CN116041535A - 一种靶向cd123和cd7的嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

一种靶向cd123和cd7的嵌合抗原受体及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体及其用途，所述嵌合抗原受体包含针对CD123的纳米抗体VHH01和针对CD7的纳米抗体VHH10，本发明还提供了一种同时靶向CD123和CD7的通用型CAR‑T细胞，经实验验证发现，所述CAR‑T细胞对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，本发明提供的通用型CAR‑T细胞产品在使用中不受病人自身病情或治疗方式的影响，可以随时制备，在最佳的时机给予治疗，确保治疗的有效性，具有较好的临床应用前景。

Description

一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法已经成为一种新型的免疫疗法，对一些血液系统恶性肿瘤的长期疾病控制具有巨大的潜力，这在一定程度上也进一步促进了CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤的发展。在几种CAR-T细胞疗法中，靶向CD123分子的CAR-T细胞应用较为广泛，尤其是治疗急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)等血液系统肿瘤。CD123蛋白的基因名称为IL3RA。CD123的高表达与信号转导及转录激活因子5(STAT5)信号通路的活化相关，STAT5激活通路参与在多种恶性血液病中，CD123主要在造血系统中表达，CD123在正常CD34+CD38-细胞中低表达或不表达。此外，正常情况下在髓系祖细胞、B淋巴祖细胞中CD123有较高表达，而红系祖细胞和多向分化潜能祖细胞中低表达或不表达。相关研究表明，CD123在60％-90％以上的AML原始细胞中高表达。但是靶向CD123的CAR-T细胞的疗效仍然较低，可能是由于髓系肿瘤细胞形成的特殊的免疫抑制环境导致CAR-T细胞在体内不能有效扩增。
CD7分子是一个分子量约40kDa细胞表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族中的一员。CD7分子主要表达在大多数的胸腺细胞表面、85％以上的外周血T淋巴细胞表面以及自然杀伤细胞表面。尽管目前的研究表明CD7分子的具体功能还不太清楚，但实验研究显示CD7缺陷的鼠T淋巴细胞对刺激反应正常以及当抗体与人T淋巴细胞上的CD7分子结合后对细胞的生长和增殖并没有影响。同时，CD7分子的一个重要性质是当其和抗体结合后会快速发生内吞作用。已有研究表明靶向CD7的CAR-T细胞在CD7+的T细胞来源的恶性肿瘤治疗中临床疗效和安全性获得验证；同时，大约1/3的AML患者的肿瘤细胞也表达CD7抗原，已有病例证实CD7 CAR-细胞回输给CD7+的AML患者后，在体内可以获得高效扩增，并且能极高效的清除CD7+的AML细胞。
与传统抗体相比，纳米抗体具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、人源化简单等优势。基于纳米抗体的特性以及羊驼天然重链抗体的VHH单域抗体的特殊结构，使其在基础医学研究以及疾病诊断和治疗方面具有广阔的应用前景。
目前，尚未见同时靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体的相关报道，更没有同时靶向CD123和CD7的CAR-T细胞在治疗AML中的应用，鉴于此，本发明开发了同时靶向CD7和CD123的双特异性纳米CAR，经实验验证发现所述同时靶向CD7和CD123的双特异性CAR-T细胞对CD7+及CD123+的肿瘤细胞具有高效清除的作用，临床应用前景广阔。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体，为本领域提供一种全新的CD123和/或CD7相关疾病治疗的研究策略。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包括与CD123特异性结合的纳米抗体VHH01和与CD7特异性结合的纳米抗体VHH10；
优选地，所述纳米抗体VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示或分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述纳米抗体VHH10的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示或分别与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述纳米抗体VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示或与SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述纳米抗体VHH10的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域、胞内信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括EF1α、T2A、tEGFR；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括连接VHH01和VHH10的Linker；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括tEGFR信号肽；
更优选地，所述跨膜结构域和铰链区包括下列分子的跨膜结构域和铰链区：CD8、4-1BB、PD-1、CD34、CD28，IgG1、IgG4、OX40，CD3ε；
最优选地，所述跨膜结构域和铰链区为CD8跨膜结构域和CD8铰链区；
最优选地，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
最优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、DAP10、DAP12、FYN；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、ICOS、CD27、CD19、CD4、CD28、CD8α、CD8β、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、CD278；
最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；
最优选地，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6；
最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
更优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
更优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
更优选地，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
更优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
更优选地，所述tEGFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；
最优选地，所述嵌合抗原受体选自以下组中的任一种：
(1)由EF1α、信号肽、纳米抗体VHH01、Linker、纳米抗体VHH10、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次连接得到的嵌合抗原受体；
(2)由EF1α、信号肽、纳米抗体VHH10、Linker、纳米抗体VHH01、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次连接得到的嵌合抗原受体；
(3)在(1)中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的嵌合抗原受体；
(4)在(2)中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的嵌合抗原受体。
本发明的第二方面提供了一种多核苷酸。
进一步，所述多核苷酸的序列为本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的编码序列、或其互补序列。
进一步，在如本发明第一方面所述的所述嵌合抗原受体中，纳米抗体VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，纳米抗体VHH10的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，tEGFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。
本发明的第三方面提供了一种含有本发明第二方面所述多核苷酸的载体。
进一步，所述载体包括克隆载体、表达载体；
优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
本发明的第四方面提供了一种基因工程化的宿主细胞。
进一步，所述基因工程化的宿主细胞含有本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体；
优选地，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；
更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；
更优选地，所述原核细胞包括支原体、衣原体、立克次氏体、细菌、放线菌、蓝细菌；
最优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
最优选地，所述哺乳动物细胞为免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
本发明的第五方面提供了一种靶向CD123和CD7的通用型CAR-T细胞。
进一步，所述通用型CAR-T细胞表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体并且不表达CD7和TCR；
优选地，所述T细胞来源于健康志愿者或供者；
更优选地，所述通用型CAR-T细胞中的CD7的编码基因和TCR的编码基因被敲除；
最优选地，所述TCR的α链和/或β链恒定编码区(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除；
最优选地，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除；
最优选地，所述CD7的编码基因和TCR的编码基因被引入到所述T细胞的Cas9蛋白、CD7-sgRNA和TRAC-sgRNA形成的复合物所敲除；
最优选地，所述CD7-sgRNA的序列如SEQ ID NO:28所示；
最优选地，所述TRAC-sgRNA的序列如SEQ ID NO:29所示。
在本发明的具体实施方案中，本发明通过敲除T细胞内源性的CD7降低细胞自杀，提高制备成功率，并通过敲除TCR的α链恒定编码区(即TRAC)，消除TCR的表达，降低同种异体T细胞引发的移植物抗宿主病(GvHD)风险。靶向CD7的CAR可以特异性靶向患者自身T细胞和自然杀伤(NK)细胞(同种异体反应性杀伤细胞)，减少宿主抗移植物排斥反应(HvG)，同时靶向CD123的CAR可以清除AML肿瘤细胞。在本发明的具体实施例中，所述靶向CD123和CD7双特异性纳米通用型CAR-T细胞为UCAR0901T，具有显著的杀伤肿瘤细胞的能力，且所述通用型CAR-T细胞产品在患者需要时即可直接取用，而不需要在已经罹患病重的患者体内提取T细胞后再定制产品。
本发明的第六方面提供了一种衍生物。
进一步，所述衍生物包括可检测标记的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸、赋予抗生素抗性的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸、与治疗剂结合或偶联的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的多核苷酸；
优选地，所述可检测标记包括荧光染料、化学发光标记物、胶体金、化学发光催化剂；
更优选地，所述化学发光标记物包括鲁米诺及其衍生物、吖啶酯或其衍生物、金刚烷、异鲁米诺及其衍生物、稀土元素、联吡啶钌配合物；
更优选地，所述化学发光催化剂包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；
优选地，所述抗生素抗性的基因包括青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因；
优选地，所述治疗剂包括放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂；
更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；
更优选地，所述化疗剂包括顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
本发明的第七方面提供了一种用于治疗CD123和/或CD7相关疾病的药物组合物。
进一步，所述药物组合物包含本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞、本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞和/或本发明第六方面所述的衍生物；
优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合；
优选地，所述CD123和/或CD7相关疾病包括：急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、NKT细胞白血病、外周T细胞淋巴、NKT细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤/母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
在本发明的具体实施方案中，所述CD123和/或CD7相关疾病包括但不限于上述列举出的疾病，只要与CD123和/或CD7相关的疾病均在本发明的保护范围内。
进一步，所述一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合可以包含：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。
本发明公开的药物组合物可根据实际需求被配制用于口服、静脉内、局部、肠内和/或肠胃外施用的药物。
本发明的第八方面提供了一种试剂盒。
进一步，所述试剂盒包含本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸或载体引入到宿主细胞中的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸或载体引入到宿主细胞中的说明书。
本发明的第九方面提供了如下任一种方法：
(1)一种制备本发明第四方面所述基因工程化的宿主细胞的方法；
进一步，所述方法包括如下步骤：将本发明第二方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括脂质转染法、微注射、电穿孔、DNA载体、RNA载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(2)一种刺激哺乳动物靶细胞群或组织产生免疫应答的方法；
进一步，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞或本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞；
(3)一种制备本发明第五方面所述通用型CAR-T细胞的方法；
进一步，所述方法包括如下步骤：
①获得活化的T细胞；
②通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除步骤①所述的T细胞中的CD7和TCR，得到CD7和TCR双敲除的通用型T细胞；
③用编码如本发明第一方面所述的靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体表达的慢病毒载体来转染步骤②得到的通用型T细胞，获得靶向CD123和CD7的通用型CAR-T细胞；
优选地，步骤①中所述的T细胞来源于健康志愿者或供者；
优选地，步骤②中所述的TCR为TCR的α链恒定编码区(即TRAC)；
更优选地，所述CD7和TCR的编码基因被引入到所述T细胞的Cas9蛋白、CD7-sgRNA和TRAC-sgRNA形成的复合物所敲除；
最优选地，所述CD7-sgRNA的序列如SEQ ID NO:28所示；
最优选地，所述TRAC-sgRNA的序列如SEQ ID NO:29所示。
此外，本发明还提供了一种治疗和/或预防CD123和/或CD7相关疾病的方法。
进一步，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞、本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞、本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物；
优选地，所述CD123和/或CD7相关疾病包括：急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、NKT细胞白血病、外周T细胞淋巴、NKT细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤/母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
本发明的第十方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞、本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞、本发明第六方面所述的衍生物、本发明第七方面所述的药物组合物、本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的药物中的应用；
(2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞、本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞、本发明第六方面所述的衍生物在制备用于制备预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(3)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的基因工程化的宿主细胞、本发明第五方面所述的通用型CAR-T细胞、本发明第六方面所述的衍生物、本发明第七方面所述的药物组合物、本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的生物制剂中的应用；
(4)本发明第八方面所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的免疫细胞中的应用；
优选地，所述CD123和/或CD7相关疾病包括：急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、NKT细胞白血病、外周T细胞淋巴、NKT细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤/母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明首次开发了一种同时靶向CD7和CD123的双特异性嵌合抗原受体，并提供了一种同时靶向CD7和CD123的通用型CAR-T细胞产品，经实验验证发现所述同时靶向CD7和CD123的双特异性CAR-T细胞对CD7+及CD123+的肿瘤细胞具有高效清除的作用，在治疗CD7和/或CD123相关的疾病中具有重要的应用前景，尤其是在急性髓系白血病的治疗中。此外，本发明首次提供的同时靶向CD7和CD123的通用型CAR-T细胞产品在使用中不受病人自身病情或治疗方式的影响，可以随时制备，在最佳的时机给予治疗，确保治疗的有效性。
附图说明
图1为SPR方法检测抗体dNb0901-B亲和活性的结果图，其中，A图：人CD7抗原，B图：人CD123；
图2为0901-CAR基因具体结构示意图；
图3为0109-CAR基因具体结构示意图；
图4为本发明制备NS 0901-CAR-T细胞的具体制备流程图；
图5为本发明制备KO7-0901 CAR-T细胞和KO7-0901 CAR-T细胞的具体制备流程图；
图6为4个靶向CD7的gRNA敲除T细胞CD7的流式代表图；
图7为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞体外培养12天的扩增倍数曲线图；
图8为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞体外培养过程中CAR阳性率(ERB)的变化图；
图9为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞CAR表达的流式代表图；
图10为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞体外培养过程中细胞活率的变化图；
图11为T细胞CD7敲除效率流式代表图，其中，A图：T细胞对照，B图：KO7 T细胞；
图12为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞对MOLM-13和CCRF-CEM杀伤作用的结果图，其中，A图：MOLM-13细胞，B图：CCRF-CEM细胞；
图13为NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞与MOLM-13和CCRF-CEM共同孵育后分泌的细胞因子检测结果图，其中，A图：MOLM-13细胞，B图：CCRF-CEM细胞；
图14为给药不同剂量的KO7-0901CAR-T细胞后动物体内抗肿瘤作用的荧光成像图；
图15为给药不同剂量的KO7-0901CAR-T细胞后动物体内荧光强度趋势图；
图16为给药不同剂量的KO7-0901CAR-T细胞后动物体内CAR-T细胞表达趋势图；
图17为UCAR0901 T和mock-T细胞体外培养12天的扩增倍数曲线图；
图18为UCAR0901 T和mock-T细胞体外培养过程中CAR阳性率(ERB)的变化图；
图19为UCAR0901 T和mock-T细胞CAR表达的流式代表图；
图20为T细胞CD7和TRAC双敲除效率流式代表图，其中，A图：T细胞对照，B图：敲除CD7和TRAC的T细胞；
图21为UCAR0901 T细胞对MOLM-13和CCRF-CEM杀伤作用的结果图，其中，A图：MOLM-13细胞，B图：CCRF-CEM细胞；
图22为UCAR0901 T细胞与MOLM13和CCRF-CEM共同孵育后分泌的细胞因子检测结果图，其中，A图：MOLM-13细胞，B图：CCRF-CEM细胞。
具体实施方式
本发明首次构建了一种同时靶向CD123和CD7双靶点的嵌合抗原受体，并将其应用于CAR-T细胞的制备中，经实验验证发现，所述CAR-T细胞对肿瘤细胞具有显著的杀伤效果，本发明为本领域提供了一种全新的CD123和/或CD7相关疾病的治疗方案。
本发明提供的同时靶向CD123和CD7双靶点的嵌合抗原受体(CAR)不仅包括氨基酸序列如本发明第一方面中所述的嵌合抗原受体，也包括本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的突变体。这些突变体包括：与本发明第一方面所述的嵌合抗原受体的氨基酸序列具有至少75％，优选至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该嵌合抗原受体的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。也即在本发明第一方面所述的嵌合抗原受体对应的氨基酸序列/核苷酸序列的基础上进行突变得到的突变体同样包含在本发明的保护范围内。
突变体还包括：在如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体所对应的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该嵌合抗原受体的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1-10个以内，例如1-8个、1-5个或1-3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。这些保守性的修饰是指不会明显影响或改变含有该氨基酸序列的抗体或抗体片段的结合特征的氨基酸修饰。这些保守修饰包括氨基酸取代、添加及缺失。修饰可以通过本领域中已知的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变而引入本发明的嵌合抗原受体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基置换的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中有定义，包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)及芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。保守性修饰可以例如基于极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或所涉及残基的两亲性质的相似性来进行选择。
本发明通过全基因合成嵌合抗原受体抗0901CAR(EF1α-leader-anti CD123 VHH(VHH01)-Linker-anti CD7 VHH(VHH10)-CD8 hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR)和0109CAR(EF1α-leader-anti CD7 VHH(VHH10)-Linker-anti CD123 VHH(VHH01)-CD8hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR)的基因片段，插入到慢病毒载体NMC009-01中。重组慢病毒载体NMC009-01在293FT细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于慢病毒转导方法，该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。转导的核酸通过转录、翻译表达在CAR-T细胞表面。用流式细胞术，通过检测与纳米抗体结合的蛋白的含量，可以计算出慢病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。本发明通过慢病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高，体外通过酶联免疫反应(ELISA)检测发现，基于所述嵌合抗原受体制备得到的CAR-T细胞能分泌大量的IFN-γ、TNF-α和IL-8至培养基上清，表明了慢病毒成功转导至T细胞中并表达分泌型的IFN-γ、TNF-α和IL-8。本发明制备的CAR-T细胞对CD123或CD7阳性的肿瘤细胞具有强烈的杀伤功能，在效靶比为2:1的情况下，杀伤值可达80％以上。
在本发明中，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”无区别地使用，并且表示在骆驼科动物中发现的那些类型的抗体的单个重链的可变结构域。在没有轻链的情况下，纳米抗体各自具有三个CDR，分别表示为CDR1、CDR2和CDR3。它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。纳米抗体/单域抗体(Nanobody)作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。其具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。
在本发明中，术语“同一性”、“同源性”无区别地使用，是指两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员将认识到，一些算法可以用于使用标准参数来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)和ClustalW。
在本发明中，术语“施用”，是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入到受试者体内，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。
在本发明中，术语“载体”，是指编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。
本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点；
简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子；
本发明第二方面提供的多核苷酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)；
额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以启动转录；合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
本发明中所述的将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞；
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)；
将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362；
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。
在本发明中，术语“免疫细胞”，是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和/或NKT细胞，或者是衍生自干细胞，例如成体干细胞、胚胎干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞等的免疫细胞。优选地，免疫细胞是T细胞。T细胞可以是任何T细胞，如体外培养的T细胞，例如原代T细胞，或者来自体外培养的T细胞系,例如Jurkat、SupT1等的T细胞，或获得自受试者的T细胞。受试者的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠及其转基因物种。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+/CD8+T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫细胞是人T细胞。可以使用本领域技术人员已知的多种技术，如Ficoll分离受试者的血液获得T细胞。在本发明中，免疫细胞被工程化以表达本发明第一方面所述的同时靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体并抑制或沉默内源性CD7和/或TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因的表达。
本发明提供的CAR修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明提供的治疗CD123和/或CD7相关疾病的方法中，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR修饰的T细胞，施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×106个至1×1010个本发明提供的CAR修饰的T细胞(如，KO7-0901 CAR T、KO7-0109 CAR-T和/或UCAR0901 T)，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。
本发明中所述的施用产品的方式包括任何方便的方式，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。此外，本发明提供的药物组合物、CAR修饰的T细胞、衍生物等还可与其他治疗剂一起施用。所述其他治疗剂的优选实例包括已知的抗癌药物，例如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。
在本发明中，术语“受试者”，是指哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。
在本发明的具体实施方案中，所述与CD123和/或CD7相关的疾病包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)和实体瘤。血液学肿瘤是血液或骨髓的癌症，包括但不限于急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓系白血病(AML)、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病、伯基特淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T淋巴母细胞性淋巴瘤(T-LBL)、早期前T淋巴母细胞白血病(ETP-ALL)、结外NK/T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)和脊髓发育不良。实体瘤是通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块，其可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤的实例包括但不限于纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌、腹膜、大网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、黑素瘤、肾癌，喉癌、软组织癌、胃癌、睾丸癌、结肠癌，食道癌，宫颈癌、腺泡型横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌、胸膜癌、鼻癌、中耳癌、口腔癌、外阴癌、甲状腺癌和输尿管癌。也即与CD123和/或CD7相关的疾病均在本发明的保护范围内，在本发明的具体实施方案中，所述CD123和/或CD7相关的疾病优选为急性髓系白血病。
本发明提供的通用型CAR-T细胞，是一种首次同时抑制T细胞抗原受体TCR和T细胞内源性的CD7获得的通用型CAR-T细胞，其具有如下特点：(1)通过敲除T细胞内源性的CD7降低细胞自杀，提高制备成功率，进一步提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果；(2)使用CRISPR/Cas9定向敲除免疫排斥反应的相关基因(TCR)，避免了输入同种异体的T细胞出现的GVHD以及潜在的TCR受体信号干扰，从而实现异体治疗。用同种异体供体来源的CAR-T细胞用来发展通用型产品，用来提供给那些因淋巴细胞数量较低或质量较差(以及体外扩增能力低)而没有机会进行自体细胞输注的患者；(3)本发明可适用于治疗移植后复发的患者。对于移植后复发的患者，国内外尚无有效的治疗手段。本发明基于健康供体T细胞的通用型嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法，提出对移植后复发的患者进行CAR-T细胞治疗。由于患者接受了供体的骨髓造血干细胞移植，这部分患者复发后，可直接用健康供体的T细胞进行修饰后的细胞治疗。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1纳米抗体亲和力检测
1、亲和力检测方法
将dNMC0901-B(实施例2中所述的0901-CAR)结构中包含的CD7(anti-CD7 VHH10)和CD123(anti-CD123 VHH01)纳米抗体用15个氨基酸的短肽(GGGGSGGGGSGGGGS)进行连接，然后再与人IgG1 FC进行融合表达，重组抗体命名为dNb0901-B。将表达纯化后的dNb0901-B抗体用于SPR测定。使用Biacore 8K分析系统通过SPR测定dNb0901-B对人源CD123、CD7蛋白和鼠源CD123、CD7的亲和力。首先，将抗人IgG1 Fc抗体以25μg/mL共价偶联至CM5传感器芯片；然后，用抗人IgG1 Fc抗体去捕获dNb0901-B蛋白作为固定相；再将倍比稀释的人源CD123、CD7蛋白和鼠源CD123、CD7蛋白作为流动相以30μL/min的流速注射，然后进行解离；最后，使用Biacore Insight Evaluation Software 3.0.12.15655软件测定缔合和解离速率常数。
2、实验结果
SPR方法检测抗体亲和活性结果如表1和图1A和图1B所示dNb0901-B与人CD123蛋白之间的亲和力常数为4.07E-09，dNb0901-B与人CD7蛋白之间的亲和力常数为5.94E-09。结果显示，dNb0901-B与人CD123和CD7能够发生特异性结合。以上结果表明了本发明构建得到的CAR结构所用抗体与人CD123和人CD7均具有较好的亲和力。
表1 SPR方法测定抗体亲和力的结果统计
Figure BDA0003834460280000121
实施例2制备NS0901、KO7-0901和KO7-0109 CAR-T细胞
1、构建慢病毒载体
(1)将靶向CD123的纳米抗体片段(VHH01)和靶向CD7的纳米抗体片段(VHH10)克隆至具有4-1BB和CD3ζ的第二代CAR结构骨架中，以T2A连接胞外tEGFR结构域，得到名称为0901的CAR。0901-CAR基因具体结构为EF1α-leader-anti CD123 VHH(VHH01)-Linker-antiCD7 VHH(VHH10)-CD8 hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR(如图2所示)。
(2)将靶向CD7的纳米抗体片段(VHH10)和靶向CD123的纳米抗体片段(VHH01)克隆至具有4-1BB和CD3ζ的第二代CAR结构骨架中，以T2A连接胞外tEGFR结构域，得到名称为0109的CAR。0109-CAR基因具体结构为EF1α-leader-anti CD7 VHH(VHH10)-Linker-antiCD123 VHH(VHH01)-CD8 hinge-CD8TM-4-1BB-CD3ζ-T2A-tEGFR(如图3所示)。
其中，EF1α是延长因子1α的启动子，leader是信号肽的编码序列，anti-CD7 VHH是抗CD7纳米抗体(VHH10)的编码序列，anti-CD123 VHH是抗CD123纳米抗体(VHH01)的编码序列，CD8 hinge是铰链区，CD8TM是跨膜区，4-1BB和CD3ζ胞内信号区是胞内共刺激域，通过T2A肽连接表达tEGFR胞外区域，以便病毒转导后检测CAR的表达。
其中，所述纳米抗体VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示，所述纳米抗体VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示；所述纳米抗体VHH10的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示，所述纳米抗体VHH10的氨基酸序列如SEQID NO:8所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示；所述CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述CD8 hinge的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述CD3ζ胞内信号区的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示，所述leader的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，所述tEGFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；所述CD8TM的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，所述CD8 hinge的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，所述CD3ζ胞内信号区的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，所述4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，所述leader的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，所述T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，所述tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，所述Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，所述tEGFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。
(3)0901-CAR基因表达载体(慢病毒表达载体)的构建，通过PCR获得VHH10序列，并通过同源重组的方式将其连接入本实验室自主保存的慢病毒载体NMC009-01，序列为SEQID NO:37。重组载体命名为0901-CAR。
(4)0109-CAR基因表达载体(慢病毒表达载体)的构建，通过PCR获得VHH01序列，并通过同源重组的方式将其连接入本实验室自主保存的慢病毒载体NMC001-10，序列为SEQID NO:36。重组载体命名为0109-CAR。
2、慢病毒包装
慢病毒包装操作步骤如下：首先进行PEI转染试剂和质粒混合物的制备，将慢病毒表达载体、编码Rev蛋白的包装质粒psPAX2、编码VSV-G蛋白的包膜质粒pMD2.G与PEI转染试剂(Polyplus)混合均匀，室温静置20min。然后将上述混合液加到293FT细胞中，培养72h后收取培养上清作为病毒原液。4℃18300g高速离心2h。将上清液弃净，加入无血清培养基重悬病毒颗粒，此即为慢病毒溶液。
3、NS 0901-CAR-T细胞的制备和KO7-0901 CAR-T、KO7-0109 CAR-T细胞的制备
(1)NS 0901-CAR-T细胞的制备
将外周血PBMC分选出来的T细胞，加入Dynabeads CD3/CD28活化磁珠进行激活，放入37℃5％CO2细胞培养箱进行培养(记为Day0)，培养48小时后，用上述制备的慢病毒溶液加入到T细胞中，离心2小时(2000rpm，35℃)进行慢病毒转导，转导完成后加入含有200UI/mL IL-2的MACS培养基放入37℃5％CO2细胞培养箱进行培养，Day5取样，通过流式细胞术进行CAR+比例检测。Day12到Day14收获细胞，得到NS 0901-CAR-T细胞。具体制备流程见图4。
(2)KO7-0901CAR-T和KO7-0109CAR-T细胞的制备
通过CRISPR/Cas9基因编辑敲除T细胞内源性的CD7降低细胞自杀，提高制备成功率。设计四个靶向CD7的向导RNA(gRNA)，分别为gRNA-T71、gRNA-T72、gRNA-T73、gRNA-T74，其序列信息分别如SEQ ID NO:32-35所示，并且验证活性。通过商业合成sgRNA，并在sgRNA的5’和3’的三个末端碱基处并入2′-O-甲基和3′硫代磷酸碱基以防止核酸酶活性。将9μgCas9蛋白和4.5μg sgRNA加入到30μL EO buffer中，室温孵育10min，形成Cas9蛋白和CD7-sgRNA复合物(Cas9 RNP-CD7)，然后电穿孔到T细胞中，在电转后的72小时通过流式细胞术进行CD7敲除率的测试，sgRNA-T71具有最有效的CD7敲除效率，将CD7+T细胞的百分比由92.9％降低到11.1％(见图6)，因此，在本发明中选择sgRNA-T71应用于后续所有敲除CD7的实验。
按照上述T细胞分离活化的方法制备T细胞。将分选出来的T细胞，加入DynabeadsCD3/CD28活化磁珠进行激活，放入37℃5％CO2细胞培养箱进行培养，培养48小时后，收集细胞，去除磁珠，用EO buffer重悬细胞，将Cas9 RNP-CD7复合物加入到细胞中，对细胞进行电转，电转后的细胞继续培养24小时，用上述制备的慢病毒溶液(LV-0901或LV-0109)加入到T细胞中，进行慢病毒转导，继续培养至12-14天，获得KO7-0901 CAR-T细胞或KO7-0109 CAR-T(具体制备流程见图5)，只进行敲除CD7未转导慢病毒的T细胞作为mock-T细胞对照。
4、NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞体外抗肿瘤能力的研究
采用NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞作为效应细胞，CCRF-CEM-GFP-LUC细胞(表达CD7抗原)和MOLM-13-GEP-LUC细胞(表达CD123抗原)作为靶细胞。
体外杀伤效果测试：按效靶比2：1将效应细胞和靶细胞混匀，混合后孵育18-24小时，孵育结束后，加入
Figure BDA0003834460280000141
检测试剂，在荧光酶标仪上读取化学发光数值，计算杀伤率。杀伤率(％)＝(靶细胞RCL-实验细胞RCL)/靶细胞RCL。
细胞因子测试：按效靶比1：1将效应细胞和靶细胞混匀，混匀共同孵育18小时，取上清检测细胞因子的分泌。
5、KO7-0901 CAR-T细胞在动物体内抗肿瘤效果
为了评估KO7-0901 CAR-T在动物体内的抗肿瘤效果及安全性，采用NPG小鼠荷瘤模型进行动物体内研究。
采用NPG小鼠移植人急性髓系白血病细胞-荧光素酶(luciferase)标记细胞(KG-1a-LUC)构建移植瘤模型，共使用24只雄性小鼠，按照1×106个KG-1a-LUC/只注射到NPG小鼠尾静脉。根据荧光强度分为4组，模型对照组、CAR-T低、中、高剂量组，每组6只小鼠。造模后第5天，各组小鼠分别经尾静脉给予溶媒、0.1×107、0.33×107、1.0×107CAR+T细胞/只。通过活体成像法，于分组给药当天(即D1)、给药后每周1次检测体内KG-1a-LUC细胞荧光强度，并观察临床症状、记录动物死亡情况；于给药后2-4h、D2、D5、D8、D15采血，通过流式细胞术检测血液样本中细胞表型，评估CAR-T细胞在体内的增殖水平。
6、实验结果
(1)对于体外培养，结果显示，细胞从0天培养到第12天时，NS 0901-CAR-T细胞扩增7.3±2.6倍，KO7-0901 CAR-T细胞扩增22.4±7.4倍，KO7-0109 CAR-T细胞扩增18.6±2.2倍(见图7)；在收获时NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞的CAR阳性率分别为97.0±1.3％，57.9±19.3％和65.9±4.4％(见图8)；图9为CAR阳性率的流式代表图，用ERB染色作为CAR阳性率，用CD123抗原和CD7抗原染色，表示CAR-T细胞可以识别CD123和CD7抗原；细胞收获时，NS 0901-CAR T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞均具有较高的细胞活率(见图10)，其中敲除CD7的mock-T细胞的敲除效率为98.7％(见图11)。
(2)对于体外杀伤检测，结果显示，NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109CAR-T对CCRF-CEM和MOLM-13细胞都有强的杀伤力，在效靶比为2:1时，杀伤率可达80％以上(见图12A和12B)。
(3)对于细胞因子检测，结果显示，与靶细胞孵育18小时后，NS 0901-CAR-T、KO7-0901 CAR-T和KO7-0109 CAR-T细胞上清中均分泌较高的IFN-γ、TNF-α和IL-8(见图13A和13B)。
(4)对于小鼠体内抗肿瘤效果研究的结果如下：
①活体成像结果：给药后，D1、D8、D15进行活体成像。模型对照组动物体内荧光强度随着时间逐渐增强，表明了随试验进展动物体内肿瘤细胞数量逐渐增多(见图14)；CAR-T低、中、高剂量组动物总荧光值随着时间逐渐下降，在给药后D8时，CAR-T中、高剂量组动物总荧光值与模型对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)；在给药后D15时，CAR-T低、中、高剂量组动物总荧光值与模型对照组相比均具有显著性差异(P<0.05)(见图15)，表明了本发明构建的CAR-T细胞对于动物体内肿瘤具有一定的杀伤和/或抑制作用。
②CAR-T细胞在小鼠体内的表达结果：采用流式细胞术检测不同时间点(2-4h、D2、D5、D8、D15)外周血中CAR-T细胞的表达，反映血液中CAR-T细胞的动态变化情况。对于受试物CAR+CD3+/WBC，模型对照组在D2-D15无检出，CAR-T低、中、高剂量组在D2时表达量为最高值，随后呈下降趋势；D2时，CAR-T低、中、高剂量组CAR+占比相对模型对照组显著性升高(P<0.05)，D5、D8、D15时，CAR-T低、中、高剂量组CAR+占比相对模型对照组无显著变化(P>0.05)(见图16)；肿瘤造模NPG小鼠单次经尾静脉给予KO7-0109 CAR-T细胞，0.1×107、0.33×107、1.0×107CAR+T细胞/只剂量范围内具有一定程度的抑制体内KG-1a-LUC肿瘤细胞增殖效果，对肿瘤相关的临床症状明显改善，且试验期间未出现与药物相关的不良反应。
实施例3通用型CAR0901 T细胞的制备
在本实施例中，发明人利用靶向CD123和CD7双特异性纳米CAR的特点开发一种通用型CAR-T细胞，生产一种现成的(off-the-shelf)即用型治疗产品。本实施例中所述靶向CD123和CD7双特异性纳米通用型CAR-T细胞(UCAR0901 T)的详细介绍如下：发明人利用CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏T细胞受体α恒定(TRAC)位点，以消除TCR的表达，降低同种异体T细胞引发的移植物抗宿主病(GvHD)风险。靶向CD7的CAR可以特异性靶向患者自身T细胞和自然杀伤(NK)细胞(同种异体反应性杀伤细胞)，减少宿主抗移植物排斥反应(HvG)，同时靶向CD123的CAR可以清除AML肿瘤细胞(急性髓系白血病细胞)。
1、通用型CAR0901 T(UCAR0901 T)细胞的制备
Cas9蛋白、CD7-sgRNA和TRAC-sgRNA复合物(Cas9 RNP-CD7&TRAC)的制备：将9μgCas9蛋白和4.5μg CD7-sgRNA(CAUCAUUUACUACGAGGACG)(SEQ ID NO:28)和9μg TRAC-sgRNA(从Osborn等人获得)(GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU)(SEQ ID NO:29)加入到30μL EO buffer中，室温孵育10min，形成Cas9 RNP-CD7&TRAC复合物。上述序列中，A、G、C和U为核糖核苷酸，T为脱氧核糖核苷酸，第1-3位核苷酸的核糖中的2′-OH均替换为甲氧基，磷酸均被替换为硫代磷酸；倒数第1-3位核苷酸的核糖中的2′-OH均替换为甲氧基，磷酸均被替换为硫代磷酸；第1-20位核苷酸为TRAC基因的gRNA的靶标核苷酸序列。
将PBMC分选出来的T细胞，加入Dynabeads CD3/CD28活化磁珠进行激活，放入37℃、5％CO2细胞培养箱进行培养，培养48小时后，收集细胞，去除磁珠，用EO buffer重悬细胞，将Cas9 RNP-CD7&TRAC复合物加入到细胞中，混匀，室温孵育10min，对细胞进行电转，电转后继续培养24小时后，用上述制备的病毒浓缩(LV-0901)加入到T细胞中，离心2小时(2000rpm，35℃)进行慢病毒转染，继续培养至12-14天，获得UCAR0901 T细胞，只进行敲除CD7和TCR未转导慢病毒的T细胞作为mock-T细胞对照。
2、UCAR0901 T细胞体外抗肿瘤能力的研究
采用UCAR0901 T和mock-T细胞作为效应细胞，用CCRF-CEM-GFP-LUC细胞(表达CD7抗原)和MOLM-13-GEP-LUC细胞(表达CD123抗原)作为靶细胞。
体外杀伤效果测试：按效靶比2：1将效应细胞和靶细胞混匀，混合后孵育18-24小时，孵育结束后，加入
Figure BDA0003834460280000161
检测试剂，在荧光酶标仪上读取化学发光数值，计算杀伤率。杀伤率(％)＝(靶细胞RCL-实验细胞RCL)/靶细胞RCL。
细胞因子测试：按效靶比1：1将效应细胞和靶细胞混匀，混匀共同孵育18小时，取上清检测细胞因子的分泌。
3、实验结果
结果显示，细胞从0天培养到第12天时，UCAR0901 T细胞扩增21.6±8.2倍，mock-T细胞扩增22.8±6.9倍(见图17)；在收获时UCAR0901 T细胞的CAR阳性率为57.9±6.6％(见图18)；图19为CAR阳性率的流式代表图，用ERB染色作为CAR阳性率，用CD123抗原和CD7抗原染色，表示CAR-T细胞可以识别CD123和CD7抗原。CD7和TRAC敲除的mock-T细胞的双敲除效率为96.2％(见图20)。
对于体外杀伤效果检测，结果显示，与mock-T细胞相比，UCAR0901 T对CCRF-CEM和MOLM-13细胞都有强的杀伤力，在效靶比为2:1时，杀伤率可达80％以上(见图21A和21B)。
对于细胞因子检测，结果显示，与靶细胞孵育18小时后，UCAR0901 T细胞上清中分泌较高的IFN-γ、TNF-α和IL-8(见图22A和22B)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想，本领域技术人员还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括与CD123特异性结合的纳米抗体VHH01和与CD7特异性结合的纳米抗体VHH10；
优选地，所述纳米抗体VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQID NO:2、SEQ ID NO:3所示或分别与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述纳米抗体VHH10的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6所示或分别与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述纳米抗体VHH01的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示或与SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的氨基酸序列；
更优选地，所述纳米抗体VHH10的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示或与SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括跨膜结构域、胞内信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括EF1α、T2A、tEGFR；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括连接VHH01和VHH10的Linker；
优选地，所述嵌合抗原受体还包括tEGFR信号肽；
更优选地，所述跨膜结构域和铰链区包括下列分子的跨膜结构域和铰链区：CD8、4-1BB、PD-1、CD34、CD28、IgG1、IgG4、OX40、CD3ε；
最优选地，所述跨膜结构域和铰链区为CD8跨膜结构域和CD8铰链区；
最优选地，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示；
最优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、DAP10、DAP12、FYN；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、ICOS、CD27、CD19、CD4、CD28、CD8α、CD8β、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、CD278；
最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；
最优选地，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；
更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6；
最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；
更优选地，所述EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；
更优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；
更优选地，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；
更优选地，所述Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；
更优选地，所述tEGFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示；
最优选地，所述嵌合抗原受体选自以下组中的任一种：
(1)由EF1α、信号肽、纳米抗体VHH01、Linker、纳米抗体VHH10、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次连接得到的嵌合抗原受体；
(2)由EF1α、信号肽、纳米抗体VHH10、Linker、纳米抗体VHH01、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次连接得到的嵌合抗原受体；
(3)在(1)中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的嵌合抗原受体；
(4)在(2)中所述嵌合抗原受体的氨基酸序列的基础上经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸后形成的嵌合抗原受体。
2.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的序列为权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码序列、或其互补序列；
优选地，在所述嵌合抗原受体中，纳米抗体VHH01的核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示，纳米抗体VHH10的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示，CD8跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO:20所示，CD8铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO:21所示，CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:22所示，4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示，信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:24所示，EF1α的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，T2A的核苷酸序列如SEQ ID NO:25所示，tEGFR的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示，Linker的核苷酸序列如SEQ ID NO:27所示，tEGFR信号肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:31所示。
3.一种含有权利要求2所述多核苷酸的载体，其特征在于，所述载体包括克隆载体、表达载体；
优选地，所述载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
4.一种基因工程化的宿主细胞，其特征在于，所述基因工程化的宿主细胞含有权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体；
优选地，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞；
更优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；
更优选地，所述原核细胞包括支原体、衣原体、立克次氏体、细菌、放线菌、蓝细菌；
最优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞为哺乳动物细胞；
最优选地，所述哺乳动物细胞为免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
5.一种靶向CD123和CD7的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述通用型CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体并且不表达CD7和TCR；
优选地，所述T细胞来源于健康志愿者或供者；
更优选地，所述通用型CAR-T细胞中的CD7的编码基因和TCR的编码基因被敲除；
最优选地，所述TCR的α链和/或β链恒定编码区(即TRAC和/或TRBC)基因被敲除；
最优选地，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除；
最优选地，所述CD7的编码基因和TCR的编码基因被引入到所述T细胞的Cas9蛋白、CD7-sgRNA和TRAC-sgRNA形成的复合物所敲除；
最优选地，所述CD7-sgRNA的序列如SEQ ID NO:28所示；
最优选地，所述TRAC-sgRNA的序列如SEQ ID NO:29所示。
6.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物包括可检测标记的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的多核苷酸、赋予抗生素抗性的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的多核苷酸、与治疗剂结合或偶联的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的多核苷酸；
优选地，所述可检测标记包括荧光染料、化学发光标记物、胶体金、化学发光催化剂；
更优选地，所述化学发光标记物包括鲁米诺及其衍生物、吖啶酯或其衍生物、金刚烷、异鲁米诺及其衍生物、稀土元素、联吡啶钌配合物；
更优选地，所述化学发光催化剂包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；
优选地，所述抗生素抗性的基因包括青霉素抗性基因、四环素抗性基因、氯霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因；
优选地，所述治疗剂包括放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂；
更优选地，所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-14、IFN-γ、TNF-β、TNF-α、G-CSF、M-CSF；
更优选地，所述化疗剂包括顺铂、紫杉醇、长春新碱、门冬酰胺酶、奥沙利铂、草酸铂、乐沙定。
7.一种用于治疗CD123和/或CD7相关疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的宿主细胞、权利要求5所述的通用型CAR-T细胞和/或权利要求6所述的衍生物；
优选地，所述药物组合物还包括一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合；
优选地，所述CD123和/或CD7相关疾病包括：急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、NKT细胞白血病、外周T细胞淋巴、NKT细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤/母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸或载体引入到宿主细胞中的试剂；
优选地，所述试剂盒还包括将所述多核苷酸或载体引入到宿主细胞中的说明书。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种制备权利要求4所述基因工程化的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求2所述的多核苷酸或权利要求3所述的载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括脂质转染法、微注射、电穿孔、DNA载体、RNA载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(2)一种刺激哺乳动物靶细胞群或组织产生免疫应答的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：给哺乳动物施用有效量的权利要求4所述的基因工程化的宿主细胞或权利要求5所述的通用型CAR-T细胞；
(3)一种制备权利要求5所述通用型CAR-T细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
①获得活化的T细胞；
②通过CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除步骤①所述的T细胞中的CD7和TCR，得到CD7和TCR双敲除的通用型T细胞；
③用编码如权利要求1所述的靶向CD123和CD7的嵌合抗原受体表达的慢病毒载体来转染步骤②得到的通用型T细胞，获得靶向CD123和CD7的通用型CAR-T细胞；
优选地，步骤①中所述的T细胞来源于健康志愿者或供者；
优选地，步骤②中所述的TCR为TCR的α链恒定编码区(即TRAC)；
更优选地，所述CD7和TCR的编码基因被引入到所述T细胞的Cas9蛋白、CD7-sgRNA和TRAC-sgRNA形成的复合物所敲除；
最优选地，所述CD7-sgRNA的序列如SEQ ID NO:28所示；
最优选地，所述TRAC-sgRNA的序列如SEQ ID NO:29所示。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的宿主细胞、权利要求5所述的通用型CAR-T细胞、权利要求6所述的衍生物、权利要求7所述的药物组合物、权利要求8所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的药物中的应用；
(2)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的宿主细胞、权利要求5所述的通用型CAR-T细胞、权利要求6所述的衍生物在制备用于制备预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的免疫细胞的试剂盒中的应用；
(3)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的多核苷酸、权利要求3所述的载体、权利要求4所述的基因工程化的宿主细胞、权利要求5所述的通用型CAR-T细胞、权利要求6所述的衍生物、权利要求7所述的药物组合物、权利要求8所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的生物制剂中的应用；
(4)权利要求8所述的试剂盒在制备用于预防和/或治疗CD123和/或CD7相关疾病的免疫细胞中的应用；
优选地，所述CD123和/或CD7相关疾病包括：急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、淋巴母细胞淋巴瘤、NKT细胞白血病、外周T细胞淋巴、NKT细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤/母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
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