 180
caagcccccg gcaagggact ggaatgggtc gccgtgattt ggggcagcga gaccacctac 240
tacaactccg ctctgaagtc tagattcaca atctccagag ataattccaa aaataccctc 300
tatctgcaaa tgaactctct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg tgctaagcac 360
tactactatg gcggcagctt cgccatggat tactggggac aaggcacact ggtgaccgtc 420
tcctccggaa gcaccagcgg aagcggaaag cccggcagcg gcgagggctc cacaaaagga 480
gacatccaga tgacacaatc cccttcctct ctgagcgctt ccgtcggcga cagagtcacc 540
atcacatgca gagccagcca agacatcagc aagtatctga actggtacca gcagaagccc 600
ggcaaggcca tcaaactgct gatctaccac acatctagac tgcacagcgg agtgccctcc 660
agattctccg gcagcggcag cggcaccgac tttacactga ccattagctc tctgcagccc 720
gaggactttg ctacctacta ctgtcagcaa ggcgccacac tgccctatac ctttggcccc 780
ggcacaaagg tggacatcaa gaccacaaca cccgccccta gacctcccac ccccgcccct 840
accatcgcta gccagcctct gtctctgaga cccgaggctt gcagacccgc tgctggagga 900
gctgtgcata caagaggact ggatttcgct tgcgacatct acatctgggc ccctctggct 960
ggcacatgtg gagtgctgct gctgtctctg gtgatcaccc tctactgcaa gagaggaaga 1020
aaaaaactgc tctatatttt taaacagcct tttatgaggc ccgtccagac cacacaagag 1080
gaagacggat gtagctgcag attccccgag gaggaagagg gaggatgcga gctgagagtc 1140
aagttctcta gatccgctga tgcccccgcc tacaaacaag gccagaatca gctctacaac 1200
gagctcaacc tcggcagaag agaggagtac gacgtgctgg acaagagaag aggcagagat 1260
cccgagatgg gcggaaagcc tagaaggaag aaccctcaag agggactgta caacgagctg 1320
cagaaggaca aaatggctga ggcctacagc gaaatcggca tgaaaggcga gaggaggagg 1380
ggcaaaggac acgatggact gtaccaaggc ctctccaccg ccacaaagga cacctacgac 1440
gccctccata tgcaagctct gccccctagg 1470
<210> 20
<211> 2511
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H63 CAR-2A-TMEM59
<400> 20
atgctgctgc tcgtgacctc tctgctgctg tgcgaactgc cccaccccgc ctttctgctg 60
attccccaag tgcagctcgt ccaaagcggc ggaggagtgg tgcagcccgg aagaagcctc 120
agactcagct gtgctgccag cggagtcagc ctccccgact acggagtgag ctgggtgaga 180
caagcccccg gcaagggact ggaatgggtc gccgtgattt ggggcagcga gaccacctac 240
tacaactccg ctctgaagtc tagattcaca atctccagag ataattccaa aaataccctc 300
tatctgcaaa tgaactctct gagggccgag gacaccgccg tgtactactg tgctaagcac 360
tactactatg gcggcagctt cgccatggat tactggggac aaggcacact ggtgaccgtc 420
tcctccggaa gcaccagcgg aagcggaaag cccggcagcg gcgagggctc cacaaaagga 480
gacatccaga tgacacaatc cccttcctct ctgagcgctt ccgtcggcga cagagtcacc 540
atcacatgca gagccagcca agacatcagc aagtatctga actggtacca gcagaagccc 600
ggcaaggcca tcaaactgct gatctaccac acatctagac tgcacagcgg agtgccctcc 660
agattctccg gcagcggcag cggcaccgac tttacactga ccattagctc tctgcagccc 720
gaggactttg ctacctacta ctgtcagcaa ggcgccacac tgccctatac ctttggcccc 780
ggcacaaagg tggacatcaa gaccacaaca cccgccccta gacctcccac ccccgcccct 840
accatcgcta gccagcctct gtctctgaga cccgaggctt gcagacccgc tgctggagga 900
gctgtgcata caagaggact ggatttcgct tgcgacatct acatctgggc ccctctggct 960
ggcacatgtg gagtgctgct gctgtctctg gtgatcaccc tctactgcaa gagaggaaga 1020
aaaaaactgc tctatatttt taaacagcct tttatgaggc ccgtccagac cacacaagag 1080
gaagacggat gtagctgcag attccccgag gaggaagagg gaggatgcga gctgagagtc 1140
aagttctcta gatccgctga tgcccccgcc tacaaacaag gccagaatca gctctacaac 1200
gagctcaacc tcggcagaag agaggagtac gacgtgctgg acaagagaag aggcagagat 1260
cccgagatgg gcggaaagcc tagaaggaag aaccctcaag agggactgta caacgagctg 1320
cagaaggaca aaatggctga ggcctacagc gaaatcggca tgaaaggcga gaggaggagg 1380
ggcaaaggac acgatggact gtaccaaggc ctctccaccg ccacaaagga cacctacgac 1440
gccctccata tgcaagctct gccccctagg ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg 1500
aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct ggacctatgg cggcgccgaa ggggagcctc 1560
tgggtgagga cccaactggg gctcccgccg ctgctgctgc tgaccatggc cttggccgga 1620
ggttcgggga ccgcttcggc tgaagcattt gactcggtct tgggtgatac ggcgtcttgc 1680
caccgggcct gtcagttgac ctaccccttg cacacctacc ctaaggaaga ggagttgtac 1740
gcatgtcaga gaggttgcag gctgttttca atttgtcagt ttgtggatga tggaattgac 1800
ttaaatcgaa ctaaattgga atgtgaatct gcatgtacag aagcatattc ccaatctgat 1860
gagcaatatg cttgccatct tggttgccag aatcagctgc cattcgctga actgagacaa 1920
gaacaactta tgtccctgat gccaaaaatg cacctactct ttcctctaac tctggtgagg 1980
tcattctgga gtgacatgat ggactccgca cagagcttca taacctcttc atggactttt 2040
tatcttcaag ccgatgacgg aaaaatagtt atattccagt ctaagccaga aatccagtac 2100
gcaccacatt tggagcagga gcctacaaat ttgagagaat catctctaag caaaatgtcc 2160
tcagatctgc aaatgagaaa ttcacaagcg cacaggaatt ttcttgaaga tggagaaagt 2220
gatggctttt taagatgcct ctctcttaac tctgggtgga ttttaactac aactcttgtc 2280
ctctcggtga tggtattgct ttggatttgt tgtgcaactg ttgctacagc tgtggagcag 2340
tatgttccct ctgagaagct gagtatctat ggtgacttgg agtttatgaa tgaacaaaag 2400
ctaaacagat atccagcttc ttctcttgtg gttgttagat ctaaaactga agatcatgaa 2460
gaagcagggc ctctacctac aaaagtgaat cttgctcatt ctgaaattta a 2511
<210> 21
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4 CAR
<400> 21
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca accacaggaa ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1080
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500
caggccctgc cccctcgc 1518
<210> 22
<211> 2682
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4 CAR-2A-TMEM59
<400> 22
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca accacaggaa caggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1080
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1140
cgcgacttcg cagcctatcg ctcccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaagctc 1200
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1260
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1320
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1380
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1440
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1500
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1560
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1620
atgcaggccc tgccccctcg cggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct 1680
ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gcggcgccga aggggagcct ctgggtgagg 1740
acccaactgg ggctcccgcc gctgctgctg ctgaccatgg ccttggccgg aggttcgggg 1800
accgcttcgg ctgaagcatt tgactcggtc ttgggtgata cggcgtcttg ccaccgggcc 1860
tgtcagttga cctacccctt gcacacctac cctaaggaag aggagttgta cgcatgtcag 1920
agaggttgca ggctgttttc aatttgtcag tttgtggatg atggaattga cttaaatcga 1980
actaaattgg aatgtgaatc tgcatgtaca gaagcatatt cccaatctga tgagcaatat 2040
gcttgccatc ttggttgcca gaatcagctg ccattcgctg aactgagaca agaacaactt 2100
atgtccctga tgccaaaaat gcacctactc tttcctctaa ctctggtgag gtcattctgg 2160
agtgacatga tggactccgc acagagcttc ataacctctt catggacttt ttatcttcaa 2220
gccgatgacg gaaaaatagt tatattccag tctaagccag aaatccagta cgcaccacat 2280
ttggagcagg agcctacaaa tttgagagaa tcatctctaa gcaaaatgtc ctcagatctg 2340
caaatgagaa attcacaagc gcacaggaat tttcttgaag atggagaaag tgatggcttt 2400
ttaagatgcc tctctcttaa ctctgggtgg attttaacta caactcttgt cctctcggtg 2460
atggtattgc tttggatttg ttgtgcaact gttgctacag ctgtggagca gtatgttccc 2520
tctgagaagc tgagtatcta tggtgacttg gagtttatga atgaacaaaa gctaaacaga 2580
tatccagctt cttctcttgt ggttgttaga tctaaaactg aagatcatga agaagcaggg 2640
cctctaccta caaaagtgaa tcttgctcat tctgaaattt aa 2682
<210> 23
<211> 2304
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4 CAR-2A-GFP
<400> 23
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca accacaggaa ccgtttctct gttgttaaac ggggcagaaa gaagctcctg 1080
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500
caggccctgc cccctcgcgg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa gcaggctgga 1560
gacgtggagg agaaccctgg acctatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 1620
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 1680
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 1740
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 1800
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 1860
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 1920
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 1980
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 2040
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 2100
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 2160
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 2220
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 2280
ggcatggacg agctgtacaa gtaa 2304
<210> 24
<211> 2970
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4 CAR-IRES-GFP
<400> 24
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggccatcc agttgaccca gtctccatcc tccctgtctg catctgtagg agacagagtc 120
accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct cattcgtgcc ggtcttcctg ccagcgaagc ccaccacgac gccagcgccg 840
cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg 900
tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc 960
tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc 1020
ctttactgca accacaggaa caggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 1080
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 1140
cgcgacttcg cagcctatcg ctcccgtttc tctgttgtta aacggggcag aaagaagctc 1200
ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1260
tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1320
aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1380
ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1440
gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1500
aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1560
cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1620
atgcaggccc tgccccctcg ctaaggatcc cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt 1680
actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc 1740
atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc 1800
attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag 1860
gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg 1920
cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat 1980
acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga 2040
gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc 2100
cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg 2160
ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga 2220
tgataagctt gccacaaccc acaatctaga atggtgagca agggcgagga gctgttcacc 2280
ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg 2340
tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc 2400
accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag 2460
tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc 2520
gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc 2580
gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac 2640
ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac 2700
gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac 2760
aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc 2820
gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa 2880
gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc 2940
actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 2970
<210> 25
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3 CAR
<400> 25
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagct tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggaaccg tttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa gctcctgtat 1080
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaaa agaagaggcc gggaccctga gatgggggga 1320
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500
gccctgcccc ctcgctaa 1518
<210> 26
<211> 3099
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3 CAR-IRES-TMEM59
<400> 26
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagct tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggaaccg tttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa gctcctgtat 1080
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaaa agaagaggcc gggaccctga gatgggggga 1320
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500
gccctgcccc ctcgctaagg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 1560
cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 1620
ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 1680
aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 1740
gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 1800
aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 1860
gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 1920
tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 1980
atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 2040
aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 2100
gcttgccaca acccacaatc tagaatggcg gcgccgaagg ggagcctctg ggtgaggacc 2160
caactggggc tcccgccgct gctgctgctg accatggcct tggccggagg ttcggggacc 2220
gcttcggctg aagcatttga ctcggtcttg ggtgatacgg cgtcttgcca ccgggcctgt 2280
cagttgacct accccttgca cacctaccct aaggaagagg agttgtacgc atgtcagaga 2340
ggttgcaggc tgttttcaat ttgtcagttt gtggatgatg gaattgactt aaatcgaact 2400
aaattggaat gtgaatctgc atgtacagaa gcatattccc aatctgatga gcaatatgct 2460
tgccatcttg gttgccagaa tcagctgcca ttcgctgaac tgagacaaga acaacttatg 2520
tccctgatgc caaaaatgca cctactcttt cctctaactc tggtgaggtc attctggagt 2580
gacatgatgg actccgcaca gagcttcata acctcttcat ggacttttta tcttcaagcc 2640
gatgacggaa aaatagttat attccagtct aagccagaaa tccagtacgc accacatttg 2700
gagcaggagc ctacaaattt gagagaatca tctctaagca aaatgtcctc agatctgcaa 2760
atgagaaatt cacaagcgca caggaatttt cttgaagatg gagaaagtga tggcttttta 2820
agatgcctct ctcttaactc tgggtggatt ttaactacaa ctcttgtcct ctcggtgatg 2880
gtattgcttt ggatttgttg tgcaactgtt gctacagctg tggagcagta tgttccctct 2940
gagaagctga gtatctatgg tgacttggag tttatgaatg aacaaaagct aaacagatat 3000
ccagcttctt ctcttgtggt tgttagatct aaaactgaag atcatgaaga agcagggcct 3060
ctacctacaa aagtgaatct tgctcattct gaaatttaa 3099
<210> 27
<211> 2844
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> gpc3 car-ires-gfp
<400> 27
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagct tcgtgccggt cttcctgcca gcgaagccca ccacgacgcc agcgccgcga 840
ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc 900
cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac 960
atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt 1020
tactgcaacc acaggaaccg tttctctgtt gttaaacggg gcagaaagaa gctcctgtat 1080
atattcaaac aaccatttat gagaccagta caaactactc aagaggaaga tggctgtagc 1140
tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc 1200
gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260
cgaagagagg agtacgatgt tttggacaaa agaagaggcc gggaccctga gatgggggga 1320
aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380
gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440
ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500
gccctgcccc ctcgctaagg atcccgcccc tctccctccc ccccccctaa cgttactggc 1560
cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg tttgtctata tgttattttc caccatattg 1620
ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa cctggccctg tcttcttgac gagcattcct 1680
aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca 1740
gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg 1800
aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc ggccaaaagc cacgtgtata agatacacct 1860
gcaaaggcgg cacaacccca gtgccacgtt gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa 1920
tggctctcct caagcgtatt caacaagggg ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt 1980
atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa 2040
aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac gtggttttcc tttgaaaaac acgatgataa 2100
gcttgccaca acccacaatc tagaatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg 2160
gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc 2220
gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc 2280
aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc 2340
agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc 2400
tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag 2460
gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag 2520
gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat 2580
atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc 2640
gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc 2700
cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc 2760
aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc 2820
ggcatggacg agctgtacaa gtaa 2844
<210> 28
<211> 2202
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19CD22 CAR
<400> 28
atgctgctgc tcgtgacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccctgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgataga 120
gtgaccatca gctgcagagc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggcgtg 240
cccagcagat tttctggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcaaggca acaccctgcc ctacaccttc 360
ggcggaggca ccaagctgga aatcacaggc ggcggaggat cccaggtgca gctgcagcag 420
tctggacccg gcctcgtgaa gcctagccag accctgtctc tgacctgcgc catcagcggc 480
gatagcgtgt ccagcaatag cgccgcctgg aactggatcc ggcagagccc ttctagaggc 540
ctggaatggc tgggccggac ctactaccgg tccaagtggt acaacgacta cgccgtgtcc 600
gtgaagtccc ggatcaccat caaccccgac accagcaaga accagttctc cctgcagctg 660
aacagcgtga cccccgagga taccgccgtg tactactgcg ccagagaagt gaccggcgac 720
ctggaagatg ccttcgacat ctggggccag ggcacaatgg tcaccgtgtc tagcggcagc 780
acaagcggct ctggcaagcc tggatctggc gagggctcta ccaagggcga tattcagatg 840
acacagagcc cctccagcct gtccgcctct gtgggagaca gagtgacaat cacctgtcgg 900
gcctcccaga ccatctggtc ctatctgaat tggtatcagc agcggcctgg caaggccccc 960
aacctgctga tctatgccgc cagctctctg cagtccggcg tgccatctag attcagcggc 1020
agaggcagcg gcaccgattt caccctgaca attagcagtc tgcaggccga ggacttcgcc 1080
acctactatt gccagcagag ctacagcatc ccccagacct tcggccaggg aacaaaactg 1140
gaaatcaaag ggggaggcgg cagcgaagtg aaactgcagg aatctggccc tggcctggtg 1200
gccccaagcc agtctctgag cgtgacctgt accgtgtctg gcgtgtccct gcccgattac 1260
ggcgtgtcct ggatcagaca gccccccaga aagggactgg aatggctggg agtgatctgg 1320
ggcagcgaga caacctacta caacagcgcc ctgaagtcca ggctgaccat catcaaggac 1380
aactccaaga gccaggtgtt cctgaagatg aattccctgc agaccgacga caccgccatc 1440
tattactgtg ccaagcacta ctactacggc ggcagctacg ccatggacta ctggggacag 1500
ggaacctccg tgaccgtgtc ctcttccgga accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 1560
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 1620
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 1680
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 1740
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 1800
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accatcactt gccgggcaag tcagggcatt agcagtgctt tagcctggta tcagcagaaa 180
ccagggaaag ctcctaagct cctgatctat gatgcctcca gtttggaaag tggggtccca 240
tcaaggttca gcggcagtgg atctgggaca gatttcactc tcaccatcag cagcctgcag 300
cctgaagatt ttgcaactta ttactgtcaa cagtttaata gttacccgta cacttttggc 360
caggggacca agctggagat caaaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 420
ggcggatctg aggtgcagct ggtgcagtct ggagcagagg tgaaaaagcc cggggagtct 480
ctgaagatct cctgtaaggg ttctggatac agctttagca gcagctggat cggctgggtg 540
cgccagatgc ccgggaaagg cctggagtgg atggggatca tctatcctga tgactctgat 600
accagataca gtccgtcctt ccaaggccag gtcaccatct cagccgacaa gtccatcagg 660
accgcctacc tgcagtggag cagcctgaag gcctcggaca ccgccatgta ttactgtgcg 720
agacatgtta ctatgatttg gggagttatt attgacttct ggggccaggg aaccctggtc 780
accgtctcct caccacattt ggagcaggag cctacaaatt tgagagaatc atctctaagc 840
aaaatgtcct cagatctgca aatgagaaat tcacaagcgc acaggaattt tcttgaagat 900
ggagaaagtg atggcttttt aagatgcctc tctcttaact ctgggtggat tttaactaca 960
actcttgtcc tctcggtgat ggtattgctt tggatttgtt gtgcaaaacg gggcagaaag 1020
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac aagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc 1380
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc 1440
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa 1470
<210> 34
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜区核苷酸序列
<400> 34
ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 180
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac 240
cacaggaaca gg 252
<210> 35
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22靶向部分
<400> 35
caagtgcagc tgcagcagtc cggacccggc ctcgtcaagc cctcccagac cctctctctg 60
acatgtgcca tcagcggcga tagcgtcagc tccaacagcg ctgcttggaa ctggattagg 120
cagagcccta gcagaggact ggagtggctg ggaaggacct actatagaag caagtggtac 180
aacgattacg ccgtgagcgt caagtctaga atcaccatta accccgacac ctccaagaac 240
cagttctctc tgcagctcaa cagcgtgacc cccgaggaca ccgctgtcta ctattgtgcc 300
agagaggtga ccggagatct ggaggatgcc ttcgacatct ggggccaagg caccatggtc 360
accgtgagca gcggctccac atccggctcc ggaaagcccg gcagcggcga aggctccaca 420
aagggcgaca tccagatgac ccaaagccct tcctctctgt ccgctagcgt cggagataga 480
gtcaccatca catgcagagc tagccagacc atttggagct acctcaactg gtaccagcag 540
aggcccggca aggcccctaa tctgctgatc tacgctgcct cctctctgca gagcggagtg 600
cctagcagat tcagcggaag gggcagcgga accgacttta cactgaccat tagcagcctc 660
caagccgaag acttcgccac ctactactgc caacagtcct actccattcc tcagacattt 720
ggccaaggca ccaagctcga gatcaag 747
<210> 36
<211> 789
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3靶向部分
<400> 36
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggacgtgg tgatgaccca gagcccttta tctttacccg ttacacccgg tgagcccgct 120
agcatctctt gtagaagcag ccagtcttta gtgcacagca acggcaacac atatttacac 180
tggtatttac agaagcccgg tcagagcccc cagctgctga tctacaaggt gagcaatcgt 240
ttctccggcg tgcccgatag attcagcggc agcggctccg gaaccgactt cactttaaag 300
atcagcagag tggaggccga ggacgtgggt gtgtactact gctcccagaa cacccacgtg 360
ccccctacat tcggtcaagg taccaaactg gagatcaaag gtggcggtgg ctcgggcggt 420
ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaagtt cagctggtgc agagcggcgc cgaggtcaaa 480
aaacccggag ccagcgtgaa ggtgtcttgt aaagccagcg gctacacctt taccgactat 540
gagatgcact gggtgagaca agctcccggt caaggtctgg aatggatggg cgctttagac 600
cccaagactg gtgacacagc ctactcccag aagttcaagg gtcgtgtgac tttaacagcc 660
gacgagtcca ccagcacagc ctacatggaa ctgagctctt taaggagcga ggacaccgcc 720
gtgtattact gcactcgttt ctacagctac acctactggg gccaaggtac tttagtgaca 780
gtgagcagc 789
<210> 37
<211> 84
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8跨膜区氨基酸序列
<400> 37
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn
65 70 75 80
His Arg Asn Arg
<210> 38
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8铰链区氨基酸序列
<400> 38
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD3ζ信号传导结构域氨基酸序列
<400> 39
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 40
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人4-1BB共刺激结构域氨基酸序列
<400> 40
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 41
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人源化CD19单克隆抗体单链可变区H63
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln
130 135 140
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
145 150 155 160
Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu
180 185 190
His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
210 215 220
Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Pro Gly Thr
225 230 235 240
Lys Val Asp Ile Lys
245
<210> 42
<211> 264
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 全人源CD19单克隆抗体单链可变区21D4
<400> 42
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp
165 170 175
Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
180 185 190
Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr Leu
210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 43
<211> 488
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3-59TM CAR
<400> 43
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
85 90 95
Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr
100 105 110
Tyr Cys Ser Gln Asn Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
115 120 125
Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
145 150 155 160
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr
195 200 205
Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro His Leu Glu Gln Glu Pro Thr Asn
260 265 270
Leu Arg Glu Ser Ser Leu Ser Lys Met Ser Ser Asp Leu Gln Met Arg
275 280 285
Asn Ser Gln Ala His Arg Asn Phe Leu Glu Asp Gly Glu Ser Asp Gly
290 295 300
Phe Leu Arg Cys Leu Ser Leu Asn Ser Gly Trp Ile Leu Thr Thr Thr
305 310 315 320
Leu Val Leu Ser Val Met Val Leu Leu Trp Ile Cys Cys Ala Lys Arg
325 330 335
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
340 345 350
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
355 360 365
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
370 375 380
Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
385 390 395 400
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
405 410 415
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
420 425 430
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
435 440 445
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
450 455 460
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
465 470 475 480
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 44
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4-59TM CAR
<400> 44
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe
100 105 110
Asn Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
130 135 140
Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu Ser
145 150 155 160
Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp
165 170 175
Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
180 185 190
Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr Leu
210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Pro His Leu Glu Gln Glu Pro Thr
260 265 270
Asn Leu Arg Glu Ser Ser Leu Ser Lys Met Ser Ser Asp Leu Gln Met
275 280 285
Arg Asn Ser Gln Ala His Arg Asn Phe Leu Glu Asp Gly Glu Ser Asp
290 295 300
Gly Phe Leu Arg Cys Leu Ser Leu Asn Ser Gly Trp Ile Leu Thr Thr
305 310 315 320
Thr Leu Val Leu Ser Val Met Val Leu Leu Trp Ile Cys Cys Ala Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485
<210> 45
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GFP靶向部分
<400> 45
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
1 5 10 15
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
20 25 30
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
35 40 45
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
50 55 60
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
65 70 75 80
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
85 90 95
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
100 105 110
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
115 120 125
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
130 135 140
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
145 150 155 160
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
165 170 175
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
180 185 190
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
195 200 205
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
210 215 220
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
225 230 235
<210> 46
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD8信号肽氨基酸序列
<400> 46
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20
<210> 47
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 2A序列
<400> 47
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 48
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD22靶向部分
<400> 48
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu Asp Ala Phe Asp
100 105 110
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser
115 120 125
Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile
130 135 140
Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg
145 150 155 160
Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu Asn
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp
210 215 220
Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245
<210> 49
<211> 490
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> H63 CAR
<400> 49
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Val Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
35 40 45
Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
50 55 60
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Phe Ala
115 120 125
Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser
130 135 140
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
145 150 155 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
165 170 175
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
180 185 190
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ile Lys Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
225 230 235 240
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ala Thr Leu Pro Tyr
245 250 255
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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405 410 415
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450 455 460
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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35 40 45
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65 70 75 80
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Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val
340 345 350
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385 390 395 400
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405 410 415
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
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515 520 525
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580 585 590
Met Ala Leu Ala Gly Gly Ser Gly Thr Ala Ser Ala Glu Ala Phe Asp
595 600 605
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770 775 780
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Leu Arg Cys Leu Ser Leu Asn Ser Gly Trp Ile Leu Thr Thr Thr Leu
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820 825 830
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885 890
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 21D4 CAR-2A-GFP
<400> 53
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Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
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Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Ser Ser Trp
165 170 175
Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly
180 185 190
Ile Ile Tyr Pro Asp Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
195 200 205
Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Arg Thr Ala Tyr Leu
210 215 220
Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg His Val Thr Met Ile Trp Gly Val Ile Ile Asp Phe Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala
260 265 270
Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
275 280 285
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
290 295 300
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
305 310 315 320
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
325 330 335
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val
340 345 350
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
355 360 365
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370 375 380
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
385 390 395 400
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
405 410 415
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
420 425 430
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
435 440 445
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
450 455 460
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
465 470 475 480
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
485 490 495
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn
500 505 510
Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro
515 520 525
Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu
530 535 540
Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly
545 550 555 560
Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile
565 570 575
Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr
580 585 590
Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys
595 600 605
Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu
610 615 620
Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu
625 630 635 640
Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly
645 650 655
Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr
660 665 670
Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn
675 680 685
Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser
690 695 700
Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly
705 710 715 720
Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu
725 730 735
Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe
740 745 750
Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys
755 760 765
<210> 54
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3靶向部分
<400> 54
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Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
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Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
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Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr
165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Met Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr
195 200 205
Ser Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Thr
210 215 220
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260
<210> 55
<211> 505
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> GPC3 CAR
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln
35 40 45
Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln
50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Phe Thr Asp Tyr Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
260 265 270
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
275 280 285
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
290 295 300
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
305 310 315 320
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
325 330 335
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val Val Lys
340 345 350
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
355 360 365
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
370 375 380
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
385 390 395 400
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
405 410 415
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
420 425 430
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
435 440 445
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
450 455 460
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
465 470 475 480
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
485 490 495
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500 505
<210> 56
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19CD22 CAR
<400> 56
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly
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145 150 155 160
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165 170 175
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225 230 235 240
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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435 440 445
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450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ser Gly Thr Thr
500 505 510
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515 520 525
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
530 535 540
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
545 550 555 560
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
565 570 575
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
580 585 590
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
595 600 605
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Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln
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Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
645 650 655
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660 665 670
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675 680 685
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725 730
<210> 57
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CD19CD22-59TM CAR
<400> 57
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1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
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145 150 155 160
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165 170 175
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr
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Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser
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Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
340 345 350
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr
355 360 365
Ser Ile Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
370 375 380
Gly Gly Gly Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val
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Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser
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420 425 430
Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn
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Claims (12)

1. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.20。
2. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.22。
3. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.26。
4. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的核苷酸序列为SEQ ID NO.29。
5. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的氨基酸序列为SEQ ID NO.43。
6. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的氨基酸序列为SEQ ID NO.44。
7. 免疫细胞，包含嵌合抗原受体CAR和/或其编码元件，所述CAR和/或其编码元件表达TMEM59蛋白和/或其功能性片段，所述功能性片段至少包含所述TMEM59蛋白的跨膜区及铰链区，所述CAR和/或其编码元件的氨基酸序列为SEQ ID NO.57。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞包括T淋巴细胞。
9.药物组合物，其包括权利要求1-8中任一项所述的免疫细胞及任选地药学上可接受的载体。
10.权利要求1-8中任一项所述的免疫细胞或权利要求9所述的药物组合物在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中所述肿瘤包括实体瘤和/或非实体瘤。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述肿瘤包括B淋巴白血病和/或肝癌。
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