CN108424463B

CN108424463B - 一种堆积型的嵌合抗原受体及其制备方法

Info

Publication number: CN108424463B
Application number: CN201810225584.0A
Authority: CN
Inventors: 应述欢; 李玉霞; 高鹏; 谢国明
Original assignee: Shengwu Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shengwu Beijing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-03-19
Filing date: 2018-03-19
Publication date: 2020-11-27
Anticipated expiration: 2038-03-19
Also published as: CN108424463A

Abstract

本发明公开了一种堆积型嵌合抗原受体及其制备方法。通过“点击化学”为基础的堆积式的组合方法形成嵌合抗原受体修饰的T细胞，简称为4C‑T(Click Chemistry‑based Cordwood Chimeric antigen receptor T‑Cell)。本发明所述的点击化学为基础的堆积型CAR‑T保持了CAR‑T的靶向性和杀伤性，又进一步减小了不同产品间的生物技术路线方面的差异，提高了生物制品的同质性，从而提高了CAR‑T制品的均一性和质量标准，还进一步提高了CAR‑T的个性化，为CAR‑T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

Description

一种堆积型的嵌合抗原受体及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物医学转化领域，尤其涉及一种堆积型的嵌合抗原受体及其制备方法。

技术背景

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰T细胞是近年来迅速发展的肿瘤过继免疫治疗新手段，其独特的作用机制和诱人的应用前景为肿瘤生物治疗开辟了一个崭新的舞台。CAR将识别肿瘤相关抗原的单链抗体和T细胞的活化基序相结合，通过基因转导赋予T细胞肿瘤靶向性、更强的杀伤活性和持久的生命力。自1989年Eshhar等首次提出CAR以来，CAR技术临床上在血液系统肿瘤甚至实体瘤的治疗上取得了显著成绩，目前已经发展到第三代。第一代CAR由单链抗体通过跨膜区域与胞内信号传导区(ITAM)相连，ITAM通常为CD3ζ或FcεRIγ；第二代CAR的胞内信号传导区引入了共刺激分子(costimulatorymolecule，CM)，主要为CD28分子；第三代CAR引入了双共刺激分子(CM1和CM2)，主要为CD28分子加上CD134或CD137等。第一代CAR-T淋巴细胞研究较多，但是大多数试验在细胞扩增、体外存活时间、细胞因子分泌等方面还存在不足，没有达到预期的临床效果。研究表明，T淋巴细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用。其中第一信号为特异性信号，由TCR识别抗原递呈细胞表面的抗原肽-MHC复合物所启动；第二信号为协同刺激信号，通过CD28/B7等重要的共刺激分子，促进IL-2合成，并使T淋巴细胞充分活化及免于凋亡。即使T淋巴细胞与抗原接触，如果没有协同刺激信号，细胞难以发挥正常功能。相应的，仅含有CD3ζ序列的嵌合抗原受体，如果没有协同刺激信号，也难以高效激活CAR-T淋巴细胞。因此，依照T淋巴细胞活化的双信号学说，第二代和第三代CAR在嵌合抗原受体上加上如CD28、CD137等共刺激分子，以提高T淋巴细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T淋巴细胞应答，延长T淋巴细胞存活时间等。研究证实第二代的CAR-T淋巴细胞在杀伤肿瘤活性和体内存活时间均优于第一代。目前，第三代CAR-T淋巴细胞临床应用还比较少，故其安全性和有效性是否就一定优于第二代CAR-T淋巴细胞，以及选择怎样的共刺激分子组合，还需要进一步观察。

虽然CAR-T靶向治疗肿瘤细胞是目前最有前景的癌症治疗方案之一，但是，有效保持产品的质量和一致性是CAR-T产业化途径中的重要方面。提高T细胞编辑的均质性，可以有效提高T细胞产品的一致性和质量控制，加快CAR-T的产业化进程。因此，将复杂的CAR-T细胞模块化，将同质部分进行同质化处理，再通过后续的技术进行模块堆积化的处理而形成产品差异化，对CAR-T在临床的质控和推广应用具有重要意义。

另一方面，多靶点的CAR-T能够解决单靶点CAR-T靶向性差，结合力弱的缺点；还可以解决复发的肿瘤对CAR-T细胞产生了耐药性。以往的串联表达多个scFv的策略一方面受限于空间表位，多抗原结合力弱；并且，不同患者不同双表位制备复杂，增加了质控难度。本发明在同质化的T细胞上堆积修饰不同的表位抗体，可以针对不同患者进行双靶点甚至多靶点的个性化治疗设计，并且有效回避耐药性。

发明内容

本发明针对现有技术不足，提供了一种新的设计思路，构建堆积型的嵌合抗原受体，通过先构建具有均质性的含有胞内区的truncated CAR-T，然后再连接靶向不同类型靶点的胞外抗原结合区。本发明所述嵌合抗原受体拥有同一种跨膜区和胞内区，即细胞编辑工具具有唯一性和同质性。通过堆积方式可以为含有嵌合抗原受体胞内区的T细胞连接不同的scFv，即可靶向不同的肿瘤细胞。进一步的，可以同时连接不同的scFv并同时靶向多种抗原表位，根据患者的个体化体征进行重组和配置，具有更强的针对性。本发明所述的嵌合抗原受体既保持了CAR-T的靶向性和杀伤性，又进一步减小了不同产品间的生物技术路线方面的差异，提高了生物制品的同质性，从而提高了CAR-T制品的均一性和质量标准，还进一步提高了CAR-T的个性化，为CAR-T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

本发明技术方案基于生物性良好的点击化学技术，本发明技术方案可称为“点击化学基础的堆积型CAR-T”，(Click Chemistry-based Cordwood CAR-T，简称4C-T)。

点击化学(click chemistry)，又称链接化学、动态组合化学，是2001年由诺贝尔化学奖获得者K.Barry Sharpless首次提出的一个模块化合成概念，它是一种选用易得原料，通过模块化的、可靠的、高效率的、高选择性的化学转变来实现碳杂原子连接(C—X—C)，以低成本快速合成各类新化合物的组合化学新方法，它给传统的有机合成带来革命性的突破，是当今化学领域最显著的趋势之一。

嵌合抗原受体的结构一般包含胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和共刺激信号传导区和T细胞信号传导区等，通常，完整的嵌合抗原受体或其片段(如本发明所述的非胞外抗原区)N端连接有信号肽指导前体蛋白定位到质膜，完成定位后蛋白前体切去信号肽成为成熟的蛋白质。本发明将嵌合抗原受体中胞外抗原结合区以外的部分定义为非胞外抗原结合区。

本发明具体内容如下：

一种堆积型嵌合抗原受体，包括胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区，胞外区和胞内区通过“点击化学”的方式进行共价连接，形成完整的嵌合抗原受体。

所述胞外抗原结合区C端氨基酸为具有炔烃基团/叠氮基团的非天然氨基酸，相应的，所述非胞外抗原结合区N段氨基酸为具有叠氮基团/炔烃基团的非天然氨基酸，胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区通过非天然氨基酸的叠氮基团与炔基发生1,3-偶极环加成反应连接，其中炔烃基团包括端基炔和环辛炔。

本发明所述嵌合抗原受体包含但不限于经典的CAR结构，通常包括抗原结合区、铰链区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区。也适用于各种升级型CAR结构，如iCasp9自杀型CAR、靶向双阳性细胞的双CAR、分别靶向肿瘤细胞和正常细胞的双CAR系统：CAR+iCAR、应用小分子将CART激活元件与CID融合表达实现精准调控的CART系统。所述各功能结构域可以直接相连，即通过克隆基因时加入酶切位点或者融合PCR技术将这些元件相连接后进行表达，也可以通过连接肽连接各功能结构域。优选连接肽是指1～50个富含Gly和/或Ala和/或Ser氨基酸残基的柔性肽。

本发明所述的胞外抗原结合区选自人抗体、人源化抗体、抗原结合片段或其组合，可以是完整的抗体，Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv片段或者单链可变区片段scFv。

优选的，本发明所述胞外抗原结合区能够结合肿瘤抗原。所述肿瘤为前列腺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病(慢性淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞细胞性白血病、小淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病、多发性骨髓瘤、腺癌、大肠癌、乳腺癌、实体瘤、头颈部癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、肉瘤、转移性癌、多形性胶质母细胞瘤等。

优选的，所述肿瘤抗原选自CD19，CD20，CD22，CD33，CD138，ROR1，Her2/neu，间皮素，CD33/IL3Ra，c-Met，PSMA，CAIX，CEA、PSCA，GD2，糖脂F77，EGFRvIII，GD-2，FAP，FBP，NY-ESO-1TCR，MAGEA3TCR或其任意组合。

本发明所述的非胞外抗原结合区，包含细胞外铰链区、跨膜区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区。

优选的，所述细胞外铰链区是免疫球蛋白IgG铰链区或CD8蛋白分子的铰链区或其组合。本发明在细胞外铰链区起始氨基酸位置定点插入具有炔烃基团的非天然氨基酸。

所述跨膜区选自CD3、CD4、CD8或CD28蛋白分子的跨膜区或其任意组合。

所述共刺激信号传导区选自CD27，CD28，CD137(4-1BB)，CD134(OX40)，CD30，CD40，PD-1，LFA-1，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3蛋白分子的共刺激信号传导区、与CD3ζ特异性结合的配体或其任意组合。

所述T细胞信号传导区功能结构域选自CD28、CD137、FcεRIγ、ZAP70或CD3ζ蛋白分子的T细胞信号传导区中的一种或几种。T细胞信号传导区可以包含有免疫受体酪氨酸活化基序。

本发明所述具有炔烃基团的非天然氨基酸包括N^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-赖氨酸(N^ε-[(2-propynyloxy)carbonyl]-L-lysine，CAK)、N^ε-戊炔-4-乙氧羰基-L-赖氨酸(N^ε-pent-4-ynyloxycarbonyl-l-lysine，PENK)、N^ε-(2-丙炔基甘氨酰)-赖氨酸(N^ε-(2-propargylglycyl)lysine)、

具有叠氮基团的非天然氨基酸包括对叠氮-L-苯丙氨酸(p-azido-L-phenylalanine，AzPhe)、N^ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸(N^ε-2-azidoethyloxycarbonyl-L-lysine，NAEK)、

N^ε-((1R,2R)-2-叠氮-环戊氧羰基)-L-赖氨酸(N^ε-((1R,2R)-2-azido-cyclopentyl oxy-carbonyl)-l-lysine，ACPK)。本发明一个优选的方案，含有炔烃基团的非天然氨基酸是CAK，含有叠氮基团的非天然氨基酸是NAEK。

含有炔烃基团的非天然氨基酸和含有叠氮基团的非天然氨基酸可发生1,3-偶极环加成反应连接胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区，两种类型的非天然氨基酸在胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区中的对应关系可以互换。本发明的一个优选的技术方案，非胞外抗原结合区的非天然氨基酸含炔烃基团，胞外抗原结合区的非天然氨基酸包含叠氮基团。

本发明所述的堆积型嵌合抗原受体可通过如下步骤制备而成：

(1)分别制备嵌合抗原受体的胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区，所述胞外抗原结合区C端氨基酸为具有炔烃基团/叠氮基团的非天然氨基酸，相应的，所述非胞外抗原结合区N段氨基酸为具有叠氮基团/炔烃基团的非天然氨基酸；

(2)采用点击化学技术将步骤(1)制得的嵌合抗原受体的胞外抗原结合区肽段和非胞外抗原结合区肽段通过1,3-偶极环加成反应连接，即得嵌合抗原受体。

本发明优选的炔烃基团和叠氮基团通过点击化学获得嵌合抗原受体的示意图如图1所示。

本发明所述的嵌合抗原受体的胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区采用人工合成或原核系统或真核系统表达制备得到，优选过表达的制备方法。

优选的，包含非天然氨基酸的非胞外抗原结合区可由遗传密码子扩充技术完成。包含有非天然氨基酸的胞外抗原结合区人工合成获得或者细菌过表达获得。

点击化学类型有环加成反应、亲核开环反应、非醇醛的羰基化学、碳碳多键的加成反应等。本发明选择技术最为成熟的Huisgen反应，炔烃基团和叠氮化物1,3-偶极环加成反应连接嵌合抗原受体的胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区。

现有技术下，在细胞水平，在蛋白质的特定位置插入非天然氨基酸有多种正交系统可以实现，包括原核系统中可以应用的M.jannaschii酪氨酸相关的正交系统，真核系统中可以应用的E.coli酪氨酸相关的正交系统，原核系统和真核系统中都可以应用的吡咯赖氨酸相关的正交系统。本发明优选吡咯赖氨酸相关的正交系统。

吡咯赖氨酸发现于产甲烷八叠球菌的甲烷甲基转移酶，区别于常见的20种的标准氨基酸，由终止密码子UAG有义编码写入蛋白。从吡咯赖氨酸的编码机制入手，科学家已经成功在细菌、哺乳动物细胞、真菌、昆虫、线虫等中编码超过70种人工合成的非天然氨基酸。

编码UAG密码子的非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶能够将非天然氨基酸及其类似物氨酰化到识别UAG密码子的tRNA上。与非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶正交配对的tRNA能够识别UAG密码子且能够在配对氨酰tRNA合成酶的作用下将非天然氨基酸氨活化，形成tRNA^Pyl(Pyl-tRNA^Pyl)。本发明所述非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶源于天然可以编辑吡咯赖氨酸及其类似物的古生菌，包括但不限于Metbanosarcina barkeri，Metbanosarcinamazei。优选来源于Metbanosarcina barkeri的参与吡咯赖氨酸编码的氨酰tRNA合成酶和tRNA及其突变体，如Y384F的突变体。本发明所述的tRNA主要指与氨酰tRNA合成酶同种属来源的、携带吡咯赖氨酸及其类似物参与蛋白编码合成的tRNA，包括各种突变体，如U25C突变体增强了反密码子臂的稳定性和吡咯赖氨酸的编码能力。

本发明的一个优选的方案，在表达体系共表达嵌合抗原受体的含有炔烃基团的非胞外抗原结合区、非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和与该合成酶正交配对的tRNA。含有叠氮基团非天然氨基酸的胞外抗原区可采用化学方法合成。

本发明所述的制备方法，所述非胞外抗原结合区肽段采用如下方法制备而成：

(1)运用分子克隆方法将正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA编码基因及非胞外抗原结合区的含有UAG密码子的嵌合抗原受体编码基因克隆入质粒pUltra的多克隆位点和长末端重复区中，构建共表达载体；

(2)将上述共表达载体与慢病毒包装所必须的结构蛋白表达质粒共转染高效组装慢病毒的细胞中得到具有表达重组基因的慢病毒；

(3)慢病毒介导具有非胞外抗原结合区的嵌合抗原受体转染免疫细胞。

本发明所述方法将目的基因构建在恰当质粒上。通过转基因修饰的方法修饰T细胞。转基因修饰方法包括病毒介导的转化、显微注射、离子轰击、基因枪转化、电穿孔以及其他新兴转化载体，如微环质粒、睡美人转座子。本发明优选病毒介导的转化方法。病毒介导的转化包括逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或者慢病毒为载体的表达体系可使用质粒或者病毒作为表达载体，优选微环质粒、逆转录病毒或者慢病毒作为表达载体。本发明更优选慢病毒表达载体pUltra-hUbC-MCS-PGK-Puro。

本发明一个优选方案，选择3代慢病毒表达载体，慢病毒载体3’LTR区的△U3位置具有克隆位点，本发明优选在该克隆位点插入tRNA表达盒(expression cassette)，更优选插入两组拷贝。

本发明所述载体包含嵌合抗原受体开放阅读框、正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶开放阅读框和正交tRNA表达盒(expression cassette)的同时表达，其中嵌合抗原受体和正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶为翻译表达，正交tRNA为转录表达。正交tRNA表达基因拷贝数多于2。此三个表达元件以各种方式在慢病毒表达载体整合区域相互组合进行高效表达。本发明的一个优选方案，所述的重组嵌合抗原受体的蛋白开放阅读框和氨酰tRNA合成酶开放阅读框同处慢病毒表达载体启动子后方，优选使用“自剪切”的2A蛋白酶将重组嵌合抗原受体开放阅读框连接在氨酰tRNA合成酶开放阅读框后边，使用2A蛋白酶连接两蛋白编码区，所述的2A连接肽可以是P2A，T2A，E2A，F2A，BmIFV2A和BmCPV2A等“自剪切”连接肽，优选F2A。

本发明的一个优选方案，嵌合抗原受体的非胞外抗原结合区的第一个氨基酸密码子突变为UAG密码子，该嵌合抗原受体基因通过F2A“自剪切”基因连接在氨酰tRNA合成酶基因后面，构成同一启动子启动的两个蛋白基因，两组携带吡咯赖氨酸的tRNA的转录基因分别位于慢病毒载体的常规克隆位置和3’LTR区。具体的，载体包括基因表达盒1：启动子1—正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区—F2A连接肽编码区—非胞外抗原结合区的嵌合抗原受体和基因表达盒2：启动子2—tRNA编码区。所述启动子1选自UbC、EF1α、CAG、CMV、PGK、MSCV、WJ6、SV40和GALV LTR、MSCV LTR中的一种或几种，启动子2选自类别3RNA聚合酶III(type 3 Pol III)，包括但不限于hU6、mU6、H1、SNR52、7SK、MRP/7-2等，优选使用U6启动子和H1启动子。

本发明一个具体的方案，所述启动子1核苷酸序列如SEQ ID.No：12所示，正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：5所示，氨基酸序列如SEQ IDNo：6所示，F2A连接肽编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：7所示，氨基酸序列如SEQ ID No：8所示，嵌合抗原受体胞外含叠氮基团的scFv氨基酸序列如SEQ ID.No：1或SEQ ID.No：2所示，嵌合抗原受体非胞外抗原结合区核苷酸序列如SEQ ID.No：3所示，氨基酸序列如SEQ IDNo：4所示，启动子2与tRNA编码区形成的tRNA表达盒(expression cassette)核苷酸序列如SEQ ID.No：10和SEQ ID.No：11所示。其中，SEQ ID.No：10所示的是U6启动的tRNA，SEQID.No：11所示的是H1启动的tRNA。

本发明的一个具体方案，表达载体为pUltra，重组载体命名为Lenti-4C，具体为将吡咯赖氨酰tRNA合成酶与嵌合抗原受体非胞外抗原结合区的基因插入hUbC启动子之后，两个蛋白用“自剪切”2A连接肽分离连接；将一组由U6启动子和H1启动子分别起始的tRNA插入常规克隆位点的蛋白基因表达盒(expression cassette)之后；将另一组U6启动子和H1启动子分别起始的tRNA插入慢病毒载体的3’LTR区，3’LTR区的核苷酸序列如SEQ ID.No：9所示，其中有SnaBI酶切位点。

本发明所述4C(Click Chemistry-based Cordwood Chimeric antigenreceptor)的慢病毒基因结构示意图如图2所示。

本发明所述方法，具体可包括以下步骤：

1)共表达载体的构建

运用分子克隆方法将正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA编码基因及非胞外抗原结合区的含有UAG密码子的嵌合抗原受体编码基因克隆入质粒pUltra的多克隆位点和长末端重复区中，构建4C的共表达载体；

2)慢病毒载体的包装

利用293T细胞包装获得4C的慢病毒载体。所述慢病毒载体为将上述共表达载体与慢病毒包装必须的结构蛋白表达质粒共转高效组装慢病毒的细胞中所得的具有表达重组基因的慢病毒。本发明的一个优选方案，将上述共表达载体与慢病毒结构蛋白表达载体pMDLg/pRRE、pRSV-Rev和pMD2.G共同转染HEK 293T细胞培养得到慢病毒载体；

3)慢病毒介导truncated-CAR转染细胞

本发明提供的方法包括如下步骤：构建目的基因慢病毒包装载体，包装慢病毒，慢病毒介导的T细胞转基因，4C-T对靶细胞的特异性杀伤活性，即通过点击化学连接scFv的4C-T细胞能够被激活并释放细胞因子IL-2。

本发明的另一目的在于提供一种无胞外抗原结合区的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，所述嵌合抗原受体的N端氨基酸为具有叠氮基团/炔烃基团的非天然氨基酸。

本发明的另一目的在于提供一种具有多抗原靶向性的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，细胞膜上具有多种携有不同抗原结合区的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合区C端氨基酸为具有炔烃基团/叠氮基团的非天然氨基酸，嵌合抗原受体的非胞外抗原结合区肽段N端氨基酸对应的为具有叠氮基团/炔烃基团的非天然氨基酸，胞外抗原结合区与非胞外抗原结合区通过1,3-偶极环加成反应偶联形成嵌合抗原受体。

上述免疫细胞优选选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞，记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。

本发明的另一目的在于提供本发明方法相关的点击化学相关的堆积型的嵌合抗原受体的载体、基因表达盒(expression cassette)、慢病毒载体或细胞，以及含有上述重组嵌合抗原受体基因。

本发明优点：

本发明通过堆积方式可以为含有嵌合抗原受体胞内区的T细胞连接不同的scFv，即可靶向不同的肿瘤细胞。进一步的，可以同时连接不同的scFv并同时靶向多种抗原表位，根据患者的个体化体征进行重组和配置，具有更强的针对性。本发明所述的点击化学为基础的堆积型CAR-T保持了CAR-T的靶向性和杀伤性，又进一步减小了不同产品间的生物技术路线方面的差异，提高了生物制品的同质性，从而提高了CAR-T制品的均一性和质量标准，还进一步提高了CAR-T的个性化，为CAR-T提高临床治疗癌症的安全性提供了重要途径。

附图说明

图1为4C(Click Chemistry-based Cordwood Chimeric antigen receptor)的慢病毒基因结构示意图。

图2为本发明优选的炔烃基团和叠氮基团通过点击化学获得4C的示意图。

图3为表达非胞外抗原结合区的截短型CAR的Western Blot鉴定结果。

图4为4C-T与靶细胞共培养后释放IL-2的测定结果。

图5为不同靶向4C-T与相应靶细胞共培养后释放IL-2的测定结果。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下面结合具体实施例对本发明进一步说明。

下述实例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1、4C的表达载体设计

本发明选用目前研究、应用最为广泛的CD19-CAR分子作为示例，用质粒pUltra为骨架，构建4C的慢病毒转染质粒如下(如图1所示)：

Lentiviral Transfer Plasmids:Lenti-4C 5’LTR(truncated)-ψ-RRE-UbCpromoter-PylRS-2A-truncated CD19CAR-(U6-tRNA-H1-tRNA)*2-3’LTR[△U3(U6-tRNA-H1-tRNA)-R-U5]。

其中，truncated CAR分子＝Signal peptide-UAG-hinge-transmembranedomain-4-1BB-CD3 zeta。核苷酸序列编号SEQ ID No：3，氨基酸序列编号SEQ ID No：4。

正交非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：5所示，氨基酸序列如SEQ ID No：6所示，F2A连接肽编码区核苷酸序列如SEQ ID.No：7所示，氨基酸序列如SEQ ID No：8所示，启动子2与tRNA编码区形成的tRNA表达盒(expression cassette)核苷酸序列如SEQ ID.No：10和SEQ ID.No：11所示。其中，SEQ ID.No：10所示的是U6启动的tRNA，SEQ ID.No：11所示的是H1启动的tRNA，所述启动子UbC核苷酸序列如SEQ ID.No：12所示。3’LTR区的核苷酸序列如SEQ ID.No：9所示。

质粒构建交由北京奥科生物技术有限责任公司合成并测序确认序列正确。

实施例2、慢病毒载体的包装

在明胶预包被的15-cm培养皿中接种5×10⁶ 293T细胞，在37℃ CO₂培养箱中过夜培养。当汇合度达到70％时，准备质粒转染。在转染前2小时，更换新鲜无血清培养基，进行转染。

从冰箱中取出转染试剂100μM PEI(Polyethylenimine)，在60℃水浴锅加热15min至完全溶解。从冰箱中取出质粒Lenti-4C、pMDL g/pRRE、pRSV-Rev、pMD2.G，室温溶解。

制备PEI/DNA复合物：取2ml PBS，加入10μg Lenti-4C、5μg pMDL g/pRRE、2.5μgpRSV-Rev、2.5μg pMD2.G，充分吹打混匀后，加入18μl 100μM PEI，立即吹吸混匀，室温静置10min。将静置后获得的PEI/DNA复合物逐滴加入已更换培养基的细胞培养物中，轻轻晃动培养皿，充分混匀。在37℃CO₂培养箱中培养6-8h后，将含有转染试剂的培养基换成新鲜的完全培养基。

在转染后48h收集含有病毒颗粒的细胞培养上清，并添加新的完全培养基。72h再次收集细胞培养上清，两次收集物通过0.45μm过滤膜过滤。采用Amicon UltraCentrifugal Filters 100KDa浓缩病毒颗粒，然后分装保存在-80℃超低温冰箱。

实施例3、慢病毒介导的细胞转染

在适量体积的无血清的RPMI 1640中加入Polybrene至终浓度为8μg/ml，用该培养基重悬离心收集的Jurkat细胞，并以5×10⁵/孔的密度接种在6孔板中。根据病毒滴度与细胞数目，加入MOI＝10的慢病毒浓缩液，轻轻摇动培养板以混匀。放置在37℃，5％CO₂孵育箱培养，16-24h后换成含有10％FBS的RPMI 1640培养基继续培养，并同时加入非天然氨基酸N^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-赖氨酸(N^ε-[(2-propynyloxy)carbonyl]-L-lysine，CAK)。

实施例4、truncated CAR的表达鉴定

通过Western Blot鉴定truncated CAR的表达，由于truncated CAR含有CD3zeta分子，所以通过Anti-CD3zeta免疫反应鉴定truncated CAR的表达。收集2×10⁷细胞后使用1ml RIPA裂解液(PBS，1％Triton X100，0.5％叠氮化钠，0.1％十二烷基磺酸钠)冰上裂解30min。离心取上清加入SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸即可上样。配置浓度为12％的分离胶与常规浓缩胶制版，凝固后于SDS-PAGE电泳缓冲液中电泳。90V恒压将样品压缩到分离胶与浓缩胶的临界面后更换为恒压120进行电泳。电泳结束后采用半干转法进行转膜，恒压12V转膜30min。5％脱脂奶粉室温封闭2小时后，用0.1％一抗(Anti CD3zeta Mouse MonoclonalAntibody、Anti-β-Actin Mouse Monoclonal Antibody)进行4℃过夜孵育。使用TBST洗膜三次，然后用0.1％二抗(Goat Anti-Mouse IgG(H+L)HRP Conjugate)室温孵育1h。再次使用TBST洗膜三次，在膜上滴加辣根过氧化物酶底物，然后曝光。结果如图3所示，Jurkat细胞的内源的CD3分子具有指示作用，其理论值大小为15kDa，图中可见。另有truncated CAR理论值为25kDa，条带位置与理论值相符。

实施例5、制备单靶点4C-T

过表达truncated CAR的Jurkat细胞加入0.4μl of胞吞抑制剂Dynasore stocksolution in 1,000μl of medium(-FBS)，CO₂培养箱孵育30min。同时配置点击反应体系，即在DPBS中依次加入下列浓度的物质：40μM scFv；80μM CuSO₄·5H₂O；4μM THPTA；400μM抗坏血酸钠。孵育结束后更换为含有点击化学连接肽的点击化学体系，分别含有非天然氨基酸NAEK和AzPhe的Anti-CD19scFv多肽，多肽购自吉尔生化(上海)有限公司，氨基酸序列如SEQ ID.No：1和2所示。去除含有多余连接肽的培养基，更换为完全培养基，培养箱静止恢复2h，由此完成点击化学。获得的4C-T细胞即为Anti-CD19 4C-T细胞，分别记为NAEK-Anti-CD19 4C-T和AzPhe-Anti-CD19 4C-T。

实施例6、4C-Jurkat的细胞杀伤活性分析

本实施例展示了4C-T细胞与常规嵌合抗原受体T细胞在与靶细胞共培养的条件下T细胞激活情况和IL-2的分泌水平。将K562细胞与K562-CD19细胞按照1×10⁵/孔的浓度铺板于96孔板中，每孔100ul靶细胞。K562-CD19细胞是稳定过表达CD19分子的K562细胞株。将Anti-CD19 4C Jurkat T细胞按照靶细胞：效应细胞＝1:2的比例，与靶细胞共培养。在37℃5％CO₂培养箱共培养18-20h后，分别收集细胞培养悬液经过离心收取上清，使用人IL-2ELISA kit检测IL-2含量，具体步骤参见人IL-2ELISA kit使用说明书。

具体结果如图4A所示，结果表明，本发明所述的抗CD19的4C-T细胞白介素分泌量相比未进行点击化学反应连接scFv的truncated CAR-T表现出IL-2分泌量的显著性升高。此结果表明，通过点击化学获得的抗CD19的4C-T细胞具有抗肿瘤的作用。同时，图4B的结果表明，同为叠氮基团的非天然氨基酸，NAEK形成的堆积型嵌合抗原受体相比AzPhe，具有更强的活性，对肿瘤细胞具有更强的杀伤能力。图4的结果表明，不仅堆积型嵌合抗原受体是形成具有活性的靶向杀伤型T细胞的方式，而且这种方式依赖于特定种类的非天然氨基酸。在这种堆积型的嵌合抗原受体中，不同种类的非天然氨基酸可能导致不同的T细胞杀伤活性。

实施例7、4C-T细胞的多靶向性研究

过表达truncated CAR的Jurkat细胞加入0.4μl of胞吞抑制剂Dynasore stocksolution in 1,000μl of medium(-FBS)，CO2培养箱孵育30min同时配置点击反应体系，即在DPBS中依次加入下列浓度的物质：40μM scFv；80μM CuSO₄·5H₂O；4μM THPTA；400μM抗坏血酸钠。孵育结束后更换为含有点击化学连接肽的点击化学体系，体系中分别或同时加入含有点击化学连接肽的scFv为含有NAEK的Anti-CD19scFv和Anti-Her2scFv，CO₂培养箱孵育2h。(购自吉尔生化(上海)有限公司，氨基酸序列分别为SEQ ID No：1和SEQ ID No：13所示)。去除含有多余连接肽的培养基，更换为完全培养基，培养箱静止恢复2h，由此完成点击化学。分别加入scFv而获得的4C-T细胞即为Anti-CD19 4C-T细胞和Anti-Her2 4C-T细胞，同时加入两种scFv而获得的4C-T细胞即为Anti-CD19/Her2 4C-T细胞。

将效应细胞Anti-CD19 4C-T细胞和Anti-CD19/Her2 4C-T细胞与靶细胞K562-CD19细胞(CD19阳性)和MCF-7细胞(Her2阳性)共培养。在37℃5％CO₂培养箱共培养18-20h后，通过离心方法获取培养液上清，使用人IL-2 ELISA kit检测IL-2含量，评价效应细胞杀伤能力。具体结果如图5所示，图5A为Anti-CD19 4C-T细胞与靶细胞K562-CD19细胞(CD19阳性)和MCF-7细胞(Her2阳性)共培养的考察结果，图5B为Anti-CD19/Her2 4C-T细胞与靶细胞K562-CD19细胞(CD19阳性)和MCF-7细胞(Her2阳性)共培养的考察结果，结果表明，本发明所述的堆积型嵌合抗原受体具有形成同时靶向两种特异性抗原的能力。

序列表

<110> 胜武（北京）生物科技有限公司

<120> 一种堆积型的嵌合抗原受体及其制备方法

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (（243）)

<223> Xaa是非天然氨基酸残基

<220>

<221> UNSURE

<222> (243)..(243)

<223> The 'Xaa' at location 243 stands for NAEK.

<400> 1

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Xaa

<210> 2

<211> 243

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (（243）)

<223> Xaa是非天然氨基酸残基

<220>

<221> UNSURE

<222> (243)..(243)

<223> The 'Xaa' at location 243 stands for AzPhe.

<400> 2

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu

115 120 125

Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys

130 135 140

Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg

145 150 155 160

Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Trp Gly Ser

165 170 175

Glu Thr Thr Tyr Tyr Ser Ser Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser

180 185 190

Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr

195 200 205

Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly

210 215 220

Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

225 230 235 240

Ser Ser Xaa

<210> 3

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

ccctagacta ccccagcacc gaggccaccc accccggctc ctaccatcgc ctcccagcct 120

ctgtccctgc gtccggaggc atgtagaccc gcagctggtg gggccgtgca tacccggggt 180

cttgacttcg cctgcgatat ctacatttgg gcccctctgg ctggtacttg cggggtcctg 240

ctgctttcac tcgtgatcac tctttactgt aagcgcggtc ggaagaagct gctgtacatc 300

tttaagcaac ccttcatgag gcctgtgcag actactcaag aggaggacgg ctgttcatgc 360

cggttcccag aggaggagga aggcggctgc gaactgcgcg tgaaattcag ccgcagcgca 420

gatgctccag cctaccagca ggggcagaac cagctctaca acgaactcaa tcttggtcgg 480

agagaggagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggacggg acccagaaat gggcgggaag 540

ccgcgcagaa agaatcccca agagggcctg tacaacgagc tccaaaagga taagatggca 600

gaagcctata gcgagattgg tatgaaaggg gaacgcagaa gaggcaaagg ccacgacgga 660

ctgtaccagg gactcagcac cgccaccaag gacacctatg acgctcttca catgcaggcc 720

ctgccgcctc ggtga 735

<210> 4

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (（22）)

<223> Xaa是非天然氨基酸残基

<220>

<221> UNSURE

<222> (22)..(22)

<223> The 'Xaa' at location 22 stands for CAK.

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Xaa Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro

20 25 30

Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys

35 40 45

Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala

50 55 60

Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu

65 70 75 80

Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys

85 90 95

Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

100 105 110

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly

115 120 125

Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala

130 135 140

Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg

145 150 155 160

Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

165 170 175

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn

180 185 190

Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met

195 200 205

Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala

225 230 235 240

Leu Pro Pro Arg

<210> 5

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggattaca aggacgacga tgacaaggat aaaaaaccac taaacactct gatatctgca 60

accgggctct ggatgtccag gaccggaaca attcataaaa taaaacacca cgaagtctct 120

cgaagcaaaa tctatattga aatggcatgc ggagaccacc ttgttgtaaa caactccagg 180

agcagcagga ctgcaagagc gctcaggcac cacaaataca ggaagacctg caaacgctgc 240

agggtttcgg atgaggatct caataagttc ctcacaaagg caaacgaaga ccagacaagc 300

gtaaaagtca aggtcgtttc tgcccctacc agaacgaaaa aggcaatgcc aaaatccgtt 360

gcgagagccc cgaaacctct tgagaataca gaagcggcac aggctcaacc ttctggatct 420

aaattttcac ctgcgatacc ggtttccacc caagagtcag tttctgtccc ggcatctgtt 480

tcaacatcaa tatcaagcat ttctacagga gcaactgcat ccgcactggt aaaagggaat 540

acgaacccca ttacatccat gtctgcccct gttcaggcaa gtgcccccgc acttacgaag 600

agccagactg acaggcttga agtcctgtta aacccaaaag atgagatttc cctgaattcc 660

ggcaagcctt tcagggagct tgagtccgaa ttgctctctc gcagaaaaaa agacctgcag 720

cagatctacg cggaagaaag ggagaattat ctggggaaac tcgagcgtga aattaccagg 780

ttctttgtgg acaggggttt tctggaaata aaatccccga tcctgatccc tcttgagtat 840

atcgaaagga tgggcattga taatgatacc gaactttcaa aacagatctt cagggttgac 900

aagaacttct gcctgagacc catgcttgct ccaaaccttt acaactacct gcgcaagctt 960

gacagggccc tgcctgatcc aataaaaatt tttgaaatag gcccatgcta cagaaaagag 1020

tccgacggca aagaacacct cgaagagttt accatgctga acttctgcca gatgggatcg 1080

ggatgcacac gggaaaatct tgaaagcata attacagact tcctgaacca cctgggaatt 1140

gatttcaaga tcgtaggcga ttcctgcatg gtctttgggg atacccttga tgtaatgcac 1200

ggagacctgg aactttcctc tgcagtagtc ggacccatac cgcttgaccg ggaatggggt 1260

attgataaac cctggatagg ggcaggtttc gggctcgaac gccttctcaa ggttaaacac 1320

gactttaaaa atatcaagag agctgcaagg tccgagtctt actataacgg gatttctacc 1380

aacctg 1386

<210> 6

<211> 462

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Asp Lys Lys Pro Leu Asn Thr

1 5 10 15

Leu Ile Ser Ala Thr Gly Leu Trp Met Ser Arg Thr Gly Thr Ile His

20 25 30

Lys Ile Lys His His Glu Val Ser Arg Ser Lys Ile Tyr Ile Glu Met

35 40 45

Ala Cys Gly Asp His Leu Val Val Asn Asn Ser Arg Ser Ser Arg Thr

50 55 60

Ala Arg Ala Leu Arg His His Lys Tyr Arg Lys Thr Cys Lys Arg Cys

65 70 75 80

Arg Val Ser Asp Glu Asp Leu Asn Lys Phe Leu Thr Lys Ala Asn Glu

85 90 95

Asp Gln Thr Ser Val Lys Val Lys Val Val Ser Ala Pro Thr Arg Thr

100 105 110

Lys Lys Ala Met Pro Lys Ser Val Ala Arg Ala Pro Lys Pro Leu Glu

115 120 125

Asn Thr Glu Ala Ala Gln Ala Gln Pro Ser Gly Ser Lys Phe Ser Pro

130 135 140

Ala Ile Pro Val Ser Thr Gln Glu Ser Val Ser Val Pro Ala Ser Val

145 150 155 160

Ser Thr Ser Ile Ser Ser Ile Ser Thr Gly Ala Thr Ala Ser Ala Leu

165 170 175

Val Lys Gly Asn Thr Asn Pro Ile Thr Ser Met Ser Ala Pro Val Gln

180 185 190

Ala Ser Ala Pro Ala Leu Thr Lys Ser Gln Thr Asp Arg Leu Glu Val

195 200 205

Leu Leu Asn Pro Lys Asp Glu Ile Ser Leu Asn Ser Gly Lys Pro Phe

210 215 220

Arg Glu Leu Glu Ser Glu Leu Leu Ser Arg Arg Lys Lys Asp Leu Gln

225 230 235 240

Gln Ile Tyr Ala Glu Glu Arg Glu Asn Tyr Leu Gly Lys Leu Glu Arg

245 250 255

Glu Ile Thr Arg Phe Phe Val Asp Arg Gly Phe Leu Glu Ile Lys Ser

260 265 270

Pro Ile Leu Ile Pro Leu Glu Tyr Ile Glu Arg Met Gly Ile Asp Asn

275 280 285

Asp Thr Glu Leu Ser Lys Gln Ile Phe Arg Val Asp Lys Asn Phe Cys

290 295 300

Leu Arg Pro Met Leu Ala Pro Asn Leu Tyr Asn Tyr Leu Arg Lys Leu

305 310 315 320

Asp Arg Ala Leu Pro Asp Pro Ile Lys Ile Phe Glu Ile Gly Pro Cys

325 330 335

Tyr Arg Lys Glu Ser Asp Gly Lys Glu His Leu Glu Glu Phe Thr Met

340 345 350

Leu Asn Phe Cys Gln Met Gly Ser Gly Cys Thr Arg Glu Asn Leu Glu

355 360 365

Ser Ile Ile Thr Asp Phe Leu Asn His Leu Gly Ile Asp Phe Lys Ile

370 375 380

Val Gly Asp Ser Cys Met Val Phe Gly Asp Thr Leu Asp Val Met His

385 390 395 400

Gly Asp Leu Glu Leu Ser Ser Ala Val Val Gly Pro Ile Pro Leu Asp

405 410 415

Arg Glu Trp Gly Ile Asp Lys Pro Trp Ile Gly Ala Gly Phe Gly Leu

420 425 430

Glu Arg Leu Leu Lys Val Lys His Asp Phe Lys Asn Ile Lys Arg Ala

435 440 445

Ala Arg Ser Glu Ser Tyr Tyr Asn Gly Ile Ser Thr Asn Leu

450 455 460

<210> 8

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtgaaacaga ctttgaattt tgaccttctc aagttggcgg gagacgtgga gtccaaccca 60

gggccc 66

<210> 7

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 9

<211> 234

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tggaagggct acgtaactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc 60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta 120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact 180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca 234

<210> 10

<211> 350

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctgggcagga agagggccta tttcccatga ttccttcata tttgcatata cgatacaagg 60

ctgttagaga gataattaga attaatttga ctgtaaacac aaagatatta gtacaaaata 120

cgtgacgtag aaagtaataa tttcttgggt agtttgcagt tttaaaatta tgttttaaaa 180

tggactatca tatgcttacc gtaacttgaa agtatttcga tttcttggct ttatatatct 240

tgtggaaagg acgaaacacc ggaaacctga tcatgtagat cgaacggact ctaaatccgt 300

tcagccgggt tagattcccg gggtttccgg acaagtgcgg tttttcaatt 350

<210> 11

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgcgaggcca gaggccactt gtgtagcgcc aagtgcccag cggggctgct aaagcgcatg 60

ctccagactg ccttgggaaa agcgcctccc ctacccggta gaattcgaac gctgacgtca 120

tcaacccgct ccaaggaatc gcgggcccag tgtcactagg cgggaacacc cagcgcgcgt 180

gcgccctggc aggaagatgg ctgtgaggga caggggagtg gcgccctgca atatttgcat 240

gtcgctatgt gttctgggaa atcaccataa acgtgaaatg tctttggatt tgggaatctt 300

ataagttctg tatgagacca cagatccgga aacctgatca tgtagatcga acggactcta 360

aatccgttca gccgggttag attcccgggg tttccggtcc tttttttg 408

<210> 12

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggcctccgcg ccgggttttg gcgcctcccg cgggcgcccc cctcctcacg gcgagcgctg 60

ccacgtcaga cgaagggcgc agcgagcgtc ctgatccttc cgcccggacg ctcaggacag 120

cggcccgctg ctcataagac tcggccttag aaccccagta tcagcagaag gacattttag 180

gacgggactt gggtgactct agggcactgg ttttctttcc agagagcgga acaggcgagg 240

aaaagtagtc ccttctcggc gattctgcgg agggatctcc gtggggcggt gaacgccgat 300

gattatataa ggacgcgccg ggtgtggcac agctagttcc gtcgcagccg ggatttgggt 360

cgcggttctt gtttgtggat cgctgtgatc gtcacttggt gagtagcggg ctgctgggct 420

ggccggggct ttcgtggccg ccgggccgct cggtgggacg gaagcgtgtg gagagaccgc 480

caagggctgt agtctgggtc cgcgagcaag gttgccctga actgggggtt ggggggagcg 540

cagcaaaatg gcggctgttc ccgagtcttg aatggaagac gcttgtgagg cgggctgtga 600

ggtcgttgaa acaaggtggg gggcatggtg ggcggcaaga acccaaggtc ttgaggcctt 660

cgctaatgcg ggaaagctct tattcgggtg agatgggctg gggcaccatc tggggaccct 720

gacgtgaagt ttgtcactga ctggagaact cggtttgtcg tctgttgcgg gggcggcagt 780

tatggcggtg ccgttgggca gtgcacccgt acctttggga gcgcgcgccc tcgtcgtgtc 840

gtgacgtcac ccgttctgtt ggcttataat gcagggtggg gccacctgcc ggtaggtgtg 900

cggtaggctt ttctccgtcg caggacgcag ggttcgggcc tagggtaggc tctcctgaat 960

cgacaggcgc cggacctctg gtgaggggag ggataagtga ggcgtcagtt tctttggtcg 1020

gttttatgta cctatcttct taagtagctg aagctccggt tttgaactat gcgctcgggg 1080

ttggcgagtg tgttttgtga agttttttag gcaccttttg aaatgtaatc atttgggtca 1140

atatgtaatt ttcagtgtta gactagtaaa ttgtccgcta aattctggcc gtttttggct 1200

tttttgttag ac 1212

<210> 13

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<222> (（245）)

<223> Xaa是非天然氨基酸残基

<220>

<221> UNSURE

<222> (245)..(245)

<223> The 'Xaa' at location 245 stands for NAEK.

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Ser Asp Ile Asn Asp Tyr

20 25 30

Pro Ile Ser Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Phe Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Trp Tyr Ala Ser Trp Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ile Ala Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala

85 90 95

Arg Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Gly Asp Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

115 120 125

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

130 135 140

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser

145 150 155 160

Gln Ser Ile Asp Ser Asn Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys

165 170 175

Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val

180 185 190

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr

195 200 205

Ile Ser Ser Leu Gly Arg Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly

210 215 220

Gly Val Gly Asn Val Ser Tyr Arg Thr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys

225 230 235 240

Val Glu Ile Lys Xaa

245

Claims

1.一种堆积型嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）分别制备嵌合抗原受体的胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区，所述胞外抗原结合区C端氨基酸为具有炔烃基团的非天然氨基酸，相应的，所述非胞外抗原结合区N端氨基酸为具有叠氮基团的非天然氨基酸，或者，所述胞外抗原结合区C端氨基酸为具有叠氮基团的非天然氨基酸，相应的，所述非胞外抗原结合区N端氨基酸为具有炔烃基团的非天然氨基酸；

（2）采用点击化学技术将步骤（1）制得的嵌合抗原受体的胞外抗原结合区肽段和非胞外抗原结合区肽段通过1, 3-偶极环加成反应偶联，即得嵌合抗原受体，所述非胞外抗原结合区为嵌合抗原受体中胞外抗原结合区以外的部分。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述具有叠氮基团的非天然氨基酸选自对叠氮-L-苯丙氨酸、N ^ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-((1R,2R)-2-叠氮-环戊氧羰基)-L-赖氨酸、

，所述具有炔烃基团的非天然氨基酸选自N ^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-赖氨酸、N ^ε-戊炔-4-乙氧羰基-L-赖氨酸、N ^ε-(2-丙炔基甘氨酰)-赖氨酸、

、

或

。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述嵌合抗原受体的胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区采用人工合成或原核系统或真核系统过表达制备得到。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于采用人工合成的方法或采用M. jannaschii酪氨酸相关的正交系统、E. coli酪氨酸相关的正交系统或吡咯赖氨酸相关的正交系统在嵌合抗原受体的胞外抗原结合区肽段和非胞外抗原结合区插入非天然氨基酸。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述非胞外抗原结合区肽段采用如下方法制备而成：

（1）运用分子克隆方法将正交性非天然氨基酸氨酰tRNA合成酶和tRNA编码基因及非胞外抗原结合区的含有UAG密码子的嵌合抗原受体编码基因克隆入质粒pUltra的多克隆位点和长末端重复区中，构建共表达载体；

（2）将上述共表达载体与慢病毒包装所必须的结构蛋白表达质粒共转染高效组装慢病毒的细胞中得到具有表达重组基因的慢病毒；

（3）慢病毒介导具有非胞外抗原结合区的嵌合抗原受体转染免疫细胞。

6.一种堆积型嵌合抗原受体，其特征在于包括胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区，胞外抗原结合区和非胞外抗原结合区通过“点击化学”的方式进行共价连接，形成完整的嵌合抗原受体，所述非胞外抗原结合区肽为嵌合抗原受体中胞外抗原结合区以外的部分，所述胞外抗原结合区C端氨基酸为具有叠氮基团的非天然氨基酸N ^ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸，所述胞外抗原结合区的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，所述非胞外抗原结合区N端氨基酸为具有炔烃基团的非天然氨基酸N ^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-赖氨酸，所述非胞外抗原结合区氨基酸序列为SEQ ID No：4所示氨基酸序列去除信号肽的部分，胞外抗原结合区非天然氨基酸的叠氮基团与和非胞外抗原结合区非天然氨基酸的炔烃基团的通过1, 3-偶极环加成反应偶联。

7.一种嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于表达权利要求6所述的堆积型嵌合抗原受体。

8. 一种具有多抗原靶向性的嵌合抗原受体修饰的免疫细胞，其特征在于细胞膜上具有携有不同胞外抗原结合区的嵌合抗原受体，所述胞外抗原结合区为C端氨基酸为N ^ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸的 Anti-CD19 scFv，氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，和C端氨基酸为N ^ε-2-叠氮乙氧羰基-L-赖氨酸的Anti-Her2 scFv，氨基酸序列如SEQ ID No：13所示，所述嵌合抗原受体中胞外抗原结合区以外的部分为非胞外抗原结合区，所述非胞外抗原结合区肽段N端氨基酸为具有炔烃基团的非天然氨基酸N ^ε-[(2丙炔氧基)-羰基]-L-赖氨酸，所述非胞外抗原结合区氨基酸序列为SEQ ID No：4所示氨基酸序列去除信号肽的部分，所述Anti-CD19 scFv和Anti-Her2 scFv C端氨基酸的叠氮基团与和非胞外抗原结合区非天然氨基酸的炔烃基团的通过1, 3-偶极环加成反应偶联。