CN108264567A - 一种识别cd19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成，本发明的嵌合抗原受体可通过其CD19抗体的scFv结构域与靶细胞的CD19抗原结合，介导特异性的细胞杀伤；本发明的嵌合抗原受体可通过其IL‑15与IL‑15Rα‑sushi的复合体刺激T/NK细胞，使其免除对IL‑2的依赖并活化。本发明的嵌合抗原受体提供的胞外PD‑1结构域可以作为靶细胞表达的PD‑L1的特异性配体，一方面与T/NK细胞本身的PD‑1竞争性结合靶细胞表面的PD‑L1，另一方面此嵌合抗原受体的PD‑1与PD‑L1结合后信号传导给胞内的4‑1BBζ链，造成的结果不是T/NK细胞的抑制反而是激活，比单纯用PD‑1/PD‑L1抗体封闭抗原的方法更胜一筹。

Description

一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一种工程化的细胞表面受体，一般主要由抗原结合域、跨膜结构域和胞内信号传导结构域三部分组成，抗原结合域可结合靶细胞表面的抗原，经由跨膜结构域激活胞内信号传导结构域(专利号：CN 105392888A)。表达嵌合抗原受体的免疫细胞(例如T细胞或NK细胞)在胞内信号传导结构域的刺激下释放细胞因子诱导靶细胞凋亡，达到杀伤特定靶细胞的目的。

B细胞恶性肿瘤是一种很常见的癌症，包括多种白血病和B细胞淋巴瘤。CD19是一个特异性表达在B细胞表面的蛋白，其他类型细胞都没有或很低水平表达，因此CD19成为一个非常理想的B细胞淋巴瘤标志抗原。研究者用CD19抗体作为抗原结合域构建CD19-CAR(CD19嵌合抗原受体)并将其表达在T细胞表面，借助CD19抗体的特异识别能力和T细胞的细胞杀伤能力，得到了特异杀伤B细胞淋巴瘤的CD19-CAR-T细胞。全球现在进行着大量的CD19-CAR-T的技术开发和临床研究，CD19-CAR-T在黑色素瘤、骨髓瘤和急/慢性淋巴细胞白血病等几乎所有实验都显示了极高的有效性(专利申请号：201480027401.4，201480027071.9，201510532222.2，201510061635.7)。

PD-1(programmed death 1)和它的受体PD-L1，PD-L2是T细胞活性的重要调节因子。T细胞表面的PD-1与其他细胞表面的PD-L1/2的结合造成T细胞的抑制，这在人体避免自体免疫病和产生免疫耐受的过程中起到重要作用，但一些病原微生物和癌细胞也能通过上调自身PD-L1/2或T细胞PD-1表达来逃避T细胞的监视，进而造成疾病。因此研究者探索用PD-1或PD-L1的抗体去结合抗原，以封闭这一信号通路，结果显示此方法能够显著提高T细胞活性，增强机体对病原微生物和癌症的抵抗能力，已有多项临床试验证明了PD-1/PD-L1抗体对于黑色素瘤、多发性骨髓瘤、白血病等癌症都有很好的治疗效果(专利申请号：200380109929.8，201310258289.2，201180019629.5)。

T细胞或NK细胞的体外扩增都依赖IL-2的刺激，因此T细胞和NK细胞的培养基中都必须添加一定量的IL-2.为了简化NK细胞培养，并且鉴于IL-2在临床应用上的毒副作用，研究者对IL-2依赖的NK-92细胞做基因改造，使之稳定表达IL-2，发现可以免除培养基中IL-2的添加。IL-15与IL-2功能类似，而且共用相同的βγ受体，研究表示IL-2或IL-15对于NK细胞和CD8+T细胞的存活和增殖是必须的。于是研究者构建表达IL-15的NK细胞系，发现表达IL-15的NK-92细胞可以很大程度的减少培养基中IL-2的添加(专利号：03152968.2)。IL-15与IL-2虽然共用相同的βγ受体，但各自又有特异的α受体，研究发现IL-15Rα-sushi(IL-15受体α的sushi结构域)是IL-15的超级激动剂，可以极大的提高IL-15的功能(专利申请号：201280037114.2，201510358540.1)，IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体可以完全替代IL-2在T/NK细胞中的作用，激活NK/CD8+T细胞并提高其杀伤肿瘤的细胞毒性。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明的目的是提供一种可以靶向CD19和PD-L1两个靶点，介导特异性的细胞杀伤的多靶点嵌合抗原受体；并通过其内部结构中的IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体，可以刺激T/NK细胞，免除T/NK细胞对细胞因子的依赖性而扩增。

本发明的技术方案是：一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成(图1)，

所述主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；

所述辅肽链包括抗原结合域E和主肽链连接域F；

所述辅肽链连接域B和所述主肽链连接域F相互结合；

所述抗原结合域A为antiCD19-ScFv；

所述辅肽链连接域B为IL15Rαsushi

所述跨膜结构域C为CD8的跨膜区；

所述胞内信号传导结构域D为由CD3ζ信号传导区与4-1BB(CD137)信号传导区融合得到的多肽；

所述抗原结合域E为PD1的胞外区；

所述主肽链连接域F为IL15。

进一步的，所述antiCD19-ScFv的氨基酸序列为序列1或与序列1具有75％以上同源性的多肽；

进一步的，所述IL15Rαsushi的氨基酸序列为序列4；

进一步的，所述CD8的跨膜区的氨基酸序列为序列5；

进一步的，所述由4-1BB(CD137)与CD3ζ与融合得到的多肽的氨基酸序列由序列6和序列8组成；

进一步的，所述PD1的胞外区的氨基酸序列为序列2；

进一步的，所述主肽链连接域为IL15的氨基酸序列为序列3。

进一步的，所述多靶点嵌合抗原受体的主肽链的氨基酸序列为序列9；且所述受体的辅肽链的氨基酸序列为序列10。

进一步的，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述辅肽链的核酸分子组成。

进一步的，含有所述的核酸分子的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。

进一步的，所述细胞为原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞；

或，所述哺乳动物细胞具体为人类细胞；

或，所述人类细胞具体为免疫细胞，

或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞。

进一步的，所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞在免疫治疗中的应用；

或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；

或，在免疫检测中的应用。

或，在制备免疫治疗产品中的应用；

或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；

或，在制备免疫检测产品中的应用；

或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用；

或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用；

一种试剂盒，包括所述的多靶点嵌合抗原受体、所述的核酸分子或所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。

进一步的，所述的试剂盒在免疫治疗中的应用；

或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；

或，在免疫检测中的应用。

或，在制备免疫治疗产品中的应用；

或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；

或，在制备免疫检测产品中的应用；

或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用；

或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的嵌合抗原受体可通过其CD19抗体的scFv结构域与靶细胞的CD19抗原结合，介导特异性的细胞杀伤；本发明的嵌合抗原受体可通过其IL-15与IL-15Rα-sushi的复合体刺激T/NK细胞，使其免除对IL-2的依赖并活化。本发明的嵌合抗原受体提供的胞外PD-1结构域可以作为靶细胞表达的PD-L1的特异性配体，一方面与T/NK细胞本身的PD-1竞争性结合靶细胞表面的PD-L1，另一方面此嵌合抗原受体的PD-1与PD-L1结合后信号传导给胞内的4-1BBζ链，造成的结果不是T/NK细胞的抑制反而是激活，比单纯用PD-1/PD-L1抗体封闭抗原的方法更胜一筹。

附图说明

图1为多靶点嵌合抗原受体示意图。多靶点嵌合抗原受体由主肽链和辅肽链组成；主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；辅肽链包括主肽链连接域F和抗原结合域E。

图2为RaceCar-1表达盒示意图。RaceCar-1表达盒由启动子和RaceCar-1的编码基因组成。

图3为流式细胞仪验证RaceCar-1功能。其中图3a与图3b分别为未转染293T阴性对照与转染pFUGW-RaceCar-1的293T实验组，横坐标代表antiCD19水平，图3c与图3d分别为未转染293T阴性对照与转染pFUGW-RaceCar-1的293T实验组，横坐标代表PD1水平。从图中可见转染pFUGW-RaceCar-1的293T表面可检测到anti-CD19-ScFv和PD1的表达，证明RaceCar-1在293T细胞表面表达，并且其中的anti-CD19-ScFv和PD1都具有免疫学活性。

图4为Western blot验证RaceCar-1表达。第一泳道为实验组转染pFUGW-RaceCar-1的293T细胞，第二泳道为阴性对照，即没有转染的293T细胞，下图条带为β-actin内参，可见上图第一泳道相比第二泳道多出一条特异性条带，证明PD1表达，表明RaceCar-1表达。

图5为RaceCar-1-NK92细胞靶向杀伤能力验证。图中横坐标为效应细胞与靶细胞比例，纵坐标为杀伤效率。图中显示RaceCar-1-NK-92可以杀伤3m-CD19-luc细胞，证明靶向CD19和PD-L1的多靶点嵌合抗原受体RaceCar-1在NK-92细胞中表达，并具有生物功能。RaceCar-1-NK-92的杀伤能力高于NK-92。加入CD19抗体的实验组，RaceCar-1-NK-92杀伤能力下降，这是因为CD19抗体与靶细胞结合阻断了效应细胞与靶细胞的结合，从而抑制了RaceCar-1-NK-92对靶细胞的杀伤能力，证明RaceCar-1-NK-92对3m-CD19-luc细胞的杀伤具有CD19特异性。

图6为RaceCar-1-T细胞与Car-1-T细胞杀伤靶细胞能力比较。图中横坐标为效应细胞与靶细胞比例，纵坐标为杀伤效率。图中显示RaceCar-1-T细胞可以杀伤k562-cd19-luc细胞，证明RaceCar-1在T细胞中表达，并具有生物功能；并且RaceCar-1-T细胞的杀伤能力高于普通的Car-1-T。

图7为T细胞状态图，图7a为未转染的T细胞的初始状态，图7b为未转染的T细胞在无细胞因子条件下培养7天后的状态，图7c为RaceCar-1-T细胞的初始状态，图7d为RaceCar-1-T细胞在无细胞因子状态下培养7天后的状态。图中可以看到7天后，为转染的T细胞已经全部凋亡，RaceCar-1-T细胞状态良好，证明RaceCar具有刺激T细胞增殖的功能。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：多靶点嵌合抗原受体结构与表达载体构建

1、靶向CD19与PD-L1阳性细胞的多靶点嵌合抗原受体(RaceCar-1)由主肽链X1和辅肽链Y1聚合得到蛋白；

RaceCar-1中，主肽链X1的抗原结合域(A)选用抗CD19的ScFv(序列1)、辅肽链连接域(B)选用IL15Rαsushi(序列4)、跨膜结构域(C)选用CD8的跨膜区(序列5)和胞内信号传导结构域(D)选用41BB信号传导区(序列8)与CD3ζ信号传导区(序列6)串联，辅肽链Y1的抗原结合域(E)选用PDL1的受体PD1的胞外区(序列2)，主肽链连接域(F)选用IL15(序列3)，最终的到主肽链X1(氨基酸序列为序列9)和辅肽链Y1(氨基酸序列为序列10)。

2、在主肽链X1氨基酸序列N端前添加分泌信号肽(氨基酸序列为：序列11)，人工合成其编码核酸DNA-X1(序列13)；在辅肽链Y1氨基酸序列N端前N添加2A信号肽(氨基酸序列为：序列12)，人工合成其编码核酸DNA-X2(序列14)。

3、在DNA-X1序列5’端添加BamHI位点，3’端添加HindIII位点，使用BamHI和HindIII切割DNA-X1，得到其核酸片段；在DNA-X2序列5’端添加HinDIII位点，3’端添加EcoRI位点，使用HindIII和EcoRI切割DNA-X2，得到其核酸片段。

4、使用BamHI和EcoRI切割载体pFUGW(addgene产品)将3中得到的两个核酸片段连接至载体中，转化大肠杆菌，挑取单克隆进行PCR鉴定，最后得到重组载体pFUGW-RaceCar-1，重组载体pFUGW-RaceCar-1为表达RaceCar1的编码核酸(该编码核酸由序列13、AAGCTT和序列14组成，且序列13的最后一位核苷酸和AAGCTT的第一个碱基相邻，序列14第一位核苷酸与AAGCTT的最后一个碱基相邻，AAGCTT为HindIII酶切位点)替换pFUGW载体的BamHI和EcoRI酶切位点间片段，得到的重组载体，RaceCar-1的编码核酸与pFUGW载体中BamHI前的启动子共同组成了RaceCar-1表达盒(图2)。

实施例2：RaceCar的293T细胞表达流式验证

1、将Lenti-X-293T细胞(Clontech，货号：632180，下简称293T)1.2*10E⁶铺中于6孔板内，37℃，5％CO₂过夜培养。

2、将实施例1中构建的载体pFUGW-RaceCar-1使用lipofectamine3000转染于上述1得到的细胞中，37℃，5％CO₂培养48h。

3、将转染pFUGW-RaceCar-1的293T细胞使用胰蛋白酶消化后重悬于PBS中，控制细胞密度为在1*10E⁶/mL。

4、向分别向200uL3处理后的细胞中加入1.5uL APC Mouse anti-Human CD279(BD，货号558694)和FITC标记的CD19-FC融合蛋白(CD19-FC融合蛋白核酸序列为序列15)，使用FITC冰浴30min后脱盐进行标记，293F表达)，冰上孵浴30min。离心去上清，使用等量PBS重悬细胞。

5、进行流式分析(见图3)，图3a与图3b分别为未转染293T阴性对照与转染pFUGW-RaceCar-1的293T实验组，横坐标代表antiCD19水平，图3c与图3d分别为未转染293T阴性对照与转染pFUGW-RaceCar-1的293T实验组，横坐标代表PD1水平。从图中可见转染pFUGW-RaceCar-1的293T表面可检测到anti-CD19-ScFv和PD1的表达，证明RaceCar-1在293T细胞表面表达，并且其中的anti-CD19-ScFv和PD1都具有免疫学活性。

实施例3：RaceCar在293T中表达的Western blot验证

1、取5×10⁶实施例2中转染pFUGW-RaceCar-1的293T细胞，1500R，10min离心弃上清。

2、加入200uL Ripa细胞裂解液(碧云天，货号：P0013B)冰上静止30min。8000g，5min离心取上清20uL，加入5X蛋白电泳buffer，95℃金属浴5min，制备蛋白电泳样品。

3、进行SDS-PAGE，电泳完成后，切去浓缩胶部分，100V，200mA，1h进行转膜。

4、将转移好蛋白的PVDF膜放置于5％的脱脂乳/PBS溶液中，过夜封闭。PBST脱色摇床清洗3次，每次15min。

5、将PVDF膜放置入luL抗体/mL1％脱脂乳/PBS溶液，其中抗体为PD1/PDCD1/CD279抗体(义翘神州，货号：10377-T48-50)，脱色摇床孵育1h，PBST脱色摇床清洗3次，每次15min。

6、将PVDF膜放置入luL抗体/mL1％脱脂乳/PBS溶液，其中抗体为Goat anti-ratIgG(H+L)-HRP(三箭生物，货号：LK2009)，脱色摇床孵育1h，PBST脱色摇床清洗3次，每次15min。

7、使用W-TMB试剂盒(上海生工，货号：C510025-0005)显色，结果见图4，第一泳道为实验组转染pFUGW-RaceCar-1的293T细胞，第二泳道为阴性对照，即没有转染的293T细胞，下图条带为β-actin内参，可见上图第一泳道相比第二泳道多出一条特异性条带，证明PD1表达，表明RaceCar-1表达。

实施例4：pFUGW-RaceCar-1载体慢病毒包装与细胞感染

1、293T过夜培养至70％-80％密度，用于转染；将pCMV-VSV-G、pCMV-ΔR 8.91(pCMV-VSV-G与pCMV-ΔR 8.91为addgene产品，用于提供病毒外壳蛋白。)和实施例1制备的pFUGW-RaceCar-1按照各质粒质量比pCMV-VSV-G∶pCMV-ΔR 8.91∶实施例1制备的pFUGW-RaceCar-1)＝1∶3∶4，共同混合得到共转染质粒40ug；

2、取两个15ml离心管分别标记管1、管2，管1加入上述1的共转染质粒并补充无血清DMEM至1.5ml，管2加入1mg/mL的PEI水溶液(PEI为sigma产品货号GF70215825)120ul并补充无血清DMEM至1.5ml，分别充分混匀后将管1漩涡振荡，同时将管2中PEI逐滴加入管1中，得到质粒-PEI混合液，将质粒-PEI混合液在室温静置30min；加入用于转染的293T中，切勿将细胞悬起，将转染后的细胞置于37℃、CO₂孵箱中过夜培养24h。之后将细胞培养液弃去，重新加入20ml含10％FBS DMEM，并加入丁酸钠至终浓度10mM，37℃、CO₂孵箱过夜培养48小时。

3、收集上述2得到的细胞培养上清，4000g/min，离心15min，0.45um滤器过滤上清，得到病毒原液1*10⁶TU/mL。病毒原液添加1/3体积的质量百分含量为40％PEG水溶液，混匀后4℃放置过夜。第二天离心，4℃，1800g，45分钟，弃上清后用病毒原液1/10体积的培养基(后期感染T细胞使用X-vivo15，感染NK-92细胞使用MEM-Alpha)重悬病毒沉淀，得到10倍浓缩的病毒悬液。

4、将取3×10⁵NK-92(ATCC，CRL-2407)和1×10⁶的T细胞(T细胞为从健康献血者抽取的外周血中梯度离心分离出T细胞后，培养而来)分别用1×10⁷的病毒重悬感染并添加8ug/ml polybrane(Sigma，H9268-5G)，转移到24孔板一个孔中，32℃，1500R离心45分钟后转移到二氧化碳培养箱培养，3小时后离心去上清，换添加100U/ml IL-2的培养基于CO₂培养箱中培养，用于实验，得到RaceCar-1-NK-92和RaceCar-1-T。

实施例5：RaceCar在NK-92中的表达及RaceCar-NK-92靶向杀伤能力验证

1、使用细胞系3m-CD19-luc(向Malme-3m细胞系(ATCC，HTB-64)基因组中整合编码表达CD19抗原(序列16)和luciferase的核酸(序列17)，使其表达CD19抗原和luciferase，得到细胞系3m-CD19-luc)做靶细胞，分为如下3个实验组：第一组使用实施例4制备的RaceCar-l-NK-92作为效应细胞，第二组使用普通的NK92作为效应细胞，第三组使用RaceCar-1-NK-92作为效应细胞，并在体系中加入CD19抗体(mouse anti-HumanCD19Biotin标记抗体，北京博奥龙免疫技术有限公司，货号：BDLS-1968-100)。阴性对照为不添加效应细胞的体系，进行细胞杀伤。

2、效应细胞分别以个数比为10∶1，5∶1，1∶1的比例与1×10⁴靶细胞在96孔板100ul体系中混合，37℃二氧化碳培养箱孵育24h后向细胞中加入50μl 1％Triton裂解液+1μl底物(300ug/mL Luc水溶液与2mg/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)，裂解5min，检测luciferase荧光值，计算杀伤效率＝{(阴性对照荧光值-实验组荧光值)/阴性对照荧光值}×100％。

3、结果如图5所示，显示RaceCar-l-NK-92可以杀伤3m-CD19-luc细胞，证明靶向CD19和PD-L1的多靶点嵌合抗原受体RaceCar-1在NK-92细胞中表达，并具有生物功能。RaceCar-1-NK-92的杀伤能力高于NK-92。加入CD19抗体的实验组，RaceCar-1-NK-92杀伤能力下降，这是因为CD19抗体与靶细胞结合阻断了效应细胞与靶细胞的结合，从而抑制了RaceCar-1-NK-92对靶细胞的杀伤能力，证明RaceCar-1-NK-92对3m-CD19-luc细胞的杀伤具有CD19特异性。

实施例6：RaceCar在T细胞中的表达及RaceCar-T与Car-T靶向杀伤能力的比较

1、使用细胞系k562-cd19-luc(向k562细胞系(ATCC产品)基因组中整合编码表达CD19抗原(序列16)和luciferase的核酸(序列17)，使其表达CD19抗原和luciferase，得到细胞系3m-CD19-luc)作为靶细胞。一组效应细胞使用实施例4中得到的RaceCar-1-T，另一组效应细胞使用Car-1-T细胞(将antiCD19ScFv-CD8TM-41BB-CD3ζ嵌合抗原受体(氨基酸序列为序列18)按照上述病毒转染的方式转入T细胞中得到的细胞，表达普通的antiCD19ScFv-CD8TM-41BB-CD3ζ嵌合抗原受体)，以不加入效应细胞为阴性对照，进行细胞杀伤实验。

2、k562-cd19-luc细胞铺板1×10⁴个/孔，同时按照效应细胞与靶细胞个数比为5∶1、10∶1、20∶1比例分别加入RaceCar-1-T细胞和Car-1-T。24h后向细胞中加入50μl1％Triton裂解液+1μl底物(300ug/mL Luc水溶液与2mg/mL ATP水溶液按照体积比为3∶1混和)，裂解5min，利用酶标仪检测luciferase发光，计算杀伤效率＝{(阴性对照荧光值-实验组荧光值)/阴性对照荧光值}×100％。

结果如图6所示，图中横坐标为效应细胞与靶细胞比例，纵坐标为杀伤效率，可以看到RaceCar-1-T细胞可以杀伤k562-cd19-luc细胞，证明RaceCar-1在T细胞中表达，并具有生物功能；并且RaceCar-1-T细胞的杀伤能力高于普通的Car-1-T。

实施例7：RaceCar对免疫细胞增殖的影响

1、将转染RaceCar基因的T细胞，与未处理的T细胞在不添加IL12的X-vivo15+0.5％HSA的培养基中培养。

2、7天后观察细胞状态，结果如图7所示，图7a为未转染的T细胞的初始状态，图7b为未转染的T细胞在无细胞因子条件下培养7天后的状态，图7c为RaceCar-1-T细胞的初始状态，图7d为RaceCar-1-T细胞在无细胞因子状态下培养7天后的状态。图中可以看到7天后，为转染的T细胞已经全部凋亡，RaceCar-1-T细胞状态良好，证明RaceCar具有刺激T细胞增殖的功能。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

<110>天津天锐生物科技有限公司

<120> 一种识别CD19阳性肿瘤的嵌合抗原受体及细胞

<160> 18

<210> 1

<211>245

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

5 10 15 20

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

25 30 35 40

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

45 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

65 70 75 80 85

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

90 95 100 105

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

110 115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

130 135 140 145 150

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp

155 160 165 170

Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile

175 180 185 190

Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

195 200 205 210 215

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

220 225 230 235

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

240 245

<210>2

<211>150

<212>PRT

<213>人工序列

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<223>

<400> 2

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

5 10 15 20

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu

25 30 35 40

Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala

45 50 55 60

Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn

65 70 75 80

Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys

85 90 95 100

Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

105 110 115 120

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln

125 130 135 140 145

Phe Gln Thr Leu Val

150

<210>3

<211>114

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

5 10 15 20

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys

25 30 35 40

Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr

45 50 55 60

Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser

65 70 75 80

Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val

85 90 95 100

His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

105 110

<210> 4

<211>72

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr

5 10 15 20

Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu

25 30 35 40

Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile

45 50 55 60

Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln

65 70

<210>5

<211>69

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

5 10 15 20

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

25 30 35 40

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val

45 50 55 60

Ile Thr Leu Tyr Cys

65

<210>6

<211>112

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr

5 10 15 20

Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

25 30 35 40

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

45 50 55 60

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly

65 70 75 80

Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

85 90 95 100

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

105 110

<210>7

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly

5 10 15 20

Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

25 30 35 40

<210> 8

<211>42

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr

5 10 15 20

Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

25 30 35 40

<210> 9

<211>547

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser

5 10 15 20

Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

25 30 35 40

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

45 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

65 70 75 80 85

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

90 95 100 105

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

110 115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser

130 135 140 145 150

Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp

155 160 165 170

Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile

175 180 185 190

Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

195 200 205 210 215

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

220 225 230 235

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Thr Cys Pro Pro Pro Met Ser Val

240 245 250 255

Glu His Ala Asp Ile Trp Val Lys Ser Tyr Ser Leu Tyr Ser Arg Glu Arg Tyr Ile Cys Asn Ser

260 265 270 275 280

Gly Phe Lys Arg Lys Ala Gly Thr Ser Ser Leu Thr Glu Cys Val Leu Asn Lys Ala Thr Asn

285 290 295 300

Val Ala His Trp Thr Thr Pro Ser Leu Lys Cys Ile Arg Asp Pro Ala Leu Val His Gln Thr Thr

305 310 315 320

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

325 330 335 340 345

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

350 355 360 365

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

370 375 380 385 390

Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln

395 400 405 410

Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu

415 420 425 430

Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu

435 440 445 450

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

455 460 465 470

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

475 480 485 490

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg

495 500 505 510 515

Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

520 525 530 535

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Lys Leu

540 545

<210>10

<211>269

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu

5 10 15 20

Leu Val Val Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser

25 30 35 40

Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro

45 50 55 60

Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg

65 70 75 80

Asp Phe His Met Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala

85 90 95 100 105

Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg

110 115 120 125

Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln

130 135 140 145

Thr Leu Val Gly Gly Gly Gly Ser Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu

150 155 160 165

Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser

170 175 180 185

Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly

190 195 200 205 210

Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn

215 220 225 230

Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Lys Lys Asn Ile Lys Glu

235 240 245 250

Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser

255 260 265

<210>11

<211>21

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro

5 10 15 20

<210>12

<211>22

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

5 10 15 20

Pro

<210>13

<211>1698

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccggatatcc agatgacaca gactacatcc tccctgtctg cctctctggg agacagagtc 120

accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt agtaaatatt taaattggta tcagcagaaa 180

ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac catacatcaa gattacactc aggagtccca 240

tcaaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gattattctc tcaccattag caacctggag 300

caagaagata ttgccactta cttttgccaa cagggtaata cgcttccgta cacgttcgga 360

ggggggacca agctggagat cacaggctcc acctctggct ccggcaagcc cggatctggc 420

gagggctcca ccaagggcga ggtgaaactg caggagtcag gacctggcct ggtggcgccc 480

tcacagagcc tgtccgtcac atgcactgtc tcaggggtct cattacccga ctatggtgta 540

agctggattc gccagcctcc acgaaagggt ctggagtggc tgggagtaat atggggtagt 600

gaaaccacat actataattc agctctcaaa tccagactga ccatcatcaa ggacaactcc 660

aagagccaag ttttcttaaa aatgaacagt ctgcaaactg atgacacagc catttactac 720

tgtgccaaac attattacta cggtggtagc tatgctatgg actactgggg ccaaggaacc 780

tcagtcaccg tgagctcagg cggcggcgga tctatcacgt gccctccccc catgtccgtg 840

gaacacgcag acatctgggt caagagctac agcttgtact ccagggagcg gtacatttgt 900

aactctggtt tcaagcgtaa agccggcacg tccagcctga cggagtgcgt gttgaacaag 960

gccacgaatg tcgcccactg gacaaccccc agtctcaaat gcattagaga ccctgccctg 1020

gttcaccaaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 1080

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 1140

agggggctgg acttcgcctg tgacatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1200

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1260

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1320

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1380

agcgcagacg cccccgcgta caagcagggc cagaaccagc tctataacga actcaatcta 1440

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1500

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1560

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc ggcggagggg caaggggcac 1620

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1680

caggccctgc cccctcgc 1698

<210> 14

<211>879

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

ggaagcggcg ccaccaactt ctccctgctg aagcaagctg gcgacgtgga agagaacccc 60

ggccccccag gatggttctt agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc 120

ccagccctgc tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac 180

acatcggaga gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag 240

ctggccgcct tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca 300

caactgccca acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc 360

ggcacctacc tctgtggggc catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg 420

cgggcagagc tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc 480

tcacccaggc cagccggcca gttccaaacc ctggtgggcg gaggaggctc caactgggtg 540

aacgtcatct ccgacctcaa gaagatcgag gacctgatcc agagcatgca catcgacgcc 600

accctgtata ccgagagcga cgtgcacccc tcctgtaaag tgaccgccat gaagtgcttc 660

ctgctggagc tgcaggtgat cagcctggag agcggcgacg ccagcatcca tgacaccgtg 720

gagaacctga tcatcctggc caataacagc ctgagctcca acggcaacgt gaccgagagc 780

ggctgcaagg aatgcgagga gctggagaag aagaacatta aggagttcct gcagagcttc 840

gtccacatcg tgcagatgtt cattaacacc tcctaatga 879

<210>15

<211>1575

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60

gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120

gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180

ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240

tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300

cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360

ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420

tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480

aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540

aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600

ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660

gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720

gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780

tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840

tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aagggatccg agcccaaatc ttgtgagaag 900

acccacacat gcccaccgtg cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtgttcctc 960

ttccccccaa aacccaagga caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg 1020

gtggtggacg tgagccacga ggaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg 1080

gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg 1140

gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag 1200

gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag 1260

ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag 1320

gtcagcctga cttgcctggt caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag 1380

agcaatgggc agccggagaa caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc 1440

tccttcttcc tctactccaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtg 1500

ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc 1560

ctgtctccgg gtaaa 1575

<210>16

<211>1671

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

atgccacctc ctcgcctcct cttcttcctc ctcttcctca cccccatgga agtcaggccc 60

gaggaacctc tagtggtgaa ggtggaagag ggagataacg ctgtgctgca gtgcctcaag 120

gggacctcag atggccccac tcagcagctg acctggtctc gggagtcccc gcttaaaccc 180

ttcttaaaac tcagcctggg gctgccaggc ctgggaatcc acatgaggcc cctggccatc 240

tggcttttca tcttcaacgt ctctcaacag atggggggct tctacctgtg ccagccgggg 300

cccccctctg agaaggcctg gcagcctggc tggacagtca atgtggaggg cagcggggag 360

ctgttccggt ggaatgtttc ggacctaggt ggcctgggct gtggcctgaa gaacaggtcc 420

tcagagggcc ccagctcccc ttccgggaag ctcatgagcc ccaagctgta tgtgtgggcc 480

aaagaccgcc ctgagatctg ggagggagag cctccgtgtc tcccaccgag ggacagcctg 540

aaccagagcc tcagccagga cctcaccatg gcccctggct ccacactctg gctgtcctgt 600

ggggtacccc ctgactctgt gtccaggggc cccctctcct ggacccatgt gcaccccaag 660

gggcctaagt cattgctgag cctagagctg aaggacgatc gcccggccag agatatgtgg 720

gtaatggaga cgggtctgtt gttgccccgg gccacagctc aagacgctgg aaagtattat 780

tgtcaccgtg gcaacctgac catgtcattc cacctggaga tcactgctcg gccagtacta 840

tggcactggc tgctgaggac tggtggctgg aaggtctcag ctgtgacttt ggcttatctg 900

atcttctgcc tgtgttccct tgtgggcatt cttcatcttc aaagagccct ggtcctgagg 960

aggaaaagaa agcgaatgac tgaccccacc aggagattct tcaaagtgac gcctccccca 1020

ggaagcgggc cccagaacca gtacgggaac gtgctgtctc tccccacacc cacctcaggc 1080

ctcggacgcg cccagcgttg ggccgcaggc ctggggggca ctgccccgtc ttatggaaac 1140

ccgagcagcg acgtccaggc ggatggagcc ttggggtccc ggagcccgcc gggagtgggc 1200

ccagaagaag aggaagggga gggctatgag gaacctgaca gtgaggagga ctccgagttc 1260

tatgagaacg actccaacct tgggcaggac cagctctccc aggatggcag cggctacgag 1320

aaccctgagg atgagcccct gggtcctgag gatgaagact ccttctccaa cgctgagtct 1380

tatgagaacg aggatgaaga gctgacccag ccggtcgcca ggacaatgga cttcctgagc 1440

cctcatgggt cagcctggga ccccagccgg gaagcaacct ccctggggtc ccagtcctat 1500

gaggatatga gaggaatcct gtatgcagcc ccccagctcc gctccattcg gggccagcct 1560

ggacccaatc atgaggaaga tgcagactct tatgagaaca tggataatcc cgatgggcca 1620

gacccagcct ggggaggagg gggccgcatg ggcacctgga gcaccaggtg a 1671

<210>17

<211>1773

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

atggaagatg ccaaaaacat taagaagggc ccagcgccat tctacccact cgaagacggg 60

accgccggcg agcagctgca caaagccatg aagcgctacg ccctggtgcc cggcaccatc 120

gcctttaccg acgcacatat cgaggtggac attacctacg ccgagtactt cgagatgagc 180

gttcggctgg cagaagctat gaagcgctat gggctgaata caaaccatcg gatcgtggtg 240

tgcagcgaga atagcttgca gttcttcatg cccgtgttgg gtgccctgtt catcggtgtg 300

gctgtggccc cagctaacga catctacaac gagcgcgagc tgctgaacag catgggcatc 360

agccagccca ccgtcgtatt cgtgagcaag aaagggctgc aaaagatcct caacgtgcaa 420

aagaagctac cgatcataca aaagatcatc atcatggata gcaagaccga ctaccagggc 480

ttccaaagca tgtacacctt cgtgacttcc catttgccac ccggcttcaa cgagtacgac 540

ttcgtgcccg agagcttcga ccgggacaaa accatcgccc tgatcatgaa cagtagtggc 600

agtaccggat tgcccaaggg cgtagcccta ccgcaccgca ccgcttgtgt ccgattcagt 660

catgcccgcg accccatctt cggcaaccag atcatccccg acaccgctat cctcagcgtg 720

gtgccatttc accacggctt cggcatgttc accacgctgg gctacttgat ctgcggcttt 780

cgggtcgtgc tcatgtaccg cttcgaggag gagctattct tgcgcagctt gcaagactat 840

aagattcaat ctgccctgct ggtgcccaca ctatttagct tcttcgctaa gagcactctc 900

atcgacaagt acgacctaag caacttgcac gagatcgcca gcggcggggc gccgctcagc 960

aaggaggtag gtgaggccgt ggccaaacgc ttccacctac caggcatccg ccagggctac 1020

ggcctgacag aaacaaccag cgccattctg atcacccccg aaggggacga caagcctggc 1080

gcagtaggca aggtggtgcc cttcttcgag gctaaggtgg tggacttgga caccggtaag 1140

acactgggtg tgaaccagcg cggcgagctg tgcgtccgtg gccccatgat catgagcggc 1200

tacgttaaca accccgaggc tacaaacgct ctcatcgaca aggacggctg gctgcacagc 1260

ggcgacatcg cctactggga cgaggacgag cacttcttca tcgtggaccg gctgaagagc 1320

ctgatcaaat acaagggcta ccaggtagcc ccagccgaac tggagagcat cctgctgcaa 1380

caccccaaca tcttcgacgc cggggtcgcc ggcctgcccg acgacgatgc cggcgagctg 1440

cccgccgcag tcgtcgtgct ggaacacggt aaaaccatga ccgagaagga gatcgtggac 1500

tatgtggcca gccaggttac aaccgccaag aagctgcgcg gtggtgttgt gttcgtggac 1560

gaggtgccta aaggactgac cggcaagttg gacgcccgca agatccgcga gattctcatt 1620

aaggccaaga agggcggcaa gatcgccgtg aattctcacg gcttccctcc cgaggtggag 1680

gagcaggccg ccggcaccct gcccatgagc tgcgcccagg agagcggcat ggatagacac 1740

cctgctgctt gcgccagcgc caggatcaac gtc 1773

<210>18

<211>470

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr

5 10 15 20

Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

25 30 35 40

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

45 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala

65 70 75 80

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

85 90 95 100 105

Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val

110 115 120 125

Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr

130 135 140 145

Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly

150 155 160 165

Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

170 175 180 185 190

Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln

195 200 205 210

Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met

215 220 225 230

Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

235 240 245 250

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

255 260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

275 280 285 290 295

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

300 305 310 315

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

320 325 330 335

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys

340 345 350 355

Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

360 365 370 375 380

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu

385 390 395 400

Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

405 410 415 420

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly

425 430 435 440

His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

445 450 455 460

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Lys Leu

465 470

Claims (9)

1.一种多靶点嵌合抗原受体，由主肽链和辅肽链组成，其特征在于，

所述主肽链包括抗原结合域A、辅肽链连接域B、跨膜结构域C和胞内信号传导结构域D；

所述辅肽链包括抗原结合域E和主肽链连接域F；

所述辅肽链连接域B和所述主肽链连接域F相互结合；

所述抗原结合域A为识别CD19的抗体；

所述辅肽链连接域B为IL15Rαsushi

所述跨膜结构域C为CD8的跨膜区；

所述胞内信号传导结构域D为由CD3ζ信号传导区与4-1BB(CD137)信号传导区融合得到的多肽；

所述抗原结合域E为PD1的胞外区；

所述主肽链连接域F为IL15。

2.根据权利要求1所述的多靶点嵌合抗原受体，其特征在于：

所述识别CD19的抗体antiCD19-ScFv的氨基酸序列为序列1，或与序列1具有75％以上同源性的多肽；

所述IL15Rαsushi的氨基酸序列为序列4；

所述CD8的跨膜区的氨基酸序列为序列5；

所述由4-1BB(CD137)与CD3ζ与融合得到的多肽的氨基酸序列由序列6和序列8组成；

所述PD1的胞外区的氨基酸序列为序列2；

所述主肽链连接域为IL15的氨基酸序列为序列3。

3.根据权利要求1或2所述的多靶点嵌合抗原受体，其特征在于：

所述多靶点嵌合抗原受体的主肽链的氨基酸序列为序列9；且所述受体的辅肽链的氨基酸序列为序列10。

4.权利要求1-3中任一所述的多靶点嵌合抗原受体的编码核酸分子，由编码所述主肽链的核酸分子或编码所述辅肽链的核酸分子组成。

5.含有权利要求4所述的核酸分子的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。

6.根据权利要求5所述的细胞，其特征在于：所述细胞为原核细胞、真核细胞或哺乳动物细胞；

或，所述哺乳动物细胞具体为人类细胞；

或，所述人类细胞具体为免疫细胞，

或，所述免疫细胞具体为T细胞或NK细胞。

7.权利要求1-3中任一所述的多靶点嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞在免疫治疗中的应用；

或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；

或，在免疫检测中的应用；

或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用。

或权利要求1-3中任一所述的多靶点嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞在制备免疫治疗产品中的应用；

或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；

或，在制备免疫检测产品中的应用；

或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用。

8.一种试剂盒，其包括权利要求1-3中任一所述的多靶点嵌合抗原受体、权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组载体、重组菌、重组病毒或细胞。

9.权利要求8中所述试剂盒在免疫治疗中的应用；

或，在免疫细胞培养与增殖中的应用；

或，在免疫检测中的应用；

或，在抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞中的应用；

或，在制备免疫治疗产品中的应用；

或，在制备免疫细胞培养与增殖产品中的应用；

或，在制备免疫检测产品中的应用。

或，在制备抑制或杀伤表达所述抗原的靶细胞产品中的应用。