CN116987192A - 抗人b淋巴细胞刺激因子受体baffr的抗原结合多肽及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗人B淋巴细胞刺激因子受体BAFFR的抗原结合多肽及其用途。特别涉及抗BAFFR的纳米抗体。本发明还提供编码所述抗原结合多肽的核苷酸序列、包含所述核苷酸序列的表达载体或宿主细胞，以及用于制备该纳米抗体的方法。还提供包含本发明纳米抗体的药物组合物及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学和生物医药技术领域，具体涉及一种特异性结合B淋巴细胞刺激因子受体BAFFR的纳米抗体(VHH抗体)、其制备方法以及相关用途。
背景技术
B淋巴细胞刺激因子(B lymphocyte stimulator factor，BAFF；也称为TNFSF13B)是一种属于肿瘤坏死因子家族的细胞因子，是B细胞存活和成熟的关键因子。BAFF可以通过促进B细胞的增殖和/或分化从而促进B细胞存活，对成熟B细胞的产生以及维持具有重要的作用。B细胞发育失调可能导致免疫缺陷、自身免疫性B细胞的逃逸以及自身免疫性抗体的产生等，是自身免疫病以及B细胞相关肿瘤起始和不断发展的关键因素。BAFF作为重要的免疫调节分子具有很强的B细胞趋化性，在维持B细胞动态平衡中发挥着关键作用。BAFF异常的高表达可以抑制自身反应性B细胞的死亡、诱导自身免疫性抗体的产生，从而打破自身免疫耐受的平衡，导致机体发生自身免疫性疾病或者肿瘤。
研究表明，BAFF参与多种自身免疫性疾病的进展。在很多自身免疫性疾病中，BAFF的表达水平明显升高。例如，在系统性红斑狼疮患者中，BAFF持续高表达，患者血清中BAFF的浓度与抗dsDNA抗体(anti-dsDNA antibodies)的效价呈正相关。此外，在干燥综合征、类风湿性关节炎以及多发性硬化疾患者的血清中，BAFF表达水平也显著升高。
BAFF可与B细胞表面TNFR家族的三种膜受体结合，这三种膜受体分别是BAFFR(BAFF receptor，B淋巴细胞刺激因子受体)、TACI (transmembrane activator andcalcium modulator and cyclophilin ligand interactor，跨膜激活剂及钙调亲环素配基相互作用因子)和BCMA (B cell maturation antigen，B细胞成熟抗原)，其中BAFF和BAFFR的结合在外周B细胞成熟过程中发挥着最主要的作用。
目前应用CD19或CD20抗体的B细胞删除是自身免疫病的主要治疗方式，但是治疗效果并不理想。一方面，CD19或CD20抗体会针对全部幼稚和成熟B细胞，容易造成免疫缺陷甚至病人的感染。另一方面，CD19或CD20抗体可能降低患者对疫苗，例如COVID-19疫苗的反应性。此外，自身免疫病患者中存在自身抗体，如系统性红斑狼疮患者中的dsDNA抗体，或者多发病硬化患者中的MOG抗体，视神经脊髓炎患者中的AQP4抗体等自身抗体，而CD20单抗并不能很好地降低患者体内这些致病性自身抗体的浓度(30-70%)。
目前已经开发了以BAFFR为靶点的治疗性抗体，如Lanalumab单抗。Lanalumab单抗为一种人鼠嵌合抗体。这类抗体的生产方式一般是通过生产某种鼠源单克隆抗体的杂交瘤细胞中得到目的抗体V区(variable region）基因，再与人类的C区(constant region）基因重组并克隆到合适载体中，然后转入受体细胞表达。因此，这类抗体人源化比例较低，一般为60-70%，潜在具有较强的免疫原性，安全性较低。
鉴于目前治疗方式的局限性和复杂性，本领域仍然需要找到新的治疗方法和/或产品，其可以清除特定的致病性B细胞亚群，或者能够以更加精准的方式调节B细胞的激活和功能，从而治疗与B细胞相关的疾病，如肿瘤或自身免疫病。
发明内容
为了解决上述问题，发明人通过噬菌体展示技术结合高通量表达的平台，筛选出了靶向BAFFR的纳米抗体。所述纳米抗体具有人源化简单、亲和力高、稳定性高、可微生物表达、免疫原性低、可溶性好、渗透力强、可识别隐藏表位等优势，由此完成了本发明。此外，还进一步提供制备所述纳米抗体的方法，以及所述纳米抗体在自身免疫性疾病和肿瘤的治疗或诊断中的用途。
因此，第一方面，本发明提供特异性针对人BAFFR的抗原结合多肽，所述抗原结合多肽包含选自如下的互补决定区1 (CDR1)、互补决定区2 (CDR2)和互补决定区3 (CDR3)：
所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8或9所示，
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14-17中任一种所示，
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22-25中任一种所示。
在具体的实施方案中，所述CDR1、CDR2和CDR3选自如下各组：
(a) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示；
(b) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示；
(c) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示；或
(d) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。
优选地，所述抗原结合多肽是抗BAFFR抗体。优选地，所述抗体包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4，例如作为重链可变区。
更优选地，所述抗BAFFR抗体是抗BAFFR纳米抗体，其由FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4组成。
更优选地，所述FR1的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 5-7中任一所示的序列，所述FR2的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 10-13中任一所示的序列，所述FR3的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 18-21中任一所示的序列，和/或所述FR4的氨基酸序列选自SEQ ID NO: 26-27中任一所示的序列。
更具体地，所述抗BAFFR纳米抗体具有选自以下任意一种的氨基酸序列：
(a)如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列(纳米抗体NB467-55)；
(b) 如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列(纳米抗体NB467-46)；
(c) 如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列(纳米抗体NB467-35)；
(d) 如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列(纳米抗体NB467-8)。
第二方面，本发明进一步提供了一种分离的核酸分子，其包含编码所述的抗原结合多肽的核苷酸序列。优选地，所述核苷酸分子包含选自SEQ ID NO: 28-31中任一项的核苷酸序列，或由其组成。
第三方面，本发明进一步提供了一种重组表达载体，所述表达载体包含第二方面的分离的核酸分子。
第四方面，本发明进一步提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含第二方面的核酸分子或第三方面的重组表达载体。优选地，所述宿主细胞为真核细胞，更优选为哺乳动物细胞。
第五方面，本发明进一步提供了一种药物组合物，其包含第一方面的抗原结合多肽和药学上可接受的载体。
第六方面，本发明进一步提供了包含第一方面的抗原结合多肽的融合蛋白。例如，所述融合蛋白是嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体的胞外结构域包含第一方面的抗原结合多肽，所受嵌合抗原受体进一步包含跨膜结构域和胞内结构域。
第七方面，本发明进一步提供了抗人BAFFR纳米抗体的制备方法，包括表达第二方面的分离的核酸分子，或表达第三方面的重组载体，或培养第四方面的宿主细胞，并任选地进行纯化。
第八方面，本发明进一步提供了第一方面的抗原结合多肽、第二方面的分离的核酸分子、第三方面的重组表达载体或第四方面的宿主细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防自身免疫病或肿瘤。
优选地，所述自身免疫病选自下组：神经系统免疫性疾病如多发性硬化、视神经脊髓炎、重症肌无力等，以及其它自身免疫性疾病如风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、干燥综合征等疾病的患者等。
优选地，所述肿瘤为血液瘤，如B细胞淋巴瘤，如以霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型的霍奇金淋巴瘤，以及非霍奇金淋巴瘤，如弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT）、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤(MCL）。
第九方面，本发明进一步提供了一种在受试者中治疗或预防自身免疫病或肿瘤的方法，包括向所述受试者施用治疗有效量的第一方面的抗原结合多肽、第二方面的分离的核酸分子、第三方面的重组表达载体、第四方面的宿主细胞或第五方面的药物组合物。
本发明的纳米抗体在具有纳米抗体的优越性能，如分子量小、人源化程度高的同时，具有优异的抗原结合特异性、竞争性阻断BAFF-BAFFR相互作用的能力和ADCC活性，因此至少具有如下优势：
(1) 本发明的抗人BAFFR纳米抗体与人BAFFR亲和力较高，同时相较于现有抗人BAFFR抗体具有更强的ADCC吞噬作用，能够诱导巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，且其EC50值低于参照抗体。
(2) 本发明的抗人BAFFR纳米抗体对BAFF-BAFFR相互作用的竞争性阻断能力更强。
(3) 本发明的抗人BAFFR纳米抗体与单克隆抗体特别是嵌合抗体相比，安全性比较高、免疫原性低。
(4) 本发明提供的纳米抗体分子量小，因此具有极强的组织渗透力，可直接穿透某些体内屏障，利于疾病的诊断与靶向治疗。
附图说明
图1为流式细胞术检测的纳米抗体和对照抗体与表面过表达BAFFR的293T细胞的亲和力的图，MFI指中位荧光强度。
图2为ELISA测定的纳米抗体和对照抗体对BAFF-BAFFR相互作用的半抑制浓度(IC50值)的图。
图3为ELISA测定的纳米抗体和对照抗体诱导T细胞对过表达BAFFR的293T细胞的细胞毒作用的有效浓度(EC50值)的图。
具体实施方式
I. 术语
在本发明的上下文中，除非另有说明，否则BAFFR为人BAFFR (Gene ID: 115650；核苷酸：NM_052945.4；氨基酸：NP_443177.1)，其氨基酸序列和核苷酸序列分别如SEQ IDNO: 39和SEQ ID NO: 40所示。
“抗原结合多肽”，指与抗原特异性结合的多肽序列，可以为经过修饰或不经修饰的完整的蛋白、多肽，或具有免疫学功能的抗原结合片段。
“结合BAFFR”或“与BAFFR结合”，指能与BAFFR特异性结合的相互作用。
“纳米抗体”也称为VHH抗体，指获得自骆驼科动物、仅由重链上的单个可变结构域组成的单域抗体。纳米抗体或其抗原结合片段可以例如通过重组技术、噬菌体展示技术、合成技术例如CDR嫁接、或此类或其它本领域已知的技术的组合来产生。
“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，本文中，“结合亲和力”指反映抗体与抗原之间1∶1相互作用的内在结合亲和力。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括现有技术已知以及本文中所描述的方法。
“竞争”当用于竞争相同表位的抗原结合多肽(例如中和抗原结合多肽或中和抗体) 的情况时，意指在抗原结合多肽之间的竞争。抗原结合多肽之间的竞争可以通过以下测定法来测定：在所述测定法中，待检测的抗原结合多肽(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合多肽(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如BAFFR或其片段)的特异性结合。可使用众多类型的竞争性结合测定方法确定一种抗原结合多肽是否与另一种竞争。对竞争性结合的抑制可以通过测量在所测抗原结合多肽存在下，结合固态表面或细胞的标记的量来测量。通常所测的抗原结合多肽是过量存在的。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含特异性结合BAFFR的抗原结合多肽的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗原结合多肽与其他药学组分的混合物，其他药学组分如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
II. 抗原结合多肽和纳米抗体
本发明提供多种特异性结合BAFFR的抗原结合多肽。在一些实施方案中，所述特异性结合BAFFR的抗原结合多肽是抗体，优选是纳米抗体。
在一些实施方案中，所述抗体，优选纳米抗体，包含互补决定区1 (CDR1)、互补决定区2 (CDR2)和互补决定区3 (CDR3)。
在优选的实施方案中，所述CDR1包含如SEQ ID NO: 8或9所示的氨基酸序列或由其组成，或包含与如SEQ ID NO: 8或9所示的氨基酸序列具有1个或 2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8或SEQID NO: 9所示。
在优选的实施方案中，所述CDR2包含如14-17中任一所示的所示的氨基酸序列或由其组成，或包含与如14-17中任一所示的氨基酸序列具有1个或 2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，所述CDR2的氨基酸序列如14-17中任一所示。
在优选的实施方案中，所述CDR3包含如22-25中任一所示的所示的氨基酸序列或由其组成，或包含与如22-25中任一所示的氨基酸序列具有1个或 2个氨基酸差异的氨基酸序列或由其组成。在更优选的实施方案中，所述CDR2的氨基酸序列如22-25中任一所示。
在更优选的实施方案中，所述CDR1、CDR2和CDR3选自如下各组：
(a) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示；
(b) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示；
(c) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示；或
(d) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。
在具体的实施方案中，所述抗体，优选纳米抗体，包含与所述三个CDR间隔排列的四个框架序列(FR)。具体而言，所述抗体，优选纳米抗体，依次包含FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
在一个具体的实施方案中，所述抗体，优选纳米抗体，包含如下所示的氨基酸序列或由其组成：
(a) 如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的氨基酸序列；
(b) 如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的氨基酸序列；
(c) 如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的氨基酸序列；
(d) 如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列，或与所述氨基酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性的氨基酸序列。
本发明还提供编码所述抗原结合多肽的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述核苷酸序列选自下组：
(a) 如SEQ ID NO: 28所示的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且编码如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(b) 如SEQ ID NO: 29所示的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且编码如SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(c) 如SEQ ID NO: 30所示的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且编码如SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；
(d) 如SEQ ID NO: 31所示的核苷酸序列，或与所述核苷酸序列具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性并且编码如SEQ ID NO: 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。
本发明还提供包含编码本发明的抗原结合多肽的核苷酸分子的表达载体。所述表达载体可以含有启动子、用于翻译起始的核糖体结合位点、转录终止子和其他调控元件。所述启动子可以是适合在生产细胞中进行表达的启动子。
本发明还提供包含编码本发明的抗原结合多肽的核苷酸分子的宿主细胞。所述宿主细胞可用于所述
抗原结合多肽的生产。可以将宿主细胞用本发明的表达载体瞬时或非瞬时地转染。在优选的实施方案中，所述细胞选自CHO或其衍生细胞系、293T或其衍生细胞系。
在一些实施方式中，本发明的抗原结合多肽为单域抗体(VHH)或重链抗体。在一些实施方式中，抗原结合多肽为人源化抗体和/或全人源抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合多肽是抗体片段，例如Fv、Fab、Fab′、scFv、diabody或F(ab′)2。在一些实施方案中，所述抗原结合多肽是多特异性抗体，如双特异性抗体或三特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗原结合多肽是VHH抗体。在一些实施方案中，本发明的抗原结合多肽是VHH与人免疫球蛋白的Fc区融合的VHH-Fc抗体，其中所述人免疫球蛋白优选IgG，更优选IgG1。
本发明还提供包含本发明的抗原结合多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，所述融合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)，其包含胞外结构域、跨膜结构域和内信号传导结构域，其中所述胞外结构域包含本发明的抗原结合多肽，如本发明的纳米抗体。
在一些实施方案中，所述CAR的跨膜结构域可以来自本领域常用的跨膜结构域，例如来自T细胞共刺激分子的跨膜结构域。
在一些实施方案中，所述CAR的胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域可以包含免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)。在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域可以包含选自以下的分子的胞内结构域：Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称为ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70。
在一些实施方案中，所述CAR还可以包含共刺激结构域。在一些实施方案中，所述共刺激结构域可以包含以下的信号传导结构域：MHCI类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、激活NK细胞受体或Toll配体受体。
III. 用途
本发明的抗原结合多肽或抗体如纳米抗体能够以高亲和力特异性结合BAFFR，由此抑制BAFF-BAFFR相互作用，因此特别适合用于治疗自身免疫病和肿瘤。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体如纳米抗体用于治疗患有自身免疫病的受试者。例如，所述患有自身免疫病的受试者与健康受试者相比具有升高的BAFF表达水平。
在一个实施方案中，本发明的抗原结合多肽或抗体如纳米抗体用于治疗患有肿瘤的受试者，特别是恶性肿瘤。
在本发明的上下文中，所述受试者为脊椎动物，优选哺乳动物，如人。所述哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人、农场动物、运动动物和宠物。受试者以广义理解还涵盖在体内获得的或在体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
本发明的抗原结合多肽、抗体、纳米抗体或融合蛋白可以包含在药物组合物中。所述药物组合物可以用于预防性和/或治疗性治疗。
在治疗应用中，可以将本发明的药物组合物以足以治愈或至少部分阻止疾病的症状进展的量给予已经患有疾病的受试者。对于治疗有效的量可以根据疾病的严重程度、病程、既往疗法、受试者的健康状态、体重、对药物的反应、以及治疗医师的判断而变化。可以将本发明的抗原结合多肽、抗体、纳米抗体或融合蛋白与其他治疗剂联用，例如顺序施用或同时施用。
在预防应用中，可以在疾病发生之前、期间或之后给予发明的药物组合物。例如，可以将本发明的药物组合物用作预防剂，以便防止疾病的发生。
本发明的抗原结合多肽、抗体、纳米抗体、融合蛋白或药物组合物可以通过注射施用，例如直接注射、立体定向注射、通过微型泵输注系统注射。所述注射可以通过静脉内、肠胃外、腹膜内和/或皮下途径进行，从而将所述抗原结合多肽、抗体、纳米抗体、融合蛋白或药物组合物地送至受试者的细胞、组织或器官。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1. 通过噬菌体展示获得抗BAFFR的纳米抗体
在本实施例中，通过用人BAFFR作为抗原对羊驼进行免疫获得了多种抗体编码片段，随后通过噬菌体文库和哺乳动物表达系统筛选出了候选抗体克隆。具体而言，抗BAFFR纳米抗体的筛选过程的具体步骤如下所示。
a. 抗原的制备
依据人BAFFR的氨基酸序列和核苷酸序列，分析并设计可有效诱导羊驼产生针对人BAFFR的特异性抗体的抗原，并在其C端连接Human IgG1 Fc，获得经修饰的抗原，记作“人BAFFRhFC抗原”，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 33所示，编码序列如SEQ ID NO: 32所示。
b. 免疫羊驼
将步骤a获得的人BAFFRhFC抗原与等体积的弗氏佐剂完全混合均匀，并用于对羊驼进行皮下注射。
具体地，在第1天，使用500 μg的人BAFFRhFC抗原与等体积弗氏完全佐剂的乳化混合物对羊驼进行初免，并分别在第21天、42天、63天、84天用250 μg 的Human BAFFRhFC抗原与等体积弗氏完全佐剂的乳化混合物进行4次加强免疫。在前4次免疫的7天后，分别采10ml羊驼外周血以通过ELISA检测血中的抗BAFFR血清效价。
ELISA检测的具体步骤如下。将Human BAFFR his抗原用0.05 M碳酸盐缓冲液(pH=9.6)稀释至2μg/mL，并按100 μL/孔的量添加至培养板中。将培养板在4℃包被过夜。弃包被液，并用PBST洗涤3次。每孔加入5%脱脂牛奶300 µL，于37℃封闭1 h。用PBST缓冲液洗涤3次。加入100 μL/孔的血清稀释液(从1:2000开始倍比稀释)，并于37 ℃ 孵育45 min。用PBST洗涤5次，向每孔加入100 μL山羊抗羊驼IgG (Goat anti-Alpaca IgG)(H+L)HRP(成都阿帕克生物科技有限公司，Cat#：S001H，成都阿帕克生物科技有限公司，用PBS按1:1W稀释)，37 ℃ 孵育45 min。用PBST洗板5次。加入TMB显色液显色(100 μL/孔)，并 在37℃孵育5 min。加入终止液终止反应(50 μL/孔)，并于450 nm下测光密度。
在第5次免疫的1周后，采羊驼外周血50mL并分离单个核细胞。
c. 文库构建
提取步骤b获得的PBMC的RNA，并在反转录之后通过巢式PCR获得目的基因片段。将目的基因片段克隆至真核表达载体中，并将获得的表达载体转化进感受态细胞以构建BAFFR-VHH噬菌体展示文库。具体步骤如下所示。
以步骤b筛选得到的PBMC细胞为模板，利用RNAiso Plus提取细胞总RNA，并利用PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒将RNA反转录为cDNA。通过巢式PCR获得目的片段。目的片段的扩增体系如下表1所示，扩增程序如下表2所示。
表1巢式PCR一轮反应体系
表2巢式PCR二轮反应体系
将扩增获得的编码羊驼VHH的核苷酸片段克隆至真核表达载体pComb3XSS(成都阿帕克生物科技有限公司）中。将生成的重组载体通过电击转化至TG1的感受态细胞中，得到VHH噬菌体展示文库。为了进一步鉴定BAFFR-VHH噬菌体展示文库是否构建成功，将文库培养在2-YT-A平板上，并在形成的菌落中挑选48个克隆进行测序。
测序结果显示，克隆的成功插入率为100%。根据文库转化子数、库插入率和多样性测序分析结果，计算出的文库库容为1.92×109，说明得到的BAFFR-VHH噬菌体展示文库的文库库容和多样性良好。
d. 纳米抗体的获得
使用步骤c得到的噬菌体展示文库进行淘选并选出阳性克隆。将选出的VHH抗体的编码序列与Human IgG1 Fc编码序列融合，并构建到pTT5 (成都阿帕克生物科技有限公司)表达载体中以转染真核细胞，从而进行表达和纯化。最终，获得了抗人BAFFR纳米抗体。具体方法如下。
取出SA-磁珠(苏州纳薇科技有限公司，MPHTSA-300)，PBS清洗2次备用；将Bio-Human BAFFR-his(Acro，BAR-H82E3）抗原用PBS稀释至终浓度为5μg/ml，加入2×1011噬菌体文库，37℃孵育1h；将孵育后的混合物加入磁珠管中，4℃振摇作用45min；在磁力架作用下吸出上清，用PBST洗涤3次，PBS洗涤2次；加入800µL Gly-HCl 洗脱液，37℃孵育8min，洗脱特异性结合的噬菌体；将该洗脱液转移至1.5mL无菌离心管中，迅速用160μL Tris-HCl中和缓冲液中和；取10µL进行梯度稀释，测定滴度，计算淘选回收率，其余洗脱物混合后进行扩增和纯化，用于下一轮亲和淘选。
经过两轮筛选，在第二轮筛选后进行单克隆噬菌体上清ELISA鉴定。将Bio-HumanBAFFR-his抗原按照2μg/ml*100μl规格固定在96孔酶标板中，于4℃孵育过夜。弃包被液，并用PBST 洗涤3次。每孔加入5%脱脂牛奶300 µL，37℃封闭1 h。用PBST缓冲液洗涤3次，以100μL/孔加入二倍稀释的噬菌体上清液，并在37 ℃ 孵育45 min。用PBST洗涤5次，以100 μL/孔向各孔中分别加入小鼠抗M13抗体 HRP (mouse anti-M13 antibody HRP，成都阿帕克生物科技有限公司)，并在37 ℃ 孵育45 min。用PBST洗板5次。以100 μL/孔加入TMB显色液显色，37℃孵育5 min。
以50 μL/孔加入1 M HCl 终止液终止反应，并于450 nm波长下检测光密度。通过检测结果筛选阳性克隆(OD450>1)。将与阳性克隆融合Human IgG1 Fc构建到pTT5质粒中，对应的质粒转染至哺乳动物细胞HEK293T中，于37℃ 5%二氧化碳的摇床中表达7天。培养后收集细胞上清液，采用Protein A亲和填料(苏州纳薇科技有限公司，17010-050100）分离纯化得到了4株目的抗体，分别命名为NB467-55、NB467-46、NB467-35、NB467-8。
纳米抗体NB467-55、NB467-46、NB467-35、NB467-8的VHH氨基酸序列和核苷酸序列如下所示。
表3. NB467-55、NB467-46、NB467-35、NB467-8的序列信息
实施例2. 抗BAFFR纳米抗体与过表达BAFFR的293T细胞的结合
将实施例1中获得的4种抗BAFFR纳米抗体NB467-55、NB467-46、NB467-35、NB467-8通过流式细胞仪进行结合亲和力动力学的表征性测定。同时，使用了抗BAFFR抗体Lanalumab (成都阿帕克生物科技有限公司)作为阳性对照抗体。
具体地，从细胞培养瓶中收集HEK-293T-BAFFR细胞，并用FACS缓冲液洗两次并离心。将细胞重悬于合适体积的流式细胞分析染色液，使每管细胞终浓度达到2×105细胞/mL。
将实施例1中生成的抗体NB467-55、NB467-46、NB467-35、NB467-8，以及Lanalumab分别稀释至200 nM。将 50 μl抗体溶液加入带有HEK-293T-BAFFR细胞的试管中。混合均匀，在4℃孵育60分钟。孵育完成，利用FACS缓冲液洗涤细胞一次。
根据说明书稀释抗人FC-647二抗(Jackson, 109-605-003)，并将100 μl二抗稀释液加入到样品管中。混合均匀之后，在4℃孵育60分钟。孵育完成之后，用FACS缓冲液洗涤细胞3次，并将离心获得的细胞沉淀重悬于200 μl PBS中，用流式细胞仪(Sony, SA3800)检测。检测结果见表4和图1。
表4. 纳米抗体与过表达BAFF的293T细胞的结合(EC50)
图1中显示了各抗体的平均荧光强度(MFI)值，证实与Lanalumab相比，本发明的纳米抗体与过表达人BAFFR的293T细胞的结合能力更强。表4显示，本发明的纳米抗体EC50值均优于或者接近对照抗体Lanalumab，其中NB467-46、NB467-55、NB467-8强于NB467-35。
实施例3. 人抗BAFFR纳米抗体对BAFF-BAFFR相互作用的竞争性阻断能力
本实施例测定了实施例1中获得的4种抗BAFFR纳米抗体对BAFF-BAFFR相互作用的竞争性功能阻断能力。同时，使用了Lanalumab (同上)作为阳性对照抗体。
具体而言，将人BAFFR-his蛋白(Acro, BAR-HP2H6）以200 ng/孔添加于96孔微板上，并于4℃孵育过夜。第二天，用PBST洗涤平板3次，用含5％w/v脱脂奶粉的PBST在37℃下封闭1小时。然后再用PBS清洗平板。
将待测抗体分别从浓度800 nM开始进行1:3梯度稀释(用5%脱脂奶粉稀释)。同时将Biotin Human BAFF his蛋白(Acro，BAF-H82Q2)稀释至0.2 μg/mL。对照组：50 μL稀释后的Biotin Human BAFF his蛋白与50 μL的5%的牛奶；实验组：50 μL稀释后的Biotin HumanBAFF his蛋白与50μL梯度稀释的抗体。
然后，将抗体/Biotin Human BAFF his混合物加入到Human BAFFR-his蛋白包被的平板。于37℃孵育1h后，用PBST洗涤5次。加入用封闭液1:10K稀释后的二抗(成都阿帕克生物科技有限公司 )37℃孵育1h。将孵育了二抗的酶标板，用PBST洗涤5次，每孔加入100μlTMB单组分显色液，并在37℃孵育7min，用50 μL/孔1M HCL终止反应，然后测定450 nm处的吸收值。使用Graphpad Prism软件对数据进行分析，得出半抑制浓度(IC50值)，具体结果见表5和图2。
表5. 各纳米抗体对BAFF-BAFFR相互作用的竞争性阻断
结果表明，与Lanalumab相比，本发明的纳米抗体的IC50值更低，IC50可以达到Lanalumab的约十分之一甚至更小，说明本发明的纳米抗体对BAFF-BAFFR相互作用的竞争性阻断能力显著强于Lanalumab。图2为450 nm处的吸收值，表明本发明的抗体能够阻断人BAFF-BAFFR相互作用，并且与参照抗体相比，本发明的抗体具有更好的BAFF-BAFFR阻断活性。
实施例4. 抗人BAFFR纳米抗体ADCC活性
本实施例测定实施例1中获得的4种抗BAFFR纳米抗体ADCC活性。同时，使用了Lanalumab (同上)作为阳性对照抗体。
具体而言，消化如实施例2中的HEK293T-BAFFR细胞，离心收集细胞，用DEME+1%FBS重悬细胞，在96 Well Assay Plate中每孔铺35000个细胞，体积为50 μl。离心收集Jurkat-NFAT-CD16a细胞(购自四川思柏沃生物科技有限公司)，用RPMI 1640+1% FBS重悬细胞，每孔铺100000个细胞，体积为50 μl。
用RPMI1640+1% FBS稀释待测抗体。抗体浓度以50 μg/mL起始进行5倍稀释，共11个浓度点。取稀释后的抗体以100 μl/孔加入板中，并另行纳入50 μg/mL 同种型对照(Isotype Control)作为阴性对照。在37℃二氧化碳培养箱中孵育5小时。孵育完成后，每孔加入30 μl Bio-Lite Luciferase Assay System荧光素酶底物，震荡孵育3分钟，SpectraMax i3x上机检测。
使用Graphpad Prism 软件分析数据得到EC50值，测定结果见表6。
表6. 四种抗体与对照抗体的EC50值
表6的结果显示，本发明的纳米抗体能够诱导ADCC效应，其EC50值显著低于参照抗体，显示出比参照抗体Lanalumab更强的ADCC作用。图3的荧光值-浓度曲线显示，本发明的抗体显示出比参照抗体Lanalumab更强的荧光强度，表明有更强的ADCC作用。Isotype表示同种型对照抗体。
以上所述仅是本公开的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本公开。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本公开的范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本公开将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
表7. 序列信息
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Claims (10)
1.一种特异性结合人B淋巴细胞刺激因子受体BAFFR的抗原结合多肽，其特征在于，包含选自如下各组的CDR1、CDR2和CDR3中的一组：
(a) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 22所示；
(b) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 23所示；
(c) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 24所示；或
(d) 所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO: 9所示；
所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示；且
所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 25所示。
2.根据权利要求1所述的抗原结合多肽，其特征在于，所述抗原结合多肽是VHH单域抗体，或VHH与来自人免疫球蛋白的Fc区融合的VHH-Fc抗体。
3. 根据权利要求2所述的抗原结合多肽，其特征在于，包含如SEQ ID NO: 1-4中任一种所示的氨基酸序列，或其中所述VHH由如SEQ ID NOs: 1-4中任一种所示的氨基酸序列组成。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，包含编码权利要求1-3中任一项所述的抗原结合多肽的核苷酸序列。
5. 根据权利要求4所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列包含如SEQID NOs: 28-31中任一种所示的核苷酸序列或由所述核苷酸序列组成。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含根据权利要求4或5所述的分离的核酸分子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包含根据权利要求6所述的重组表达载体。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-3中任一项所述的抗原结合多肽和药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1-3任一项所述的抗原结合多肽、根据权利要求4或5所述的核酸分子、根据权利要求6所述的重组表达载体、根据权利要求7所述的宿主细胞或根据权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗肿瘤或自身免疫病的药物中的用途。
10.一种融合蛋白，其特征在于，包含根据权利要求1-3中任一项所述的抗原结合多肽。
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