CN110746505B

CN110746505B - 特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN110746505B
Application number: CN201810813665.2A
Authority: CN
Inventors: 金华君; 江芏青; 王超; 黄晨; 刘祥箴; 何江川; 何周; 崔连振; 钱其军
Original assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Current assignee: Shanghai Cell Therapy Research Institute; Shanghai Cell Therapy Group Co Ltd
Priority date: 2018-07-23
Filing date: 2018-07-23
Publication date: 2023-04-14
Anticipated expiration: 2038-07-23
Also published as: CN110746505A

Abstract

本发明涉及特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体。本发明的单克隆抗体含有文中所述的CDR序列，重链可变区在对应于SEQ ID NO:1第60‑70位的氨基酸位置上存在一个或数个取代突变，且该单克隆抗体与间皮素抗原的亲和力与SEQ ID NO:1第23‑272位所示的单链抗体的亲和力相比降低。优选的是，该单克隆抗体是单链抗体。表达含有本发明单链抗体的CAR的免疫效应细胞能有效杀伤间皮素阳性肿瘤细胞、同时毒副作用又较小。

Description

特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗领域，尤其涉及特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体。

背景技术

针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是免疫治疗方法中的一个重要分支。嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragmentvariable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)s在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。CAR疗法在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。

间皮素是一种通过磷脂酰肌醇区(GPI)锚定在细胞质膜上的糖蛋白，高表达于多种肿瘤组织中间皮素基因编码一种69kDa的前体蛋白，经加工形成一个40kDa的膜结合蛋白和一个31kDa称之为巨核细胞促进因子(MPF)的脱落片断并释放出细胞外，我们通常所说的间皮素指的是锚定在膜上的片段，根据其蛋白结构可以分为Region I、II、III三个区域。它一方面可以通过其GPI结构域激活NF域激、MAPK和PI3K细胞内信号通路，促进细胞增殖，抵抗细胞凋亡；另一方面与其受体CA125/MUC16相互作用导致异常的细胞粘附，促进癌细胞转移。由于间皮素在多种恶性肿瘤(间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌、胃癌、胆管癌等)中过表达，因此是一个很有潜力的肿瘤特异性治疗靶点。

但是间皮素仍然少量表达于正常胸膜、心包和腹膜的间皮细胞中，Pastan等人所开发的鼠抗人抗体K1与腹膜、胸膜和细胞膜空腔内里的细胞显示出较强的免疫反应，虽然这些反应的水平与和恶性肿瘤组织产生的通常反应相比较弱(Chang K,et al.,CancerRes.1992；52(1):181-186)。在输卵管上皮、气管基底上皮与扁桃体上皮中也发现K1抗体有弱活性(Jirsova K,et al.Experimental eye research.2010；91(5):623-629)。与此相一致地是，在前期临床研究中，本发明人发现与靶点亲和力较强的靶向间皮素的CAR-T细胞会引起部分受试患者的肺部表面炎症，而肺部的炎症如果不能得到及时有效的控制往往会危及生命。为了克服嵌合抗原受体“中靶脱瘤”(on-target/off-tumor)效应，目前广泛采用的一种方法是设计靶向两种肿瘤抗原的CAR，将共刺激结构域与激活结构域分别与两个肿瘤抗原结合域相连，只有当靶细胞表面两种肿瘤抗原同时存在时，才有可能完全激活下游的信号通路。然而肿瘤本身具有异质性，实际在表面同时存在两种所选抗原的肿瘤细胞数量往往相对较少，这样会导致两种CAR修饰的免疫效应细胞对肿瘤的杀伤效果受到局限。

因此，目前亟需一种能够有效杀伤间皮素阳性肿瘤细胞、同时毒副作用又较小的靶向间皮素的CAR修饰的免疫效应细胞。

发明内容

本发明提供一种特异性结合间皮素的单克隆抗体，该单克隆抗体与间皮素抗原的亲和力与SEQ ID NO:1第23-272位所示的单链抗体的亲和力相比降低，其轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO:1第188-193位氨基酸序列，轻链可变区LCDR2包含SEQ ID NO:1第211-213位氨基酸序列，轻链可变区LCDR3包含SEQ ID NO:1第250-262位氨基酸序列；重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO:1第49-56位氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO:1第74-81位氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO:1第121-135位氨基酸序列；并且该重链可变区在对应于SEQ ID NO:1第57-73位的氨基酸位置上存在一个或数个取代突变。

在一个或多个实施方案中，该单克隆抗体特异性结合间皮素结构域III。

在一个或多个实施方案中，所述取代突变发生在对应于SEQ ID NO:1第68位和/或第70位的氨基酸残基上。

在一个或多个实施方案中，所述取代突变为对应于SEQ ID NO:1第68位上的的疏水性氨基酸L突变为碱性氨基酸。

在一个或多个实施方案中，所述碱性氨基酸选自：赖氨酸、组氨酸和精氨酸，优选选自精氨酸。

在一个或多个实施方案中，对应于SEQ ID NO:1第70位上的取代突变为疏水性氨基酸色氨酸(W)突变为亲水性氨基酸。

在一个或多个实施方案中，所述亲水性氨基酸选自：甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)，优选为甘氨酸。

在一个或多个实施方案中，所述单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:4或5第162-272位氨基酸序列所示；和/或，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:4或5第23-146位氨基酸序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述单克隆抗体为单链抗体。

在一个或多个实施方案中，所述单链抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:4或5第162-272位氨基酸序列所示；和/或，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:4或5第23-146位氨基酸序列所示。

在一个或多个实施方案中，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区由含有G和S的接头连接，优选的接头为(GGGGS)_n，其中n为1-10的整数；更优选地，n＝3。

在一个或多个实施方案中，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或5第23-272位所示。

本发明还包括本发明所述单克隆抗体的编码序列及其互补序列。

在某些实施方案中，所述编码序列如SEQ ID NO:9第79-828位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:10第79-828位碱基序列所示。

本发明还提供一种嵌合抗原受体(CAR)，从N端到C端依次含有任选的信号肽序列、本发明特异性结合间皮素的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域。

在一个或多个实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；优选地为CD8信号肽；优选地，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；优选为IgG4 CH2CH3铰链区；优选地，所述IgG4 CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区；优选为CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述胞内共刺激信号域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域；优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第529-569位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域，优选地所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第570-681位氨基酸残基所示。

在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或5所示。

本发明还包括本发明嵌合抗原受体的编码序列及其互补序列。

在某些实施方案中，所述编码序列如SEQ ID NO:9或10所示。

本发明还包括核酸构建体，该核酸构建体含有本文所述的单克隆抗体的编码序列或本文所述的嵌合抗原受体的编码序列。

在某些实施方案中，所述核酸构建体为克隆载体或表达载体。

本发明还包括一种宿主细胞，所述宿主细胞包含前述核酸构建体。

本发明还包括一种免疫效应细胞，所述免疫效应细胞表达本文所述的单链抗体或含该单链抗体的嵌合抗原受体，和/或含有本文所述单链抗体的编码序列或本文所述的嵌合抗原受体的编码序列，和/或含有本文所述的核酸构建体。

在一个或多个实施方案中，所述核酸构建体为克隆载体或表达载体，优选地为表达载体。

在一个或多个实施方案中，所述免疫效应细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞；优选地，所述免疫效应细胞为NK细胞或T细胞；更优选地，所述免疫效应细胞为T细胞。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物含有本文所述的单克隆抗体、嵌合抗原受体、所述单克隆抗体的编码序列、所述嵌合抗原受体的编码序列、本文所述的核酸构建体、本文所述的宿主细胞和本文所述的免疫效应细胞中的一种或多种。

本发明还提供前述单克隆抗体、编码所述单克隆抗体的核酸、前述嵌合抗原受体、前述编码所述签合抗原受体的核酸、前述核酸构建体、前述宿主细胞核前述免疫效应细胞中的一种或多种在制备间皮素高表达的癌症的药物中的应用。

在某些实施方案中，所述间皮素高表达的癌症选自：间皮瘤、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。

附图说明

图1：本发明CAR的结构模式图。

图2A-2E：分别显示Meso3-CAR-T细胞、Meso3-60F-CAR-T细胞、Meso3-67E-CAR-T细胞、Meso3-68R-CAR-T细胞和Meso3-70G-CAR-T细胞的阳性率和与间皮素抗原的亲和力检测。

图3A-3B：靶向间皮素结构域III的5种CAR-T细胞在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比。

图4A-4B：靶向间皮素结构域III的5种CAR-T细胞的杀伤功能比较。

图5：meso368R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞的PD-1表达表型检测。

图6A-6D：记忆T细胞表型检测。图6A：Mock-T细胞的记忆T细胞比例流式细胞分析结果；图6B：Meso3-CAR-T细胞的记忆T细胞比例流式细胞分析结果；图6C：Meso3-68R-CAR-T细胞的记忆T细胞比例流式细胞分析结果；图6D：Meso3-70G-CAR-T细胞的记忆T细胞比例流式细胞分析结果。

图7A：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞抑制体内skov3-luc细胞肿瘤体积的检测。

图7B：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞抑制体内skov3-luc细胞肿瘤荧光通量的检测。

图8：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞对间皮素低表达的Calu-6细胞的杀伤作用检测。

具体实施方式

下面对本发明涉及的部分术语进行定义。

除非另有注释，本申请依照常规用法使用技术术语。分子生物学中的常用术语的定义可以在Benjamin Lewin,Genes X,published by Jones&Bartlett Publishers,2009；和Meyers et al.(eds.),The Encyclopedia of Cell Biology and MolecularMedicine,published by Wiley-VCH in 16volumes,2008和其它类似参考文献中找到。

在本文中，术语“抗原”表示在引入体内时，被免疫系统识别的任何物质。例如蛋白质或细胞跨膜蛋白的胞外结构域。

术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即，含特异性结合抗原(与抗原免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”、“特异性靶向”或“与抗原免疫反应”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其它多肽反应。

术语“单克隆抗体”包括但不限于由B淋巴细胞的单个克隆或由其中已转染单一抗体的轻链和/或重链基因的细胞产生的抗体(例如通过骨髓瘤细胞核免疫脾细胞的融合体制备形成的杂交瘤细胞分泌的抗体)、嵌合抗体、dAb(结构域抗体)、单链抗体、Fab、Fab’和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。可采用本领域周知的方法制备得到单克隆抗体。

“单链抗体”(scFv)是指由抗体轻链可变区(VL区)氨基酸序列和重链可变区(VH区)氨基酸序列经铰链连接而成，具有结合抗原能力的抗体片段。在某些实施方案中，感兴趣单链抗体(scFv)来自感兴趣的抗体。感兴趣的抗体可以是人抗体，包括人鼠嵌合抗体和人源化抗体。抗体可以是分泌型或膜锚定型。

“多核苷酸”表示具有含氮杂环碱基的核苷或核苷类似物的聚合物，其中核苷经由主链结构共价连接以形成多核苷酸。常规的RNA、DNA、以及RNA和DNA的类似物都包括在该术语中。核酸骨架可以包括多种已知的键，包括一个或多个糖-磷酸二酯键、肽-核酸键、硫代磷酸酯键、甲基磷酸酯键或已知键的组合。核酸的糖部分可以是核糖或脱氧核糖，或具有已知取代(例如2'甲氧基和/或2'卤化物取代)的类似化合物。含氮碱基可以是常规的碱基(A、G、C、T、U)、已知碱基类似物(例如肌苷；参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36(核酸的生物化学5-36)，Adams(亚当斯)等人编辑，第11版，1992)或嘌呤或嘧啶碱基的已知衍生物。核酸可以包括如在RNA和DNA中发现的常规的糖、碱基和键，或者可以包括常规的组合和取代(例如经由甲氧基骨架连接的常规碱基，或包括常规碱基和一种或多种类似物的核酸)。

术语“编码序列”在文中定义为核酸序列中直接确定其蛋白产物(例如CAR，单克隆抗体，铰链区和跨膜区)的氨基酸序列的部分。编码序列的边界通常是由紧邻mRNA 5’端开放读码框上游的核糖体结合位点(对于原核细胞)和紧邻mRNA 3’端开放读码框下游的转录终止序列确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组核酸序列。

术语“突变”是指在起始氨基酸或核酸序列中进行的改变。该术语旨在涵盖取代、插入和缺失。

术语“载体”是指用于将一个或多个核酸或一个或多个多核苷酸引入或转移到靶细胞或组织中的核酸构建体或多核苷酸构建体。典型地，载体用于将外源DNA引入另一个细胞或组织中。载体通常包含作为转基因的DNA序列、以及用作载体“骨架”的较大的多核苷酸序列。典型地，载体用于将遗传信息(例如插入的转基因)转移到靶细胞或组织，以致于在该靶细胞或组织中分离、增殖或表达插入片段。载体包括质粒、克隆载体、噬菌体、病毒(例如病毒载体)、粘粒、表达载体、穿梭载体、载体盒(cassettes)等。典型地，载体包括复制起点、多克隆位点和可选择标记。

术语“核酸构建体”是可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段。典型地，核酸构建体包含已被亚克隆进载体中的编码目的蛋白质的核苷酸序列的DNA插入。载体可以包含用于在细菌中生长的细菌抗性基因和用于在生物体中表达目的蛋白质的启动子。DNA可以通过PCR或任何其他本领域技术人员已知的一种或多种合适的技术在体外产生。在一些实施例中，DNA构建体包含目的核酸序列。在一些实施例中，序列有效地连接到另外的元件，例如控制元件(例如启动子等)。DNA构建体可以进一步包含可选择标记，并且可以进一步包含在同源盒侧翼的进入序列。构建体可以包含添加到末端的其他非同源序列(例如填充序列或侧翼序列)。在一些实施例中，序列的末端是封闭的这样使得DNA构建体形成闭合的环。使用本领域熟知的技术掺入DNA构建体中的目的核酸序列可以是野生型、突变型或经修饰的核酸。在一些实施例中，DNA构建体包含一个或多个与宿主细胞染色体同源的核酸序列。在其他实施例中，DNA构建体包含一个或多个非同源核苷酸序列。一旦在体外装配了DNA构建体，则可将其用于例如：1)将异源序列插入宿主细胞的所希望的靶序列中；和/或2)诱变宿主细胞染色体的区域(即用异源序列置换内源序列)；3)使靶基因缺失；和/或4)将复制质粒引入宿主中。

术语“高表达”是指根据本领域技术人员常规的认识即可以作出判断，抗原在某种肿瘤细胞中的表达水平与其在正常细胞中的表达水平相比明显较高的表达状态。

术语“亲和力”是指抗体对抗原的结合强弱的程度，在一个实施方案种是通过抗原/抗体的解离速率测量的。

术语“特异性”是指特定抗原结合分子或抗原结合蛋白(本发明中即为单克隆抗体)可结合的不同类型抗原或表位的数目。可基于抗原结合蛋白的亲和力和/或亲合力确定其特异性。由抗原与抗原结合蛋白的解离平衡常数(KD)所表示的亲和力，是表位与抗原结合蛋白上抗原结合位点之间结合强度的量度：KD值越小，表位与抗原结合蛋白之间的结合强度越强(或者，亲和力也可表示为缔合常数(KA)，其为1/KD)。如本领域技术人员将了解，取决于具体感兴趣的抗原，可以以已知方式测定亲和力。亲合力为抗原结合蛋白(例如免疫球蛋白、抗体、免疫球蛋白单一可变结构域或含有其的多肽)与相关抗原之间结合强度的量度。亲合力与以下两者有关：与其抗原结合蛋白上的抗原结合位点之间的亲和力，以及存在于抗原结合蛋白上的相关结合位点的数目。“特异性结合”抗原(例如本发明中为间皮素，尤其是其结构域III)的抗体是以高亲和力结合所述抗原并且不显著结合其他不想管抗原的抗体。

术语“接头”或铰链是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。示例性的接头包括含有G和/或S的接头，如(GGGGS)n，其中，n为1-10的整数；以及例如Furin 2A肽。

术语“嵌合抗原受体”(CAR)是人工改造受体，能够将识别肿瘤细胞表面抗原的特异性分子(如抗体)锚定在免疫细胞(如T细胞)上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。CAR通常依次包含任选的信号肽、结合肿瘤细胞膜抗原的多肽如单链抗体、铰链区、跨膜区和胞内信号区。通常，结合肿瘤细胞膜抗原的多肽能够以中等亲和力结合肿瘤细胞广泛表达的膜抗原。结合肿瘤细胞膜抗原的多肽可以是天然多肽或人工合成多肽；优选地，人工合成多肽为单链抗体或Fab片段。

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明的部分目的是提供一种特异性靶向间皮素的单克隆抗体，以解决与靶点亲和力较强的靶向间皮素的CAR-T细胞会引起部分受试患者的肺部表面炎症问题。本发明提供的单克隆抗体与间皮素抗原的亲和力与SEQ ID NO:1第23-272位所示的单链抗体的亲和力相比降低，其轻链可变区的LCDR1包含SEQ ID NO:1第188-193位氨基酸序列，LCDR2包含SEQ ID NO:1第211-213位氨基酸序列，LCDR3包含SEQ ID NO:1第250-262位氨基酸序列；重链可变区的HCDR1包含SEQ ID NO:1第49-56位氨基酸序列、HCDR2包含SEQ ID NO:1第74-81位氨基酸序列和HCDR3包含SEQ ID NO:1第121-135位氨基酸序列；并且该重链可变区在对应于SEQ ID NO:1第57-73位的氨基酸位置上存在一个或数个取代突变。优选的是，该单克隆抗体特异性靶向间皮素结构域III。在某些实施方案中，在对应于SEQ ID NO:1第60-70位的氨基酸位置上存在一个或数个取代突变，更优选在对应于SEQ ID NO:1第65-70位的氨基酸位置上存在一个或数个取代突变。应理解的是，本文中，取代突变的数量可以是1个、2个、3个或更多个，通常不超过10个，例如不超过8个或不超过5个，更通常为1个。

优选的是，该单克隆抗体在对应于SEQ ID NO:1第68位和/或第70位的位置上存在取代突变。在某些实施方案中，第68位上的取代突变为疏水性氨基酸L突变为碱性氨基酸，包括但不限于赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)，优选精氨酸。在某些实施方案中，第70位上的取代突变为疏水性氨基酸色氨酸W突变为亲水性氨基酸，包括但不限于甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)，优选甘氨酸。

因此，在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:4或5第162-272位氨基酸序列所示；和/或，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:4或5第23-146位氨基酸序列所示。例如，本发明的单克隆抗体的轻链可变区如SEQ ID NO:4第162-272位氨基酸序列所示，重链可变区如SEQ ID NO:4第23-146位氨基酸序列所示；或者，其轻链可变区如SEQ ID NO:5第162-272位氨基酸序列所示，重链可变区如SEQ ID NO:5第23-146位氨基酸序列所示。

在优选的实施方案中，本发明的单克隆抗体为单链抗体。所述的单链抗体的轻链可变区可如SEQ ID NO:4或5第162-272位氨基酸序列所示；和/或，所述单克隆抗体的重链可变区如SEQ ID NO:4或5第23-146位氨基酸序列所示。所述的单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间通常具有接头序列，如含G和S的接头序列。在某些实施方案中，所述的接头序列为(GGGGS)n，其中n为1-10的整数，如n为3。

本发明还包括本文所述单克隆抗体的编码序列及其互补序列。在优选的实施方案中，所述的编码序列为单链抗体的编码序列，可如SEQ ID NO:9第79-828位碱基序列所示，或如SEQ ID NO:10第79-828位碱基序列所示。

本发明的嵌合抗原受体(CAR)含有本文所述的单链抗体和CAR通常所含有的其它的功能域，如任选的信号肽、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域。在某些实施方案中，本发明的CAR从N端到C端依次含有任选的信号肽序列、本发明特异性结合间皮素的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域。

信号肽是引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短肽链(长度5-30个氨基酸)，常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移(定位)的N-末端的氨基酸序列(有时不一定在N端)，它负责把蛋白质引导到细胞含不同膜结构的亚细胞器内。本领域周知的信号肽、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域均可用于本发明。例如，信号肽可以为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；优选地为CD8信号肽。在某些实施方案中，本发明使用CD8信号肽，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示。

铰链区指免疫球蛋白重链CH1和CH2功能区之间的区域，该区富含脯氨酸，不形成α螺旋，易发生伸展及一定程度扭曲，有利于抗体的抗原结合部位与抗原表位间的互补性结合。铰链区可选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；优选为IgG4 CH2CH3铰链区。在某些实施方案中，本发明使用IgG4 CH2CH3铰链区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示。

跨膜区可选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区；优选为CD8跨膜区。在某些实施方案中，本发明使用CD8跨膜区，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528位氨基酸残基所示。

胞内共刺激信号域可选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；优选地，所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域。在某些实施方案中，本发明使用CD28的胞内结构域，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第529-569位氨基酸残基所示。

胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或FcεRIγ胞内信号域；优选为CD3ζ胞内信号域。在某些实施方案中，本发明使用CD3ζ胞内信号域，优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:1第570-681位氨基酸残基所示。

形成本文嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗meso单链抗体的轻链可变区和重链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域以及免疫受体酪氨酸活化基序等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。接头的长度可以是3-25个氨基酸残基，例如3-15、5-15、10-20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2-20个，例如2-15、2-10、2-8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。

应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本文的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。

在优选的实施方案中，本发明嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或5所示。

本发明还包括多核苷酸序列，如本发明所述的单克隆抗体和所述的嵌合抗原受体的编码序列及其互补序列。本文的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。

本文所述的多核苷酸序列通常可以用PCR扩增法获得。具体而言，可根据本文所公开的核苷酸序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。例如，在某些实施方案中，编码本文所述嵌合抗原受体的多核苷酸序列如SEQ ID NO:9或10所示。

本文还包括核酸构建体，其含有本文所述的单克隆抗体(尤其是单链抗体)的编码序列或其互补序列，或含有编码本文所述嵌合抗原受体的编码序列或其互补序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。

调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。

调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本文。

在某些实施方案中，所述核酸构建体是载体。具体而言，可将本文单克隆抗体或CAR的编码序列克隆入许多类型的载体，例如这些类型的载体包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。载体可以是表达载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。

通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记。例如，在某些实施方案中，本发明使用逆转录病毒载体，该逆转录病毒载体含有复制起始位点，3’LTR，5’LTR，本文所述CAR的编码序列，以及任选的可选择的标记。

合适的启动子包括但不限于即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在某些实施方案中，可使用CN201510021408.1所公布的各种启动子序列，包括但不限于该申请SEQID NO:1所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的CCEF启动子；SEQ ID NO:2所示的含CD3e增强子和EF1α启动子的TEF启动子；SEQ ID NO:3所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和EF1α启动子的TCEF启动子；SEQ ID NO:4所示的含mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的CCEFI启动子；SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子和含内含子的EF1α启动子的TEFI启动子；以及SEQ ID NO:5所示的含CD3e增强子、mCMV增强子、hCMV增强子和含内含子的EF1α启动子的TCEFI启动子。本文将该申请的全部内容以引用的方式纳入本文。

可选择的标记包括可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从被病毒载体感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。有用的可选择标记基因包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白基因的基因。

在某些实施方案中，本文的表达载体真核表达载体，具体是转座子载体。在某些实施方案中，该转座子载体是含有选自piggybac、sleeping beauty、frog prince、Tn5或Ty的转座元件的真核表达载体。这类转座子载体含有相应转座子的5’反向末端重复序列(5’ITR)和相应转座子的3’反向末端重复序列(3’ITR)。例如，在某些实施方案中，本文的核酸构建体或表达载体从5’到3’依次含有转座子5’反向末端重复序列(5’ITR)、信号肽编码序列、本发明单链抗体的编码序列、铰链区编码序列、跨膜区编码序列、胞内共刺激信号域的编码序列、胞内信号域的编码序列以及转座子3’反向末端重复序列(3’ITR)。所述转座子载体还可含有转座酶编码序列和控制转座酶编码序列表达的启动子。在某些实施方案中，所述真核表达载体是pNB328载体，其记载于CN 201510638974.7中，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。

可采用常规的方法将本文的载体导入宿主细胞中，这些方法包括显微注射法、基因枪法、电穿孔法、病毒介导的转化法、电子轰击法、磷酸钙沉淀法等。在某些实施方案中，本文采用电穿孔法将本文的核酸构建体导入宿主细胞中。具体地，将重组的质粒经电转仪高压电的作用转到感兴趣的宿主细胞中。

适用于本文的宿主细胞可以是本领域周知的哺乳动物细胞，优选是T细胞，包括各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，T细胞为原代培养T细胞。

因此，本文也包括一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有本文所述的单克隆抗体(尤其是单链抗体)或嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建体。在某些实施方案中，本文所述的重组宿主细胞表达本文所述的嵌合抗原受体，和/或含有本文所述的嵌合抗原受体的编码序列或本文所述的核酸构建体。该重组宿主细胞可以是前文所述的转入了本文所述载体的宿主细胞。优选地，该宿主是表达本文任一实施方案所述的单克隆抗体(尤其是单链抗体)或含有该单链抗体的嵌合抗原受体的免疫效应细胞，尤其是T细胞。

具体而言，本发明的免疫效应细胞为表达本发明特别设计的CAR的T细胞，该特别设计的CAR中含有特异性结合间皮素结构域III的单链抗体，该单链抗体衍生自SEQ ID NO:1第23-272所示的序列，且与SEQ ID NO:1第23-272位所示的单链抗体相比，其与间皮素抗原的亲和力降低。在某些实施方案中，所述间皮素结构域III的编码序列如SEQ ID NO:11所示。优选的是，该单链抗体在对应于SEQ ID NO:1第23-272位所示的单链抗体中的第57-73位的位置上存在一个或数个(例如2个、3个或更多个)取代突变，优选是在对应于SEQ IDNO:1第68位和/或70位上存在取代突变。第68位上的取代突变可为疏水性氨基酸L突变为碱性氨基酸，包括但不限于赖氨酸(K)、组氨酸(H)和精氨酸(R)，优选精氨酸。在某些实施方案中，第70位上的取代突变可为疏水性氨基酸色氨酸W突变为亲水性氨基酸，包括但不限于甘氨酸(G)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和半胱氨酸(C)，优选甘氨酸。在特别优选的实施方案中，本发明的CAR中的单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:4或5第23-272位氨基酸残基所示。本发明的免疫效应细胞是一种既能够有效杀伤间皮素阳性肿瘤细胞、同时毒副作用又较小的靶向间皮素的CAR修饰的免疫效应细胞。

本文还包括前文提及的各种氨基酸序列、核酸序列、重组宿主细胞等的用途，这些用途尤其包括在制备治疗间皮素高表达的癌症的药物中的应用。适用于本文所述单克隆抗体(尤其是单链抗体)、CAR或其表达细胞进行治疗或预防的癌症优选间皮素阳性癌症，具体包括癌细胞表面异常表达间皮素的癌症。具体而言，这类癌症可选自：间皮瘤、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。在某些实施方案中，本文所述的含有针对间皮素结构域III单链抗体的CAR或其表达细胞，对同时高表达CA125/MUC16的癌症，如卵巢癌，具有优异的杀伤效果，因此，本文的这类CAR或其表达细胞可特别用于治疗或预防同时高表达间皮素和CA125/MUC16的癌症。

本文还提供一种试剂盒，所述试剂盒含有本文所述的表达载体。试剂盒还可含有适用于将所述表达载体转入细胞中的试剂，以及任选的指导本领域技术人员将所述重组表达载体转入细胞的说明书。

本文还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有本文所述的嵌合抗原受体和/或重组宿主细胞，和药学上可接受的辅料。本文中，“药学上可接受的辅料”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的载体和/或赋形剂，其是本领域公知的(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19thed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)，并且包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂。例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液；表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂，例如Tween-80；离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。

治疗或预防癌症的方法也包括在本文的范围之内，所述方法包括将本文所述的重组宿主细胞和/或药物组合物给予有需要的个体的步骤。给予的方法可以是细胞治疗中常用的方法。给予的剂量可根据病患性别、年龄、所患疾病、身体状况等因素加以考虑。

本发明所取得的技术上的优势在于，本发明提供的特异性结合间皮素的、含有突变的单克隆抗体能够适当降低与间皮素抗原之间的亲和力，减少了因抗体与抗原亲和力过高所带来的副作用；本发明提供的表达含有所述突变的靶向间皮素的嵌合抗原受体的免疫效应细胞，如CAR-T细胞，在细胞因子的分泌水平、对肿瘤细胞的体外和体内杀伤力仍保持了有效的水平，但显著地降低了对间皮素抗原低表达细胞的攻击，极大地降低了目前针对间皮素的免疫细胞治疗中存在比较严重的中靶脱瘤(on-target/off-tumor)所产生的副作用，如对胸膜、腹膜或肺部正常组织的攻击，为针对间皮素靶点进行的免疫细胞疗法提供了一种新的选择。下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得的常规产品。

本发明中所用到的部分仪器与试剂的来源如下：

电转仪：Lonza2b-Nucleofactor购自Lonza公司；

抗CD28抗体：购自Sigma Aldrich，货号：SAB1405583；

Skov3细胞系：购自ATCC；

HGC-27细胞系：购自中科院典型培养物保藏委员会细胞库，目录号：TCHu 22；

慢病毒包装试剂盒ViraPower^TM HiPerform^TM Lentiviral FastTiter^TM TOPO^TMExpression Kit with 293FT cell-line购自ThermoFisher；

One

Stbl3^TM感受态菌株：购自ThermoFisher，货号：C737303。

间皮素结构域III(Meso3)抗原按以下方法制备：

人工合成编码N端带有信号肽的间皮素结构域III抗原(Meso3)的序列(如SEQ IDNO:11所示)，5’端与3’端分别连接EcoRI与XbaI的酶切位点接头后，连接到pCDNA3.4载体上，构建得到过表达GPC3蛋白的表达载体。根据ExpiCHO^TM表达系统说明书，使用ExpiCHO^TM表达系统对上述融合蛋白进行过表达后，使用GE Healthcare的MabSelect亲和层析树脂按说明书操作步骤对表达产物进行纯化，获得纯化的Meso3抗原。

Skov3-luc细胞系按以下方法构建：

从吉凯基因购买表达荧光素酶基因的慢病毒颗粒，货号LVCON101；卵巢癌细胞系skov3购自美国ATCC。按以下步骤用表达荧光素酶的慢病毒转导skov3细胞并筛选稳定转染细胞系：

第一步：skov3细胞准备，用含10％FBS的DMEM培养液制备1×10⁵/ml的skov3细胞悬液，取3ml加到6孔板中的一个孔中，37℃，CO₂培养箱8-12h，待细胞完全贴壁。

第二步：感染前准备，从冰箱取出病毒，冰上融化，将病毒用无FBS的DMEM稀释100倍。

第三步：感染操作，将6孔板中的细胞用移液枪吸掉上清，后用生理盐水洗2-3遍，根据细胞MOI及病毒滴度，将人相应的病毒量，计算公式：病毒体积＝(MOI×细胞数目)/病毒滴度。从吉凯公司购买的试剂盒中说明书得知病毒滴度为5×10⁸TU/ml，稀释100倍后病毒滴度为5×10⁶TU/ml，用30MOI值感染细胞，取1.8ml病毒稀释液加到洗涤好的板中，感染8-12h后补加含10％FBS的DMEM继续培养24h。

第四步：细胞培养和传代，中途可以对细胞进行补液，保持细胞活性。

第五步：感染效果确认，感染后72h，取少量细胞加到96孔板中的一个孔中，同时加入20微升荧光素加盐稀释液，通过小动物活体成像仪观测荧光情况。

第六步：用嘌呤霉素筛选阳性细胞株，将细胞传代至小瓶，用10微克/毫升的浓度筛选，每次细胞传代过程中要保持嘌呤霉素的浓度为10微克/毫升，细胞传过3-4代后，停止嘌呤霉素筛选。

第七步：将嘌呤霉素筛选过的细胞进行扩增，即获得稳定转染表达荧光素酶的skov-luc细胞系，到取一定的量细胞冻存到液氮中待用保存。

HGC-27-PDL1-Nluc细胞系按以下方法构建：

委托上海杰瑞人工合成PDL1-L1-P2A-Nluc-IRES-PuroR融合蛋白的编码序列(如SEQ ID NO:12所示)，按慢病毒包装试剂盒ViraPower^TM HiPerform^TM LentiviralFastTiter^TM TOPO^TM Expression Kit with 293FT cell-line的说明书构建慢病毒表达载体，以PNP-F：ATGAGGATCTTTGCTGTC(SEQ ID NO:13)和PNP-R：TTATCAGGCACCGGGCTTG(SEQ IDNO:14)为引物，以上述SEQ ID NO:12的序列为模板进行PCR扩增，回收片段并TA克隆至上述试剂盒中的慢病毒表达载体

得pLenti7.3/V5-PD-L1-P2A-NLuc-IRES-PuroR，转化感受态One

Stbl3^TM，含100μg/ml的LB培养，抽提质粒。

病毒包装和浓缩：病毒包装细胞293TF培养于含10％FBS的DMEM培养基中，每10cm培养皿铺6×10⁶细胞，过夜，以

2000共转染质粒ViraPower^TM PackagingMix 9μg、pLenti7.3/V5-PD-L1-P2A-NLuc-IRES-PuroR 3μg，分别于24h和48h收集培养液上清，经0.45μm滤器过滤，每30ml加入25％的PEG8000/4.4％NaCl 7.5ml，4℃振荡过夜，4000g，4℃离心20min，弃上清，PBS 500μl重悬沉淀，-80℃冻存。

慢病毒转导和HGC-27-PDL1-Nluc细胞系的筛选：

第一步：HGC-27细胞准备，用含20％FBS的RPMI-1640培养液制备1×10⁵/ml的HGC-27细胞悬液，取1ml加到24孔板中的一个孔中，37℃，CO₂培养箱8-12h，待细胞完全贴壁。

第二步：感染前准备，从冰箱取出病毒，冰上融化待用。

第三步：感染操作，将24孔板中的细胞用移液枪吸掉上清，后用生理盐水洗2-3遍，每孔加入100μl病毒，polybrene 1μg/ml，24h后换液，加入含20％FBS的RPMI-1640培养液，加入嘌呤霉素开始筛选阳性细胞株；

第四步：用嘌呤霉素筛选阳性细胞株，将细胞传代至小瓶，用5微克/毫升的浓度筛选，每次细胞传代过程中要保持嘌呤霉素的浓度为5微克/毫升，细胞传过2-4代后，停止嘌呤霉素筛选。

第七步：将嘌呤霉素筛选过的细胞进行扩增，即获得稳定转染表达荧光素酶和PD-L1的HGC-27-PDL1-Nluc细胞系，取一定的量细胞冻存到液氮中待用保存。

实施例1：表达靶向间皮素CAR及其突变体的重组质粒的构建

分别委托上海杰瑞人工合成meso3-CAR的编码序列(序列如SEQ ID NO:6所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)、meso3-CAR第60位为60F的meso3-60F-CAR的编码序列(序列如SEQ ID NO:7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)、meso3-CAR第67位为67E的meso3-67E-CAR的编码序列(序列如SEQ ID NO:8所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)、meso3-CAR第68位为68R的meso3-68R-CAR的编码序列(序列如SEQ ID NO:9所示，氨基酸序列如SEQID NO:4所示)和meso3-CAR第70位为70G的meso3-70G-CAR的编码序列(序列如SEQ ID NO:10所示，氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示)。各CAR的结构模式如图1所示。

将各序列分别装入pNB328载体EcoRI和SalI酶切位点之间(pNB328的结构及序列参见CN 201510638974.7，本文将其全部内容以引用的方式纳入本文)，构建得到的重组质粒分别命名为pNB328-meso3-CAR、pNB328-meso3-60F-CAR、pNB328-meso3-67E-CAR、pNB328-meso3-68R-CAR和pNB328-meso3-70G-CAR。

图1未示出启动子序列和polyA加尾信号序列，其分别位于5’LTR和信号肽序列之间以及3’LTR之前。

实施例2：靶向间皮素结构域III的CAR-T细胞的构建

1)利用Ficoll分离法从患者血液中分离获得外周血单核细胞(PBMCs)。将PBMC贴壁培养2-4h，其中未贴壁的悬浮细胞即为初始T细胞，将悬浮细胞收集到15ml离心管中，1200rmp离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤。

2)取五个1.5ml离心管，编号a、b、c、d和e，每管加入5×10⁶个步骤1)获得的初始T细胞，1200rpm离心3min，弃上清，加入生理盐水，1200rmp离心3min，弃生理盐水，并重复此步骤；

3)用含有5μg/ml的间皮素结构域III抗原和5μg/ml的抗CD28抗体的包被液包被六孔板室温2-4小时，吸去包被液后用生理盐水洗涤孔板1-3次，加入含2％FBSAIM-V培养基待用；

4)a、b、c、d和e五个离心管按比例加入Lonza电转试剂，每管共100μl，向a、b、c、d、e各管分别加入pNB328-meso3-CAR、pNB328-meso3-60F-CAR、pNB328-meso3-67E-CAR、pNB328-meso3-68R-CAR和pNB328-meso3-70G-CAR五种质粒，每种4μg，混合，将混合液转移至电转杯中，放入电转仪，按说明书选取所需程序进行电击；

5)使用试剂盒中的微量吸管将a、b、c、d、e管中电转好的细胞悬液转移到加好培液的经Meso3抗原和抗CD28抗体包被好的六孔板中(含2％FBS的AIM-V培液)，混匀，置于37℃，5％CO₂培养箱培养，六小时后加入刺激因子IL-2至终浓度0.25-0.6IU，37℃，5％CO₂培养3～4天，观察T细胞的生长情况，获得表达靶向间皮素结构域III的meso3-CAR-T细胞、meso3-60F-CAR-T细胞、meso3-67E-CAR-T细胞、meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞，其中meso3-CAR-T细胞为对照细胞。

实施例3：靶向间皮素结构域III的5种CAR-T细胞的阳性率检测

收集实施例2制得的meso3-CAR-T细胞、meso3-60F-CAR-T细胞、meso3-67E-CAR-T细胞、meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞，各分为两份，每份1×10⁶个细胞，生理盐水洗涤两遍，100μl生理盐水重悬细胞，一份加入1μg的间皮素-生物素，另一份不加，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，再次用100μl生理盐水重悬细胞，加入1μg的链霉素-PE抗体，4℃孵育30分钟。生理盐水洗涤两遍，上机检测，以只加二抗的为对照。

结果如图2A-2E所示。meso3-60F-CAR-T细胞的阳性率与对照细胞(meso3-CAR-T细胞)阳性率相近，没有明显区别，荧光强度水平也基本相当；meso3-67E-CAR-T细胞的阳性率同对照细胞相比有明显降低，但荧光强度水平与对照细胞相比仍基本相当；meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞的阳性率均高于对照细胞的阳性率，并且该两种细胞的荧光强度水平与对照细胞相比都有一个数量级的下降。以上结果说明meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞与对照细胞相比与间皮素抗原的亲和力有显著的下降，而meso3-60F-CAR-T细胞和meso3-67E-CAR-T细胞与对照细胞相比于间皮素抗原的亲和力相当。

实施例4：靶向间皮素结构域III的5种CAR-T细胞在间皮素抗原的特异性刺激下细胞因子释放对比

用2μg/ml的间皮素抗原包被96孔板，4℃包被过夜，PBS清洗3遍，分别加入1×10⁵个实施例2制得的meso3-CAR-T细胞、meso3-60F-CAR-T细胞、meso3-67E-CAR-T细胞、meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞，以及Mock-T细胞(即实施例1获得的未转质粒的细胞)，培养24h后收集细胞上清。用BD^TMCBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit II检测这6种T细胞受间皮素抗原刺激后细胞因子的分泌情况，具体步骤如下：

(1)混合人的IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ捕获磁珠，涡旋振荡混匀捕获磁珠，每管加入50ul混匀后的捕获磁珠；

(2)加入50l人的Th1/Th2细胞因子标准品(倍比稀释5000pg/ml、2500pg/ml、1250pg/ml、625pg/ml、312.5pg/ml、156pg/ml、80pg/ml、40pg/ml、20pg/ml、0pg/ml)和50l的待测样品(经稀释液2倍稀释)；

(3)每管加入50l的人的Th1/Th2-II-PE的检测抗体；

(4)室温避光孵育3h；

(5)每管加入1ml的洗涤缓冲液，200离心5min，弃上清；

(6)每管加入300ul的洗涤缓冲液重悬细胞，并转移至流式管中，用流式细胞仪检测荧光值。

结果如图3A-3B所示。与meso3-CAR-T细胞相比，meso3-68R-CAR-T细胞的IL-6、IL-10、TNF-α和IFN-γ四种细胞因子的分泌水平均明显降低；meso3-70G-CAR-T细胞的IL-6和TNF-α的分泌水平与meso3-CAR-T细胞相比明显降低，IL-10和IFN-γ两种细胞因子的分泌水平与对照细胞相比略有下降；而meso3-60F-CAR-T细胞的IL-6、TNF-α和IFN-γ三种细胞因子的分泌水平与meso3-CAR-T细胞大致相当，IL-10的分泌水平显著高于meso3-CAR-T细胞；meso3-67E-CAR-T细胞的TNF-α和IFN-γ这两种细胞因子的分泌水平与meso3-CAR-T细胞大致相当，IL-6与IL-10的分泌水平显著高于对照细胞。以上结果表明meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞在受到间皮素抗原刺激后与对照细胞相比，细胞因子的分泌水平有明显的总体下降。

实施例5：靶向间皮素结构域III的5种CAR-T细胞的肿瘤细胞杀伤功能比较

选取MHC class I分型匹配的效应细胞与靶细胞，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测实施例2制备得到的5种靶向CAR-T细胞的体外杀伤活性，具体步骤如下：

(1)调零：每孔加入50μl DMEM或1640培养液，放入仪器中，选择step 1，调零；

(2)靶细胞铺板：卵巢癌细胞SKOV-3(均购买于美国菌种保藏中心ATCC)和胃癌HGC-27-PDL1-Nluc细胞按每孔10⁴个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；

(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为1:1，以未转质粒的Mock T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。

结果如图4A-4B所示，前述5种细胞对HGC-27PDL1-Nluc细胞的杀伤力基本相同，对照细胞、meso3-60F-CAR-T细胞、meso3-67E-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞对SKOV3细胞的杀伤力基本一致，meso3-68R-CAR-T细胞的杀伤力低于前4种细胞，但与Mock T细胞相比仍然具有显著的杀伤效果。

基于以上实施例的结果，选择meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞进一步进行后续实验。

实施例6：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞的PD-1表达表型检测

取浓度为5μg/mL间皮素抗原包被孔板，Mock T细胞(未转染质粒的细胞)、meso3-CAR-T细胞、meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞按1×10⁶个细胞/孔加入到孔板中37℃、5％CO₂刺激培养48小时后计数，每种细胞以1×10⁶个细胞/管分别加入2个1.5ml的EP管中，一管为待测样品，另一管为流式细胞检测对照组，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清，待测样品管每管中加入检测抑制性T细胞表型的流式抗体anti-PD1-PE 2μl(购自Jackson ImmunoResearch公司)，对照组每管中加入同型对照流式抗体IgG1 Alexa Fluor647 2μl(购自Jackson ImmunoResearch公司)，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。

结果如图5所示，与meso3-CAR-T细胞相比，meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞中表达PD-1的细胞均明显减少，表明该两个含有点突变的CAR修饰的细胞中抑制性T细胞的比例明显减少。

实施例7：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞的记忆T细胞表型检测

取浓度为5μg/mL间皮素抗原包被孔板，Mock T细胞(未转染质粒的细胞)、meso3-CAR-T细胞、meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞按1×10⁶个细胞/孔加入到孔板中37℃、5％CO₂刺激培养48小时后计数，每种以1×10⁶个细胞/管分别加入2个1.5ml的EP管中，一管为待测样品，另一管为流式细胞检测对照组，PBS洗涤两次，1200rpm离心5min，弃上清，待测样品管每管中加入检测记忆T细胞的流式抗体组合anti-CD45RO-PECy5+anti-CD197-FITC+anti-CD62L-PE(购自Jackson ImmunoResearch公司)，每种抗体2μl；对照组每管加入同型对照流式抗体组合IgG1-PE+IgG2a-PECy5+IgG2a-PE(购自JacksonImmunoResearch公司)，每种抗体2μl，轻弹沉淀使其混合均匀；室温避光孵育30min后，PBS清洗一遍，1200rpm离心5min，弃上清加入400μl的生理盐水，将细胞转移至流式管中，上机检测。

结果如图6所示，几种细胞中记忆T细胞的比例均达到99％以上，区别不明显。进一步具体的表型分析显示，Mock T中的效应记忆T细胞(CD197lo/CD62Llo)的比例仅有4.17％，meso3-CAR-T细胞的效应记忆T细胞比例最高，接近27％。meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞与meso3-CAR-T细胞相比，效应记忆T细胞的比例均有明显下降。效应记忆T细胞提供的是即时的、非持久的免疫防御，因此与meso3-CAR-T细胞相比，meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞的即时免疫应答水平有一定降低。

实施例8：meso3-68R-CAR-T细胞和meso3-70G-CAR-T细胞体内对肿瘤抑制效果的检测

第一步：6～8周龄NSG完全免疫缺陷小鼠(24)只，平均重量20～24g，由北京百奥赛图基因生物技术有限公司提供，SPF级动物实验室饲养。

第二步：体外培育实施例8构建的skov3-luc细胞，取对数生长期贴壁生长细胞，0.25％胰酶消化，离心、收集细胞后用PBS液重悬，3000g室温离心2分钟，弃上清，再用PBS液重悬后离心收集细胞，调整细胞悬液浓度至5×10⁷个/ml。

第三步：于小鼠右肋背部皮下接种skov3-luc细胞，0.1ml/只。接种后在不同的时间点，通过活体成像仪观察肿瘤大小，将NSG免疫缺陷小鼠随机分为4组，每组6只小鼠，分别给予对照T细胞(未转染质粒的细胞)、Meso3-CAR-T细胞、Meso3-68R-CAR-T细胞和Meso3-70G-CAR-T细胞(5×10⁶个/只，按照阳性细胞数计算)。给药途径为尾静脉注射。其中，在在第13天对Meso3-68R-CAR-T组小鼠第二次注射Meso3-68R-CAR-T细胞，注射的细胞数量为5×10⁶个/只(按照阳性细胞数计算)。给药途径为尾静脉注射。

第四步：每日观察小鼠的生活状态并每在不同天数通过活体成像仪观察小鼠肿瘤变化。

结果如图7A和图7B所示。与对照T细胞组相比，meso3-CAR-T细胞能够最有效地抑制肿瘤的增长，meso3-CAR-T细胞组肿瘤的体积(图7A)以及瘤体的荧光通量(图7B)都最小。Meso3-68R-CAR-T细胞组和Meso3-70G-CAR-T细胞组小鼠的肿瘤体积增长大于Meso3-CAR-T细胞组(图7A)，但都明显小于对照T细胞组；瘤体的荧光通量上，Meso3-68R-CAR-T细胞组和Meso3-70G-CAR-T细胞组小鼠的通量也小于对照T细胞组(图7B)，其中Meso3-70G-CAR-T细胞组对肿瘤增长的抑制效果优于Meso3-68R-CAR-T细胞组。

以上结果表明，Meso3-68R-CAR-T细胞和Meso3-70G-CAR-T细胞能够对体内肿瘤的生长产生抑制作用，具有抗肿瘤的效果。

实施例9：Meso3-CAR-T、Meso3-68R-CAR-T和Meso3-70G-CAR-T细胞对间皮素低表达细胞系Calu-6杀伤功能的比较

选取间皮素低表达的肺腺癌细胞系Calu-6，应用艾森公司的实时无标记细胞功能分析仪(RTCA)检测Meso3-CAR-T、Meso3-68R-CAR-T和Meso3-70G-CAR-T三种靶向CAR-T细胞的体外杀伤活性，以Mock-T细胞作对照，具体步骤如下：

(2)靶细胞铺板：肺腺癌细胞Calu-6(购买于美国菌种保藏中心ATCC)按每孔10⁴个细胞/50μl铺在含有检测电极的板中，放置数分钟，待细胞稳定一下，再放入仪器中，开始step 2，培养细胞；

(3)加入效应细胞：靶细胞培养24h后，暂停step 2，加入效应细胞，每孔50μl，效靶比分别设置为1:1，以未转质粒的Mock-T细胞作为对照，开始step 3，继续共培养24h后，观察细胞增殖曲线。

结果如图8所示，Meso3-68R-CAR-T细胞和Meso3-70G-CAR-T细胞对Calu-6细胞的杀伤力与Mock-T细胞相当，其中Meso3-70G-CAR-T对Calu-6细胞杀伤力略高，但三者对Calu-6细胞的杀伤力均显著低于野生型Meso3-CAR-T细胞。

Calu-6细胞为间皮素低水平表达的肺腺癌细胞，以上结果表明，在68位和70位具有点突变的Meso3-68R-CAR-T细胞和Meso3-70G-CAR-T细胞对间皮素低表达的细胞杀伤力非常低，接近对照Mock-T细胞的杀伤水平。

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明的相关条件作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海细胞治疗工程技术研究中心集团有限公司

上海细胞治疗研究院

<120> 特异性结合间皮素的单克隆抗体及嵌合抗原受体

<130> 185641

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg

115 120 125

Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

165 170 175

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp

245 250 255

Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

260 265 270

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 2

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Phe Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg

115 120 125

Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

165 170 175

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp

245 250 255

Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

260 265 270

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 3

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Glu Leu Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg

115 120 125

Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

165 170 175

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp

245 250 255

Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

260 265 270

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 4

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Arg Glu Trp Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg

115 120 125

Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

165 170 175

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp

245 250 255

Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

260 265 270

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 5

<211> 681

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly

20 25 30

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

35 40 45

Phe Asp Leu Gly Phe Tyr Phe Tyr Ala Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ser Cys Ile Tyr Thr Ala Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg

85 90 95

Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

100 105 110

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Ala Asn Thr Arg

115 120 125

Ser Thr Tyr Tyr Leu Asn Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

165 170 175

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Arg Ile Ser Ser

180 185 190

Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu

195 200 205

Ile Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

210 215 220

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

225 230 235 240

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Ala Tyr Phe Asp

245 250 255

Ser Asn Asn Trp His Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

260 265 270

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val

275 280 285

Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

290 295 300

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

305 310 315 320

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

325 330 335

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Gln Ser Thr

340 345 350

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

355 360 365

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

370 375 380

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

385 390 395 400

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

405 410 415

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

420 425 430

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

435 440 445

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

450 455 460

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

465 470 475 480

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

485 490 495

Ser Leu Gly Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

500 505 510

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

515 520 525

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

530 535 540

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

545 550 555 560

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

565 570 575

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

580 585 590

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

595 600 605

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

610 615 620

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

625 630 635 640

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

645 650 655

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

660 665 670

Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

675 680

<210> 6

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaattcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct 120

gggggatccc tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac 180

gcctgttggg tccgccaggc tccagggaag ggcctggagt gggtctcatg catttatact 240

gctggtagtg gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga 300

gacaattcga agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc 360

gtgtattact gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg 420

ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct 480

ggaggtggcg gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 540

ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg 600

tatcagcaga aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca 660

tctggggtcc cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720

agcagcctgc agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat 780

agtaataatt ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat 840

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc 900

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 960

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1500

tctctgggta aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1560

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1620

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1680

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1740

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1800

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1860

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1920

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1980

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2040

gccctgcccc ctcgctgata agtcgac 2067

<210> 7

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaattcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct 120

gggggatccc tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac 180

gcctgttggt tccgccaggc tccagggaag ggcctggagt gggtctcatg catttatact 240

gctggtagtg gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga 300

gacaattcga agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc 360

gtgtattact gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg 420

ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct 480

ggaggtggcg gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 540

ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg 600

tatcagcaga aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca 660

tctggggtcc cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720

agcagcctgc agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat 780

agtaataatt ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat 840

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc 900

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 960

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1500

tctctgggta aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1560

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1620

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1680

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1740

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1800

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1860

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1920

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1980

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2040

gccctgcccc ctcgctgata agtcgac 2067

<210> 8

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct 120

gggggatccc tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac 180

gcctgttggg tccgccaggc tccagggaag gagctggagt gggtctcatg catttatact 240

gctggtagtg gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga 300

gacaattcga agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc 360

gtgtattact gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg 420

ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct 480

ggaggtggcg gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 540

ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg 600

tatcagcaga aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca 660

tctggggtcc cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720

agcagcctgc agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat 780

agtaataatt ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat 840

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc 900

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 960

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1500

tctctgggta aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1560

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1620

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1680

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1740

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1800

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1860

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1920

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1980

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2040

gccctgcccc ctcgctgata agtcgac 2067

<210> 9

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct 120

gggggatccc tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac 180

gcctgttggg tccgccaggc tccagggaag ggcagagagt gggtctcatg catttatact 240

gctggtagtg gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga 300

gacaattcga agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc 360

gtgtattact gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg 420

ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct 480

ggaggtggcg gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 540

ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg 600

tatcagcaga aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca 660

tctggggtcc cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720

agcagcctgc agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat 780

agtaataatt ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat 840

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc 900

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 960

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1500

tctctgggta aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1560

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1620

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1680

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1740

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1800

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1860

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1920

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1980

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2040

gccctgcccc ctcgctgata agtcgac 2067

<210> 10

<211> 2067

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaattcgcca ccatggcctt accagtgacc gccttgctcc tgccgctggc cttgctgctc 60

cacgccgcca ggccgagcga ggtgcagctg gtggagtccg ggggaggcct ggtccagcct 120

gggggatccc tgagactctc ctgcgcagcc tctggattcg acctcggttt ctacttttac 180

gcctgttggg tccgccaggc tccagggaag ggcctggagg gcgtctcatg catttatact 240

gctggtagtg gtagcacgta ctacgcgagc tgggcgaaag gccgattcac catctccaga 300

gacaattcga agaacacgct gtatctgcaa atgaacagtc tgagagccga ggacacggcc 360

gtgtattact gtgcgagatc tactgctaat actagaagta cttattatct taacttgtgg 420

ggccaaggca ccctggtcac cgtctcctca ggcggaggcg gatcaggtgg tggcggatct 480

ggaggtggcg gaagcgacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgtg 540

ggagacagag tcaccatcac ttgccaggcc agtcagagga ttagtagtta cttatcctgg 600

tatcagcaga aaccagggaa agttcccaag ctcctgatct atggtgcatc cactctggca 660

tctggggtcc cctcgcggtt cagtggcagt ggatctggga cagatttcac tctcaccatc 720

agcagcctgc agcctgaaga tgttgccact tactactgtc agagttatgc ttattttgat 780

agtaataatt ggcatgcttt cggcggaggg accaaggtgg agatcaaaga gtccaaatat 840

ggtcccccat gcccaccatg cccagcacct cccgtggccg gaccatcagt cttcctgttc 900

cccccaaaac ccaaggacac tctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac gtgcgtggtg 960

gtggacgtga gccaggaaga ccccgaggtc cagttcaact ggtacgtgga tggcgtggag 1020

gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagttcc agagcacgta ccgtgtggtc 1080

agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaacggca aggagtacaa gtgcaaggtc 1140

tccaacaaag gcctcccgtc ctccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc 1200

cgagagccac aggtgtacac cctgccccca tcccaggagg agatgaccaa gaaccaggtc 1260

agcctgacct gcctggtcaa aggcttctac cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc 1320

aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc 1380

ttcttcctct acagcaggct aaccgtggac aagagcaggt ggcaggaggg gaatgtcttc 1440

tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac aaccactaca cacagaagag cctctccctg 1500

tctctgggta aacccttttg ggtgctggtg gtggttggtg gagtcctggc ttgctatagc 1560

ttgctagtaa cagtggcctt tattattttc tgggtgagga gtaagaggag caggctcctg 1620

cacagtgact acatgaacat gactccccgc cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag 1680

ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc 1740

gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1800

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1860

aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg 1920

gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat 1980

ggcctttacc agggtctcag tacagccacc aaggacacct acgacgccct tcacatgcag 2040

gccctgcccc ctcgctgata agtcgac 2067

<210> 11

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atggaagccc cagctcagct tctcttcctc ctgctactct ggctcccaga taccaccgga 60

gaagtggaga agacagcctg tccttcaggc aagaaggccc gcgagataga cgagagcctc 120

atcttctaca agaagtggga gctggaagcc tgcgtggatg cggccctgct ggccacccag 180

atggaccgcg tgaacgccat ccccttcacc tacgagcagc tggacgtcct aaagcataaa 240

ctggatgagc tctacccaca aggttacccc gagtctgtga tccagcacct gggctacctc 300

ttcctcaaga tgagccctga ggacattcgc aagtggaatg tgacgtccct ggagaccctg 360

aaggctttgc ttgaagtcaa caaagggcac gaaatgagtc ctcaggtggc caccctgatc 420

gaccgctttg tgaagggaag gggccagcta gacaaagaca ccctagacac cctgaccgcc 480

ttctaccctg ggtacctgtg ctccctcagc cccgaggagc tgagctccgt gccccccagc 540

agcatctggg cggtcaggcc ccaggacctg gacacgtgtg acccaaggca gctggacgtc 600

ctctatccca aggcccgcct tgctttccag aacatgaacg ggtccgaata cttcgtgaag 660

atccagtcct tcctgggtgg ggcccccacg gaggatttga aggcgctcag tcagcagaat 720

gtgagcatgg acttggccac gttcatgaag ctgcggacgg atgcggtgct gccgttgact 780

gtggctgagg tgcagaaact tctgggaccc cacgtggagg gcctgaaggc ggaggagcgg 840

caccgcccgg tgcgggactg gatcctacgg cagcggcagg acgacctgga cacgctgggg 900

ctggggctac agggcggcat ccccaacggc tacctggtcc tagacctcag catgcaagag 960

gccctctcgt ga 972

<210> 12

<211> 2604

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgaggatct ttgctgtctt tatcttcatg acctactggc acttgctgaa cgcatttact 60

gtcaccgttc ccaaggacct gtatgtggtg gagtatggca gcaatatgac aattgagtgc 120

aagttcccag tggagaagca gctggacctg gctgcactga ttgtctattg ggagatggag 180

gataagaaca ttattcagtt tgtgcacgga gaggaggacc tgaaggttca gcacagtagc 240

tacagacaga gggcccggct gttgaaggac cagctctccc tgggaaatgc tgcacttcag 300

atcacagatg tgaagttgca ggatgcaggg gtgtaccgct gcatgatcag ctatggcggc 360

gccgactaca agagaattac tgtgaaggtc aatgccccat acaacaagat caaccagaga 420

attttggttg tggacccagt cacctctgag cacgagctga catgtcaggc tgagggctac 480

cccaaggccg aggtcatctg gacaagcagt gaccaccagg tcctgagtgg caagaccacc 540

accaccaatt ccaagagaga ggagaagctc ttcaatgtga ccagcacact gagaatcaac 600

acaacaacta atgagatttt ctactgcact tttaggagac tggaccctga ggagaaccac 660

acagctgagt tggtcatccc agagctgcct ctggcacacc ctccaaatga gaggactcac 720

ttggtgattc tgggagccat cctgctgtgc cttggcgtgg cactgacatt catcttcaga 780

ctgagaaagg atatcgccac aaacttctct ctgctaaagc aagcaggtga tgttgaagaa 840

aaccccgggc ctctcgagat ggtcttcaca ctcgaagatt tcgttgggga ctggcgacag 900

acagccggct acaacctgga ccaagtcctt gaacagggag gtgtgtccag tttgtttcag 960

aatctcgggg tgtccgtaac tccgatccaa aggattgtcc tgagcggtga aaatgggctg 1020

aagatcgaca tccatgtcat catcccgtat gaaggtctga gcggcgacca aatgggccag 1080

atcgaaaaaa tttttaaggt ggtgtaccct gtggatgatc atcactttaa ggtgatcctg 1140

cactatggca cactggtaat cgacggggtt acgccgaaca tgatcgacta tttcggacgg 1200

ccgtatgaag gcatcgccgt gttcgacggc aaaaagatca ctgtaacagg gaccctgtgg 1260

aacggcaaca aaattatcga cgagcgcctg atcaaccccg acggctccct gctgttccga 1320

gtaaccatca acggagtgac cggctggcgg ctgtgcgaac gcattctggc gtaaggatcc 1380

ctagggcggc caattccgcc cctctccctc ccccccccct aacgttactg gccgaagccg 1440

cttggaataa ggccggtgtg cgtttgtcta tatgtgattt tccaccatat tgccgtcttt 1500

tggcaatgtg agggcccgga aacctggccc tgtcttcttg acgagcattc ctaggggtct 1560

ttcccctctc gccaaaggaa tgcaaggtct gttgaatgtc gtgaaggaag cagttcctct 1620

ggaagcttct tgaagacaaa caacgtctgt agcgaccctt tgcaggcagc ggaacccccc 1680

acctggcgac aggtgcctct gcggccaaaa gccacgtgta taagatacac ctgcaaaggc 1740

ggcacaaccc cagtgccacg ttgtgagttg gatagttgtg gaaagagtca aatggctctc 1800

ctcaagcgta ttcaacaagg ggctgaagga tgcccagaag gtaccccatt gtatgggatc 1860

tgatctgggg cctcggtgca catgctttac atgtgtttag tcgaggttaa aaaaacgtct 1920

aggccccccg aaccacgggg acgtggtttt cctttgaaaa acacgatgat aagcttgcca 1980

caacccacaa ggagacgacc ttccatgacc gagtacaagc ccacggtgcg cctcgccacc 2040

cgcgacgacg tcccccgggc cgtacgcacc ctcgccgccg cgttcgccga ctaccccgcc 2100

acgcgccaca ccgtcgaccc ggaccgccac atcgagcggg tcaccgagct gcaagaactc 2160

ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg tcgcggacga cggcgccgcg 2220

gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg cggtgttcgc cgagatcggc 2280

ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc agcaacagat ggaaggcctc 2340

ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg ccaccgtcgg cgtctcgccc 2400

gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc ccggagtgga ggcggccgag 2460

cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc gcaacctccc cttctacgag 2520

cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg aaggaccgcg cacctggtgc 2580

atgacccgca agcccggtgc ctga 2604

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaggatct ttgctgtc 18

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttatcaggca ccgggcttg 19

Claims

1.一种特异性结合间皮素的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第162-272位氨基酸序列所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5第23-146位氨基酸序列所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为单链抗体。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单链抗体的重链可变区和轻链可变区由含有G和S的接头连接。

4.如权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述接头为(GGGGS)_n，其中n为1-10的整数。

5.如权利要求4所述的单克隆抗体，其特征在于，n=3。

6.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ IDNO:5第23-272位所示。

7.多核苷酸，其多核苷酸序列选自：

（1）编码权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体的多核苷酸序列；和

（2）（1）所述多核苷酸序列的互补序列。

8.如权利要求7所述的多核苷酸，其特征在于，（1）所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:10第79-828位碱基序列所示。

9.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体从N端到C端依次含有任选的信号肽序列、权利要求2-6中任一项所述的单链抗体、铰链区、跨膜区、胞内共刺激区和胞内信号域。

10.如权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述信号肽为CD8信号肽、CD28信号肽或CD4信号肽；和/或

所述铰链区选自CD8的胞外铰链区、IgG1 Fc CH2CH3铰链区、IgD铰链区、CD28胞外铰链区、IgG4 Fc CH2CH3铰链区和CD4的胞外铰链区；和/或

所述跨膜区选自CD28跨膜区、CD8跨膜区、CD3ζ跨膜区、CD134跨膜区、CD137跨膜区、ICOS跨膜区和DAP10跨膜区；和/或

所述胞内共刺激信号域选自CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶、诱导性T细胞共刺激因子和DNAX激活蛋白10的胞内结构域；和/或

所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域或 FcεRIγ胞内信号域。

11.如权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述信号肽为CD8信号肽；

所述铰链区为IgG4 CH2CH3铰链区；

所述跨膜区为CD8跨膜区；

所述胞内共刺激信号域为CD28的胞内结构域；

所述胞内信号域为CD3ζ胞内信号域。

12.如权利要求10所述的嵌合抗原受体，其特征在于，

所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第1-22位氨基酸残基所示；

所述IgG4 CH2CH3铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第273-500位氨基酸残基所示；

所述CD8跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第501-528位氨基酸残基所示；

所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第529-569位氨基酸残基所示；

所述CD3ζ胞内信号域的氨基酸序列如SEQ ID NO:1第570-681位氨基酸残基所示。

13.如权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

14.多核苷酸，其多核苷酸序列选自：

（1）编码权利要求9-13中任一项所述的嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和

（2）（1）所述的多核苷酸序列的互补序列。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，其特征在于，（1）所述的多核苷酸序列如SEQ IDNO: 10所示。

16.核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体含有权利要求7或8所述的多核苷酸，或含有权利要求14或15所述的多核苷酸。

17.如权利要求16所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为克隆载体或表达载体。

18.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求16或17所述的核酸构建体。

19.一种免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞表达如权利要求2-6中任一项所述的单链抗体或如权利要求9-13中任一项所述的嵌合抗原受体，和/或含有如权利要求2-6中任一项所述的单链抗体的编码序列或如权利要求9-13中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列，和/或含有如权利要求16或17所述的核酸构建体。

20.如权利要求19所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为NK细胞、巨噬细胞或T细胞。

21.如权利要求19所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为NK细胞或T细胞。

22.如权利要求19所述的免疫效应细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞为T细胞。

23.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9-13中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求14或15所述的多核苷酸、如权利要求16或17所述的核酸构建体、如权利要求18所述的宿主细胞和如权利要求19-22中任一项所述的免疫效应细胞中的一种或多种。

24.如权利要求1-6中任一项所述的单克隆抗体、如权利要求7或8所述的多核苷酸、如权利要求9-13中任一项所述的嵌合抗原受体、如权利要求14或15所述的多核苷酸、如权利要求16或17所述的核酸构建体、如权利要求18所述的宿主细胞和如权利要求19-22中任一项所述的免疫效应细胞中的一种或多种在制备治疗间皮素高表达的癌症的药物中的应用。

25.如权利要求24所述的应用，其特征在于，所述间皮素高表达的癌症选自：间皮瘤、腺癌、肺癌、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、胰腺癌或前列腺癌。