CN115724972A - 抗cd123的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了抗CD123的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用，所述纳米抗体为VHH01、VHH02，所述纳米抗体VHH01、VHH02与CD123均具有较好的亲和力和专属性，基于所述纳米抗体VHH01、VHH02构建得到的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体免疫细胞对CD123阳性细胞均具有显著的细胞毒性，在肿瘤治疗领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及抗CD123的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
CD123又称IL-3受体α链(IL-3Rα)，是一种分子量为75kDa的糖蛋白，仅表达于和IL-3结合的细胞，例如B淋巴细胞、巨核细胞、造血干/祖细胞、浆细胞样树突状细胞及单核细胞。CD123与其配体IL-3结合后可诱发酪氨酸磷酸化，进而促进造血细胞的增殖和分化及参与固有和适应性免疫应答、炎症反应等。相关研究学者经研究发现，45％的急性髓系白血病(Acute myelogenous leukemia，AML)患者存在CD123的过表达，过表达CD123的AML细胞具有更高的增殖活性和耐凋亡能力，存在着STAT5的持续磷酸化，患者初诊时肿瘤负荷更高且临床预后更差。此外，CD123在白血病干细胞和更多分化的白血病母细胞中均存在高表达，而在正常造血干细胞中低表达或不表达，因此，CD123是白血病相关抗原也是AML的特异性抗原，这使得CD123成为有望治疗AML的靶标。由于CD123在AML高表达，理论上以CD123为靶标的免疫治疗具有更安全有效的治疗效果，国内外也已经在进行以CD123为靶标的靶向药物的临床试验，但是功效均有限并且仍有安全性问题的发生，因此，筛选有效的靶向CD123的纳米抗体具有重要意义。
近些年来，免疫学领域中对于转化医学的研究越来越多，尤其是肿瘤免疫。肿瘤免疫治疗中应用较为广泛的是CAR-T细胞免疫治疗策略。在90年代早期，这种免疫治疗策略在转化医学中就获得了较好的效果。其中，靶向CD123分子的CAR-T细胞应用较为广泛，尤其是治疗AML等血液系统肿瘤。正常机体内的T细胞被有效刺激并发挥免疫学功能需要多重信号的调控，主要包括T细胞受体与MHC-抗原肽复合物的识别作为第一信号、T细胞表面的共刺激分子识别活化作为第二信号，甚至还需要细胞因子参与形成第三信号。这种嵌合抗原受体主要是将T细胞刺激和活化的过程所需的蛋白分子进行人工串联整合，从而促进T细胞的活化和特异性杀伤。CAR-T细胞的特异性杀伤主要依赖于前端的抗体分子部分的识别和结合。目前使用较为广泛的是基于人或其它种属的单克隆抗体单链可变区(Single chainFv，ScFv)对靶蛋白的特异性识别。但存在如下缺陷：在ScFv与纳米抗体亲和力相当的基础上，ScFv相对于纳米抗体而言分子量较大，在分子表达和功能发挥上均存在一定的局限性；ScFv由其亲本单克隆抗体衍生而来，在活性和稳定性等方面都可能存在一定的不足。
鉴于此，有必要提供新型有效的抗CD123的纳米抗体，用于构建新的嵌合抗原受体和/或融合蛋白，以解决现有技术存在的不足。
发明内容
针对现有技术存在的不足和本领域的实际需求，本发明的目的在于提供抗CD123的纳米抗体、嵌合抗原受体及其应用。本发明经筛选得到了高亲和力和高专属性的抗CD123纳米抗体VHH01、VHH02，将其分别作为嵌合抗原受体分子的抗原结合结构域构建CAR-T细胞，经实验验证发现，所述CAR-T细胞能够特异性识别杀伤CD123阳性细胞，在肿瘤治疗领域中具有重要的应用前景。
本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：
本发明的第一方面提供了抗CD123纳米抗体。
进一步，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；
所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示或分别为与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的氨基酸序列；
所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示或分别为与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15具有至少75％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:8所示或分别为与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的核苷酸序列；
所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示或分别为与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核苷酸序列。
进一步，所述VHH01的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ IDNO:1具有至少75％同一性的氨基酸序列；
所述VHH02的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述VHH01的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或与SEQ IDNO:2具有至少75％同一性的核苷酸序列；
优选地，所述VHH02的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示或与SEQ IDNO:10具有至少75％同一性的核苷酸序列。
在本发明的具体实施方案中，所述具有至少75％同一性的氨基酸序列或核苷酸序列是指与所述氨基酸序列或核苷酸序列具有75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
进一步，包括优选抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体也包括在本发明的范围之内。保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明的单克隆中和抗体结合性质和中和性质的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体均在本发明的保护范围内。此外，本发明的纳米抗体还包括人源与非人源抗体，以及具有与本发明的单克隆抗体相同功能或改造及优化的一切抗体。
本发明的第二方面提供了基于抗CD123纳米抗体的嵌合抗原受体。
进一步，所述嵌合抗原受体包含本发明第一方面所述的纳米抗体；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含EF1α、T2A、tEGFR；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；
更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6；
更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、PD-1、CD34、OX40、CD3ε、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；
更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、PD-1、CD34、CD3ε、CD8α、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、CD28、ICOS、CD27、CD19、CD4、CD8α、CD8β、HVEM、LIGHT、CD40、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、CD278；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、FYN；
最优选地，所述铰链区为CD8铰链区；
最优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、本发明第一方面所述的纳米抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；
最优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示或与SEQ IDNO:21具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示或与SEQ ID NO:23具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示或与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述tEGFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示或与SEQ ID NO:29具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示或与SEQ ID NO:31具有至少75％同一性的氨基酸序列。
本发明的第三方面提供了核酸分子。
进一步，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的纳米抗体或编码本发明第二方面所述的嵌合抗原受体。
进一步，编码本发明第一方面所述的纳米抗体或编码本发明第二方面所述的嵌合抗原受体的核酸分子包括具有上述核苷酸序列的保守核苷酸序列变体的核酸分子。所谓的保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在本发明的保护范围内。
本发明还提供了一种如前所述的核酸分子的DNA片段，所述DNA片段可以编码本发明第一方面所述的纳米抗体的重链可变区的任何区域，包括但不限于重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3。
在本发明的具体实施方案中，本发明所述的核酸分子可以通过例如标准化学合成方法和/或重组方法合成，或半合成地产生，例如通过组合化学合成和重组方法。编码序列与转录调控元件和/或与其他氨基酸编码序列的连接可以使用已确立的方法进行，例如限制酶切消化、连接和分子克隆。
本发明的第四方面提供了重组表达载体。
进一步，所述重组表达载体包含本发明第三方面所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
进一步，所述重组表达载体除了包含本发明第三方面所述的核酸分子外，还包含与所述核酸分子序列操作性相连的表达调控序列。
表达载体是指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的种类包括本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以使用。在表达载体中，除了含有复制起点外，还可含有标记基因和其他翻译控制元件。
本发明的第五方面提供了经工程改造的宿主细胞。
进一步，所述经工程改造的宿主细胞表达含有本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞；
最优选地，所述真核细胞为免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
本发明的第六方面提供了一种纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物。
进一步，所述纳米抗体-药物偶联物是通过将本发明第一方面所述的纳米抗体共价附着至小分子药物上得以形成的；
优选地，所述小分子药物包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂；
更优选地，所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、六甲密胺、氯乙环磷酰胺、异磷酰胺、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、福替目丁、环己亚硝脲、白消安、苏消安、英丙舒凡、氮烯咪胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂；
更优选地，所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁；
更优选地，所述抗肿瘤抗生素包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧正定霉素、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、光神霉素、丝裂霉素C、博来霉素、甲基苄肼；
更优选地，所述有丝分裂抑制剂包括紫杉醇、紫杉萜、长春碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨；
更优选地，所述染色质功能抑制剂包括托泊替康、依立替康、依托扑沙、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙；
更优选地，所述抗血管生成剂包括丙亚胺、马马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺；
更优选地，所述抗雌激素包括阿纳托唑、来曲唑、它莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、奥多昔芬、依西美坦；
更优选地，所述抗雄激素包括氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通、醋酸环丙氯地孕酮、非那司提、西咪替丁；
更优选地，所述免疫调节剂包括干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂；
优选地，所述试剂盒或组合物包含本发明第一方面所述的纳米抗体，本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞。
进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体，所述载体包括但不限于已经被美国食品与药品管理局认可的而可用于人类或动物的任何佐剂、载体、赋形剂、助流剂、稀释剂、表面活性剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、稳定剂、等渗压剂、溶剂或乳化剂等对组成药物组合物无副作用的各种形式的载体。
本发明还提供了一种包含本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段的检测产品。所述检测产品包括但不限于检测试剂、试剂盒、芯片或试纸。凡是包括本发明第一方面所述纳米抗体或其抗原结合片段能够检测出CD123的检测产品均包括在本发明的保护范围内。
本发明的第七方面提供了如下任一种方法：
(1)一种生产本发明第一方面所述的纳米抗体的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞，从培养物中分离出本发明第一方面所述的纳米抗体；
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD123的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与本发明第一方面所述的纳米抗体接触，检测所述纳米抗体与CD123的复合物的形成；
优选地，所述纳米抗体是被可用于检测的标记物标记的纳米抗体；
更优选地，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素；
最优选地，所述荧光色素为荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
最优选地，所述亲和素为生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；
最优选地，所述放射性同位素为放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；
(3)一种制备本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第四方面所述的重组表达载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；
更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；
最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；
更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(4)一种体外特异性地抑制CD123活性的方法，所述方法包括如下步骤：将本发明第三方面所述的核酸分子导入到生物体细胞中，通过表达本发明第一方面所述的纳米抗体抑制CD123的活性。
本发明的第八方面提供了如下任一方面的应用：
(1)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在检测CD123蛋白或其抗原片段中的应用；
(2)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于检测CD123蛋白或其抗原片段的产品中的应用；
(3)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于诊断CD123相关疾病的产品中的应用；
(4)本发明第一方面所述的纳米抗体、本发明第二方面所述的嵌合抗原受体、本发明第三方面所述的核酸分子、本发明第四方面所述的重组表达载体、本发明第五方面所述的经工程改造的宿主细胞、本发明第六方面所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于治疗表达CD123的肿瘤的药物中的应用；
(5)本发明第三方面所述的核酸分子或本发明第四方面所述的重组表达载体在制备经工程改造的宿主细胞中的应用；
优选地，所述肿瘤为血液系统肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
进一步，所述CD123相关疾病是指高表达CD123的疾病，包括高表达CD123的血液系统肿瘤等。
本发明公开的纳米抗体可以在重链可变区包含一个或多个糖基化位点，如本领域技术人员熟知的，在重量可变区中存在的一个或多个糖基化位点可以增强抗体免疫原性，或者由于改变了抗原结合而改变抗体的药物动力学。
本发明公开的纳米抗体可以以化学方法或者通过基因工程与其他因子缀合。这些因子提供将抗体靶向所需功能位点的作用或者为抗体提高或提供其他性能。
根据本发明的纳米抗体可以以化学方法或者通过基因工程标记，以提供可检测的纳米抗体，可检测的抗体包括可检测部分。可检测的部分包括但不限于酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。
为了检测和/或分析和/或诊断目的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术、激光扫描细胞计量术检测、荧光免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、生物测定(例如吞噬作用测定)、蛋白质印迹应用等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
本发明提供的两种抗CD123的纳米抗体VHH01和VHH02对CD123均具有高亲和力和高专属性，且目前尚未见报道。本发明进一步利用基因工程技术将所述纳米抗体表达于免疫细胞中，由此构建得到的表达抗CD123嵌合抗原受体的免疫细胞对CD123阳性肿瘤细胞具有显著的杀伤作用，在治疗CD123阳性急性髓系白血病方面具有重要的应用前景。
附图说明
图1为羊驼免疫流程图；
图2为噬菌体淘选后阳性组与阴性组比值的结果统计图；
图3为单克隆筛选阳性克隆OD值统计结果图；
图4为抗CD123单克隆纳米抗体(VHH)的ELISA亲和力检测结果图，其中，A图：VHH01，B图：VHH02；
图5为抗CD123单克隆纳米抗体(VHH)的SPR方法检测亲和力结果图，其中，A图：VHH01，B图：VHH02；
图6为抗CD123单克隆纳米抗体(VHH)的专属性检测结果图，其中，A图：纳米抗体与K562细胞系和CD123阳性细胞系K562-CD123的结合情况，B图纳米抗体与MOLM-13细胞系的结合情况；
图7为流式细胞术对构建得到的细胞系K562-CD123的CD123表达情况进行验证得到的结果图；
图8为单VHH CAR-T结构示意图；
图9为CAR-T细胞培养流程图；
图10为K562-NMC009细胞表面VHH与人CD123-His抗原结合MFI统计结果图；
图11为单VHH CAR-T细胞流式细胞术检测代表性结果图，其中，A图：细胞表面tEGFR的表达情况，B图：细胞表面纳米抗体的表达情况；
图12为单VHH CAR-T细胞表面VHH与人CD123-His抗原结合MFI统计结果图；
图13为单VHH CAR-T细胞培养后期CD4/CD8比例的统计结果图；
图14为单VHH CAR-T细胞扩增曲线图；
图15为单VHH CAR-T细胞杀伤比例统计结果图；
图16为双VHH CAR-T结构示意图；
图17为双VHH CAR-T细胞流式细胞术检测代表性结果图，其中，A图：细胞表面tEGFR的表达情况，B图：细胞表面纳米抗体的表达情况；
图18为双VHH CAR-T细胞表面VHH与人CD123-His抗原结合MFI统计结果；
图19为双VHH CAR-T细胞扩增结果图；
图20为双VHH CAR-T细胞杀伤比例统计结果。
具体实施方式
本发明通过深入的研究，经过大量的筛选，成功获得纳米抗体VHH01和VHH02。具体地，本发明利用CD123抗原蛋白免疫羊驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将抗原分子偶联在酶标板上，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了CD123特异性的纳米抗体基因。实验结果表明，本发明获得纳米抗体能够有效地与CD123抗原结合，且基于所述纳米抗体制备得到的CAR-T细胞能够有效杀伤肿瘤细胞。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“纳米抗体”、“VHH”、“VHH抗体片段”无区别地使用，并且表示在骆驼科动物中发现的那些类型的抗体的单个重链的可变结构域。在没有轻链的情况下，纳米抗体各自具有三个CDR，分别表示为CDR1、CDR2和CDR3。它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(Nanobody，Nb)也被称为VHH。纳米抗体/单域抗体作为一种新型的小分子抗体片段，由驼类天然的重链抗体重链可变区(VHH)克隆获得。其具有优良的生物学特性，分子量12-15kDa，是完整抗体的十分之一，具有很好的组织穿透性，特异性高，水溶性好。
在本发明中，术语“亲和力”是指大分子与其结合的抗原之间的结合能力，特别是纳米抗体与其结合的抗原之间的结合能力，例如本发明的纳米抗体和如上所定义的病理形式的CD123蛋白之间的结合能力。
本发明所述的纳米抗体的亲和力，可以通过几种方法在体外测量，包括表面等离子体共振或通过ELISA测定。
在本发明中，术语“可变”是指抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。可变性集中于重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。天然重链的可变区中各自包含四个FR区(可变区中较保守的部分)，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
本发明提供的非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD123的方法中，所述“样品”在本文中意指较大元件的一部分。优选地，样品是生物来源的物质。其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体例如，是指来源于感兴趣的受试者的任何样品，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样品包括但不限于组织样品(例如肿瘤组织样品)、原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰、泪液、汗液，粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物如匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物、及其组合。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1抗CD123纳米抗体的筛选
1、CD123抗原制备
利用RNA提取试剂盒提取T细胞中的RNA。参考SuperScriptTMII ReverseTranscriptase使用说明书，利用random primers引物进行反转录，获得cDNA。以cDNA为模板，通过PCR获得抗原CD123的胞外区基因序列。将CD123胞外区基因序列连接入蛋白表达载体中进行表达，并进行Ni柱纯化，获得纯化的CD123-His蛋白。
2、纳米抗体文库的构建
利用本发明自主纯化的CD123-His蛋白进行羊驼免疫，具体羊驼免疫流程图见图1。每周进行1次免疫，共连续进行6次免疫；最后一次免疫7天后采集外周血100mL，通过Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞，并进行RNA的提取，并利用反转录试剂盒进行cDNA的制备；利用SOE-PCR获得VHH片段，并将其连接入pMES4噬菌体展示载体；将连接产物电转化至电转感受态细胞TG1中，所得菌库即为构建的CD123的单域重链抗体噬菌体展示文库；文库构建完成后，为检测文库的插入效率，随机选择25个克隆利用引物MP57以及GIII进行了菌落PCR，并将PCR产物进行Sanger测序。
3、纳米抗体的富集筛选
3.1、噬菌体纳米抗体文库的扩增
取TG1大肠杆菌纳米抗体文库转接到2-YT液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD值为0.5，然后加入辅助噬菌体VCSM13对细胞进行侵染。轻轻混合后在37℃下孵育30分钟。离心菌液以去除微量葡萄糖，再将沉淀重悬于同时加有氨苄和卡那霉素抗性的2-YT培养基中，37℃、200rpm摇培过夜，以扩增展示纳米抗体的噬菌体；将过夜培养物转移到50mL离心管中，离心取上清液，并添加20％(wt/vol)PEG6000/2.5M NaCl溶液沉淀噬菌体。离心弃上清，PBS重悬沉淀，离心取上清至新的离心管中添加20％(wt/vol)PEG6000/2.5MNaCl溶液重新沉淀噬菌体。离心弃上清，并将沉淀重新悬浮于1mL PBS中。离心后将上清液转移到新的离心管中，添加甘油至终浓度为20％保存于-80℃中；噬菌体纳米抗体库滴度测定，将噬菌体按10倍梯度进行稀释，取不同稀释倍数的噬菌体对对数生长期的TG1细菌进行侵染，37℃过夜培养，通过第二天的菌斑数目推算噬菌体纳米抗体库的滴度。
3.2、噬菌体富集筛选
通过ELISA方法对纳米抗体进行淘选，将重组CD123-His蛋白包被在酶标板上，在4℃下孵育过夜；用250μL PBST清洗酶标板三次，添加200μL封闭液，于室温孵育酶标板2h；在每个孔中加入相对应的噬菌体，室温孵育2h；250μL PBST洗板15次；每孔添加100μL浓度为0.25mg/mL的胰蛋白酶，室温700rpm孵育0.5h；用AEBSF洗脱噬菌体；将洗脱下的噬菌体进行滴度测定和噬菌体侵染扩增；洗脱下的噬菌体数量阳性：阴性≥100时，停止淘选。
4、阳性单克隆的筛选与鉴定
从经过3轮筛选后得到的TG1大肠杆菌文库中挑选单个克隆进行扩大培养，并利用辅助噬菌体VCSM13进行侵染，进行单克隆噬菌体的制备；将单克隆噬菌体加入到包被有CD123-His蛋白的培养板中，室温孵育2h；PBST清洗板子后，加入HA-HRP抗体，室温孵育1h；PBST清洗板子后，加入100μL TMB单组份显色液，室温孵育30min后加入100μL终止液；利用酶标仪检测450nm处的吸光度；当样品孔的OD450值与空白对照比例大于2时判定为阳性克隆；对阳性克隆进行菌液PCR，进行Sanger测序；经过Sanger测序的单克隆，利用软件DNAMAN进行序列比对。并筛选出序列特异性的克隆。
5、实验结果
纳米抗体文库的构建结果显示，本发明成功构建测定CD123的纳米抗体文库，库容量为4.8E7，插入率接近95％。
淘选结果见表1和图2，结果显示，淘选三轮后，阳性组与阴性组的比值达到了1656倍，已达到了筛选单克隆的标准。所以淘选三轮后，停止淘选，进行下一步单克隆的筛选和鉴定。
表1噬菌体淘选结果
| 筛选次数 | CD123 | 空白 | 比例 |
| 第一次筛选 | 3.83×10<sup>4</sup> | 2.33×10<sup>4</sup> | 1.64:1 |
| 第二次筛选 | 1.75×10<sup>6</sup> | 3.60×10<sup>4</sup> | 49:1 |
| 第三次筛选 | 7.17×10<sup>7</sup> | 4.33×10<sup>4</sup> | 1656:1 |
阳性单克隆的筛选与鉴定结果见图3，结果显示，本实施例共筛选到阳性克隆2个，阳性克隆OD450值如图3所示，所述序列特异性的纳米抗体的编号分别为VHH01、VHH02，VHH01、VHH02的可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:9所示，VHH01、VHH02的可变区核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10所示，其中，VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7所示，VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15所示，VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示，VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16所示。
实施例2纳米抗体的表达及亲和力和专属性检测
1、重组抗体表达
通过PstI和BstEII双酶切将纳米抗体序列插入至pET-28a-Sumo-Nb-CH(本实验室留存，序列信息如SEQ ID NO:33所示)质粒的PstI和BstEII酶切位点之间。在VHH序列的N端包括SUMO标签(SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白，研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，还具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能)，在VHH序列的C端带有6*His标签，用于蛋白纯化。测序正确后提取质粒，然后转化至大肠杆菌菌株BL21中，并在IPTG诱导下进行蛋白表达；表达完成后收集菌体进行超声裂解菌体获得粗提蛋白；经过镍柱离子亲和层析纯化获得纯度较高的纳米抗体。
2、亲和力检测方法
2.1、ELISA检测抗体亲和力
本实施例中采用ELISA检测方法测定抗体的亲和力，将制备得到的CD123-His蛋白进行过夜包被，以经过表达纯化后不同稀释度的2个抗体(VHH01、VHH02)作为分析物进行实验，检测各个抗体与CD123抗原之间的亲和力。
2.2、SPR方法检测抗体亲和力
将表达纯化后的VHH01-His和VHH02-His抗体用于SPR测定。使用Biacore 8K分析系统通过SPR测定每种VHH对CD123蛋白的亲和力。首先，将抗人IgG1 Fc抗体以25μg/mL共价偶联至CM5传感器芯片；然后，用抗人IgG1 Fc抗体去捕获CD123-hFc蛋白作为固定相；再将倍比稀释的VHH01-His和VHH02-His作为流动相以20μL/min的流速注射，然后进行解离；最后，使用Biacore Insight Evaluation Software 3.0.12.15655软件测定缔合和解离速率常数。
2.3、专属性检测方法
以纯化后纳米抗体为一抗，以HIS-FITC抗体为二抗通过流式细胞术检测2个纳米抗体(VHH01、VHH02)与K562、K562-CD123、MOLM-13细胞系的结合情况，以此来确定纳米抗体VHH01、VHH02对人CD123抗原的专属性。
3、实验结果
ELISA方法检测抗体亲和活性结果见图4A、4B，结果显示，VHH01的EC50值为0.1318nM；VHH02的EC50值为0.7219nM。上述结果再次表明了本发明经筛选鉴定得到的2个抗CD123纳米抗体(VHH01、VHH02)与人CD123具有较好的亲和力。
SPR方法检测抗体亲和活性结果如表2和图5A、5B所示，VHH01与人CD123蛋白之间的亲和力常数为1.16E-08；VHH01与人CD123蛋白之间的亲和力常数为6.37E-08。以上结果均表明了本发明经筛选鉴定得到的2个抗CD123纳米抗体(VHH01、VHH02)与人CD123具有较好的亲和力。
表2SPR方法测定抗体亲和力的结果统计
专属性检测结果见图6A和6B，流式结果显示，2个VHH(VHH01、VHH02)均未与K562发生特异性结合，但是均与CD123阳性细胞系K562-CD123、MOLM-13发生了特异性结合。表明了本发明筛选鉴定得到的2个单VHH均为人源CD123特异的。
实施例3K562-CD123稳转细胞系的构建
1、实验方法
以实施例1中获得的cDNA为模板，用PCR的方式获得CD123全长序列，并且两端带有Xho I和EcoR I酶切位点，通过双酶切、连接方式将该序列插入慢病毒载体pLVX-Puro载体中，重组质粒命名为pLVX-CD123-Puro。该重组质粒采用CMV启动子，并带有嘌呤霉素抗性基因。
将目的质粒pLVX-CD123-Puro连同慢病毒辅助质粒一起进行慢病毒包装。CAR-T细胞制备前，首先进行慢病毒的包装：将目的质粒与三个辅助质粒(pMD2.G、pRSV-REV、pMDLg)在PEI-Pro作用下共转染293FT细胞；包装6小时进行换液；包装48小时后进行慢病毒收获；收获的慢病毒原液进行超速离心浓缩，用DMEM高糖培养基重悬慢病毒颗粒，并进行分装备用。
构建阳性细胞系前，首先进行抗生素耐受性的测试。将铺有K562细胞系的24孔板中加入含有不同浓度的嘌呤霉素，DMEM+10％FBS完全培养基，当嘌呤霉素浓度到达2μg/mL时，K562细胞全部死亡。证明该浓度为K562最大耐受浓度，后续阳性细胞系用该浓度进行筛选。将包装完成的慢病毒进行库K562细胞系的转导，按照预先测试出的抗生素浓度加入到转导后的细胞系中，同时做K562的对照。当对照组细胞全部死亡，实验组细胞仍有存活时停止筛选。实验组细胞系继续进行培养，同时加入最高筛选浓度的嘌呤霉素。最终获得高表达CD123的细胞系K562-CD123。筛选完成后，利用流式细胞术对细胞系K562-CD123的CD123的表达情况进行验证，并用K562细胞系做阴性对照。
2、实验结果
结果见图7，结果显示，构建得到的K562-CD123稳转细胞系高表达CD123，即本发明成功构建得到了K562-CD123稳转细胞系。
实施例4单VHH CAR-T细胞的制备及体外功能验证
1、单VHH CAR结构构建
将序列特异性的克隆进行单VHH CAR结构构建。首先，利用PCR的方法扩增阳性克隆株的VHH序列；第一轮PCR结束后，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR；将第二轮PCR产物通过同源重组的方式，连接入载体Senl-S88BZ，载体用Not I单酶切。至此，包含有靶向CD123单VHH的CAR结构构建成功，结构示意图如图8，引物序列见表3。
表3单VHH CAR结构构建用引物列表
共构建2个单VHH CAR结构，分别命名为NMC009-01、NMC009-02，结构如图8所示，EF1α为延长因子1α的启动子，Leader是信号肽的编码序列，VHH是抗CD123的纳米抗体的编码序列，CD8H+TM为CD8铰链区和跨膜区，4-1BB和CD3ζ胞内信号区为胞内共刺激域，通过T2A肽连接表达tEGFR胞外区域，以便慢病毒转导后检测CAR的表达。
其中，在VHH CAR结构中，信号肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示，CD8铰链区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19、SEQID NO:20所示，CD8跨膜区的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22所示，4-1BB的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示，CD3ζ的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26所示，T2A的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28所示，tEGFR信号肽的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30所示，tEGFR的氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQID NO:31、SEQ ID NO:32所示。
2、慢病毒包装
CAR-T细胞制备前，首先进行慢病毒的包装：将目的质粒与三个辅助质粒(pMD2.G、pRSV-REV、pMDLg)在PEI-Pro作用下共转染293FT细胞；包装6小时进行换液；包装48小时后进行慢病毒收获；收获的慢病毒原液进行超速离心浓缩，用DMEM高糖培养基重悬慢病毒颗粒，分装备用。
3、K562-NMC009细胞制备
慢病毒包装完成后，将慢病毒进行K562细胞系的转导。并将转导NMC009系列慢病毒的K562进行培养，培养3天后进行流式细胞术检测，用CD123-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况。并对K562表面VHH的MFI进行统计。
4、CAR-T细胞制备
慢病毒包装完成后，进行CAR-T细胞的制备：采集患者或健康供者外周血单个核细胞(PBMC)；通过CD3磁珠进行αβT细胞分选；分选完成的αβT细胞在TexMACS GMP培养基(MACS)中进行培养；2天后进行慢病毒的转导；继续培养到12-14天进行CAR-T细胞收获，获得靶向CD123的VHH CAR-T细胞(分别命名为NMC009-01和NMC009-02)，CAR-T细胞培养流程如图9所示；培养过程中进行流式检测，测定CAR+细胞的比例，用抗EGFR抗体检测tEGFR的表达，用CD123-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况，并且对用CD123-His抗原检测CAR-T细胞表面VHH的MFI值进行统计。在细胞培养的第5天、第8天、第11天、第14天分别进行细胞计数，统计细胞扩增情况。并在培养的后期进行CAR-T细胞CD4/CD8比例进行统计。
5、CAR-T细胞的体外功能验证
为了验证本实施例制备得到的抗CD123 VHH CAR-T细胞的体外生物学活性，培养过程中进行了体外杀伤实验的验证：首先收集靶细胞K562-CD123(K562为人慢性髓原白血病细胞)，2000rpm离心5min，DPBS重悬计数，按1×105个/孔的数量加到96孔板中。然后根据不同效靶比(E：T＝0.3：1、1：1、3：1)向靶细胞中添加适量的效应细胞，混合后孵育4小时，流式细胞术检测细胞杀伤比例。
6、实验结果
将单VHH结构转导K562细胞后，K562细胞表面VHH的MFI统计结果如图10所示，K562-NMC009-01、K562-NMC009-02细胞表面VHH MFI值分别为：5190±380.43、5160±468.11。
将单VHH结构转导T细胞制备CAR-T细胞，CAR-T细胞培养6天后的流式细胞术代表性检测结果见图11，分别检测了CAR-T细胞表面tEGFR的表达，及纳米抗体的表达情况，其中图11A显示的是细胞表面tEGFR的表达情况，NMC009-01、NMC009-02的阳性率分别为：17.84％、45.5％，图11B显示的是细胞表面纳米抗体的表达情况，NMC009-01、NMC009-02的阳性率分别为：13.16％、36.92％；图12显示的是CAR-T细胞表面纳米抗体MFI统计情况，NMC009-01、NMC009-02细胞表面VHH MFI值分别为：683±8.48和671±36.06，均高于空白T细胞的131±23.33。细胞培养后期CD4/CD8比值如图13所示，NMC009-01、NMC009-02的CD4/CD8比值分别为3.04±0.18、2.83±0.68。
单VHH CAR-T扩增曲线见图14，由图可知，扩增到第14天，NMC009-01的平均扩增倍数为66.6±9.33倍，NMC009-02的扩增倍数为63.25±4.03倍，空白T细胞的扩增倍数为77.3±4.38倍。
CAR-T细胞的体外功能验证结果见图15，结果显示，在杀伤比例为0.3：1、1：1、3：1时，NMC009-01对K562-CD123的杀伤值分别为19.70±2.40％、45.15±3.04％、77.60±8.34％，NMC009-02对K562-CD123的杀伤比例分别为14.90±0.42％、36.05±8.56％、65.40±10.04％，空白T细胞对K562-CD123的杀伤比例分别为11.00±0.42％、11.25±1.91％、14.05±0.92％。
实施例5双VHH CAR-T细胞的制备
1、双VHH CAR结构构建
将本发明筛选到的纳米抗体VHH01和VHH02用于构建双VHH的CAR结构目的质粒，双VHH CAR的结构示意图如图16所示。首先，利用PCR的方法扩增阳性克隆株的VHH02序列；第一轮PCR结束后，以第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，引物序列见表4；然后，将第二轮PCR产物通过同源重组的方式，连接入载体NMC009-01中，载体用Not I单酶切重组质粒命名为dNMC009-A。
表4单VHH CAR结构构建用引物列表
2、双VHH CAR-T细胞的制备
按照实施例4中CAR-T细胞的制备流程，同时进行dNMC009-A、NMC009-01、NMC009-02 CAR-T细胞的培养，培养过程中进行流式检测，测定CAR+细胞的比例，用抗EGFR抗体检测tEGFR的表达，用CD123-His蛋白作一抗，抗His标签抗体为二抗检测细胞表面纳米抗体的表达情况，并且对用CD123-His抗原检测CAR-T细胞表面VHH的MFI值进行统计。在CAR-T细胞培养的第6天、第9天、第13天、第16天进行细胞计数，用于观察CAR-T细胞的扩增情况。
3、dNMC009-A双VHH CAR-T细胞的体外功能实验验证
为比较dNMC009-A与单VHH CAR-T的体外功能，在dNMC009-A、NMC009-01、NMC009-02 CAR-T细胞培养的第11天，CAR-T细胞以及空白T细胞分别与CD123表达阳性细胞系K562-CD123按照不同比例进行细胞杀伤实验：首先收集靶细胞，2000rpm离心5min，DPBS重悬计数，进行CFSE染色，并按照1E5/孔的数量添加到96孔板中。然后根据不同效靶比(E：T＝0.3：1、1：1、3：1)向靶细胞中添加适量的效应细胞，混合后孵育4小时，流式细胞术检测细胞杀伤比例。
4、实验结果
CAR-T细胞培养6天后的流式细胞术代表性检测结果见图17，分别检测了CAR-T细胞表面tEGF及纳米抗体的表达情况，其中，图17A显示的是细胞表面tEGFR的表达情况，NMC009-01、NMC009-02、dNMC009-A的阳性率分别为：84.1％、76.1％、73.0％，图17B显示的是细胞表面纳米抗体的表达情况，NMC009-01、NMC009-02、dNMC009-A的阳性率分别为：22.42％、23.5％、18.14％。图18显示的是CAR-T细胞表面纳米抗体MFI统计情况，NMC009-01、NMC009-02、dNMC009-AMFI值分别为：481.5±55.86、285.5±99.7、319±53.03，均高于空白T细胞的88.8±8.06。
扩增曲线见图19，由图可知，扩增到第16天，dNMC009-A的扩增倍数为76.4±1.40倍，NMC009-01的扩增倍数为71.77±3.62倍，NMC009-02的扩增倍数为69.05±1.63倍。
体外功能验证结果见图20，结果显示，在杀伤比例为0.3：1、1：1、3：1时，dNMC009-A对K562-CD123的杀伤均值分别为16.60±1.70％、34.50±1.84％、70.50±3.11％；NMC009-01对K562-CD123的杀伤均值分别为12.20±4.24％、25.85±5.15％、67.75±2.19％；NMC009-02对K562-CD123的杀伤均值分别为7.77±0.76％、20.00±2.69％、55.15±2.90％，表明了本发明基于纳米抗体VHH01和/或VHH02构建得到的dNMC009-A与单VHH CAR-T对CD123阳性的肿瘤细胞均具有高效的杀伤效果。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想，本领域技术人员还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.抗CD123纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括VHH01、VHH02；
所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ IDNO:7所示或分别为与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的氨基酸序列；
所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQID NO:15所示或分别为与SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15具有至少75％同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述VHH01的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8所示或分别为与SEQ ID NO:4、SEQID NO:6、SEQ ID NO:8具有至少75％同一性的核苷酸序列；
所述VHH02的CDR1、CDR2、CDR3的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQID NO:16所示或分别为与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16具有至少75％同一性的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的纳米抗体，其特征在于，所述VHH01的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或与SEQ ID NO:1具有至少75％同一性的氨基酸序列；
所述VHH02的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示或与SEQ ID NO:9具有至少75％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述VHH01的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示或与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性的核苷酸序列；
优选地，所述VHH02的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示或与SEQ ID NO:10具有至少75％同一性的核苷酸序列。
4.基于抗CD123纳米抗体的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含信号肽；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含铰链区；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含EF1α、T2A、tEGFR；
优选地，所述嵌合抗原受体还包含tEGFR信号肽；
更优选地，所述信号肽包括下列分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6；
更优选地，所述铰链区包括下列分子的铰链区：CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、PD-1、CD34、OX40、CD3ε、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；
更优选地，所述跨膜结构域包括下列分子的跨膜结构域：CD8、CD28、IgG1、IgG4、4-1BB、PD-1、CD34、CD3ε、CD8α、IL-2受体、IL-7受体、IL-11受体；
更优选地，所述共刺激信号结构域包括下列分子的共刺激信号结构域：4-1BB、CD28、ICOS、CD27、CD19、CD4、CD8α、CD8β、HVEM、LIGHT、CD40、OX40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、CD278；
更优选地，所述胞内信号传导结构域包括下列分子的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、TCRζ、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD79a、CD79b、CD278、FcεRI、DAP10、DAP12、CD66d、FYN；
最优选地，所述铰链区为CD8铰链区；
最优选地，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
最优选地，所述共刺激信号结构域为4-1BB共刺激信号结构域；
最优选地，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
最优选地，所述嵌合抗原受体为EF1α、信号肽、权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域、T2A、tEGFR信号肽、tEGFR依次串联得到；
最优选地，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示或与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示或与SEQ ID NO:21具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示或与SEQID NO:23具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示或与SEQID NO:25具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示或与SEQ ID NO:17具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示或与SEQ ID NO:27具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述tEGFR信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示或与SEQ ID NO:29具有至少75％同一性的氨基酸序列；
最优选地，所述tEGFR的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示或与SEQ ID NO:31具有至少75％同一性的氨基酸序列。
5.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体或编码权利要求4所述的嵌合抗原受体。
6.重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求5所述的核酸分子；
优选地，所述表达载体包括DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、病毒来源的载体；
更优选地，所述病毒来源的载体包慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体。
7.经工程改造的宿主细胞，其特征在于，所述经工程改造的宿主细胞表达含有权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的重组表达载体；
优选地，所述宿主细胞包括真核细胞、原核细胞；
更优选地，所述宿主细胞为真核细胞；
最优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞；
最优选地，所述真核细胞为免疫细胞；
最优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞、iNKT细胞、CTL细胞、树突状细胞、髓样细胞、单核细胞、巨噬细胞或其任意组合；
最优选地，所述免疫细胞为T细胞。
8.一种纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物，其特征在于，所述纳米抗体-药物偶联物是通过将权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体共价附着至小分子药物上得以形成的；
优选地，所述小分子药物包括烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、染色质功能抑制剂、抗血管生成剂、抗雌激素、抗雄激素、免疫调节剂；
更优选地，所述烷化剂包括双氯乙基甲胺、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、溴丙哌嗪、松龙苯芥、磷雌氮芥、环磷酰胺、六甲密胺、氯乙环磷酰胺、异磷酰胺、三胺硫磷、卡氮芥、链唑霉素、福替目丁、环己亚硝脲、白消安、苏消安、英丙舒凡、氮烯咪胺、顺铂、奥沙利铂、卡铂；
更优选地，所述抗代谢物包括甲氨喋呤、5-氟脲嘧啶、氟苷、5-氟脱氧尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤(6-MP)、6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、2-氯脱氧腺苷、5-氮杂胞苷、2，2-二氟脱氧胞嘧啶核苷、克拉屈滨、脱氧柯福霉素、喷司他丁；
更优选地，所述抗肿瘤抗生素包括阿霉素、柔红霉素、去甲氧正定霉素、戊柔比星、盐酸米托蒽醌、更生霉素、光辉霉素、光神霉素、丝裂霉素C、博来霉素、甲基苄肼；
更优选地，所述有丝分裂抑制剂包括紫杉醇、紫杉萜、长春碱、长春新碱、长春酰胺、长春瑞滨；
更优选地，所述染色质功能抑制剂包括托泊替康、依立替康、依托扑沙、磷酸依托扑沙、鬼臼噻吩甙；
更优选地，所述抗血管生成剂包括丙亚胺、马马司他、巴马司他、普啉司他、坦诺司他、伊洛马司他、CGS-27023A、溴氯哌喹酮、COL-3、新伐司他、BMS-275291、沙立度胺；
更优选地，所述抗雌激素包括它莫西芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、奥多昔芬、阿纳托唑、来曲唑、依西美坦；
更优选地，所述抗雄激素包括氟他米特、尼鲁米特、比卡鲁胺、安体舒通、醋酸环丙氯地孕酮、非那司提、西咪替丁；
更优选地，所述免疫调节剂包括干扰素、白介素、肿瘤坏死因子、蘑菇多糖、西佐糖、罗喹美克、匹多莫特、甲氧聚乙二醇琥珀酰胺腺甙脱氨酶、胸腺肽制剂；
优选地，所述试剂盒或组合物包含权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、权利要求4所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞。
9.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种生产权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞，从培养物中分离出权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体；
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中CD123的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体接触，检测所述纳米抗体与CD123的复合物的形成；
优选地，所述纳米抗体是被可用于检测的标记物标记的纳米抗体；
更优选地，所述可用于检测的标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素；
最优选地，所述荧光色素为荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
最优选地，所述亲和素为生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；
最优选地，所述放射性同位素为放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；
(3)一种制备权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求6所述的重组表达载体引入到宿主细胞中；
优选地，所述引入的方法包括物理方法、化学方法、生物方法；
更优选地，所述物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔；
更优选地，所述化学方法包括胶体分散系统、基于脂质的系统；
最优选地，所述胶体分散系统包括大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；
最优选地，所述基于脂质的系统包括水包油乳剂、胶束、混合胶束、脂质体；
更优选地，所述生物方法包括DNA载体、RNA载体、慢病毒载体、痘病毒载体、单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体；
(4)一种体外特异性地抑制CD123活性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求5所述的核酸分子导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体抑制CD123的活性。
10.如下任一方面的应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、权利要求4所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求8所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在检测CD123蛋白或其抗原片段中的应用；
(2)权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、权利要求4所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求8所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于检测CD123蛋白或其抗原片段的产品中的应用；
(3)权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、权利要求4所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求8所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于诊断CD123相关疾病的产品中的应用；
(4)权利要求1-3中任一项所述的纳米抗体、权利要求4所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的重组表达载体、权利要求7所述的经工程改造的宿主细胞、权利要求8所述的纳米抗体-药物偶联物或试剂盒或组合物在制备用于治疗表达CD123的肿瘤的药物中的应用；
(5)权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的重组表达载体在制备经工程改造的宿主细胞中的应用；
优选地，所述肿瘤为血液系统肿瘤；
更优选地，所述肿瘤包括急性髓系白血病、急性B淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、慢性髓系白血病、急性T淋巴细胞白血病、慢性B淋巴细胞白血病、慢性T淋巴细胞白血病、Richter综合征、毛细胞性白血病、非霍奇金淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤。
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