CN111411085A

CN111411085A - 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

Info

Publication number: CN111411085A
Application number: CN202010278075.1A
Authority: CN
Inventors: 苏小平; 李锐
Original assignee: Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Geyuan Zhishan Shanghai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2020-04-10
Filing date: 2020-04-10
Publication date: 2020-07-14

Abstract

本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞及其应用。所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD‑L1的嵌合抗原受体。所述嵌合抗原受体T细胞同时表达CD19 CAR结构与PD‑L1 CAR结构，所述PD‑L1 CAR与肿瘤细胞表达的PD‑L1结合后可通过胞内传递激活信号。因此，所述嵌合抗原受体T细胞不仅可以靶向识别表达CD19的肿瘤细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD‑1对T细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解CAR‑T治疗的耐药性问题，为CAR‑T治疗以及过继回输免疫细胞治疗提供了一种新思路。

Description

一种嵌合抗原受体T细胞及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤的细胞免疫治疗领域，具体涉及一种嵌合抗原受体T细胞及其应用，尤其涉及一种同时表达两种嵌合抗原受体的T细胞及其应用。

背景技术

过继性免疫治疗(Adoptive Cell Transfer Therapy，ACT)，是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。近年来，嵌合抗原受体(Chimeric Antigenreceptor，CAR)修饰的T淋巴细胞(CAR-modified T lymphocyte，CAR-T)疗法在血液肿瘤的治疗上取的了显著疗效，特别是对于急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblasticleukemia，ALL)和B细胞淋巴瘤，缓解率达到80％左右。

其中，CAR-T设计的关键是选择适当的肿瘤抗原作为靶标，CD19 CAR-T靶向治疗法的效果最为显著，可达70-90％的完全缓解。CD19是簇分化抗原的一种，是B细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。CD19分布于全体B细胞、毛细胞白血病细胞等恶性B细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断B细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定B细胞最好的标记。截止2019年，美国FDA批准了两款针对急性淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤的CAR-T疗法，Yescarta和Kymriah，也都是以CD19作为靶点。

例如，CN108864307A公开了一种信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体、表达该嵌合抗原受体的T细胞及制备方法和应用。所述信号肽优化靶向CD19的嵌合抗原受体包含顺序串联的跨膜蛋白信号肽、抗CD19抗体单链可变区、CD8蛋白分子的铰链区、跨膜区、4-1BB共刺激结构域与CD3ζ胞内信号传导结构域。

尽管CD19 CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗中取得了令人鼓舞的结果，但是研究表明，实体肿瘤比如淋巴瘤和宿主调节细胞诱导的免疫抑制性微环境可能会限制过继性T细胞免疫疗法的潜能。肿瘤可通过刺激T细胞上的免疫抑制受体，例如PD1来逃避免疫监控，这也是CD19 CAR-T细胞疗法在淋巴瘤中的疗效不佳的主要原因。PD-L1在肿瘤细胞中的过表达也是耐药机制的一种，可因PD-L1与T细胞上的PD-1结合，而抑制T细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。

阻断PD-L1和PD1的结合理论上可以消除PD1信号对T细胞的抑制，激活T细胞的免疫反应。美国FDA已批准三款PD-L1单抗药物对于非小细胞肺癌，黑色素瘤和尿路上皮癌等癌症的临床试验，平均缓解率在30％左右。单用PD-L1单抗的疗效还不足以完全治愈肿瘤患者，很多临床III期实验由于没有达到最终目标而失败。

因此，本发明的目的在于提供一种能够有效治疗肿瘤、降低免疫抑制性的嵌合抗原受体T细胞。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，鉴于抗PD-L1的免疫抑制作用，我们利用CAR来设计转换PD-L1的抑制信号为激活信号，从而为CAR-T治疗以及过继回输免疫细胞治疗提供一种新的方法和思路。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD-L1特异性结合抗原的嵌合抗原受体。

本发明将靶向CD19的CAR与靶向PD-L1的CAR共同构建于同一慢病毒载体，进而转入T细胞当中得到所述CAR-T细胞，使该基因修饰的T细胞不仅可以靶向识别表达CD19细胞，同时，PD-L1嵌合抗原受体能够把PD-L1/PD1传导的抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制。所述双CAR结构的同时表达，能够提高所述CAR-T细胞的抗肿瘤效果，缓解CAR-T治疗的耐药性问题。

作为本发明优选的技术方案，所述CD19嵌合抗原受体包括：CD19抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。

优选地，所述CD19抗原结合结构域包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域。

优选地，所述CD19嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述PD-L1嵌合抗原受体包括：PD-L1抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域。

PD-L1嵌合抗原受体能够把PD-L1/PD1传导的本来是抑制T细胞活性的信号，转换成刺激T细胞激活的信号。同时，肿瘤细胞中表达的PD-1，PD1-CD28嵌合受体借助于PD-1提供的信号，化抑制为刺激，促进T细胞的抗肿瘤活性。

为了促进PD-L1对于抑制免疫逃逸的作用，本发明通过噬箘体文库筛选到的不同PD-L1抗体，并对PD-L1的靶向序列进行了优化，从多个序列中，筛选出能使CAR活性最高的PD-L1序列。

优选地，所述PD-L1抗原结合结构域包括如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示的任意一种氨基酸序列，优选为SEQ ID NO.3。

其中，SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列为：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDSWIHRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNSKNTLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列为：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPWTFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASSYIMMRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNAKNSLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS；

SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列为：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQRVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRYWMSRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVADTSKNTARDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS。

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域。

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ IDNO.8所示的氨基酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述CD19嵌合抗原受体和PD-L1嵌合抗原受体通过2A或IRES进行连接。

为了提高慢病毒感染外周血T细胞的效率，本发明采用2A或IRES连接目的基因，以增加慢病毒载体对T细胞的感染效率。

优选地，所述2A的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列，具体为EGRGSLLTCGDVEENPGP。

本发明中，所述嵌合抗原受体T细胞中双CAR段表达的氨基酸序列可分为3种，分别为：

(1)SEQ ID NO.3、EGRGSLLTCGDVEENPGP和SEQ ID NO.6组成的氨基酸序列，记为CAR-CD19/PD-L1(1)；

(2)SEQ ID NO.3、EGRGSLLTCGDVEENPGP和SEQ ID NO.7组成的氨基酸序列，记为CAR-CD19/PD-L1(2)；

(3)SEQ ID NO.3、EGRGSLLTCGDVEENPGP和SEQ ID NO.8组成的氨基酸序列，记为CAR-CD19/PD-L1(3)，其中，CAR-CD19/PD-L1(1)对肿瘤细胞的杀伤率最高。

第二方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体用于制备如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞。

优选地，所述表达载体包括编码CD19嵌合抗原受体的核酸分子、编码2A肽的核酸分子和编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子。

优选地，所述编码CD19嵌合抗原受体的核酸分子包括如SEQ ID NO.10所示的核酸序列。

优选地，所述编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子包括如SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12或SEQ ID NO.13所示的核酸序列。

作为本发明优选的技术方案，所述编码CD19嵌合抗原受体和编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子共用一个启动子，且嵌合抗原受体在启动子后的顺序不会影响其表达效率。

优选地，所述启动子为EF1α。

为了促进CD19 CAR结构和PD-L1 CAR结构的高效表达，本发明中编码CD19嵌合抗原受体和编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子共用一个启动子，以提高目的基因的表达效率和蛋白活性。

优选地，所述表达载体包括病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。

第三方面，本发明提供一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用如第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。

优选地，所述哺乳细胞包括293细胞、293T细胞或293E细胞中的任意一种或至少两种的组合。

第四方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将如第二方面的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

本发明中，可用本领域常规方法制备所述嵌合抗原受体T细胞。

首先，对含有靶向CD19 CAR结构和PD-Ll CAR结构的慢病毒载体进行提取，然后与293ft细胞进行质粒包装，转染，收集病毒上清液，得到含有双CAR的慢病毒上清；

分离人全血中的淋巴细胞，并分选分离出T细胞，培养后加入含有双CAR的慢病毒上清，培养，转染，得到所述嵌合抗原受体T细胞。

第五方面，本发明还提供一种组合物，所述组合物包括如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的表达载体或如第三方面所述的重组慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。

第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的嵌合抗原受体T细胞、如第二方面所述的表达载体、如第三方面所述的重组慢病毒或如第五方面所述的组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病。

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。

本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明提供一种同时表达靶向CD19和PD-L1的嵌合抗原受体的CAR-T细胞，所述CAR-T细胞不仅可以靶向识别表达CD19的细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-1对T细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解CAR-T治疗的耐药性问题；

(2)本发明通过对PD-L1抗体序列的优化，获得了高活性的CAR，与CD19 CAR联合表达之后，能够实现良好的抗肿瘤效果；

(3)本发明将多个目的基因构建于在同一载体上时，通过选择合适的连接方式和启动子，使其对T细胞的感染效率较高，同时还能使得提高其表达的蛋白活性及表达效率，从而实现进一步增加CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤率；使用所述CAR-T细胞处理后，肿瘤细胞的存活率仅为15.7-35.7％。

附图说明

图1为实施例1中提供的用于制备所述CAR-T细胞的质粒结构示意图。

图2为经过实施例1、对比例1提供的CAR-T细胞和空白对照CAR-Mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

图3为经过实施例2、对比例1提供的CAR-T细胞和空白对照CAR-Mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

图4为经过实施例3、对比例1提供的CAR-T细胞和空白对照CAR-Mock细胞处理后的肿瘤细胞存活率柱状图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

以下实施例中，所用的原始载体为pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，购自武汉森灵生物科技有限公司，所用限制性内切酶包括HindIII和BamHI内切酶均购自New EnglandBiolabs(Beijing)LTD。

以下实施例中，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

本实施例提供一种同时表达CD19 CAR结构和PD-L1 CAR结构的嵌合抗原受体T细胞。

所述嵌合抗原受体T细胞的制备方法包括如下步骤：

1、将表达靶向CD19 CAR与PD-L1 CAR嵌合受体的核苷酸序列(即SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11)使用编码2A的核苷酸序列进行连接，合成融合基因，合成这段基因时，在两端分别包含限制性内切酶HindIII和BamHI的酶切位点，并装载到PCDNA3.1(+)载体上；所述序列委托上海生工生物公司合成。

2、使用HindIII和BamHI双酶切包含目的基因的PCDNA3.1(+)载体，酶切后切胶回收目的基因片段；

3、利用HindIII和BamHI双酶切原始载体pCDH-EF1-Luc2-T2A-tdTomato，酶切后切胶回收大小约为2.7kb的载体片段；

4、用DNA连接酶连接回收的目的基因片段和载体片段，所得质粒的结构如图1所示，其中包含5'LTR、CD19 CAR、PD-L1 CAR和3'LTR，所述双CAR之间采用2A进行连接，所得质粒可简记为CD19-PD-L1 CAR。

5、再通过转染试剂转染293ft细胞产生慢病毒，然后采集人PBMC细胞，分离出CD⁸⁺T细胞，制备得到同时表达CD19 CAR结构和PD-L1 CAR结构的嵌合抗原受体T细胞，其表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.6所组成的氨基酸序列。

实施例2

与实施例1的区别在于，将SEQ ID NO.11替换为SEQ ID NO.12，其制备方法与实施例1相同，其表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.7所组成的氨基酸序列。

实施例3

与实施例1的区别在于，将SEQ ID NO.11替换为SEQ ID NO.13，其制备方法与实施例1相同，其表达的氨基酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.8所组成的氨基酸序列。

对比例1

提供一种CD19 CAR-T细胞，即仅含有靶向CD19抗原的嵌合抗原受体，其制备方法与实施例1相同。

至此，实施例1～3构建了含有3种PD-L1抗体的双CAR-T细胞，即CAR-CD19/PD-L1(1)、CAR-CD19/PD-L1(2)和CAR-CD19/PD-L1(3)；

对比例1提供一种含有单一嵌合抗原受体的CAR-T细胞，记为CAR-CD19。

性能测试

对实施例1～3和对比例1提供的CAR-T细胞、以及空白对照(CAR-Mock)进行体外杀伤实验，用于验证本发明提供的同时表达CD19和PD-L1的CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

1、分别制备表达GFP(Green fluorescent protein，绿色荧光蛋白)和表达CD19/PD-L1的K562细胞；

2、将制备的CAR-T细胞分别和上述制备的K562细胞共孵育，采用LDH(乳酸脱氢酶)释放法，检测杀伤效果，杀伤效果检测结果如图2、3和4所示。

其中，如图2所示，经过CAR-Mock细胞处理后的肿瘤细胞CD19/PD-L1表达量与GFP相同，即肿瘤细胞存活率为100％，经过CAR-CD19细胞处理后的CD19/PD-L1表达量小于GFP表达量的45.6％，即肿瘤细胞存活率为45.6％，经过CAR-CD19/PD-L1(1)(即实施例1提供的CAR-T细胞)处理后的肿瘤细胞的CD19/PD-L1表达量为GFP表达量的15.7％，即肿瘤细胞存活率为15.7％。

如图3所示，经过CAR-CD19/PD-L1(2)(即实施例2提供的CAR-T细胞)处理后的肿瘤细胞的CD19/PD-L1表达量为GFP表达量的35.7％，即肿瘤细胞存活率为35.7％。

如图4所示，经过CAR-CD19/PD-L1(3)(即实施例3提供的CAR-T细胞)处理后的肿瘤细胞的CD19/PD-L1表达量约为GFP表达量的33.4％，即肿瘤细胞存活率为33.4％。

综上所述，本发明提供的嵌合抗原受体T细胞同时表达两种嵌合抗原受体，同时靶向CD19和PD-L1两个肿瘤细胞特异性抗原，因此，所述CAR-T细胞不仅可以靶向识别表达CD19的细胞，还可以解除肿瘤细胞表达的PD-1对T细胞的免疫抑制，避免肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解CAR-T治疗的耐药性问题，使用所述CAR-T细胞处理后，肿瘤细胞的存活率仅为15.7-35.7％。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 格源致善（上海）生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体T细胞及其应用

<130> 20200327

<160> 13

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 267

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Gly Leu Glu Trp Leu Gly Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Leu Gly

180 185 190

Asp Arg Val Thr Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

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245 250 255

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<211> 505

<212> PRT

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<213> 人工合成

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Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

145 150 155 160

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr

165 170 175

Ile Met Met Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

195 200 205

Tyr Val Asp Ser Val Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Arg Asp Asn

210 215 220

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu

245 250 255

Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

<210> 5

<211> 270

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 5

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Trp

165 170 175

Met Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr

195 200 205

Val Asp Ser Val Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Arg Asp Asn Ala

210 215 220

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala

245 250 255

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

260 265 270

<210> 6

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

50 55 60

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val

65 70 75 80

Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser

100 105 110

Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr

115 120 125

Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Trp

165 170 175

Ile His Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr

195 200 205

Val Asp Ser Val Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Arg Asp Asn Ala

210 215 220

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala

245 250 255

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val

260 265 270

Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

275 280 285

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

290 295 300

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

305 310 315 320

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

325 330 335

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

340 345 350

Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

355 360 365

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

370 375 380

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

385 390

<210> 7

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val

20 25 30

Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser

35 40 45

Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro

50 55 60

Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr

65 70 75 80

Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu

130 135 140

Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu

145 150 155 160

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Ser Tyr

165 170 175

Ile Met Met Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

180 185 190

Gly Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr

195 200 205

Tyr Val Asp Ser Val Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Arg Asp Asn

210 215 220

Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

225 230 235 240

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu

245 250 255

Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe

260 265 270

Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

275 280 285

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

290 295 300

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

305 310 315 320

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

325 330 335

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His

340 345 350

Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn

355 360 365

Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr

370 375 380

Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

385 390 395

<210> 8

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 8

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr

20 25 30

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

115 120 125

Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

145 150 155 160

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Tyr Trp

165 170 175

Met Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

180 185 190

Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr

195 200 205

Val Asp Ser Val Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Arg Asp Asn Ala

210 215 220

Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala

245 250 255

Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Val

260 265 270

Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

275 280 285

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

290 295 300

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

305 310 315 320

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

325 330 335

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg

340 345 350

Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

355 360 365

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

370 375 380

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

385 390

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 9

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 10

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctgg tctggagtgg 120

ctgggaatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300

gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360

ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420

ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480

ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540

gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ctgggagaca gagtcaccgt aatatggggt 600

agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660

tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720

tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780

acctcagtca ccgtctcctc attcgtgccg gtcttcctgc cagcgaagcc caccacgacg 840

ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 900

ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc 960

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 1020

gttatcaccc tttactgcaa ccacaggaac aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 1080

ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 1140

cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 1200

gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 1260

agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 1320

ccgcagagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1380

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1440

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 1500

gccctgcccc ctcgc 1515

<210> 11

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaca tccagatgac ccagagcccc agcagcctga gcgccagcgt gggcgaccgc 120

gtgaccatca cctgccgcgc cagccaggac gtgagcaccg ccgtggcctg gtaccagcag 180

aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc tacgacgtga gcaaccgccc cagcggcgtg 240

agcaaccgct tcagcggcag caagagcggc aacaccgcca gcctgaccat cagcggcctg 300

caggccgagg acgaggccga ctactactgc agcagctaca ccagcagcag cacccgcgtg 360

ttcggcaccg gcaccaaggt gaccgtgctg ggctccacct ctggatccgg caagcccgga 420

tctggcgagg gatccaccaa gggcgaggtg cagctggtgg agagcggcgg cggcctggtg 480

cagcccggcg gcagcctgcg cctgagctgc gccgccagcg acagctggat ccaccgctac 540

tggatgagct gggtgcgcca ggcccccggc aagggcctgg agtgggtggc caacatcaag 600

caggacggca gcgagaagta ctacgtggac agcgtgcgcg acaacagcaa gaacaccctg 660

cgcgacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc 720

gccgtgtact actgcgcccg cgagggcggc tggttcggcg agctggcctt cgactactgg 780

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc 840

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 900

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 960

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1020

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cacaggaaca ggagtaagag gagcaggctc 1080

ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1140

cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct cc 1182

<210> 12

<211> 1185

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccacaga gcgccctgac ccagcccgcc agcgtgagcg gcagccccgg ccagagcatc 120

accatcagct gcaccggcac cagcagcgac gtgggcggct acaactacgt gagctggtac 180

cagcagcacc ccggcaaggc ccccaagctg atgatctacg acgccagcag ccgcgccacc 240

ggcatccccg accgcttcag cggcagcggc agcggcaccg acttcaccct gaccatcagc 300

cgcctggagc ccgaggactt cgccgtgtac tactgccagc agtacggcag cctgccctgg 360

accttcggcc agggcaccaa ggtggagatc aagggctcca cctctggatc cggcaagccc 420

ggatctggcg agggatccac caagggcgag gtgcagctgg tggagagcgg cggcggcctg 480

gtgcagcccg gcggcagcct gcgcctgagc tgcgccgcca gcagctacat catgatgcgc 540

tactggatga gctgggtgcg ccaggccccc ggcaagggcc tggagtgggt ggccaacatc 600

aagcaggacg gcagcgagaa gtactacgtg gacagcgtgc gcgacaacgc caagaacagc 660

ctgcgcgaca acgccaagaa cagcctgtac ctgcagatga acagcctgcg cgccgaggac 720

accgccgtgt actactgcgc ccgcgagggc ggctggttcg gcgagctggc cttcgactac 780

tggggccagg gcaccctggt gaccgtgagc agcttcgtgc cggtcttcct gccagcgaag 840

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 900

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 960

ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 1020

ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaccacagga acaggagtaa gaggagcagg 1080

ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat 1140

taccagccct atgccccacc acgcgacttc gcagcctatc gctcc 1185

<210> 13

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atcccagaga tcgtgctgac ccagagcccc ggcaccctga gcctgagccc cggcgagcgc 120

gccaccctga gctgccgcgc cagccagcgc gtgagcagca gctacctggc ctggtaccag 180

cagaagcccg gccaggcccc ccgcctgctg atctacagcg ccagcttcct gtacagcggc 240

gtgcccagcc gcttcagcgg cagcggcagc ggcaccgact tcaccctgac catcagcagc 300

ctgcagcccg aggacttcgc cacctactac tgccagcagt acctgtacca ccccgccacc 360

ttcggccagg gcaccaaggt ggagatcaag ggctccacct ctggatccgg caagcccgga 420

tctggcgagg gatccaccaa gggcgaggtg cagctggtgg agagcggcgg cggcctggtg 480

cagcccggcg gcagcctgcg cctgagctgc gccgccagcc gctactggat gagccgctac 540

tggatgagct gggtgcgcca ggcccccggc aagggcctgg agtgggtggc caacatcaag 600

caggacggca gcgagaagta ctacgtggac agcgtggccg acaccagcaa gaacaccgcc 660

cgcgacaacg ccaagaacag cctgtacctg cagatgaaca gcctgcgcgc cgaggacacc 720

gccgtgtact actgcgcccg cgagggcggc tggttcggcg agctggcctt cgactactgg 780

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc 840

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 900

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 960

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 1020

ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaac cacaggaaca ggagtaagag gagcaggctc 1080

ctgcacagtg actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac 1140

cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct cc 1182

Claims

1.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞同时表达靶向CD19和PD-L1的嵌合抗原受体。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CD19嵌合抗原受体包括：CD19抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；

优选地，所述CD19抗原结合结构域包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述CD19嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ胞内信号传导结构域；

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述PD-L1嵌合抗原受体包括：PD-L1抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和胞内共刺激信号传导结构域；

优选地，所述PD-L1抗原结合结构域包括如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示的任意一种氨基酸序列，优选为SEQ ID NO.3；

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域、CD3ζ、TLR1、TLR2、4-1BB或CD27中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28胞内结构域；

优选地，所述PD-L1嵌合抗原受体包括如SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述CD19嵌合抗原受体和PD-L1嵌合抗原受体通过2A或IRES进行连接；

优选地，所述2A的氨基酸序列包括如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

5.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于制备如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞；

优选地，所述表达载体包括编码CD19嵌合抗原受体的核酸分子、编码2A肽的核酸分子和编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子；

优选地，所述编码CD19嵌合抗原受体的核酸分子包括如SEQ ID NO.10所示的核酸序列；

优选地，所述编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子包括如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示的核酸序列。

6.根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述编码CD19嵌合抗原受体和编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子共用一个启动子；

优选地，所述启动子为EF1α；

优选地，所述表达载体包括病毒载体；

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒采用如权利要求5或6所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到；

8.一种如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将如权利要求5或6所述的表达载体或如权利要求7所述的重组慢病毒导入T细胞的步骤。

9.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求5或6所述的表达载体或如权利要求7所述的重组慢病毒中的任意一种或至少两种的组合。

10.一种如权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体T细胞、如权利要求5或6所述的表达载体、如权利要求7所述的重组慢病毒或如权利要求9所述的组合物在制备治疗肿瘤的药物中的应用；

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病；

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病和/或淋巴瘤。