CN107286247A

CN107286247A - 含抗间皮素单链抗体的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其用途

Info

Publication number: CN107286247A
Application number: CN201611232819.6A
Authority: CN
Inventors: 樊克兴; 卫莹
Original assignee: When Biological Technology (beijing) Co Ltd
Current assignee: When Biological Technology (beijing) Co Ltd
Priority date: 2016-12-28
Filing date: 2016-12-28
Publication date: 2017-10-24
Anticipated expiration: 2036-12-28
Also published as: CN107286247B

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化的靶向间皮素的树突状细胞(mesoCAR‑DC)及其用途，所述嵌合抗原受体(mesoCAR)为GM‑CSF‑SS1scFv‑CD8α‑CD40，由人GM‑CSF信号肽、抗间皮素单链抗体(抗SS1scFv)、人CD8α铰链区、人CD40的跨膜区和胞内信号区串联构成。采用本发明的嵌合抗原受体mesoCAR修饰的树突状细胞治疗进展期间皮素阳性的癌症(特别是胰腺癌)时，对癌细胞具有很好的特异杀伤活性。

Description

含抗间皮素单链抗体的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受体mesoCAR及其基因和重组表达载体、工程化的靶向间皮素的DC细胞(mesoCAR-DC)及其应用。

背景技术

树突状细胞(dendritic cells，DCs)是一类成熟时具有许多树突样凸起的、能够识别、摄取和加工外源性抗原并将抗原肽提呈给初始T细胞并诱导T细胞活化增殖的、功能最强的抗原呈递细胞。

目前的DC细胞免疫治疗，是分离肿瘤患者自身的单核细胞，在体外培养、扩增、并诱导其生成DC，然后让DC负载相应的肿瘤抗原，经严格筛选后制备成负载肿瘤抗原的DC，然后将这些DC细胞回输到相应患者体内，刺激、激活人体内的天然抗肿瘤系统。DC免疫细胞治疗广泛适用于多种肿瘤的治疗，但是，单纯靠体外活化DC细胞取得的疗效有限，因此在DC细胞免疫治疗肿瘤的方法上仍需进一步改善。

嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)是目前最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。一般的，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。CAR-T细胞疗法通过把能特异性识别肿瘤相关抗原的单链抗体(Single chain fragment variable，scFv)和T细胞活化序列偶联，并使其表达到T细胞表面，使能特异性识别肿瘤相关抗原的scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。表达CAR的T细胞以抗原依赖、但非MHC限制的方式识别并结合肿瘤抗原，启动并活化特异性杀伤肿瘤反应。

人间皮素(Mesothelin，简写为meso)是一种40kDa的细胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)-连接的糖蛋白。间皮素以相对低的水平存在于健康个体的胸膜、腹膜及心包膜的间皮细胞中，但在许多不同的癌症中高度表达，包括间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌。已经在多于55％的肺癌和多于70％的卵巢癌中检测到高水平的间皮素。早期临床数据表明，间皮素特异的CAR-T细胞可被机体很好的耐受，并且对于卵巢癌，胰腺癌，间皮素瘤有很好的临床效果。但CAR-T可产生一定的脱靶毒性，影响其细胞免疫疗效；而且更重要的是，由于肿瘤的异质性，同一个肿瘤往往存在多种肿瘤抗原，因此针对单一肿瘤抗原的CAR-T疗效有限，而且容易复发。

因此，我们设计了一种新型的DC细胞治疗肿瘤策略，利用慢病毒系统将间皮素信号域与肿瘤相关嵌合抗原受体融合，转导DC细胞，使其在DC细胞表面表达间皮素特异性的CAR，通过识别肿瘤细胞表面的间皮素与肿瘤细胞结合，活化DC细胞，并将信号呈递给具杀伤效应的T淋巴细胞，从而激活T细胞的特异性肿瘤杀伤能力，并激活自身免疫，来达到监测、杀灭肿瘤的目的，并且可以有效降低由于脱靶效应造成的毒副作用，以及肿瘤异质性导致的复发及耐受。

发明内容

为了克服现有技术中体外活化DC细胞对肿瘤的杀伤作用比较弱、特异杀伤活性有待提高的缺陷，本发明提供了以下方面。

本发明首先提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体由人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽、抗间皮素单链抗体(SS1scFv)、人CD8α铰链区、人CD40的跨膜区和胞内信号区串联构成，称为mesoCAR。

进一步的，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了表达载体，其包含并能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因。

进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pCDH-mesoCAR。

本发明还提供了一种工程化的树突状细胞，其含有所述表达载体。

进一步地，所述表达载体为慢病毒载体pCDH-mesoCAR。

本发明还提供了所述的工程化的DC细胞在制备用于治疗癌症的制剂中的用途。

进一步地，所述癌症是间皮素阳性的间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌；优选胰腺癌。

本发明还提供了一种表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其包括将所述嵌合抗原受体的表达载体转染进树突状细胞。

进一步地，所述方法中的嵌合抗原受体为所述mesoCAR，优选为具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述方法中的表达载体包含并能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因，优选为慢病毒载体pCDH-mesoCAR。

在一些实施方案中，本发明所述的CAR的结构是由单链抗体(scfv)、铰链区(Hinge)、跨膜区(transmembrane domain)、信号域(signal domain)组成。其中scfv区由轻链可变区序列和重链可变区序列组成；轻链区和重链区之间通过(Gly4-Ser)n接头；单链抗体(scfv)结合序列可以为肿瘤相关抗原，如CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD138、CEA、cMet、EGFRvIII、IL33Rα2、FAP、Her2、GD2、PSMA、MUC1、MUC16、间皮素和NCAM等中的一种或几种；铰链区序列为FcγRIIIαhinge、CD8αhinge、IgG1/4hinge中的一种；跨膜区序列为CD8αTM、FcεRIα-TM、CD40-TM中的一种。

附图说明

图1为本发明所使用的嵌合抗原受体mesoCAR的结构示意图。

图2为慢病毒表达载体pCDH-mesoCAR质粒信息图。

图3为荧光显微镜检测慢病毒pCDH-mesoCAR侵染DC细胞的荧光表达情况；A为未侵染的DC细胞，B为pCDH-CAR(Meso)病毒侵染的DC细胞

图4为体外mesoCAR-DC细胞与Mesothelin+A431细胞(人间皮素过表达的A431细胞)共培养后活化情况，通过流式检测MHC-I/MHC-II/CD86/CD40的表达水平分析DC细胞的活化程度。

A为mesoCAR-DC细胞；B为mesoCAR-DC细胞与Mesothelin+A431以3:1的比例共培养。

图5为效应细胞mesoCAR-DC，靶细胞A431-H9，CD8⁺T细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测CD25的表达水平分析T细胞激活情况。

A：未处理的DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养；B：pCDH-空载体转导的DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养；C：pCDH-mesoCAR转导DC细胞与靶细胞A431，CD8⁺T细胞共培养。

图6为mesoCAR-DC治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，肿瘤体积的变化情况。

A：小鼠尾静脉注射1x10^6DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

B：小鼠尾静脉注射1x10^6慢病毒空载体转导体外培养DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

C：小鼠尾静脉注射1x10^6pCDH-mesoCAR-DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞。

图7为mesoCAR-DC治疗间皮素阳性荷瘤小鼠后，小鼠的存活情况。

A：小鼠尾静脉注射1x10^6DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞；

C：小鼠尾静脉注射1x10^6pCDH-mesoCAR-DC细胞和1x10^6CD8⁺T细胞。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。

下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到，其中：

DMEM培养基、X-VIVO 15培养基购自TaKaRa公司。

淋巴细胞分离液购自TBD公司。

T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。

限制性核酸内切酶EcoR I、Xba I购自Thermo Fisher Scientific公司。

pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(简称pCDH)及其包装质粒pLP1、pLP2、pLP/VSVG购自Addgene公司。

琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒均购自天根生化科技有限公司。

pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro购自Addgene公司。

DH5αPhage Resistant化学感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司。

LipofectamineTM 2000Transfection Reagent转染试剂购自Invitrogen公司。

293T包装细胞购自美国ATCC。

A431细胞系购自美国ATCC。

BHK21细胞系购自美国ATCC

胎牛血清购自Gibco公司。

PEG6000和NaCl均购自上海索莱宝生物科技有限公司。

免疫缺陷模式小鼠(NSG)购自北京维通达生物技术有限公司。

基因由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

人GM-CSF、IL-4、rhIL-2、CD3/CD28抗体等购自ebioscience公司。

抗MHC-I，MHC-II，CD80，CD86，CD3，CD25等流式抗体购自BD公司。

实施例

一、mesoCAR基因序列的确定

1.1从美国国立医学图书馆网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez)GenBank数据库中搜索到人GM-CSF信号肽基因SEQ ID NO.3、人CD8α铰链区基因SEQ IDNO.4、人CD40跨膜区和胞内信号区基因序列SEQ ID NO.5。抗间皮素单链抗体(抗SS1scFv)基因序列为SEQ ID NO.6。

1.2将上述基因序列依次按人GM-CSF信号肽基因、抗SS1scFv、人CD8α铰链区基因、人CD40跨膜区和胞内信号区序列进行连接，形成最终完整的GM-CSF-SS1scFv-CD8α-CD40(mesoCAR)基因序列SEQ ID NO.2。

二.pCDH-mesoCAR表达质粒的构建

2.1全基因合成：

由上海生工合成完整的mesoCAR基因序列，并在两端添加酶切位点Xba I/EcoR I。

2.2将上述序列克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-puro(简称pCDH)慢病毒表达载体中，获得抗人间皮素-CAR的表达质粒。

分别将mesoCAR和慢病毒表达载体pCDH用XbaI/EcoRI进行酶切，酶切体系如下，37℃水浴>1小时。

将酶切产物琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，对正确的产物进行胶回收。

将相应酶切产物用T4DNA连接酶进行连接，连接体系如下：

16℃过夜连接，连接产物转化DH5a感受态细胞。

2.3从转化有pCDH-mesoCAR的平板中随机挑取4个单克隆，分别加入含有Ampicillin氨苄青霉素(100ug/ml)的4ml的LB培养基中进行扩培，6-8小时后进行质粒提取，并用XbaI/EcoRI进行酶切鉴定，回收大小正确的酶切片段，送上海生工进行测序进一步确定。测序正确的即为pCDH-mesoCAR。

三.慢病毒的包装、浓缩和滴度测定

3.1慢病毒的包装：

3.1.1细胞处理：转染前24小时收集处于对数生长期的第3-10代293T细胞，将5×10^6293T细胞接种于10cm培养板中，细胞在含有10ml 10％FBS的DMEM培养基中生长，置37℃5％CO2培养箱培养24小时，达60-80％密度时可进行转染。

3.1.2向细胞中以5:2:2:2的比例共转染慢病毒载体质粒(pCDH-mesoCAR或其空载体pCDH)及其包装质粒pLP1，pLP2，pLP/VSVG；转染体系如下：

6～8小时后将10cm培养盘中培养基换成完全培养基。

3.1.3转染后24小时，于荧光显微镜下观察293T细胞转染后GFP荧光表达情况。分别于转染24小时、48小时后收集293T培养上清，3000rpm离心15分钟，72小时后收集293T细胞和上清于15ml管，反复冻融三次裂解细胞，离心收集上清；

3.1.4用0.45μm滤器过滤病毒上清，分别获得pCDH-空载体和pCDH-mesoCAR病毒原液；-80℃保存。

3.2慢病毒浓缩

3.2.1分别收集细胞及培养上清，PEG6000浓缩病毒，向病毒溶液中加入1/4体积的PEG6000/NaCl溶液(25％PEG6000+4.4％NaCl)，混匀，4℃静置1小时；

3.2.2 4℃，5000rpm离心30分钟；

3.2.3弃上清，加入2ml病毒溶解液(10mM Tris-HCl(pH8.0)，2mM MgCl2，5％蔗糖)溶解慢病毒沉淀，并分装于-80℃储存。

3.3慢病毒滴度测定

3.3.1预先接种BHK21细胞至24孔板，10^5细胞/孔，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养18小时；

3.3.2溶解病毒，准备从10^-2到10^-7做10倍梯度稀释病毒样品；

3.3.3去除细胞培养液，加入含有不同梯度的病毒细胞培养液，并在培养液中加入6ug/ml的聚凝胺(polybrene)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养2小时；

3.3.4去除细胞培养液，加入10％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养48小时；

3.3.5去除细胞培养液，加入含2ug/ml嘌呤霉素和1％FBS的DMEM培养液，置于37℃5％CO₂细胞培养箱培养72小时；

3.3.6去除细胞培养液，加入结晶紫染色液，计数被染色克隆数，并计算病毒滴度。

3.2.10将病毒稀释至10^7TU/ml，于-80℃储存。

四.DC细胞的体外培养、感染和扩增

1用CD14+分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将CD14+细胞从PBMC中分选出来。

2用X-VIVO 15培养基重悬细胞，加入500U/ml的GM-CSF溶液、500U/ml的IL-4溶液和一定量的自体血浆，诱导CD14⁺细胞向DC细胞分化。

3向培养6至8天的DC细胞中每孔分别加入pCDH-空载体或pCDH-mesoCAR病毒浓缩液(梯度设定，确定最佳感染滴度)，以及终浓度为6μg/ml的聚凝胺，混匀，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，24小时内不换液；感染后24小时进行第二次感染；

4感染后96小时，用荧光显微镜观察DC细胞的绿色荧光表达情况并照相。结果见图3。

5收集细胞后，1000rpm离心10分钟，PBS洗涤1次，用适量PBS重悬细胞置于流式管中，用流式细胞仪检测GFP阳性率。

五.体外共培养测定CAR-DC细胞的活化及对T细胞的激活作用

5.1分析DC细胞活化，效应细胞mesoCAR-DC与靶细胞间皮素⁺A431(人间皮素转染A431细胞)细胞以不同比例共培养后，通过流式检测表明DC细胞活化的MHC-I/MHC-II I/CD86/CD40的表达水平。结果见图4。

5.2分析T细胞激活

5.2.1T细胞的分离培养，用CD8⁺T细胞分选试剂盒(购自STEM CELL公司)将T细胞从外周血单核细胞(PBMC)中分选出来；

5.2.2用含10％FBS的RPMI 1640培养基调整细胞浓度至1×10^6/ml，将细胞接种到预先用抗人CD3和CD28抗体包被的细胞培养瓶中，再加入200IU/ml重组人白细胞介素2(rhIL-2)，置于37℃5％CO2细胞培养箱培养；

5.2.3mesoCAR-DC，A431，CD8⁺T细胞以3:1:3比例共培养后，通过流式检测T细胞活化的CD25的表达水平，分析T细胞激活情况。结果见图5，与对照相比mesoCAR-DC对T细胞的刺激作用明显。

六.体内mesoCAR-DC细胞对间皮素+肿瘤的杀伤活性

6.1NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠在皮下植入5x10^6原代A431-H9(人间皮素稳转A431)细胞，观察并测量肿瘤生长情况，直至肿瘤生长至40mm³,给予CAR-DC。

6.2mesoCAR-DC细胞治疗间皮素阳性荷瘤小鼠的效果测定：从小鼠尾静脉注射1x10^6mesoCAR-DC和1x10^6CD8⁺T细胞，观察并测量肿瘤的生长情况，结果见图6，同时记录小鼠存活情况，结果见图7。

由图可知，mesoCAR-DC细胞组的荷瘤小鼠治疗后28天生存率为100％，而单DC细胞治疗及空载体DC细胞组小鼠全部死亡。说明mesoCAR-DC对于间皮素阳性荷瘤小鼠有很好的治疗效果。

序列表

<110> 时力生物科技（北京）有限公司

<120> 含抗间皮素单链抗体的嵌合抗原受体修饰的树突状细胞及其用途

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR的氨基酸序列

<400> 1

Met Val Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser

20 25 30

Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln

50 55 60

Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr

85 90 95

Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr

100 105 110

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly

115 120 125

Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu

165 170 175

Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

180 185 190

Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp

195 200 205

Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp

225 230 235 240

Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Lys His Pro Leu Thr Phe

245 250 255

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

260 265 270

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

275 280 285

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

290 295 300

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Leu His Arg Ser Cys Ser Pro Gly Phe

305 310 315 320

Gly Val Lys Gln Ile Ala Thr Gly Val Ser Asp Thr Ile Cys Glu Pro

325 330 335

Cys Pro Val Gly Phe Ser Asn Val Ser Ser Ala Phe Glu Lys Cys His

340 345 350

Pro Trp Thr Arg Ser Pro Gly Ser Ala Glu Ser Pro Gly Gly Asp Pro

355 360 365

His His His Leu Arg Asp Pro Val Cys His Pro Leu Gly Ala Gly Leu

370 375 380

Ser Gln Lys Gly Gly Gln Glu Ala Asn Gln

385 390

<210> 2

<211> 1182

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> mesoCAR的核酸序列

<400> 2

atggttctgc tggtgacatc tctcctgctc tgtgaactgc ctcatcccgc ttttctgctc 60

attcccgaca ttcagcaggt ccagctccag cagtctggcc ctgaactcga aaaacctggc 120

gctagcgtga aaatttcctg taaagcctcc ggctactctt ttactggcta cacaatgaat 180

tgggtgaaac agtctcacgg caaatccctc gaatggatcg gactcatcac accctacaat 240

ggcgcctctt cctacaacca gaaattccgg ggcaaggcaa cactcactgt ggacaaatca 300

tcctctaccg cctacatgga tctgctctcc ctcacatctg aggactccgc tgtctacttt 360

tgtgcccgag gaggatacga cggacgagga ttcgattact ggggacaggg aacaactgtg 420

accgtgtcta gtggcggcgg agggagtgga ggcggaggat cttctggcgg gggatccgat 480

attgaactca cacagtctcc cgctatcatg tctgcttctc ccggcgagaa agtgactatg 540

acttgctctg cttcctcttc tgtgtcctac atgcactggt accagcagaa atctggcaca 600

tcccctaaac ggtggatcta cgatactagc aaactggcat ccggcgtgcc tgggcgattc 660

tctggctctg gctctggcaa ctcttactct ctcacaatct catctgtcga ggctgaggac 720

gatgccacat actactgtca gcagtggtct aaacacccac tcacattcgg cgctggcact 780

aaactggaaa taaaaaccac gacgccagcg ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc 840

gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg 900

cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat gtcctgcacc gctcatgctc gcccggcttt 960

ggggtcaagc agattgctac aggggtttct gataccatct gcgagccctg cccagtcggc 1020

ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa tgtcaccctt ggacaaggtc cccaggatcg 1080

gctgagagcc ctggtggtga tccccatcat catcttcggg atcctgtttg ccatcctctt 1140

ggtgctggtc tttctcaaaa aggtggccaa gaagccaacc aa 1182

<210> 3

<211> 75

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GM-CSF信号肽的核酸序列

<400> 3

atggttctgc tggtgacatc tctcctgctc tgtgaactgc ctcatcccgc ttttctgctc 60

attcccgaca ttcag 75

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD8α铰链区的核酸序列

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 252

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人CD40跨膜区及胞内信号区的核酸序列

<400> 5

gtcctgcacc gctcatgctc gcccggcttt ggggtcaagc agattgctac aggggtttct 60

gataccatct gcgagccctg cccagtcggc ttctccaatg tgtcatctgc tttcgaaaaa 120

tgtcaccctt ggacaaggtc cccaggatcg gctgagagcc ctggtggtga tccccatcat 180

catcttcggg atcctgtttg ccatcctctt ggtgctggtc tttctcaaaa aggtggccaa 240

gaagccaacc aa 252

<210> 6

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> SS1scFv核酸序列

<400> 6

caggtccagc tccagcagtc tggccctgaa ctcgaaaaac ctggcgctag cgtgaaaatt 60

tcctgtaaag cctccggcta ctcttttact ggctacacaa tgaattgggt gaaacagtct 120

cacggcaaat ccctcgaatg gatcggactc atcacaccct acaatggcgc ctcttcctac 180

aaccagaaat tccggggcaa ggcaacactc actgtggaca aatcatcctc taccgcctac 240

atggatctgc tctccctcac atctgaggac tccgctgtct acttttgtgc ccgaggagga 300

tacgacggac gaggattcga ttactgggga cagggaacaa ctgtgaccgt gtctagtggc 360

ggcggaggga gtggaggcgg aggatcttct ggcgggggat ccgatattga actcacacag 420

tctcccgcta tcatgtctgc ttctcccggc gagaaagtga ctatgacttg ctctgcttcc 480

tcttctgtgt cctacatgca ctggtaccag cagaaatctg gcacatcccc taaacggtgg 540

atctacgata ctagcaaact ggcatccggc gtgcctgggc gattctctgg ctctggctct 600

ggcaactctt actctctcac aatctcatct gtcgaggctg aggacgatgc cacatactac 660

tgtcagcagt ggtctaaaca cccactcaca ttcggcgctg gcactaaact ggaaataaaa 720

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由人GM-CSF信号肽、抗间皮素单链抗体(SS1scFv)、人CD8α铰链区、人CD40的跨膜区和胞内信号区串联构成，称为mesoCAR。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

3.编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

4.表达载体，其含有并且能表达氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的嵌合抗原受体的编码基因。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒表达载体pCDH-mesoCAR。

6.一种工程化的树突状细胞，其含有权利要求4所述的表达载体。

7.权利要求6所述的工程化的DC细胞在制备用于治疗癌症的制剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其中，所述癌症是间皮素阳性的间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、胃癌、鳞状细胞癌、前列腺癌、肺癌、胆管癌和乳腺癌；优选胰腺癌。

9.制备表达嵌合抗原受体的树突状细胞的方法，其特征在于将所述嵌合抗原受体的表达载体转染进树突状细胞。

10.权利要求9所述的方法，其中所述嵌合抗原受体为权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。

11.权利要求10所述的方法，其中所述表达载体为权利要求4或5所述的表达载体。