TW201529850A - 人類間皮素嵌合性抗原受體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於治療與間皮素表現有關之疾病的組合物及方法。本發明亦關於特異性針對間皮素之嵌合性抗原受體(CAR)、編碼其之載體及包含間皮素CAR之重組T細胞。本發明亦包括投與經遺傳修飾之T細胞的方法，該T細胞表現包含間皮素結合域之CAR。

Description

人類間皮素嵌合性抗原受體及其用途
本申請案主張2013年12月19日提交之國際申請案第PCT/CN2013/089979號、2014年7月21日提交之國際申請案第PCT/CN2014/082610號及2014年11月6日提交之國際申請案第PCT/CN2014/090509號之優先權，此等申請案中每一者之全部內容以引用的方式併入本文中。
本發明大體上係關於T細胞之用途，該等T細胞經工程改造以表現嵌合性抗原受體(CAR)，從而治療與間皮素表現有關之疾病。
間皮素最初由Pastan及同事鑑別為腫瘤有關抗原，因為其由正常組織表現有限且在腫瘤上過度表現。Chang K等人，Cancer Res.1992；52(1)：181-186及Chang K等人，ProcNatlAcadSciUSA.1996；93(1)：136-140。間皮素基因編碼前驅物71kDa蛋白質，該蛋白質經處理獲得40kDa蛋白質，即間皮素，間皮素由糖基磷脂醯肌醇(GPI)鍵及胺基末端31kDa脫落片段(稱為巨核細胞增強因子(MPF))錨定於細胞膜處。兩種片段皆含有N-糖基化位點。已在患有胰管腺癌(PDA)之患者的血清中發現40kDa羧基端片段之可溶性剪接變異體(稱為「可溶性間皮素/MPF相關」)。Johnston,F等人，Clinical Cancer Research.2009；15(21)：6511。間皮素目前正作為治療目標以及疾病活性及治療反應的生物標記物進行探索。Argani P等人，Clin Cancer Res.2001；7(12)：3862-3868。
間皮素為亦呈現於正常組織上之分化抗原。使用Pastan組開發之小鼠抗人類間皮素抗體K1，內襯腹膜、胸膜及心包腔之間皮素細胞內已展示強K1反應性，但比惡性組織一般所見的程度低。Chang K等人，Cancer Res.1992；52(1)：181-186輸卵管上皮細胞、氣管基底上皮細胞及扁桃體上皮細胞內已偵測到弱K1反應性。在角膜的所有層上亦已發現間皮素。Jirsova K等人，Experimental eye research.2010；91(5)：623-629。然而，包括以下之大部分正常組織中未偵測到K1反應性：肝臟、腎臟、脾臟、骨髓、淋巴結、胸腺、心肌、舌頭、骨胳肌、皮膚、大腦皮質、小腦、脊髓、周邊神經、垂體、腎上腺、唾液腺、乳腺、甲狀腺、副甲狀腺、睾丸、前列腺、附睾、子宮頸上皮細胞、肺實質、食道、小腸上皮細胞、結腸上皮細胞、膀胱上皮細胞、膽囊上皮細胞。Chang K等人，Cancer Res.1992；52(1)：181-186。
間皮素在絕大部分原發性胰腺癌中過度表現，在良性胰臟組織中罕見表現及弱表現。Argani P等人，Clin Cancer Res.2001；7(12)：3862-3868。上皮細胞惡性胸膜間皮瘤(MPM)普遍表現間皮素，但肉瘤樣MPM不表現間皮素。大多數漿液性上皮細胞卵巢癌瘤及相關原發性腹膜癌瘤表現間皮素。
間皮素為卵巢癌中之天然免疫反應之目標，且已提議為癌症免疫療法之目標。Bracci L等人，Clin Cancer Res.2007；13(2 Pt 1)：644-653；Moschella F等人，Cancer Res.2011；71(10)：3528-3539；Gross G等人，FASEB J.1992；6(15)：3370-3378；Sadelain M等人，NatRevCancer.2003；3(1)：35-45；Muul LM等人，Blood. 2003；101(7)：2563-2569；Yee C等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2002；99(25)：16168-16173。胰臟癌患者中間皮素特異性CTL的存在與整體存活率有關。Thomas AM等人，J Exp Med.2004；200：297-306。此外，Pastan及同事已使用結合至免疫毒素的抗間皮素抗體之可溶性抗體片段治療患有間皮素陽性腫瘤之癌症患者。此方法已證實足夠安全且在胰臟癌中具有一些臨床活性。Hassan R等人，Cancer Immun.2007；7：20及Hassan R等人，Clin Cancer Res.2007；13(17)：5144-5149。在卵巢癌中，此療法策略在已完成腹水解析之第二患者中產生一種輕微反應(根據RECIST準則)及穩定疾病。
本發明提供例如在患者中提供免疫反應之方法，其藉由投與經工程改造以表現包含特異性靶向間皮素之抗體(例如scFv)的嵌合性抗原受體(CAR)之免疫效應細胞。詳言之，本發明係關於經工程改造以表現包括抗體(諸如其抗原結合片段)之CAR的免疫效應細胞(諸如T細胞或NK細胞)之用途，其用於治療與間皮素(或MSLN)之表現有關的癌症。詳言之，本發明係關於可特定適於患有間皮素表現癌症之患者的過繼細胞轉移，諸如間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤、肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌)、胰臟癌(例如胰管腺癌、胰臟轉移癌)、卵巢癌、結腸直腸癌及膀胱癌，或其任何組合。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種編碼嵌合性抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中該CAR包含抗間皮素結合域(例如人類抗間皮素結合域)、跨膜結構域及包含刺激結構域之胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，經編碼抗間皮素結合域包含本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。在一個實施例中，經編碼人類抗間皮素結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如在表2、4或5中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如在表2、4或5中)或由其組成。在一個實施例中，經編碼抗間皮素結合域為包含表2之胺基酸序列的輕鏈及重鏈或由其組成之scFv。在一實施例中，抗間皮素結合域(例如scFV)包含或由以下組成：輕鏈可變區，其包含與表2中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列；及/或重鏈可變區，其包含或由以下組成：與表2中所提供之重鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，人類抗間皮素結合域包含選自由以下組成之群的序列或由其組成：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中，編碼該人類抗間皮素結合域之核酸序列包含選自由以下組成之群的序列或由其組成：SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、 SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110，或與其具有95-99%一致性之序列。
在一個實施例中，經分離核酸進一步包含編碼跨膜結構域(例如本文所述之跨膜結構域)之序列。在一個實施例中，經編碼跨膜結構域包含選自以下之蛋白質的跨膜結構域或由其組成：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，經編碼跨膜結構域包含序列SEQ ID NO：12或由其組成。在一個實施例中，跨膜結構域包含或由以下組成：與胺基酸序列SEQ ID NO：12相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：12具有95-99%一致性之序列。
在一個實施例中，經編碼CAR包括由鉸鏈區(例如本文所述之鉸鏈區)連接至跨膜結構域的抗間皮素結合域(例如本文所述之抗間皮素結合域)。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或由其組成。
在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共同刺激結構域(例如本文所述之共同刺激結構域)之序列。在一個實施例中，共同刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，經編碼共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：14或由其組成。在一個實施例中，共同刺激結構域包含或由以下組成：與胺基酸序列SEQ ID NO：14相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過 20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或胺基酸序列SEQ ID NO：14具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中，經分離核酸包含編碼胞內信號傳導結構域(例如本文所述之胞內信號傳導結構域)之序列。在一個實施例中，經分離核酸編碼4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，經編碼胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及/或序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中，經編碼胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其組成，其中該包含胞內信號傳導結構域之序列在相同框架中且以單個多肽鏈形式表現。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離核酸分子，其編碼包含例如SEQ ID NO：1之前導序列的CAR構築體；本文所述之抗間皮素結合域，例如具有表2之胺基酸序列或與其具有95-99%一致性的序列；例如SEQ ID NO：2之鉸鏈區；例如具有序列SEQ ID NO：6之跨膜結構域；共同刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：7之4-1BB共同刺激結構域；及一級信號傳導結構域，例如具有序列SEQ ID NO：9或10之CD3 ζ刺激結構域。在一個實施例中，經分離核酸分子包含(例如由其組成)編碼具有表2之胺基酸序列之多肽的核酸序列。在一個實施例中，經分離核酸分子包含(由其組成)編碼具有以下之多肽的核酸：與表2之胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺 基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種由核酸序列(例如本文所述之核酸)編碼的經分離多肽分子。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離多肽分子，其包含或由以下組成：選自由表2組成之群的序列、與表2中所提供之重鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，經分離多肽包含本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離嵌合性抗原受體(CAR)分子，其包含本文所述之抗間皮素結合域(例如本文所述之人類抗間皮素結合域)、跨膜結構域及包含刺激結構域之胞內信號傳導結構域。
在一個實施例中，抗間皮素結合域不與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域競爭結合於人類間皮素。
在一個實施例中，抗間皮素結合域與包含以下之抗原結合域競爭結合於人類間皮素：選自SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之抗間皮素輕鏈胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3及選自SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之抗間皮素重鏈胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，抗間皮素結合域與包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之抗原結合域競爭結合於人類間皮素。
在一個實施例中，抗間皮素結合域結合至與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域靶向之人類間皮素抗原決定基不同的人類間皮素抗原決定基。在一實施例中，抗原決定基包含選自以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：278之胺基酸314-315、317-318、346-349及369-375或其任何組合。在一實施例中，抗原決定基包含一或多個選自以下之胺基酸：SEQ ID NO：278之胺基酸314-315、317-318、346-349及369-375，或其任何組合。
在一實施例中，本文所述之抗間皮素結合域不結合於如SEQ ID NO：278中所示之間皮素的N端。在一個實施例中，抗間皮素結合域結合至人類間皮素之C端。在一個實施例中，抗間皮素結合域結合SEQ ID NO：278之胺基酸450-588內的抗原決定基。在一個實施例中，抗間皮素結合域結合之抗原決定基包含選自以下之序列：SEQ ID NO：278之胺基酸485-490、498-507、532-537及545-572，或其組合。在一個實施例中，抗間皮素結合域結合之抗原決定基包含一或多個選自以下之胺基酸：SEQ ID NO：278之胺基酸485-490、498-507、532-537及545-572，或其任何組合。在此等具體實例中，SEQ ID NO：278表示人類間皮素之胺基酸296-588，例如SEQ ID NO：278之第一胺基酸為胺基酸296且SEQ ID NO：278之最後胺基酸為胺基酸588。
在一個實施例中，抗間皮素結合域包含本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及本文所述之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。在一個實施例中，人類抗間皮素結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如表2中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如表2中)或由其組成。在一個實施例中，抗間皮素結合域為包含表2之胺基酸序列的輕鏈可變區及重鏈可變區或由其組成之scFv。在一實施例中，抗間 皮素結合域(例如scFV)包含或由以下組成：輕鏈可變區，其包含與表2中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列；及/或重鏈可變區，其包含或由以下組成：與表2中所提供之重鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，人類抗間皮素結合域包含選自由以下組成之群的序列或由其組成：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列。
在一個實施例中，跨膜結構域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含本文所述之跨膜結構域，例如具有序列SEQ ID NO：6、與胺基酸序列SEQ ID NO：6相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列或與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中，抗間皮素結合域由鉸鏈區連接至跨膜結構域。在一個實施例中，鉸鏈區包含本文所述之鉸鏈區，例如SEQ ID NO：2之鉸鏈區。
在一個實施例中，經分離CAR分子進一步包含共同刺激結構域，例如本文所述之共同刺激結構域。在一個實施例中，共同刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)或其功能性變異體。在一個實施例中，共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：7或由其組成。在一個實施例中，共同刺激結構域包含或由以下組成：與胺基酸序列SEQ ID NO：7相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)的胺基酸序列或與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中，經分離CAR分子包含胞內信號傳導結構域，例如本文所述之胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及/或序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其組成。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含或由以下組成：與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過20、10或5個修飾(例如取代)之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有95-99%一致性之序列。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：9及序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10或由其組成，其中該包含胞內信號傳導結構域之序列在相同框架中且以單個多肽鏈形式表現。
在另一態樣中，本發明係關於包含例如，SEQ ID NO：1之前導序列的經分離CAR分子；本文所述之抗間皮素結合域，例如具有表2之 胺基酸序列，或與其具有95-99%一致性的序列；例如SEQ ID NO：2之鉸鏈區；跨膜結構域，例如具有序列SEQ ID NO：6；共同刺激結構域，例如具有序列SEQ ID NO：7之4-1BB共同刺激結構域；及一級信號傳導結構域，例如具有序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10之CD3 ζ刺激結構域。在一個實施例中，經分離CAR分子包含(例如由其組成)具有表2之胺基酸序列的多肽。在一個實施例中，經分離CAR分子包含(由其組成)多肽，其具有與表2之胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，經分離CAR分子包含選自由以下組成之群的胺基酸序列或由其組成：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86。
在另一態樣中，本發明係關於包含本文所述之核酸序列的載體。在一個實施例中，核酸序列編碼CAR分子，例如本文所述之CAR分子。在一個實施例中，該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體。
在一個實施例中，載體為慢病毒載體，例如本文所述之慢病毒載體。在一個實施例中，載體進一步包含啟動子。在一個實施例中，啟動子為EF-1α啟動子。在一個實施例中，EF-1α啟動子包含序列SEQ ID NO：11。
在一個實施例中，載體為活體外轉錄載體，例如轉錄本文所述 之核酸分子之RNA的載體。在一個實施例中，RNA自活體外轉錄載體轉錄，其中該載體為pD-A.抗-meso BD OF.2bg.150A，其中該抗meso BD為本文所述之抗間皮素結合域。在一個實施例中，載體中之核酸序列進一步包含聚(A)尾，例如本文所述之聚A尾，例如包含約150個腺苷鹼基(SEQ ID NO：271)。在一個實施例中，載體中之核酸序列進一步包含3'UTR，例如本文所述之3'UTR，其例如包含來源於人類β-球蛋白之3'UTR的至少一個重複。
在另一態樣中，本發明係關於包含載體之細胞。細胞可為例如本文所述之細胞。在一個實施例中，細胞為人類T細胞，例如本文所述之T細胞，或人類NK細胞，例如本文所述之人類NK細胞。在一個實施例中，人類T細胞為CD8+ T細胞。在一個實施例中，細胞為自體T細胞。在一個實施例中，細胞為同種異體T細胞。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞為甘油二酯激酶(DGK)缺乏的。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞為Ikaros缺乏的。在一個實施例中，細胞為T細胞且T細胞皆為DGK及Ikaros缺乏的。
在一個態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步包含第二CAR，例如包括例如針對相同目標(間皮素)或不同目標(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞尚志間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的不同抗原結合域之第二CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共同刺激信號傳導結構域而非一級信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有 一級信號傳導結構域而非共同刺激信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第二CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞包含第一間皮素CAR，其包括間皮素結合域、跨膜結構域及共同刺激結構域；及第二CAR，其靶向除間皮素(例如在基質細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞或卵巢癌細胞上表現之抗原)以外之抗原且包括抗原結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域。在另一實施例中，CAR表現細胞包含第一間皮素CAR，其包括間皮素結合域、跨膜結構域及共同刺激結構域；及第二CAR，其靶向除間皮素(例如在基質細胞、肺癌細胞、前列腺癌細胞或卵巢癌細胞上表現之抗原)以外之抗原且包括至抗原之抗原結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域。
在一個實施例中，CAR表現細胞包含本文所述之間皮素CAR及抑制CAR。在一個實施例中，抑制CAR包含結合正常細胞(例如亦表現間皮素之正常細胞)而非癌細胞上發現之抗原的抗原結合域。在一個實施例中，抑制CAR包含抑制分子之抗原結合域、跨膜結構域及胞內結構域。舉例而言，抑制CAR之胞內結構域可為PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β之胞內結構域。
在另一實施例中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一試劑，例如提高CAR表現細胞之活性或適合性之試劑，例如本文所述之試劑。舉例而言，在一個實施例中，試劑可為抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的試劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在實施例中，例如本文所述，試劑，例如抑制核酸，例 如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如抑制蛋白或系統，例如叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)可用於抑制調節或調控(例如抑制)CAR表現細胞中之T細胞功能之分子的表現。在一實施例中，試劑為shRNA，例如本文所述之shRNA。在一實施例中，抑制CAR表現細胞內之調節或調控(例如抑制)T細胞功能之試劑。舉例而言，抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子表現的dsRNA分子連接至編碼CAR之組分(例如全部組分)的核酸。
在一個實施例中，抑制抑制分子之試劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導結構域)有關。在一個實施例中，試劑包含例如抑制分子之第一多肽，諸如PD1、PD-L1、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、CTLA4、VISTA、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4、TGFR β及TIGIT，或此等中任一者之片段(例如此等中任一者之胞外域的至少一部分)，及為本文所述之胞內信號傳導結構域(例如包含共同刺激結構域(例如本文所述之41BB、CD27或CD28)及/或一級信號傳導結構域(例如本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，試劑包含PD1之第一多肽或其片段(例如PD1之胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導結構域(例如本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。
在另一態樣中，本發明係關於一種製備細胞之方法，包含用包含編碼CAR分子(例如本文所述之CAR分子)之核酸的載體轉導本文所述之細胞(例如T細胞或NK細胞)。在一個實施例中，載體為本文所述之豆狀病毒載體。
本發明亦提供一種產生短暫表現外源性RNA之RNA工程改造細 胞(例如本文所述之細胞，例如T細胞或NK細胞)之群體的方法。該方法包含將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入至細胞中，其中RNA包含編碼本文所述之CAR分子的核酸。
在另一態樣中，本發明係關於一種在個體中提供抗腫瘤免疫性之方法，其包含向該個體投與有效量之包含CAR分子之細胞，例如表現本文所述之CAR分子之細胞，本文所述之細胞。在一個實施例中，細胞為自體T細胞或NK細胞。在一個實施例中，細胞為同種異體T細胞或NK細胞。在一個實施例中，個體為人類。
在另一態樣中，本發明係關於一種治療患有與間皮素表現有關之疾病(例如增生性疾病、癌變前病狀及與間皮素表現有關之非癌症相關適應症)之個體的方法，其包含向該個體投與有效量之包含CAR分子之細胞，例如如本文所述。
在一個實施例中，與間皮素有關之疾病為癌症，例如本文所述之癌症。在一個實施例中，與間皮素有關之疾病係選自由以下組成之群：間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)、肺癌(例如非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌)、胰臟癌(例如胰管腺癌)、卵巢癌、結腸直腸癌及膀胱癌或其任何組合。在一個實施例中，疾病為例如已進行至少一種先前標準療法之個體中的胰臟癌，例如轉移性胰管腺癌(PDA)。在一個實施例中，疾病為例如已進行至少一種先前標準療法之個體中的間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)。在一個實施例中，疾病為例如進行至少一種先前標準療法方案之個體中的卵巢癌，例如漿液性上皮細胞卵巢癌。
在一個實施例中，向已接受先前劑量之美法侖(melphalan)的個體投與間皮素CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)之細胞與提高表現CAR分子之細胞之活性或適合性之試劑(例如本文所述 之試劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)的細胞與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。儘管不希望受理論束縛，但咸信使用低免疫增強劑量(例如不足以完全抑制免疫系統但足以改善免疫功能之劑量)治療伴隨PD-1陽性T細胞減少或PD-1陰性細胞增加。PD-1陽性T細胞(而非PD-1陰性T細胞)可能因與表現例如PD-L1或PD-L2之PD-1配位體的細胞接合而耗盡。
在一實施例中，此方法可用於使個體中本文所述之CAR細胞的效能最佳。儘管不希望受理論束縛，但咸信在一實施例中，內源性未經修飾免疫效應細胞(例如T細胞)之效能得以改良。儘管不希望受理論束縛，但咸信在一實施例中，間皮素CAR表現細胞之效能得以改良。在其他實施例中，已或將經工程改造以表現CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)可藉由與增加PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)數目或提高PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞/PD1陽性免疫效應細胞，例如T細胞)之比率之量的mTOR抑制劑接觸而離體治療。
在一實施例中，在投與本文所述之CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)之前開始投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑(例如異位抑制劑(例如RAD001)或催化抑制劑)。在一實施例中，在充分時間後或mTOR抑制劑充分給藥後投與CAR細胞，使得PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞))之比率已至少短暫提高。
在一實施例中，在充分時間後或在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑充分給藥後採集待工程改造以表現CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)，使得個體中或自個體採集之PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率已至少短暫提高。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞(例如本文所述之CAR分子)與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞有關之副作用的試劑(例如本文所述之試劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞(例如本文所述之CAR分子)與治療與間皮素表現有關之疾病的試劑(例如本文所述之試劑)組合投與。
在一個實施例中，表現CAR分子之細胞(例如本文所述之CAR分子)以本文所述之劑量及/或給藥時程投與。
在一個實施例中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)之細胞作為針對疾病(例如癌症，例如本文所述之癌症)的一線治療投與。在另一實施例中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)之細胞作為針對疾病(例如癌症，例如本文所述之癌症)的二線、三線、四線治療投與。
在一個實施例中，投與本文所述之細胞群體。
在一個實施例中，例如使用活體外轉錄將CAR分子引入T細胞或NK細胞中，且個體(例如人類)接受包含CAR分子之細胞的初始投與，及一或多次包含CAR分子之細胞的隨後投與，其中一或多次隨後投與在前一次投與之後小於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，一次以上投與細胞包含每週向個體(例如人類)投與CAR分子，例如每週投與包含CAR分子之細胞2、3或4次投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受一次以上包含CAR分子之細胞投與(例如每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，隨後一週不投與包含CAR分子之細胞，接著向個體投與包含CAR分子之細胞的一或多次額外投與(例如每週一次以上投與包含CAR分子之細胞)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一次以上包含CAR分子之細胞的週期，且各週期之間的時間小於10、 9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，每隔一天投與包含CAR分子之細胞，每週3次投與。在一個實施例中，投與包含CAR分子之細胞持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或八週以上。
在一個態樣中，本發明包括例如如本文所述使用包含編碼間皮素CAR分子之核酸分子的載體轉染或轉導的自體或同種異體細胞群體。在一個實施例中，載體為反轉錄病毒載體。在一個實施例中，載體為如本文別處所述之自身不活化豆狀病毒載體。在一個實施例中，載體傳遞(例如藉由轉染或電穿孔)至細胞(例如T細胞或NK細胞)，其中該載體包含編碼如本文所述之間皮素CAR分子的核酸分子，其以mRNA分子形式轉錄，且間皮素CAR分子自RNA分子轉譯且在細胞表面上表現。
在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞)群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現具有本文所述之抗間皮素結合域的CAR之第一細胞，及表現具有不同抗間皮素結合域(例如與第一細胞表現之CAR中的抗間皮素結合域不同的本文所述之抗間皮素結合域)之CAR的第二細胞。作為另一實例，CAR表現細胞群體可包括表現包括例如如本文所述之抗間皮素結合域之CAR的第一細胞，及表現包括至除間皮素以外之目標(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2) 的抗原結合域之CAR的第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括一級胞內信號傳導結構域之CAR的第一細胞及表現包括二級信號傳導結構域之CAR的第二細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其中該群體中之至少一個細胞表示具有本文所述之抗間皮素結合域的CAR，及表現另一試劑(例如提高CAR表現細胞活性或功能之試劑)的第二細胞。舉例而言，在一個實施例中，試劑可為抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的試劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子，例如本文所述之試劑。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在實施例中，例如本文所述，試劑，例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如抑制蛋白或系統，例如叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)可用於抑制調節或調控(例如抑制)CAR表現細胞中之T細胞功能之分子的表現。在一實施例中，試劑為shRNA，例如本文所述之shRNA。在一實施例中，抑制CAR表現細胞內之調節或調控(例如抑制)T細胞功能之試劑。舉例而言，抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子表現的dsRNA分子連接至編碼CAR之組分(例如全部組分)的核酸。
在一個實施例中，抑制抑制分子之試劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導結構域)有關。在一個實施例中，試劑包含例如抑制分子之第一多肽，諸如PD1、PD-L1、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、CTLA4、VISTA、CD160、BTLA、LAIR1、TIM3、2B4、TGFR β及TIGIT，或此等中任一者之片段(例如 此等中任一者之胞外域的至少一部分)，及為本文所述之胞內信號傳導結構域(例如包含共同刺激結構域(例如本文所述之41BB、CD27或CD28)及/或一級信號傳導結構域(例如本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，試劑包含PD1之第一多肽或其片段(例如PD1之胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導結構域(例如本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。
在一個實施例中，編碼例如本文所述間皮素CAR分子之核酸分子以mRNA分子形式表現。在一個實施例中，經遺傳修飾之間皮素CAR表現細胞(例如T細胞或NK細胞)可藉由將編碼所要CAR之RNA分子(例如無載體序列)轉染或電穿孔細胞中產生。在一個實施例中，間皮素CAR分子一旦併入且在重組細胞表面上表現即自RNA分子轉譯。
在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR分子(例如本文所述之CAR分子)的經分離核酸分子、本文所述之CAR分子、包含本文所述之CAR分子的載體及/或包含本文所述之CAR分子的細胞，其用作藥劑。
在另一態樣中，本發明係關於編碼本文所述之CAR分子的經分離核酸分子、本文所述之CAR分子、包含本文所述之CAR分子的載體及/或包含本文所述之CAR分子的細胞，其用於治療例如本文所述的表現間皮素之疾病。
圖1為pD-A.抗-meso BD.OF.BBZ.2bg.150A質體的示意圖。圖式揭示「150A」作為SEQ ID NO：271。
圖2描繪可使用之細胞製造及治療時程。(A)自體細胞藉由白細胞清除術獲得且T細胞藉由用抗CD3/CD28 mAb塗佈之磁性珠粒擴展而增濃。細胞擴展8至12天。在培養最後一天，使用磁場移除珠粒且洗 滌細胞，用人類meso CAR mRNA構築體電穿孔且在可輸注培養基中低溫保藏。(B)描繪三個治療輸注時程。在時程1時，患者藉由在第0天靜脈內(i.v.)輸注接受1×108個人類meso攜帶CART細胞，隨後在一週後接受1×109個人類meso攜帶CART細胞。在患者符合時程2之條件之前，監測安全性持續至少一個月。在時程2時，患者藉由每週i.v.輸注三次接受1×108個人類meso攜帶CART細胞持續一週，隨後休息一週，接著每週投與1×109個人類meso攜帶CART細胞三次持續一週。在時程3時，患者藉由每週三次i.v.輸注接受3×108/m2人類meso攜帶CART細胞持續三週，隨後在第+35天及第+57天將2×108個人類meso攜帶CART細胞腫瘤內注射至原發病灶。
圖3A及圖3B為所分析供體2(健康供體)T細胞之細胞毒性的圖形表示，該T細胞用小鼠SS1 CAR或本發明之抗MSLN CAR M1至M12轉染且用不表現MSLN之對照K562細胞(如圖3A中所示)或經轉導以表現MSLN之K562細胞(K562-Meso)(如圖3B中所示)培養。
圖4A及圖4B為顯示藉由MSLN+細胞刺激時小鼠SS1及CD19 CART以及抗MSLN CART之IFNγ分泌的曲線。圖4A顯示對經轉導細胞株K562-Meso及其MSLN-陰性親本株K562之反應性。圖4B顯示對天然表現MSLN之癌細胞；卵巢癌株Ovcar8及胰臟癌株SW1990及Panc0203的反應性。
圖5顯示針對藉由用豆狀病毒載體轉導CAR構築體製成之間皮素CART的臨床試驗設計。
圖6A、圖6B、圖6C及圖6D顯示CART-meso細胞的抗腫瘤活性。
圖7A、圖7B及圖7C顯示CARTmeso細胞的活體內持續性及運輸至原發及轉移性腫瘤部位。
圖8顯示在CARTmeso細胞輸注後血清中之細胞激素及趨化因子。
圖9A及圖9B顯示抗腫瘤抗體的CARTmeso細胞誘導。血清獲自MPM患者(圖9A)及胰臟癌患者(圖9B)。
圖10顯示注射EMMESO腫瘤細胞之NSG小鼠中的腫瘤生長。腫瘤尺寸生長至約200mm3之後，經尾靜脈注射mesoCAR T細胞且在注射後39天量測。
圖11A及圖11B顯示注射時(圖11A)或自異種移植腫瘤採集之後40天時藉由流動式細胞量測術分析測定的mesoCAR之表現。
圖12顯示39天後自NSG小鼠側腹分離時或在轉導後低溫保藏的mesoCAR T細胞活體外殺滅的功能能力。
圖13顯示抑制劑酶DGK及SHP1於自EMESO側腹腫瘤分離之TIL中相較於隔夜靜置之TIL中的表現。
圖14A、圖14B、圖14C、圖14D、圖14E及圖14F顯示使用具有下調對腫瘤細胞殺滅(圖14A、圖14C及圖14E)以及IFNγ細胞激素分泌(圖14B、圖14C及圖14F)的mesoCART功能之抑制機制的抑制劑(抗PDL1、DGK抑制劑及SSG)治療的作用。
圖15A、圖15B、圖15C及圖15D顯示使用多種腫瘤細胞株刺激後人類CART-MSLN小組的細胞激素分泌。圖15A顯示IFNγ分泌。圖15B顯示TNF。圖15C顯示IL-2。圖15D顯示IL-4。
圖16A及圖16B顯示CART-MSLN-5、CART-MSLN-11、CART-MSLN17及鼠類CART-MSLN-SS1對Ovcar3(圖16A)及U87mg(圖16B)腫瘤細胞之殺滅分析結果。
圖17A及圖17B顯示CART-MSLN組對Ovcar3腫瘤細胞的殺滅分析結果。
圖18顯示Ovcar8異種移植模型中第一組CART-MSLN(包括M5、M11、M17及M21)的抗腫瘤活性。
圖19顯示Ovcar8異種移植模型中第二組CART-MSLN(包括M12、 M14、M16及M23)的抗腫瘤活性。
圖20A、圖20B及圖20C描繪腫瘤微環境(TIL)中隨時間之mesoCAR T細胞相較於新鮮或解凍mesoCAR T細胞之功能性損失。ERK信號傳導(經磷酸化)之A)細胞毒性分析法；B)IFNγ釋放分析法；及C)西方墨點分析。
圖21描繪DGK缺失對mesoCAR T細胞之細胞毒性的作用。在不同效應子：目標比下評定目標細胞殺滅百分比。
圖22描繪DGK缺失對IFNγ產量及自mesoCAR T細胞之釋放的作用。在不同效應子：目標比率下評定IFNγ之濃度。
圖23描繪DGK缺失對ERK信號傳導或T細胞活化、mesoCAR T細胞之作用。B：白蛋白，M：間皮素，3/28：CD3/CD28刺激細胞。
圖24描繪DGK缺失對與細胞毒性活性有關的mesoCAR T細胞之TGFβ敏感性之作用。
圖25A及圖25B描繪DGK缺失對腫瘤小鼠模型中mesoCAR T細胞之治療功效的作用。A)對抗腫瘤活性之作用藉由隨時間之腫瘤體積顯示。B)腫瘤浸潤細胞之持久性及增殖。
圖26A、圖26B、圖26C、圖26D、圖26E及圖26F顯示Ikaros含量降低之CAR表現T細胞中的細胞激素產量及細胞毒性介體釋放。圖26A顯示藉由流動式細胞量測術(左圖)及西方墨點(右圖)量測的野生型及Ikzf1+/- CAR T細胞中之Ikaros表現。使用間皮素塗佈之珠粒、PMA/伊屋諾黴素(Ionomycin)(PMA/I)或BSA塗佈之珠粒(對照物)刺激後，測定產生IFN-γ(圖26B)、TNF-α(圖26C)及IL-2(圖26D)、細胞毒性介體顆粒酶B(圖26E)及CD107a表現(圖26F)之細胞的百分比。
圖27A、圖27B及圖27C顯示具有Ikaros顯性陰性對偶基因(IkDN)之CAR表現T細胞中之細胞激素產量及細胞毒性介體釋放。在使用間皮素塗佈之珠粒、PMA/伊屋諾黴素(PMA/I)或BSA塗佈之珠粒(對照 物)刺激後，測定產生IFN-γ(圖27A)、IL-2(圖27B)及CD107a表現(圖27C)之細胞的百分比。
圖28A、圖28B、圖28C、圖28D及圖28E顯示消耗Ikaros不會增強抗原刺激後的CAR T細胞之活化及信號傳導。藉由流動式細胞量測術在指定時間點測定Ikzf1 +/- CAR T細胞中之CD69(圖28A)、CD25(圖28B)及4-1BB(圖28C)含量。在圖28D中，在使用CD3/CD28抗體進行TCR刺激後，檢驗野生型(WT)及Ikaros顯性陰性細胞(IkDN)中之RAS/ERK信號傳導路徑。藉由西方墨點評定磷酸化TCR信號傳導蛋白質(諸如磷酸化PLCγ、磷酸化Lck、磷酸化JNK、磷酸化Akt、磷酸化ERK、磷酸化IKKα及IκBα)之含量。在圖28E中，使用mesoCAR轉導之WT及IkDN細胞用BSA或間皮素塗佈之珠粒刺激，且藉由西方墨點藉由評定磷酸化ERK及磷酸化PLCγ之含量檢驗下游信號傳導路徑。
圖29A、圖29B、圖29C、圖29D及圖29E顯示CAR T細胞中之Ikaros減少加強活體外對目標細胞AE17或間皮素表現AE17(AE17 meso)之反應。圖29A描繪在指定效應子：目標細胞比率下WT及Ikzf1 +/- meso CART細胞中之IFNγ產量。在指定效應子：目標細胞比率下量測meso CAR表現WT及Ikzf1+/-(圖29B)及IkDN(圖29C)之細胞溶解。在指定效應子：目標細胞比率下量測使用FAP-CAR轉導之WT及Ikzf1+/-的IFNγ產量(圖29D)及細胞溶解(圖29E)，其中目標細胞為FAP表現3T3細胞。
圖30A、圖30B及圖30C顯示Ikaros消耗之CAR T細胞對現有腫瘤之活體內功效。向攜帶現有間皮素表現AE17腫瘤之小鼠投與CAR T細胞。在投與mesoCAR表現WT及Ikzf1 +/-(圖30A)或IkDN(圖30B)後量測腫瘤體積。在投與FAP-CAR表現WT及Ikzf1+/-(圖30C)後量測腫瘤體積。
圖31A、圖31B、圖31C、圖31D、圖31E及圖31F顯示免疫抑制腫 瘤微環境中的Ikzf1+/- CAR T細胞相較於WT CAR T細胞增加之持久性及抗性。藉由流動式細胞量測術自採集自脾臟(圖31A)及腫瘤(圖31B)偵測CAR表現WT或Ikzf1+/-細胞(GFP陽性)之百分比。藉由在使用CD3/CD28抗體(圖31C)或PMA/伊屋諾黴素(PMA/I)(圖31D)刺激後量測IFNγ產量評定在輸注後3天自脾臟或腫瘤採集之CAR T細胞的功能能力。藉由量測在輸注後9天自脾臟或腫瘤採集之CAR T細胞上的Treg或巨噬細胞標記物表現來評定調節T細胞(CD4+FoxP3+表現)及巨噬細胞(CD206表現)。
圖32A及圖32B顯示Ikaros含量降低之T細胞對可溶性抑制因子TGFβ及腺苷較不敏感。測試MesoCAR表現WT、Ikzf1+/-及IkDN細胞回應於TGF-β或腺苷產生IFNγ(圖32A)及細胞毒性(圖32B)之能力。
圖33A及圖33B為展示相較於安慰劑對流感疫苗病毒株的效價增加之曲線。在圖33A中顯示針對打算治療群體中RAD001給藥組中之每一者，在疫苗接種4週後，相對於安慰劑組中之增加的3種流感疫苗病毒株(H1N1 A/California/07/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、B/Brisbane/60/2008)中之每一者的流感幾何平均效價超過基線值之增加。粗黑線指示效價相對於安慰劑增加1.2倍，此為滿足主要研究端點的2/3流感疫苗病毒株所需。星形「*」指示GMT效價相對於安慰劑增加超過1，後驗機率至少80%。圖33B為與針對基線流感效價<=1：40之個體子組的圖33A相同之資料的曲線。
圖34顯示RAD001濃度對於在疫苗接種4週後各流感疫苗病毒株之幾何平均效價增加倍數之分散曲線。在個體已給藥4週後，量測RAD001濃度(給藥後1小時)。具有藥物動力學量測值之所有個體均包括在分析組中。在疫苗接種4週後，相對於基線值之幾何平均效價倍數增加展示於y軸上。
圖35為展示異源流感病毒株相較於安慰劑之效價增加的圖示。 顯示針對打算治療群體中之RAD001給藥組中之每一者，在疫苗接種4週之後，相對於安慰劑組中之增加，流感疫苗中不含之2種異源流感病毒株(A/H1N1病毒株A/New Jersey/8/76及A/H3N2病毒株A/Victoria/361/11)的流感幾何平均效價超過基線值之增加。*指示效價相對於安慰劑增加超過1，後驗機率為至少80%。
圖36A及圖36B為在流感疫苗接種之前及之後的IgG及IgM含量之圖示。在流感疫苗接種之前及流感疫苗接種4週之後自個體獲得之血清中量測抗A/H1N1/California/07/2009流感IgG及IgM的含量。自基線值至疫苗接種4週後抗H1N1流感IgG及IgM含量之改變在RAD001組與安慰劑組之間未偵測到顯著差異(藉由Kruskal-Wallis等級和檢驗，全部p值均>0.05)。
圖37A、圖37B及圖37C為RAD001治療之後PD-1陽性CD4及CD8百分比減少及PD-1陰性CD4T細胞百分比增加的圖示。藉由基線值、研究藥物治療6週之後(第6週)及研究藥物停止6週之後及流感疫苗接種4週之後(第12週)的PBMC樣品的FACS分析來測定PD-1陽性CD4、CD8及PD-1陰性CD4 T細胞百分比。圖37A顯示接受RAD001之組中，在0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)之劑量下，在第12週時，PD-1陽性CD4 T細胞相較於安慰劑組(n=25)顯著降低(-37.1--28.5%)，分別p=0.002(0.02)、p=0.003(q=0.03)及p=0.01(q=0.05)。圖37B顯示接受RAD001之組(n=109)中，在0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)劑量下，第12週時，PD-1陽性CD8 T細胞相較於安慰劑組(n=25)顯著降低(-43.3- -38.5%)，分別p=0.01(0.05)、p=0.007(q=0.04)及p=0.01(q=0.05)。圖37C顯示接受RAD001之組(n=109)中，在0.5mg/天(n=25)、5mg/週(n=29)及20mg/週(n=30)之劑量下，第12週時，PD-1陰性CD4 T細胞相較於安慰劑組(n=25)顯著增加(3.0-4.9%)，分別p=0.0007(0.02)、p=0.03(q=0.07)及p=0.03 (q=0.08)。
圖38A及圖38B為在針對基線值PD-1表現差異調整之RAD001治療之後，PD-1陽性CD4及CD8之百分比降低及PD-1陰性CD4 T細胞百分比增加的圖示。藉由基線值、研究藥物治療6週之後(第6週)及研究藥物停止6週之後及流感疫苗接種4週之後(第12週)的PBMC樣品的FACS分析來測定PD-1陽性CD4、CD8及PD-1陰性CD4 T細胞百分比。圖38A顯示在彙聚RAD組(n=84)中，第6週時，PD-1+CD4 T細胞相較於安慰劑組(n=25)顯著下降30.2%，p=0.03(q=0.13)。第12週時，彙聚RAD中之PD-1陽性CD4 T細胞相較於安慰劑組下降32.7%，p=0.05(q=0.19)。圖38B顯示第6週時，彙聚RAD001組(n=84)中之PD-1陽性CD8 T細胞相較於安慰劑組(n=25)顯著下降37.4%，p=0.008(q=0.07)。第12週時，彙聚RAD001中之PD-1陽性CD8 T細胞相較於安慰劑組降低41.4%，p=0.066(q=0.21)。圖38A及圖38B表示圖37A、圖37B及圖37C中之資料，但圖37A、圖37B及圖37C之不同RAD001劑量組在圖38A及圖38B中彙聚成單個RAD001處理組。
圖39描繪老年個體中之運動及能量回應於RAD001增加。
圖40A及圖40B描繪RAD001對細胞中之P70 S6K活性之預測作用。圖40A描繪每週及每日使用較高劑量之RAD001的P70 S6激酶抑制；圖40B描繪每週使用較低劑量之RAD001的P70 S6激酶抑制。
圖41A、圖41B及圖41C為scFv SS1(圖41A)、M5(圖41B)及M11(圖41C)之Biacore T200 SPR感測圖。
圖42A、圖42B及圖42C為抗人類間皮素scFv相較於鼠類SS1 scFv之抗原決定基柱形SPR感測圖。針對scFv M12、M14、M16、M17、M21及M23觀測競爭性結合(圖42A)。ScFv M5(圖42B)及M11(圖42C)結合於除SS1以外之抗原決定基。
圖43為描繪OVCAR8腫瘤模型中多種間皮素CAR T處理之後的腫 瘤生長之曲線。直至腫瘤植入後第62天的平均腫瘤體積+/-SEM。在第14天及第19天投與T細胞。小圓形：經側索尾靜脈用100ul PBS處理之小鼠；黑色正方形：用同型對照T細胞除了之小鼠；灰色三角形：用一次劑量之SS1 CAR T細胞處理之小鼠；倒置式三角形：用兩次劑量之SS1 CAR T細胞處理之小鼠；菱形：用單次劑量之M5 CAR T細胞處理之小鼠；大圓形：用兩次劑量之M5 CAR T細胞處理之小鼠；灰色正方形：用單次劑量之M11 CAR T細胞處理之小鼠；及黑色三角形：用兩次劑量之M11 CAR T細胞處理之小鼠。
圖44為氫氘交換質譜分析中之人類間皮素肽覆蓋率的示意圖。各黑色條表示肽。
圖45A及圖45B為顯示當與SS1(黑色條)及M5(灰色條)複合時人類間皮素之氘攝入差異的圖示。針對偵測之各肽片段(在x軸上表示)描繪抗體結合時之氘攝入差異(在y軸上表示)，胺基酸297-464處之肽在圖45A中且胺基酸458-586處之肽在圖45B中。全部差異均相對於未結合間皮素(對照物)之氘攝入。*表示差異小於0.75Da的肽的使用Tukey測試之統計顯著區。
圖46為顯示抗原人類間皮素之一級序列(胺基酸296-588)的圖示且該等區域由SS1及M5保護。黑色條指示當與SS1複合時經保護之胺基酸(胺基酸314-315、317-318、346-349及369-375)。灰色條指示當與M5複合時經保護之胺基酸(胺基酸485-490、498-507、532-537及545-572)。
圖47顯示展示用shRNA編碼CAR以共同表現CAR及shRNA之構築體之不同構型的參數映射。圖47A至圖47D顯示單個載體上之多種構型，例如其中U6調節之shRNA在EF1 α調節之CAR編碼要素的上游或下游。在圖47A及圖47B中描繪之例示性構築體中，轉錄藉由U6及EF1 α啟動子在相同方向中進行。在圖47C及圖47D中描繪之例示性構築體 中，轉錄藉由U6及EF1 α啟動子在不同方向中進行。在圖47E中，shRNA(及相應U6啟動子)在第一載體上，且CAR(及相應EF1 α啟動子)在第二載體上(圖16E)。
圖48描繪兩種例示性RCAR構型之結構。抗原結合成員包含抗原結合域、跨膜結構域及開關結構域。胞內結合成員包含開關結構域、共同刺激信號傳導結構域及一級信號傳導結構域。兩個構型表明本文所述之第一及第二開關結構域可關於抗原結合成員及胞內結合成員在不同方向中。本文進一步描述其他RCAR構型。
定義
除非另外定義，否則本文所用之所有技術及科學術語均具有與本發明所屬領域的一般技術者通常所理解相同的含義。
術語「一(a及an)」係指冠詞的一個或一個以上(亦即至少一個)語法賓語。舉例而言，「一要素」意謂一個要素或一個以上要素。
當涉及諸如量、暫態持續時間及其類似物之可量測值時，術語「約」欲涵蓋相較於指定值±20%，或在一些情況下±10%，或在一些情況下±5%，或在一些情況下±1%，或在一些情況下±0.1%之變化，因為此等變化適合於進行所揭示之方法。
術語「嵌合性抗原受體」或者「CAR」係指一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，其在免疫效應細胞中時，向細胞提供針對目標細胞(通常癌細胞)之特異性，且產生胞內信號。在一些實施例中，CAR包含至少一個胞外抗原結合域、跨膜結構域及細胞質信號傳導結構域(在本文中亦稱為「胞內信號傳導結構域」)，其包含來源於如下文所定義之刺激分子及/或共同刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一些態樣中，多肽集合彼此鄰接。在一些實施例中，多肽組包括當存在二聚化分子時可使多肽彼此偶合之二聚化開關，例如可使抗原結合域 偶合至胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，刺激分子為與T細胞受體複合物有關之ζ鏈。在一個態樣中，細胞質信號傳導結構域進一步包含一或多個來源於至少一個如下所定義之共同刺激分子的功能性信號傳導結構域。在一個態樣中，共同刺激分子選自本文所述之共同刺激分子，例如4-1BB(亦即CD137)、CD27及/或CD28。在一個態樣中，CAR包含嵌合融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜結構域及包含來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合性融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜結構域及包含來源於共同刺激分子之功能性信號傳導結構域及來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合性融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜結構域及包含兩個來源於一或多個共同刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR包含嵌合性融合蛋白質，該蛋白質包含胞外抗原結合域、跨膜結構域及包含至少兩個來源於一或多個共同刺激分子之功能性信號傳導結構域及一個來源於刺激分子之功能性信號傳導結構域的胞內信號傳導結構域。在一個態樣中，CAR在CAR融合蛋白之胺基端(N端)包含視情況存在之前導序列。在一個態樣中，CAR在胞外抗原結合域之N端進一步包含前導序列，其中該前導序列視情況在細胞加工期間自抗原結合域(例如scFv)裂解且將CAR定位至細胞膜。
術語「信號傳導結構域」係指藉由在細胞內傳輸資訊以藉由產生第二信使或藉由回應於此類信使充當效應子經限定信號傳導路徑調節細胞活性的蛋白質功能部分。
如本文所用，術語「間皮素」係指40kDa蛋白質，即間皮素，其藉由糖基磷脂醯肌醇(GPI)鍵及胺基端31kDa脫落片段(稱為巨核細胞 增強因子(MPF))錨定於細胞膜。兩種片段皆含有N-糖基化位點。該術語亦指具有40kDa羧基端片段之可溶性剪接變異體，亦稱為「可溶性間皮素/MPF相關」。較佳地，該術語係指Genbank寄存編號AAH03512.1之人類間皮素及其天然裂解部分，其例如在細胞膜(例如癌細胞膜)上表現。
如本文所用之術語「抗體」係指蛋白質或來源於特異性結合抗原之免疫球蛋白分子的多肽序列。抗體可為多株或單株、多鏈或單鏈或完整免疫球蛋白且可來源於天然來源或重組來源。抗體可為免疫球蛋白分子之四聚物。
術語「抗體片段」係指保留與抗原之抗原決定基特異性相互作用(例如藉由結合、空間位阻、穩定/去穩定化、空間分佈)之能力之抗體的至少一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵聯之Fvs(sdFv)、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、線性抗體、諸如sdAb之單域抗體(VL或VH)、駱駝科VHH結構域、由諸如二價片段之抗體片段形成的多特異性抗體(包含在鉸鏈區經二硫橋鍵聯之兩個Fab片段)，及經分離CDR或抗體之其他抗原決定基結合片段。抗原結合片段亦可併入單域抗體、最大抗體(maxibody)、微型抗體、奈米抗體、胞內抗體(intrabody)、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、v-NAR及雙-scFv中(參見例如Hollinger及Hudson,Nature Biotechnology 23：1126-1136,2005)。抗原結合片段亦可移植至基於多肽之骨架，諸如III型纖維結合蛋白(Fn3)(參見美國專利第6,703,199號，其描述纖維結合蛋白多肽微型抗體)。
術語「scFv」係指包含至少一個包含輕鏈可變區之抗體片段及至少一個包含重鏈可變區之抗體片段的融合蛋白，其中輕鏈及重鏈可變區例如經合成連接子(例如較短可撓性多肽連接子)連續連接且能夠表 現為單鏈多肽，且其中scFv保留其所來源之完整抗體的特異性。除非指明，否則如本文所用，scFv可例如關於多肽之N端及C端末端具有任何順序之VL及VH可變區，scFv可包含VL-連接子-VH或可包含VH-連接子-VL。
本發明之CAR部分(包含其抗體或抗體片段)可以多種形式存在，其中抗原結合域作為鄰接多肽鏈(包括例如單結構域抗體片段(sdAb)、單鏈抗體(scFv)、人類化抗體或雙特異性抗體)之部分表現(Harlow等人，1999,In：Using Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人，1989,In：Antibodies：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883；Bird等人，1988,Science 242：423-426)。在一個態樣中，本發明CAR組合物之抗原結合域包含抗體片段。在另一態樣中，CAR包含抗體片段，包含scFv。
術語「抗體重鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中且其通常決定抗體所屬類別的兩種類型多肽鏈中之較大者。
術語「抗體輕鏈」係指以其天然存在之構形存在於抗體分子中之兩種類型多肽鏈中之較小者。卡帕(κ)及拉姆達(λ)輕鏈係指兩種主要抗體輕鏈同型。
術語「重組抗體」係指使用重組DNA技術產生之抗體，諸如由噬菌體或酵母表現系統所表現之抗體。該術語亦應理解為意謂已藉由合成編碼抗體之DNA分子(且該DNA分子表現抗體蛋白)或指定抗體之胺基酸序列產生之抗體，其中該DNA或胺基酸序列已使用在此項技術中可獲得且熟知的重組DNA或胺基酸序列技術獲得。
術語「抗原」或「Ag」係指引起免疫反應之分子。此免疫反應可能涉及抗體產生或特異免疫勝任細胞之活化或兩者。熟習此項技術 者應理解包括幾乎所有蛋白質或肽之任何大分子可充當抗原。此外，抗原可來源於重組或基因組DNA。熟習此項技術者應理解，當在本文中使用彼術語時，包含編碼引發免疫反應之蛋白質的核苷酸序列或部分核苷酸序列之任何DNA因此編碼「抗原」。此外，熟習此項技術者應理解抗原無需僅藉由基因之全長核苷酸序列編碼。顯而易見，本發明包括(但不限於)一種以上基因之部分核苷酸序列之用途且此等核苷酸序列以各種組合排列以編碼引起所需免疫反應之多肽。此外，熟習此項技術者應理解抗原根本無需藉由「基因」編碼。顯而易見，抗原可合成產生或可來源於生物樣品或可為除多肽以外之大分子。此類生物樣品可包括(但不限於)組織樣品、腫瘤樣品、具有其他生物組分之細胞或液體。
術語「競爭」係指抗原結合域(例如抗體或其片段)干擾另一抗原結合域(例如本文提供之抗原結合域，例如本文提供之抗體或其片段)直接或間接結合至目標(例如間皮素)之能力。抗原結合域(例如抗體或其片段)能夠干擾另一抗原結合域(例如抗體或其片段)結合至目標之程度(且因此不論其是否稱為競爭)可使用競爭結合分析法測定。在一些實施例中，競爭結合分析為定量競爭分析。舉例而言，一種尤其適合之定量競爭分析使用基於表面電漿子共振(SPR)之方法量測一個抗體或其片段與另一抗體或其片段之間結合於固定目標之結合(例如競爭)。例示性基於SPR之競爭分析法描述於本文實例2中。另一適合定量競爭分析使用基於FACS之方法量測經標記(尤其例如His標記、生物素標記或放射性標記)之抗體或其片段與另一抗體或其片段之間結合於目標的競爭。
術語「抗癌作用」係指可藉由各種手段顯現之生物作用，其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小，腫瘤細胞數目減少，癌轉移數目減少，預期壽命增加，癌細胞增殖減少，癌細胞存活率降低，或與癌性 病狀相關之各種生理學症狀改善。「抗癌作用」亦可藉由肽、聚核苷酸、細胞及抗體預防癌症初次出現之能力顯現。術語「抗腫瘤作用」係指可藉由多種手段顯現之生物作用，其包括(但不限於)例如腫瘤體積減小、腫瘤細胞數目減少、腫瘤細胞增殖減少或腫瘤細胞存活率降低。
術語「自體」係指來源於與隨後可重新引入之個體相同個體之任何材料。
術語「同種異體」係指來源於與將引入材料之個體相同物種之不同動物的任何材料。當一或多個基因座處之基因不相同時，兩個或兩個以上個體稱為彼此同種異體。在一些態樣中，來自相同物種之個體的同種異體材料基因上可足夠不同從而以抗原方式相互作用。
術語「異種」係指移植物來源於不同物種之動物。
術語「癌症」係指特徵為異常細胞之不受控生長的疾病。癌細胞可局部擴散或經由血流及淋巴系統擴散至身體其他部分。本文描述各種癌症之實例且其包括(但不限於)間皮瘤、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、皮膚癌、胰臟癌、結腸直腸癌、腎癌、肝癌、腦癌、淋巴瘤、白血病、肺癌及其類似癌症。
「與間皮素表現有關之疾病」一詞包括(但不限於)與間皮素表現有關之疾病或與表現間皮素之細胞有關之病狀，包括例如增生性疾病，諸如癌症或惡性或癌變前病狀，諸如間皮細胞增生；或與表現間皮素之細胞有關的非癌症相關適應症。表現間皮素之多種癌症的實例包括(但不限於)間皮瘤、肺癌、卵巢癌、胰臟癌及其類似癌症。
術語「保守序列修飾」係指胺基酸修飾不顯著影響或改變含有該胺基酸序列之抗體或抗體片段的結合特徵。此類保守修飾包括胺基酸取代、添加及缺失。修飾可藉由此項技術中已知之標準技術(諸如定點突變誘發及PCR介導之突變誘發)引入本發明之抗體或抗體片段 中。保守胺基酸取代為胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的取代。此項技術中已限定具有類似側鏈之胺基酸殘基家族。此等家族包括具有鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸、色胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)之胺基酸。因此，本發明之CAR內的一或多個胺基酸殘基可置換為相同側鏈家族之其他胺基酸殘基且可例如使用本文所述之功能性分析法測試經改變CAR之結合間皮素之能力。
術語「刺激」係指由結合刺激分子(例如TCR/CD3複合物或CAR)與其同源配位體(或在CAR之情況中腫瘤抗原)藉此調節信號轉導事件(諸如(但不限於)經TCR/CD3複合物信號轉導或經適當NK受體或CAR之信號傳導結構域信號轉導)誘導之一級反應。刺激可介導某些分子之經改變表現。
術語「刺激分子」係指由免疫細胞(例如T細胞、NK細胞、B細胞)表現之分子，該分子提供針對免疫細胞信號傳導路徑之至少一些態樣以刺激方式調節免疫細胞活化之細胞質信號傳導序列。在一個態樣中，信號為藉由例如結合TCR/CD3複合物與負載有肽之MHC分子起始的一級信號，且其導致介導T細胞反應，包括(但不限於)增殖、活化、分化及其類似物。以刺激起作用之一級細胞質信號傳導序列(亦稱作「一級信號傳導結構域」)可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。特定用於本發明之含有ITAM之細胞質信號傳導序列的實例包括(但不限於)源自以下者：CD3 ζ、常見FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在本發明之特異性CAR中，任何一或多種本發明之CAR中的胞內信號傳導結構域包含胞內信號傳導序列，例如CD3-ζ之一級信號傳導序列。在本發明之特異性CAR中，CD3-ζ之一級信號傳導序列為以SEQ ID NO：9形式提供之序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。在本發明之特異性CAR中，CD3-ζ之一級信號傳導序列為如SEQ ID NO：10中所提供之序列，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。
術語「抗原呈現細胞」或「APC」係指在表面上呈現與主要組織相容複合物(MHC's)複合之外來抗原的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如B細胞、樹突狀細胞及其類似物)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合物。APC處理抗原且將其呈現給T細胞。
如本文所用之術語「胞內信號傳導結構域」係指分子之胞內部分。胞內信號傳導結構域產生促進含有CAR之細胞(例如CART細胞)之免疫效應功能的信號。免疫效應功能之實例(例如在CART細胞中)包括細胞溶解活性及輔助活性，包括細胞激素之分泌。
在一實施例中，胞內信號傳導結構域可包含一級胞內信號傳導結構域。例示性一級胞內信號傳導結構域包括來源於負責一級刺激或抗原依賴性模擬之分子者。在一實施例中，胞內信號傳導結構域可包含共同刺激胞內結構域。例示性共同刺激胞內信號傳導結構域包括來源於負責共同刺激信號或抗原獨立刺激之分子者。舉例而言，在CART情況中，一級胞內信號傳導結構域可包含T細胞受體之細胞質序列，且共同刺激胞內信號傳導結構域可包含來自輔助受體或共同刺激分子之細胞質序列。
一級胞內信號傳導結構域可包含稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。含有ITAM之一級細胞質信號傳導序 列之實例包括(但不限於)源自以下者：CD3 ζ、常見FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。
術語「ζ」或者「ζ鏈」、「CD3-ζ」或「TCR-ζ」定義為如GenBan Acc第BAG36664.1號提供之蛋白質或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基，且「ζ刺激結構域」或者「CD3-ζ刺激結構域」或「TCR-ζ刺激結構域」定義為來自ζ鏈之細胞質域的胺基酸殘基或其功能衍生物，其足以功能上傳輸T細胞活化必需之初始信號。在一個態樣中，ζ之細胞質域包含Genbank Acc第BAG36664.1號之殘基52至164或作為其功能性直系同源物的來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。在一個態樣中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」為以SEQ ID NO：9形式提供之序列。在一個態樣中，「ζ刺激結構域」或「CD3-ζ刺激結構域」為以SEQ ID NO：10形式提供之序列。
術語「共同刺激分子」係指T細胞上之同源結合搭配物，其特異性結合共同刺激配位體，藉此藉由T細胞(諸如(但不限於))增殖調節共同刺激反應。共同刺激分子為除抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子，其促成有效免疫反應。共同刺激分子包括(但不限於)MHC I級分子、BTLA及Toll配位體受體以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。此類共同刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、 CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp及特異性結合CD83之配位體。
共同刺激胞內信號傳導結構域可為共同刺激分子之胞內部分。共同刺激分子可呈現於以下蛋白質家族中：TNF受體蛋白、免疫球蛋白樣蛋白質、細胞激素受體、整合素、信號傳導淋巴球性活化分子(SLAM蛋白)及活化NK細胞受體。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴細胞功能相關之抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、SLAMF7、NKp80、CD160、B7-H3及特異性結合CD83之配位體及其類似物。
胞內信號傳導結構域可包含其所源自之分子的全部胞內部分或全部天然胞內信號傳導結構域，或其功能性片段或衍生物。
術語「4-1BB」係指胺基酸序列如GenBank Acc第AAA62478.2號所提供的TNFR超家族之一員，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。在一個態樣中，「4-1BB共同刺激結構域」定義為GenBank Acc第AAA62478.2號之胺基酸殘基214-255，或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。在一個態樣中，「4-1BB共同刺激結構域」為以SEQ ID NO：7形式提供之序列或來自非人類物種(例如小鼠、嚙齒動物、猴、猿及其類似物)之等效殘基。
如本文所用之「抗原呈現細胞」意謂在表面上呈現與主要組織 相容複合物(MHC's)複合之外來抗原的免疫系統細胞，諸如輔助細胞(例如B細胞、樹突狀細胞及其類似物)。T細胞可使用其T細胞受體(TCR)識別此等複合物。APC處理抗原且將其呈現給T細胞。
術語「編碼」係指諸如基因、cDNA或mRNA之聚核苷酸中之核苷酸之特異性序列在生物過程中充當合成其他聚合物及大分子之模板的固有特性，該等聚合物及大分子具有已確定之核苷酸序列(亦即rRNA、tRNA及mRNA)或已確定之胺基酸序列及由其獲得之生物特性。因此，若與基因相對應之mRNA之轉錄及轉譯在細胞或其他生物系統中產生蛋白質，則基因、cDNA或RNA編碼該蛋白質。核苷酸序列與mRNA序列一致且通常提供於序列表中的編碼股與用作基因或cDNA轉錄之模板的非編碼股皆可稱為編碼基因或cDNA之蛋白質或其他產物。
除非另外規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括為彼此之簡併形式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質或RNA之核苷酸序列一詞亦可包括內含子，其達到編碼蛋白質之核苷酸序列可在一些型式中含有內含子之程度。
術語「有效量」或「治療有效量」在本文中可互換使用且其係指如本文所述有效獲得特定生物結果之化合物、調配物、物質或組合物之量。術語「內源性」係指來自或在生物體、細胞、組織或系統內部產生之任何物質。
術語「外源性」係指自生物體、細胞、組織或系統外部引入或產生之任何物質。
術語「表現」係指由其啟動子驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
術語「轉移載體」係指包含經分離核酸且可用於將經分離核酸傳遞至細胞內部的物質組合物。許多載體為此項技術中已知，包括 (但不限於)線性聚核苷酸、與離子性或兩親媒性化合物有關之聚核苷酸、質體及病毒。因此，術語「轉移載體」包括自主複製質體或病毒。該術語亦應解釋為進一步包括促進核酸轉移至細胞中之非質體及非病毒化合物，諸如聚離胺酸化合物、脂質體及其類似物。病毒轉移載體之實例包括(但不限於)腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體、慢病毒載體及其類似物。
術語「表現載體」係指包含重組性聚核苷酸之載體，該重組性聚核苷酸包含可操作地連接於待表現核苷酸序列之表現控制序列。表現載體包含足夠順式作用元件用於表現；用於表現之其他要素可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中。表現載體包括此項技術中已知之全部，包括併入重組性聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。
術語「慢病毒」係指逆轉錄病毒科家族之屬。慢病毒在反轉錄病毒中為獨特的，因為其能夠感染未分化細胞；其可將足夠量之遺傳資訊傳遞至宿主細胞之DNA中，因此其為基因傳遞載體之最有效方法中之一者。HIV、SIV及FIV均為慢病毒之實例。術語「豆狀病毒載體」係指來源於慢病毒基因組之至少一部分的載體，尤其包括如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)中所提供之自身不活化豆狀病毒載體。臨床中可使用之慢病毒載體之其他實例包括(但不限於)例如來自Oxford BioMedica之LENTIVECTOR®基因傳送技術、來自Lentigen之LENTIMAXTM載體系統及其類似物。非臨床類型之慢病毒載體亦可獲得且將為熟習此項技術者所已知。
術語「同源」或「一致性」係指在兩種聚合分子之間，例如在諸如兩種DNA分子或兩種RNA分子之兩種核酸分子之間，或在兩種多肽分子之間的子單元序列一致性。當兩個分子中之子單元位置被相同單體子單元佔據時；例如若兩個DNA分子中之每一者中之位置均被腺 嘌呤佔據，則其在彼位置處為同源或一致的。兩個序列之間的同源性為匹配或同源位置數目之直接函數；例如若兩個序列中之位置有一半(例如長度為十個子單元之聚合物中之五個位置)同源，則該兩個序列為50%同源；若90%之位置(例如10個中之9個)匹配或同源，則該兩個序列為90%同源。
術語「人類化」係指以下非人類(例如鼠類)抗體形式：含有來源於非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合性免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(諸如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗體之其他抗原結合子序列)。大多數情況下，人類化抗體及其抗體片段為人類免疫球蛋白(受體抗體或抗體片段)，其中來自受體之互補決定區(CDR)之殘基置換為來自諸如具有所需特異性、親和性及能力之小鼠、大鼠或兔子之非人類物種(供體抗體)之CDR的殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之Fv構架區(FR)殘基置換為相應非人類殘基。此外，人類化抗體/抗體片段可包含既不存在於受體抗體中亦不存在於所引入之CDR或構架序列中之殘基。此等修飾可進一步使抗體或抗體片段效能得到改進及最佳化。一般而言，人類化抗體或其抗體片段將包含至少一個及通常兩個可變結構域的重要部分，其中所有或實質上所有CDR區域與非人類免疫球蛋白之彼等區域相對應且所有或絕大部分FR區域為人類免疫球蛋白序列之彼等區域。人類化抗體或抗體片段亦可包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，該恆定區典型地為人類免疫球蛋白之恆定區。其他細節參看Jones等人，Nature,321：522-525,1986；Reichmann等人，Nature,332：323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2：593-596,1992。
術語「完全人類」係指諸如抗體或抗體片段之免疫球蛋白，其中完全分子具有人類來源或由與抗體或免疫球蛋白之人類形式一致的胺基酸序列組成。
術語「經分離」意謂自天然狀態改變或移除。舉例而言，天然存在於活動物中之核酸或肽並非「經分離的」，但自其天然狀態之共存材料部分或完全分離之相同核酸或肽為「經分離的」。經分離核酸或蛋白質可以實質上經純化之形式存在或可存在於諸如宿主細胞之非原生環境中。
在本發明之情形中，使用以下通常存在之核酸鹼基之縮寫。「A」係指腺苷，「C」係指胞嘧啶，「G」係指鳥苷，「T」係指胸苷且「U」係指尿苷。
術語「可操作地連接」或「轉錄控制」係指調節序列與異源核酸序列之間的功能鍵，其導致異源核酸序列之表現。舉例而言，當第一核酸序列與第二核酸序列處於功能性關係時，第一核酸序列可操作地連接第二核酸序列。舉例而言，若啟動子影響編碼序列之轉錄或表現，則啟動子可操作地連接於編碼序列。可操作地連接之DNA序列可彼此鄰接，且若接合兩個蛋白質編碼區時必要，則在同一閱讀框架中。
術語「非經腸」投與免疫原性組合物包括例如皮下(s.c.)、靜脈內(i.v.)、肌肉內(i.m.)或胸骨內注射、瘤內或輸注技術。
術語「核酸」或「聚核苷酸」係指脫去核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈單股或雙股形式之聚合物。除非明確限制，否則該術語涵蓋含有天然核苷酸之已知類似物的核酸，該等已知類似物具有與參考核酸類似的結合特性且以與天然存在之核苷酸類似的方式代謝。除非另外指示，否則特定核酸序列亦隱含地涵蓋其經保守修飾之變異體(例如簡併密碼子取代)、對偶基因、直系同源物、SNP及互補序列以及明確指示之序列。特定言之，簡併密碼子取代可藉由產生一或多個(或所有)所選擇之密碼子之第三位置經混合鹼基及/或去氧肌苷殘基取代之序列實現(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)； Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。
術語「肽」、「多肽」及「蛋白質」可互換使用，且其係指包括由肽鍵共價連接之胺基酸殘基的化合物。蛋白質或肽必須含有至少兩個胺基酸且對可包含蛋白質或肽序列之胺基酸最大數目無限制。多肽包括包含藉由肽鍵彼此接合之兩個或兩個以上胺基酸之任何肽或蛋白質。如本文所用，該術語係指短鏈(其在此項技術中通常亦稱作例如肽、寡肽及寡聚物)及長鏈(其在此項技術中一般稱作蛋白質，其存在多種類型)。「多肽」尤其包括例如生物活性片段、實質上同源多肽、寡肽、均二聚體、雜二聚體、多肽變異體、經修飾多肽、衍生物、類似物、融合蛋白。多肽包括天然肽、重組肽、重組肽或其組合。
術語「啟動子」係指由細胞合成機制或引入之合成機制識別，起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需的DNA序列。
術語「啟動子/調節序列」係指表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所必需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核啟動子序列且在其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所必需的其他調節要素。啟動子/調節序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物者。
術語「構成性」啟動子係指當可操作地連接編碼或特異於基因產物之核苷酸序列時，在細胞之大多數或全部生理學條件下引起基因產物在細胞中產生之核苷酸序列。
術語「誘導性」啟動子係指當可操作地連接編碼或特異於基因產物之聚核苷酸時，僅當細胞中存在對應於啟動子之誘導劑時才引起基因產物在細胞中實質上產生的核苷酸序列。
術語「組織特異性」啟動子係指當可操作地連接編碼或特異於基因之聚核苷酸時，僅當細胞為對應於啟動子之組織類型的細胞時才 引起基因產物在細胞中實質上產生之核苷酸序列。
如scFv情形中所用之術語「可撓性多肽連接體」係指由諸如單獨或組合使用之甘胺酸及/或絲胺酸殘基組成之肽連接子，其將可變重鏈區域及可變輕鏈區域連接在一起。在一個實施例中，可撓性多肽連接體為Gly/Ser連接子且包含胺基酸序列(Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO：38)，其中n為等於或大於1之正整數。舉例而言，n=1、n=2、n=3、n=4、n=5及n=6、n=7、n=8、n=9及n=10。在一個實施例中，可撓性多肽連接子包括(但不限於)(Gly4 Ser)4(SEQ ID NO：27)或(Gly4 Ser)3(SEQ ID NO：28)。在另一實施例中，連接子包括多個重複(Gly2Ser)、(GlySer)或(Gly3Ser)(SEQ ID NO：29)。本發明之範疇內亦包括WO2012/138475中所述之連接子，該案以引用的方式併入本文中)。
如本文所用，5'封端(亦稱為RNA封端、RNA 7-甲基鳥苷封端或RNA m7G封端)為經修飾鳥嘌呤核苷酸，其在開始後不久即添加至真核信使RNA的「前部」或5'端。5'封端由連接至第一轉錄核苷酸之末端基團組成。其存在對於核糖體識別及保護免於RNase至關重要。封端添加與轉錄偶接，且以輔助轉錄方式進行，使得各自彼此影響。開始轉錄後不久，所合成之mRNA之5'端由與核糖核酸聚合酶有關之封端合成複合物結合。此酶促複合物催化mRNA封端所需之化學反應。合成以多步驟生物化學反應形式進行。封端部分可經修飾以調節mRNA之功能性，諸如其轉譯穩定性或效率。
如本文所用，「活體外轉錄RNA」係指已活體外合成之RNA，較佳mRNA。一般而言，活體外轉錄之RNA自活體外轉錄載體產生。活體外轉錄載體包含用於產生活體外轉錄之RNA的模板。
如本文所用，「聚(A)」為藉由聚腺苷酸化連接至mRNA的一連串腺苷。在短暫表現構築體之較佳實施例中，聚A為50至5000(SEQ ID NO：30)，較佳地大於64，更佳大於100，最佳大於300或400。聚(A)序列可經化學修飾或酶修飾以調節mRNA功能性，諸如轉譯之位置、穩定性或效率。
如本文所用，「聚腺苷酸化」係指聚腺苷部分或其經修飾變異體與信使RNA分子共價鍵聯。在真核生物中，大多數信使RNA(mRNA)分子在3'端經聚腺苷酸化。3'聚(A)尾為經酶(聚腺苷酸化聚合酶)之作用添加至前-mRNA的腺嘌呤核苷酸長序列(通常幾百)。在高級真核生物中，聚(A)尾添加至含有特異性序列(聚腺苷酸化信號)之轉錄物上。聚(A)尾及其結合之蛋白質幫助保護mRNA免於被外切核酸酶分解。聚腺苷酸化對於轉錄封端、mRNA自細胞核輸出及轉譯為重要的。聚腺苷酸化在DNA轉錄成RNA之後立即在細胞核中發生，但此外亦可稍後在細胞質中發生。轉錄結束後，mRNA鏈經與RNA聚合酶有關之核酸內切酶複合物作用裂解。裂解部位通常特徵為在裂解部位附近存在鹼基序列AAUAAA。mRNA裂解後，腺苷殘基添加至裂解部位之游離3'端。
如本文所用，「短暫」係指表現非整合轉殖基因持續幾小時、幾天或幾週之時段，其中若整合至基因組中或含於宿主細胞中之穩定質體複製子內時，則表現時段小於基因表現時段。
如本文所用，術語「治療」係指藉由投與一或多種療法(例如一或多種治療劑，諸如本發明之CAR)減少或改善增生性病症之進展、嚴重程度及/或持續時間，或改善增生性病症的一或多種症狀(較佳一或多種可辨別症狀)。在具體實施例中，術語「治療」係指改善增生性病症的至少一種患者不必辨別之可量測物理參數(諸如腫瘤生長)。在其他實施例中，術語「治療」係指藉由例如穩定可辨別症狀以物理方式，藉由例如穩定物理參數以生理學方式抑制增生性病症之進展，或其兩者。在其他實施例中，術語「治療」係指減小或穩定腫瘤尺寸 或癌細胞計數。
術語「信號轉導路徑」係指在將信號自細胞之一部分傳輸至細胞之另一部分中起作用的多種信號轉導分子之間的生物化學關係。「細胞表面受體」一詞包括能夠跨越細胞膜接收信號及傳輸信號之分子及分子複合物。
術語「個體」打算包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物、人類)。
術語「實質上經純化」細胞係指基本上不含其他細胞類型之細胞。實質上經純化之細胞亦指已與在其天然存在之狀態中通常與其相關聯之其他細胞類型分離之細胞。在一些情況下，實質上經純化之細胞群體係指細胞之同源群體。在其他情況下，此術語僅指已與在其天然狀態下與其天然相關聯之細胞分離的細胞。在一些態樣中，該等細胞在活體外培養。在其他態樣中，該等細胞不在活體外培養。
如本文所用之術語「療法」意謂治療。藉由減輕、抑制、緩解或根除疾病病況來獲得治療作用。
如本文所用之術語「預防」意謂疾病或疾病狀態之預防性治療或保護性治療。
術語「癌症相關抗原」或「腫瘤抗原」互換地係指全部或以片段形式(例如MHC/肽)在癌細胞表面上表現之分子(通常蛋白質、碳水化合物或脂質)，且其適用於將藥理學試劑較佳靶向癌細胞。在一些實施例中，腫瘤抗原為正常細胞及癌細胞表現之標記物，例如譜系標記物，例如B細胞上之CD19。在一些實施例中，腫瘤抗原為在癌細胞中相較於在正常細胞中過度表現之細胞表面分子，例如相較於正常細胞1倍過度表現、2倍過度表現、3倍或3倍以上過度表現。在一些實施例中，腫瘤抗原為癌細胞中不適當合成之細胞表面分子，例如相較於正常細胞上表現之分子含有缺失、添加或突變的分子。在一些實施例 中，腫瘤抗原將全部或以片段形式(例如MHC/肽)專門表現於癌細胞之細胞表面上，且在正常細胞表面上不合成或表現。在一些實施例中，本發明之CAR包括包含結合至MHC呈現肽之抗原結合域(例如抗體或抗體片段)的CAR。通常，來源於內源性蛋白質之肽填充主要組織相容複合體(MHC)I級分子之凹穴，且由CD8+T淋巴細胞上之T細胞受體(TCR)識別。MHC I級複合物由全部成核細胞組成性表現。在癌症中，病毒特異性及/或腫瘤特異性肽/MHC複合物表示免疫療法之獨特類別之細胞表面目標。已描述在人類白細胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情形中靶向來源於病毒或腫瘤抗原之肽的TCR樣抗體(參看例如Sastry等人，J Virol.2011 85(5)：1935-1942；Sergeeva等人，Blood,2011 117(16)：4262-4272；Verma等人，J Immunol 2010 184(4)：2156-2165；Willemsen等人，Gene Ther 2001 8(21)：1601-1608；Dao等人，Sci Transl Med 2013 5(176)：176ra33；Tassev等人，Cancer Gene Ther 2012 19(2)：84-100)。舉例而言，TCR樣抗體可自篩選文庫(諸如人類scFv噬菌體呈現庫)鑑別。
術語「轉染」或「轉化」或「轉導」係指外源性核酸藉以轉移或引入至宿主細胞中的過程。「轉染」或「轉化」或「轉導」細胞為已經外源性核酸轉染、轉化或轉導的細胞。該細胞包括一級個體細胞及其後代。
術語「特異性結合」係指經樣品中存在之結合搭配物(例如腫瘤抗原)蛋白質識別及結合之抗體或配位體，但該抗體或配位體不實質上識別或結合樣品中之其他分子。
如本文所用之術語「可調控嵌合性抗原受體(RCAR)」係指一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，當在RCARX細胞中時，其向RCARX細胞針對目標細胞(通常癌細胞)之特異性，且具有可調控胞內信號產生或增殖，其可使RCARX細胞之免疫效應子特性最佳。 RCARX細胞至少部分依賴於抗原結合域獲得對包含該抗原結合域結合之抗原的目標細胞之特異性。在一實施例中，RCAR包括二聚化開關，其在存在二聚化分子時可將胞內信號傳導結構域偶合至抗原結合域。
如本文所用之術語「膜錨」或「膜繫栓結構域」係指足以將胞外或胞內結構域錨定於質膜之多肽或部分(例如肉豆蔻醯基)。
如本文所用之術語「開關結構域」當涉及RCAR時係指在二聚化分子存在下與另一開關結構域有關之實體，通常基於多肽之實體。該關聯導致連接至(例如稠合至)第一開關結構域之第一實體與連接至(例如稠合至)第二開關結構域之第二實體功能性偶合。第一及第二開關結構域統稱為二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此相同，例如其為具有相同一級胺基酸序列之多肽且統稱為均二聚化開關。在實施例中，第一及第二開關結構域彼此不同，例如其為具有不同一級胺基酸序列之多肽且統稱為雜二聚化開關。在實施例中，開關為胞內的。在實施例中，開關為胞外的。在實施例中，開關結構域為基於多肽(例如基於FKBP或FRB)之實體且二聚化分子為小分子，例如雷帕羅吉(rapalogue)。在實施例中，開關結構域為基於多肽之實體，例如結合myc肽之scFv，且該二聚化分子為多肽、其片段或多肽之多聚物，例如結合於一或多個myc scFv的myc配位體或myc配位體之多聚物。在實施例中，開關結構域為基於多肽之實體，例如myc受體，且該二聚化分子為抗體或其片段，例如myc抗體。
如本文所用之術語「二聚化分子」例如當涉及RCAR時係指促進第一開關結構域與第二開關結構域關聯之分子。在實施例中，二聚化分子不天然存在於個體中，或不以將導致顯著二聚化之濃度存在。在實施例中，二聚化分子為小分子，例如雷帕黴素(rapamycin)或雷帕羅吉，例如RAD001。
術語「生物等效」係指不為參考化合物(例如RAD001)之試劑的量，其產生之作用與參考劑量或參考量之參考化合物(例如RAD001)產生之作用等效。在一實施例中，該作用為mTOR抑制水準或藉由西方墨點法之磷酸化S6含量之量測值，該mTOR抑制水準如例如藉由P70 S6激酶抑制所量測，如例如在活體內或活體外分析法中所評估，如例如本文所描述之分析法(例如Boulay分析法)所量測。在一實施例中，該作用為改變如細胞分選所量測之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為達到與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之P70 S6激酶抑制的量或劑量。在一實施例中，mTOR抑制劑之生物等效量或劑量為實現與參考化合物之參考劑量或參考量相同水準之PD-1陽性/PD-1陰性T細胞之比率改變的量或劑量。
當與例如異位mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)或催化mTOR抑制劑之mTOR抑制劑一起使用時，術語『低免疫增強劑量』係指如例如P70 S6激酶活性抑制所量測之部分(而非完全)抑制mTOR活性之mTOR抑制劑之劑量。本文論述例如藉由P70 S6激酶之抑制來評估mTOR活性之方法。該劑量不足以導致完全免疫抑制但足以增強免疫反應。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑使得PD-1陽性T細胞之數目減少及/或PD-1陰性T細胞之數目增加，或PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率升高。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致原生T細胞之數目增加。在一實施例中，低免疫增強劑量之mTOR抑制劑導致以下中之一或多者：例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上以下標記物中之一或多者之表現增加：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上KLRG1表現減少；及 記憶T細胞前體細胞之數目增加，該等細胞例如具有以下特徵中之任一者或組合之細胞：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及BCL2增加；其中例如相較於未經治療之個體，上文所述之變化中之任一者例如至少暫時出現。
範圍：在本發明通篇中，本發明之各種態樣可以範圍型式呈現。應理解，範圍型式中的描述僅為了方便及簡潔起見且不應解釋為對本發明範疇的不靈活限制。因此，範圍之描述應視為已確切揭示所有可能的子範圍以及彼範圍內之單個數值。舉例而言，諸如1至6之範圍描述應視為已特定揭示諸如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等之子範圍以及該範圍內之個別數字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3及6。作為另一實例，諸如95%至99%之一致性範圍包括95%、96%、97%、98%或99%之一致性，且包括子範圍，諸如96%至99%、96%至98%、96%至97%、97%至99%、97%至98%及98%至99%之一致性。不管範圍之寬度此均適用。
描述
本文提供用於使用抗間皮素嵌合性抗原受體(CAR)(例如人類間皮素CAR)治療諸如癌症之疾病的物質組合物及方法。
在一個態樣中，本發明提供許多嵌合抗原受體，其包含經工程改造以結合於間皮素蛋白質的抗體或抗體片段。在一個態樣中，本發明提供經工程改造以表現CAR之細胞(例如T細胞或NK細胞)，例如其中CAR T細胞(「CART」)呈現抗癌特性。在一個態樣中，細胞用CAR轉化且CAR表現於細胞表面上。在一些實施例中，細胞(例如T細胞或NK細胞)用編碼CAR之病毒載體轉導。在一些實施例中，載體為反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體為豆狀病毒載體。在一些此類實施例中，細胞可穩定表現CAR。在另一實施例中，細胞(例如T細 胞或NK細胞)經編碼CAR之核酸(例如mRNA、cDNA、DNA)轉染。在一些此類實施例中，細胞可短暫表現CAR。
在一個態樣中，CAR之間皮素蛋白質結合部分為scFv抗體片段。在一個態樣中，此類抗體片段因為保留等效結合親和力而起作用，亦即其以相當親和力與其所源自之IgG抗體結合相同抗原。在一個態樣中，此類抗體片段因為其提供可包括(但不限於)以下如熟習此項技術者將理解之生物反應而起作用：活化免疫反應、抑制源於其目標抗原之信號轉導、抑制激酶活性及其類似物。在一個態樣中，CAR之間皮素抗原結合域為scFv抗體片段，其相較於該scFv所源自之鼠類序列為人類或人類化的。在一個實施例中，人類抗間皮素scFv抗體片段包含表2中提供之輕鏈可變區及/或重鏈可變區，或與其實質上一致(例如95-99%一致性)的序列。
在一些態樣中，本發明抗體併入嵌合性抗原受體(CAR)中。在一個態樣中，CAR包含本文中提供之多肽序列，如SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列。
在一個態樣中，CAR之人類scFv部分由序列已針對在哺乳動物細胞中表現經密碼子最佳化之轉殖基因編碼。在一個態樣中，本發明之全部CAR構築體由全部序列已針對在哺乳動物細胞中表現經密碼子最佳化之轉殖基因編碼。密碼子最佳化係指編碼DNA中之同義密碼子(亦即編碼相同胺基酸之密碼子)之出現頻率在不同物種中有偏向的發 現。此類密碼簡併允許相同多肽由多種核苷酸序列編碼。多種密碼子最佳化方法為此項技術中已知，且包括例如至少US專利第5,786,464號及第6,114,148號中所揭示之方法。
在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：39中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：40中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：41中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：42中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：43中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：44中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：45中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：46中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：47中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：48中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：49中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：50中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：51中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：52中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：53中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：54中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：55中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：56中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：57中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：58中所提供之scFv部分。 在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：59中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：60中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：61中所提供之scFv部分。在一個態樣中，人類間皮素CAR分子包含SEQ ID NO：62中所提供之scFv部分。
在一個態樣中，本文揭示之CAR組合特異性抗體之抗原結合域與胞內信號傳導分子。舉例而言，在一些態樣中，胞內信號傳導分子包括(但不限於)CD3-ζ鏈、4-1BB及CD28信號傳導模組及其組合。在一個態樣中，抗原結合域結合至間皮素。在一個態樣中，間皮素CAR包含表2中所提供之序列。
在一個態樣中，間皮素CAR包含選自SEQ ID NO：63-86中之一或多者提供的序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：63中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：64中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：65中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：66中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：67中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：68中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：69中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：70中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：71中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：72中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：73中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：74中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：75中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：76中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：77中所提供之序 列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：78中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：79中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：80中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：81中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：82中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：83中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：84中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：85中所提供之序列。在一個態樣中，間皮素CAR包含SEQ ID NO：86中所提供之序列。
此外，本發明提供間皮素CAR組合物及其於用於在其他疾病中治療涉及表現間皮素之細胞或組織的癌症或任何惡性或自體免疫疾病之藥劑或方法中的用途。
在一個態樣中，本發明提供經工程改造以表現嵌合性抗原受體(CAR)之細胞(例如T細胞或NK細胞)，其中CAR T細胞(「CART」)呈現抗腫瘤特性。較佳抗原為間皮素。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含人類抗間皮素抗體片段。在一個態樣中，CAR之抗原結合域包含人類抗間皮素抗體片段，其包含scFv。因此，本發明提供包含人類抗間皮素結合域且工程改造至T細胞或NK細胞中的間皮素CAR及使用其進行過繼療法之方法。
在一個態樣中，間皮素CAR包含至少一個選自由以下組成之群的胞內信號傳導結構域：CD137(4-1BB)信號傳導結構域、CD28信號傳導結構域、CD3ζ信號結構域及其任何組合。在一個態樣中，間皮素CAR包含一或多個除CD137(4-1BB)或CD28以外之共同刺激分子的至少一個胞內信號傳導結構域、CD3ζ信號結構域及其任何組合。
此外，本發明提供間皮素CAR組合物及其於用於在其他疾病中治 療涉及表現間皮素之細胞或組織的癌症或任何惡性或自體免疫疾病之藥劑或方法中的用途。
嵌合性抗原受體(CAR)
本發明涵蓋包含編碼CAR之序列的重組核酸構築體，其中該CAR包含特異性結合至間皮素之抗體，例如特異性結合至間皮素之人類抗體片段。在一個態樣中，間皮素為人類間皮素，且抗體片段之序列與編碼胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且與其在相同閱讀框架內。胞內信號傳導結構域可包含共同刺激信號傳導結構域及/或一級信號傳導結構域，例如ζ鏈。共同刺激信號傳導結構域係指包含共同刺激分子之胞內結構域的至少一部分的CAR之一部分。
在特定態樣中，本發明之CAR構築體包含選自由以下組成之群的scFv結構域：SEQ ID NO：39-62，其中scFv前可冠有視情況存在的諸如SEQ ID NO：1中所提供之前導序列，及繼之以視情況存在的諸如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5中所提供之鉸鏈序列，諸如SEQ ID NO：6中所提供之跨膜區，包括SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8之胞內信號傳導結構域及包括SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10之CD3 ζ序列，其中該結構域鄰接且在相同閱讀框架中形成單個融合蛋白。本發明亦包括編碼選自由以下組成之群的多肽之核苷酸序列：SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110，或與其具有95-99%一致性的序列。本發明中亦包括編碼選自由以下組成之群的scFv片段中之每一者之多肽的核苷 酸序列：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列，及SEQ ID NO：1、2及6-9之結構域之每一者加本發明之經編碼間皮素CAR融合蛋白。在一個態樣中，例示性間皮素CAR構築體包含視情況存在之前導序列、胞外間皮素結合域、鉸鏈、跨膜結構域及胞內刺激結構域。在一個態樣中，間皮素CAR構築體包含視情況存在之前導序列、間皮素結合域、鉸鏈、跨膜結構域、胞內共同刺激結構域及胞內刺激結構域。含有人類scFv結構域之特異性間皮素CAR構築體以SEQ ID NO：87-110形式提供。
本文為提供如下全長CAR序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：86。例示性前導序列提供為SEQ ID NO：1。例示性鉸鏈/間隔基序列提供為SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。例示性跨膜結構域序列提供為SEQ ID NO：6。4-1BB蛋白質之例示性胞內信號傳導結構域序列提供為SEQ ID NO：7。CD27之例示性胞內信號傳導結構域序列提供為SEQ ID NO：8。例示性CD3ζ結構域序列提供為SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。
在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之核酸分子的重組核酸構築體，其中該核酸分子包含編碼例如本文所述之抗間皮素結合域的核酸序列，其與編碼胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且在相同閱讀框架中。在一個態樣中，抗間皮素結合域係選自SEQ ID NO：87-110中之一或多者。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：87。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：88。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：89。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：90。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：91。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：92。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：93。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：94。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：95。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：96。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：97。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：98。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：99。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：100。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：101。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：102。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：103。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：104。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：105。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：106。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：107。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：108。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：109。在一個態樣中，抗間皮素結合域包含SEQ ID NO：110。在一個態樣中，本發明涵蓋包含編碼CAR之轉殖基因的重組DNA構築體，其中該轉殖基因包含編碼本文所述之抗間皮素結合域的核酸序列，該抗間皮素結合域例如選自SEQ ID NO：87-110中之一或多者的人類抗間皮素結合域，其中該序列與編碼胞內信號傳導結構域之核酸序列鄰接且與其在相同閱讀框架中。可用於CAR中之例示性胞內信號傳導結構域包括(但不限於)例如CD3-ζ、CD28、4-1BB及其類似物的一或多個胞內信號傳導結構域。在一些情況下，CAR可包含CD3-ζ、CD28、4-1BB及其類似物的任何組合。在一個態樣中，本發明之CAR構築體的核酸序列係選自SEQ ID NO：111-134中之一或多者。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：111。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：112。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：113。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：114。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：115。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：116。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：117。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：118。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：119。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：120。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：121。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：122。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：123。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：124。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：125。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：126。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：127。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：128。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：129。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：130。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：131。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：132。在一個態樣中，CAR 構築體之核酸序列為SEQ ID NO：133。在一個態樣中，CAR構築體之核酸序列為SEQ ID NO：134。
編碼所要分子之核酸序列可使用此項技術中已知之重組方法獲得，諸如藉由使用標準技術自表現基因之細胞篩選庫、自已知包括基因之載體獲得基因或自含有基因之細胞及組織直接分離。或者，所關注核酸可以合成方式而非選殖方式產生。
本發明包括表現可直接轉導至細胞中之CAR的反轉錄病毒及豆狀病毒載體構築體。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之RNA構築體。產生用於轉染之mRNA之方法涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現核酸及長度通常50-2000鹼基之聚A尾(SEQ ID NO：35)的構築體。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個實施例中，模板包括CAR之序列。在一實施例中，RNA CAR載體藉由電穿孔轉導至T細胞中。
抗原結合域
在一個態樣中，本發明之CAR包含另外稱為抗原結合域之目標特異性結合要素。抗原結合域之選擇取決於定義目標細胞表面之抗原類型及數目。舉例而言，可選擇抗原結合域來識別與在特定疾病狀態有關之目標細胞上充當細胞表面標記物之抗原。
在一個態樣中，CAR介導之免疫效應細胞反應可針對表現所關注抗原之細胞，其中CAR包含特異性結合至所關注抗原之抗原結合域。在一個態樣中，包含抗原結合域之CAR的部分包含靶向間皮素之抗原結合域。在一個態樣中，抗原結合域靶向人類間皮素。
抗原結合域可為結合至包括(但不限於)以下抗原的任何結構域：單株抗體、多株抗體、重組抗體、人類抗體、人類化抗體及其功能性片段，包括(但不限於)單結構域抗體，諸如重鏈可變結構域(VH)、輕 鏈可變結構域(VL)及駱駝科源奈米抗體之可變域(VHH)，且抗原結合域可為結合至此項技術中已知之替代骨架以充當抗原結合域的任何結構域，諸如重組纖維結合蛋白結構域及其類似物。在一些情況下，抗原結合域宜來源於將最終使用CAR之相同物種。舉例而言，為了用於人類，CAR之抗原結合域宜包含抗體或抗體片段之抗原結合域的人類或人類化殘基。因此，在一個態樣中，抗原結合域包含人類抗體或抗體片段。
在一個實施例中，例如在本文所述之競爭分析中，抗間皮素結合域不與包含具有SEQ ID NO：279之胺基酸序列的抗原結合域(例如鼠類SS1 scFv)競爭結合於人類間皮素或與其之競爭不充分。
下文提供鼠類SS1 scFv之胺基酸序列(SEQ ID NO：279)：
在一個實施例中，例如在本文所述之競爭分析中，抗間皮素結合域與包含以下之抗原結合域競爭結合於人類間皮素：選自SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之抗間皮素輕鏈胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及選自SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之抗間皮素重鏈胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。在一個實施例中，例如在本文所述之競爭分析中，抗間皮素結合域與包含以下之抗原結合域競爭結合於人類間皮素：選自SEQ ID NO：203或SEQ ID NO：209之LC CDR1、選自SEQ ID NO：227或SEQ ID NO：233之LC CDR2及選自SEQ ID NO：251或SEQ ID NO：257之LC CDR3；及選自SEQ ID NO：138或SEQ ID NO：144之HC CDR1、選自SEQ ID NO：156或SEQ ID NO：162之HC CDR2及選自SEQ ID NO：179或SEQ ID NO：185之HC CDR3。
在一個實施例中，在例如本文所述之競爭分析中，抗間皮素結合域與包含選自SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：49之序列的抗原結合域競爭結合於人類間皮素。
在實施例中，競爭分析為基於SPR之分析法。簡言之，例如人類間皮素之抗原固定於表面上。參考抗體藉由微流系統注射至抗原層上。將參考抗體結合至抗原時，偵測到通常表現於反應單元(RU)中之信號(例如參考信號)增加。所要時間後，將測試抗體注射至抗原層上。若測試抗體結合至抗原的不同區域或抗原決定基，則相較於參考抗體結合時偵測到的最高信號(例如參考信號)，偵測到信號中有額外提高，例如5%或以上、10%或以上、15%或以上、20%或以上、25%或以上、30%或以上、35%或以上、40%或以上、45%或以上、50%或以上、55%或以上、60%或以上、65%或以上、70%或以上、75%或以上、80%或以上、85%或以上、90%或以上或95%或以上信號(例如RU)提高。若測試抗體結合至抗原之相同區域或抗原決定基，則相較於參考抗體結合時偵測到的最高信號(例如參考信號)，將偵測到信號(例如RU)中幾乎無或無提高，例如小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%信號(例如RU)提高。當使用此基於SPR之競爭分析時，當相較於參考抗體結合至抗原時偵測到的參考信號，偵測到小於20%、小於15%、小於10%、小於5%、小於4%、小於3%、小於2%或小於1%信號(例如RU)提高時，抗體稱為與參考抗體競爭。當相較於參考抗體結合至抗原時偵測到的參考信號，偵測到5%或以上、10%或以上、15%或以上、20%或以上、25%或以上、30%或以上、35%或以上、40%或以上、45%或以上、50%或以上、55%或以上、60%或以上、65%或以上、70%或以上、75%或以上、80%或以上、85%或以上、90%或以上或95%或以上信號(例如RU)提高時，抗體稱為不與參考抗體競爭或與參考抗體競爭不充分。
本文所述之抗原結合域結合的抗原決定基之鑑別可藉由此項技術中已知之多種方法測定。舉例而言，可產生含有結合於抗原或與抗原複合之抗原結合域的晶體結構。在另一實例中，可進行例如保護分析法之分析法來鑑別造成抗原決定基之抗原區域，或鑑別抗原決定基。實例18中進一步描述例示性保護分析法(氫/氘交換(HDX)質譜分析法)。進行HDX質譜來鑑別人類MSLN上之假定抗原決定基，例如hMSLN296-588，例如SEQ ID NO：278，對於鼠類SS1，例如SEQ ID NO：279，及本文所述之M5 scFv，例如SEQ ID NO：43。hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)表示人類間皮素之胺基酸296-588，例如SEQ ID NO：278之第一胺基酸為胺基酸296且SEQ ID NO：278之最後胺基酸為胺基酸588。人類間皮素之胺基酸序列(胺基酸296-588)提供於下文中：(SEQ ID NO：278)
HDX質譜分析法之結果指示hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)之一或多個胺基酸314-315、317-318、346-349及369-375造成SS1識別之抗原決定基。HDX質譜分析法之結果指示hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)之一或多個胺基酸485-490、498-507、532-537或545-572造成本文所述之抗間皮素抗原結合域識別之抗原決定基，例如M5 scFv，例如SEQ ID NO：43。
在一個實施例中，本文所述之抗間皮素結合域結合至與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域(例如鼠類SS1)靶向之人類間皮素抗原決定基不同的人類間皮素抗原決定基(例如SEQ ID NO：278)。
在一個實施例中，SS1識別之抗原決定基包含選自hMSLN296-588(例 如SEQ ID NO：278)之胺基酸314-315、317-318、346-349或369-375，或其任何組合的序列。在一個實施例中，SS1識別之抗原決定基包含一或多個選自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)之胺基酸314-315、317-318、346-349或369-375。
在一個實施例中，本文所述之抗間皮素結合域結合至人類間皮素之C端。在一個實施例中，本文所述之抗間皮素結合域結合SEQ ID NO：278之胺基酸450-588內的抗原決定基，例如其中該抗原決定基部分或全部可存在於SEQ ID NO：278之胺基酸450-588、胺基酸480-580或胺基酸485-572內。在一個實施例中，本文所述之抗間皮素結合域識別之抗原決定基包含選自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)之胺基酸485-490、498-507、532-537或545-572或其任何組合的序列。在一個實施例中，本文所述之抗間皮素結合域識別之抗原決定基包含一或多個選自hMSLN296-588(例如SEQ ID NO：278)之485-490、498-507、532-537或545-572或其任何組合的胺基酸。
在一個實施例中，抗間皮素結合域包含選自SEQ ID NO：39-62之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及選自SEQ ID NO：39-62之人類抗間皮素結合域的一或多個(例如全部三個)重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。在一個實施例中，人類抗間皮素結合域包含本文所述之輕鏈可變區(例如表2中)及/或本文所述之重鏈可變區(例如表2中)。在一個實施例中，抗間皮素結合域為包含表2之胺基酸序列的輕鏈可變區及重鏈可變區之scFv。在一實施例中，抗間皮素結合域(例如scFV)包含：輕鏈可變區，其包含與表2中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列， 或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列；及/或重鏈可變區，其包含或由以下組成：與表2中所提供之重鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾(例如取代)但不超過30、20或10個修飾(例如取代)的胺基酸序列，或與表2之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中，人類抗間皮素結合域包含選自由SEQ ID NO：39-62組成之群的序列或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，編碼人類抗間皮素結合域之核酸序列包含選自由SEQ ID NO：87-110組成之群的序列或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，人類抗間皮素結合域為scFv，且包含本文所述之胺基酸序列(例如表2或表3中)的輕鏈可變區經連接子(例如本文所述之連接子)連接至包含本文所述之胺基酸序列(例如表2或表3中)的重鏈可變區。在一個實施例中，人類化抗間皮素結合域包括(Gly4-Ser)n連接子(SEQ ID NO：26)，其中n為1、2、3、4、5或6，較佳3或4。scFv之輕鏈可變區及重鏈可變區可為例如以下定向中之任一者：輕鏈可變區-連接子-重鏈可變區或重鏈可變區-連接子-輕鏈可變區。
在一個態樣中，抗原結合域部分包含一或多個選自SEQ ID NO：39-62之序列。在一個態樣中，CAR係選自一或多個選自SEQ ID NO：63-86之序列。
在一個態樣中，本發明抗體可以多種其他形式存在，包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵聯之Fvs(sdFv)、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、直鏈抗體、諸如sdAb之單域抗體(VL或VH)、駱駝科VHH結構域、由諸如二價片段之抗體片段形成之多特異性抗體(包含在鉸鏈區經二硫橋鍵聯之兩個Fab片段)，及經分離CDR或抗體之其他抗原決定基結合片段。在一個態樣中，本文提供之抗體片段為scFv。在一些情況下，人類scFv亦可來源於酵母 呈現庫。
呈現庫為實體集；各實體包括可及多肽組分及編碼或鑑別多肽組分之可恢復組分。多肽組分為變化的，從而呈現不同胺基酸序列。多肽組分可為任何長度，例如三個胺基酸至超過300個胺基酸。呈現庫實體可包括一種以上多肽組分，例如Fab之兩條多肽鏈。在一個例示性實施例中，呈現庫可用於鑑別抗間皮素結合域。在一個選擇中，文庫之各成員的多肽組分用間皮素或其中之片段探測，且若多肽組分結合至間皮素，則呈現庫成員通常藉由滯留於支持物上而鑑別。
自支撐物回收保留之呈現庫成員且進行分析。該分析可包括擴增及隨後在類似或相異條件下選擇。舉例而言，陽性及陰性選擇可交替。分析亦可包括測定多肽組分(亦即抗間皮素結合域)之胺基酸序列，及純化多肽組分以供具體表徵。
呈現庫可使用多種型式。實例包括噬菌體呈現。在噬菌體呈現中，蛋白質組分通常共價連接至噬菌體鞘蛋白。由轉譯編碼與鞘蛋白稠合之蛋白質組分的核酸產生鍵聯。鍵聯可包括可撓性肽連接子、蛋白酶位點或因抑制終止密碼子而併入之胺基酸。噬菌體呈現描述於例如U.S.5,223,409；Smith(1985)Science 228：1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；de Haard等人，(1999)J.Biol.Chem 274：18218-30；Hoogenboom等人，(1998)Immunotechnology 4：1-20；Hoogenboom等人，(2000)Immunol Today 2：371-8及Hoet等人，(2005)Nat Biotechnol.23(3)344-8。細菌噬菌體呈現可使用標準噬菌體製備方法(例如自生長培養基PEG沈澱)生長及採集之蛋白質組分。選擇個別呈現噬菌體之後，可在擴增後自感染所選噬菌體之細胞或噬菌體本身分離編碼所選蛋白質組分之核酸。可挑選個別菌落或斑塊，分離及定序核酸。
其他呈現型式包括基於細胞之呈現(參看例如WO 03/029456)、蛋白質-核酸融合(參看例如US 6,207,446)、核糖體呈現(參看例如Mattheakis等人，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：9022及Hanes等人，(2000)Nat Biotechnol.18：1287-92；Hanes等人，(2000)Methods Enzymol.328：404-30；及Schaffitzel等人，(1999)J Immunol Methods.231(1-2)：119-35)，及大腸桿菌周質呈現(J Immunol Methods.2005年11月22日；PMID：16337958)。
除了使用呈現庫之外，可使用其他方法獲得抗間皮素結合域。舉例而言，間皮素或其片段可在非人類動物(例如嚙齒動物)中用作抗原。
在一個實施例中，非人類動物包括人類免疫球蛋白基因之至少一部分。舉例而言，可能在小鼠抗體製造中使用人類Ig基因座之大片段對小鼠病毒株缺陷進行工程改造。使用融合瘤技術，可製造及選擇來源於具有所要特異性之基因的抗原特異性單株抗體(Mab)。參看例如XENOMOUSETM,Green等人，1994,Nat.Gen.7：13-21；U.S.2003-0070185、WO 96/34096，1996年10月31日公開，及1996年4月29日申請之PCT申請案第PCT/US96/05928號。
在一些情況下，scFv可根據此項技術中已知之方法(參看例如Bird等人，(1988)Science 242：423-426及Huston等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)製備。可藉由例如使用可撓性多肽連接子將VH及VL區連接在一起製造scFv分子。scFv分子可包含具有最佳長度及/或胺基酸組成之連接子(例如Ser-Gly連接子)。連接子長度可大大影響scFv可變區之摺疊及相互作用方式。實際上，若採用短多肽連接子(例如5-10個胺基酸)，則防止鏈內摺疊。亦需要鏈間摺疊使兩個可變區一起形成功能性抗原決定基結合位點。連接子定向及尺寸之實例參看例如Hollinger等人，1993 Proc Natl Acad.Sci.U.S.A. 90：6444-6448、美國專利申請公開案第2005/0100543號、第2005/0175606號、第2007/0014794號及PCT公開案第WO2006/020258號及第WO2007/024715號，其以引用的方式併入本文中。
scFv可在其VL及VH區之間包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50個或50個以上胺基酸殘基的連接子。連接子序列可包含任何天然存在之胺基酸。在一些實施例中，連接子序列包含胺基酸甘胺酸及絲胺酸。在另一實施例中，連接子序列包含甘胺酸及絲胺酸重複單元組，諸如(Gly4Ser)n，其中n為等於或大於1之正整數。(SEQ ID NO：135)在一個實施例中，連接子可為(Gly4Ser)4(SEQ ID NO：27)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO：28)。連接子長度之變化可保持或提高活性，在活性研究中產生優良功效。
穩定性及突變
可參考習知對照scFv分子或全長抗體之生物物理學特性(例如熱穩定性)評估抗間皮素結合域(例如scFv分子，例如可溶性scFv)之穩定性。在一個實施例中，在所述分析法中，人類scFv之熱穩定性比對照結合分子(例如習知scFv分子)高約0.1、約0.25、約0.5、約0.75、約1、約1.25、約1.5、約1.75、約2、約2.5、約3、約3.5、約4、約4.5、約5、約5.5、約6、約6.5、約7、約7.5、約8、約8.5、約9、約9.5、約10攝氏度、約11攝氏度、約12攝氏度、約13攝氏度、約14攝氏度或約15攝氏度。
隨後賦予全部間皮素CAR構築體以抗間皮素結合域(例如scFv)的改良之熱穩定性，導致間皮素CAR構築體的治療特性改良。抗間皮素結合域(例如scFv)之熱穩定性相較於習知抗體可提高至少約2℃或3℃。在一個實施例中，抗間皮素結合域(例如scFv)相較於習知抗體具有提高1℃之熱穩定性。在另一實施例中，抗間皮素結合域(例如scFv) 相較於習知抗體具有提高2℃之熱穩定性。在另一實施例中，抗間皮素結合域(例如scFv)相較於習知抗體具有提高4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15℃的熱穩定性。可例如在本文揭示之scFv分子與scFv VH及VL所源自之抗體的scFv分子或Fab片段之間進行比較。可使用此項技術中已知之方法量測熱穩定性。舉例而言，在一個實施例中，可量測Tm。下文中更詳細描述量測Tm之方法及測定蛋白質穩定性之其他方法。
scFv中之突變(由可溶性scFv之直接突變誘發產生)改變scFv之穩定性且提高scFv及CART構築體之整體穩定性。使用諸如Tm、變性溫度及聚集溫度之測量值比較人類化scFv與鼠類scFv之穩定性。
在一個實施例中，抗間皮素結合域(例如scFv)包含至少一個突變使得經突變抗間皮素結合域(例如scFv)賦予抗間皮素構築體以改良之穩定性。在另一實施例中，抗間皮素結合域(例如scFv)包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個突變使得經突變抗間皮素結合域(例如scFv)賦予抗間皮素構築體以改良之穩定性。突變scFv之結合能力可使用實例中所述之分析法測定。
結合親和力
測定結合親和力之多種方法為此項技術中已知。測定結合親和力之例示性方法採用表面電漿子共振。表面電漿子共振為一種光學現象，其允許藉由例如使用BIAcore系統(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)偵測生物感測器基質中之蛋白質濃度改變分析即時生物特異性相互作用。其他描述參看Jonsson,U.等人，(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson,U.,i(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson,B.等人，(1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；及Johnnson,B.等人，(1991)Anal.Biochem.198：268-277。
在一個態樣中，包含抗體或其片段的本發明之CAR組合物之部分 包含與本文所述之胺基酸序列同源的胺基酸序列，且其中抗體或其片段保留本發明之抗間皮素抗體片段的所要功能性特性。在一個特定態樣中，本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中，彼抗體片段包含scFv。
在多個態樣中，包含本發明之CAR組合物之抗體或抗體片段的部分藉由修飾一個或兩個可變區(亦即VH及/或VL)內(例如一或多個CDR區及/或一或多個構架區內)的一或多個胺基酸進行工程改造。在一個特定態樣中，本發明之CAR組合物包含抗體片段。在另一態樣中，彼抗體片段包含scFv。
一般技術者應理解本發明之抗體或抗體片段可經進一步經修飾使得其胺基酸序列(例如自野生型)變化，但所要活性不變。舉例而言，可對蛋白質作出在「非必需」胺基酸殘基處導致胺基酸取代的額外核苷酸取代。舉例而言，分子中之非必需胺基酸殘基可置換為來自相同側鏈家族的另一胺基酸殘基。在另一實施例中，胺基酸條帶可置換為側鏈家族成員之順序及/或組成不同的結構上類似之條帶，亦即可進行胺基酸殘基置換為具有類似側鏈之胺基酸殘基的保守取代。
此項技術中已定義具有類似側鏈之胺基酸殘基家族，包括鹼性側鏈(例如離胺酸、精胺酸、組胺酸)、酸性側鏈(例如天冬胺酸、麩胺酸)、不帶電極性側鏈(例如甘胺酸、天冬醯胺、麩醯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β分支鏈側鏈(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳族側鏈(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
在兩種或兩種以上核酸或多肽序列情形中的一致性百分比係指兩種或兩種以上序列的相同程度。當在比較窗或標示區上比較及比對最大對應時，如使用以下序列比較算法中之一者或藉由手動比對及目 測所量測，若兩個序列具有指定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即在整個指定區域或未指定時整個序列上60%一致性，視情況而言70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%一致性)，則兩個序列「實質上相同」。視情況而言，一致性存在於至少約50個核苷酸(或10個胺基酸)長度之區域上，或更佳100個至500個或1000個或更多核苷酸(或20個、50個、200個或更多胺基酸)長度之區域上。
就序列比較而言，通常一個序列用作參考序列，測試序列與其比較。當使用序列比較演算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，指定子序列座標，且必要時指定序列演算法程式參數。可使用預設程式參數，或可指定替代參數。基於程式參數，隨後序列比較演算法計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。用於比較之序列比對方法在此項技術中為人所熟知。可進行最佳序列比對進行比較，例如藉由Smith及Waterman,(1970)Adv.Appl.Math.2：482c之局部同源演算法，藉由Needleman及Wunsch,(1970)J.Mol.Biol.48：443之同源比對演算法，藉由Pearson及Lipman,(1988)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85：2444之相似性方法研究，藉由此等演算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,WI中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA)，或藉由手動比對及目測(參見例如Brent等人，(2003)Current Protocols in Molecular Biology)。
適於測定序列一致性百分比及序列相似性百分比之兩個演算法實例為BLAST及BLAST 2.0演算法，其分別描述於Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402；及Altschul等人，(1990)J.Mol. Biol.215：403-410中。進行BLAST分析之軟體為經國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得。
亦可使用E.Meyers及W.Miller,(1988)Comput.Appl.Biosci.4：11-17)之演算法(其已併入ALIGN程式(2.0版)中)，使用PAM120權重殘基表、12分之空隙長度罰分及4分之空隙罰分來測定兩個胺基酸序列之間的一致性百分比。此外，兩個胺基酸序列之間的一致性百分比可使用Needleman及Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：444-453)演算法(其已併入GCG軟體套件(在www.gcg.com可獲得)中之GAP程式中)，使用Blossom 62矩陣或PAM250矩陣，及16、14、12、10、8、6或4之間隙權重及1、2、3、4、5或6之長度權重來測定。
在一個態樣中，本發明涵蓋產生功能上等效分子之起始抗體或片段(例如scFv)胺基酸序列之修飾。舉例而言，抗間皮素結合域之VH或VL(例如CAR中包含之scFv)可經修飾以保留至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%抗間皮素結合域之起始VH或VL構架區(例如scFv)的一致性。本發明涵蓋整個CAR構築體之修飾，例如CAR構築體之多個結構域的一或多個胺基酸序列中之修飾，以產生功能上等效分子。CAR構築體可經修飾以保留至少約70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%起始CAR構築體一致性。
跨膜結構域
在各種實施例中，關於跨膜結構域，CAR可經設計以包含連接至CAR之胞外域的跨膜結構域。跨膜結構域可包括一或多個與跨膜區相 鄰之額外胺基酸，例如一或多個與跨膜所源自之蛋白質之胞外區有關的胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胞外區胺基酸)及/或一或多個與跨膜蛋白所源自之蛋白質的胞內區有關之額外胺基酸(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10直至15個胞內區胺基酸)。在一個態樣中，跨膜結構域為與所用CAR之其他結構域中之一者有關的結構域，例如在一個實施例中，跨膜結構域可來自信號傳導結構域、共同刺激結構域或鉸鏈結構域所來源相同之蛋白質。在另一態樣中，跨膜結構域不來源於與CAR之任何其他結構域所來源相同之蛋白質。在一些情況下，跨膜結構域可經選擇或藉由胺基酸取代修飾以避免此類結構域結合至相同或不同表面膜蛋白質之跨膜結構域，例如以使與受體複合物之其他成員的相互作用降至最低。在一個態樣中，跨膜結構域能夠與CAR表現細胞之細胞表面上的另一CAR均二聚化。在不同態樣中，跨膜結構域之胺基酸序列可經修飾或經取代以使與相同CAR表現細胞中存在之原生結合搭配物之結合域的相互作用降至最低。
跨膜結構域可來源於天然或重組來源。若來源為天然的，則該結構域可來源於任何膜結合蛋白或跨膜蛋白。在一個態樣中，不管CAR是否結合於目標，跨膜結構域均能夠向胞內結構域發信號。特定用於本發明中之跨膜結構域可至少包括以下之跨膜結構域，例如T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如CD8 α、CD8 β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154。在一些實施例中，跨膜結構域可至少包括以下之跨膜區，例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D及NKG2C。
在一些情況下，跨膜結構域可經鉸鏈(例如來自人類蛋白質之鉸鏈)連接至CAR之胞外區，例如CAR之抗原結合域。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈可為人類Ig(免疫球蛋白)鉸鏈(例如IgG4鉸鏈、IgD鉸鏈)、GS連接子(例如本文所述之GS連接子)、KIR2DS2鉸鏈或CD8a鉸鏈。在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含(例如由其組成)胺基酸序列EQ ID NO：2。在一個態樣中，跨膜結構域包含(例如由其組成)SEQ ID NO：6之跨膜結構域。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔基包含IgG4鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含按以下胺基酸序列之鉸鏈： (SEQ ID NO：3)。
在一些實施例中，鉸鏈或間隔基包含如下核苷酸序列編碼之鉸鏈： (SEQ ID NO：14)。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔基包含IgD鉸鏈。舉例而言，在一個實施例中，鉸鏈或間隔基包含以下胺基酸序列之鉸鏈： (SEQ ID NO：4)。
在一些實施例中，鉸鏈或間隔基包含由以下核苷酸序列編碼之鉸鏈： (SEQ ID NO：15)。
在一個態樣中，跨膜結構域可為重組跨膜結構域，在此情況下，其將主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一個態樣中，重組跨膜結構域之各端可發現苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體。
視情況而言，長度為2至10個胺基酸的短寡或多肽連接子可在CAR之跨膜結構域與細胞質信號傳導區之間形成鍵聯。甘胺酸-絲胺酸二聯體提供尤其適合之連接子。舉例而言，在一個態樣中，連接子包含胺基酸序列GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：5)。在一些實施例中，連接子藉由核苷酸序列GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO：16)編碼。
在一個態樣中，鉸鏈或間隔基包含KIR2DS2鉸鏈及其部分。
細胞質域
CAR之細胞質域或區包括胞內信號傳導結構域。胞內信號傳導結構域一般負責已引入CAR之免疫細胞之正常效應功能中之至少一者的活化。術語「效應功能」係指細胞之特異性功能。T細胞之效應功能 例如可為細胞溶解活性或輔助活性，包括分泌細胞激素。因此，術語「胞內信號傳導結構域」係指轉導效應功能信號及引導細胞執行特異性功能之蛋白質部分。儘管通常可採用全部胞內信號傳導結構域，但在多數情況下，不必使用整條鏈。至於使用胞內信號傳導結構域之截斷部分的程度，此類截斷部分只要轉導效應功能信號即可用於代替完整鏈。術語胞內信號傳導結構域因此欲包括足以轉導效應功能信號之胞內信號傳導結構域的任何截斷部分。
用於本發明之CAR的胞內信號傳導結構域之實例包括共同作用以在抗原受體接合後起始信號轉導的T細胞受體(TCR)及輔助受體之細胞質序列，以及此等序列及具有相同功能性能力之任何重組序列的任何衍生物或變異體。
已知單獨TCR產生之信號不足以完全活化T細胞且亦需要二級及/或協同刺激信號。因此，T細胞活化可稱為由兩個獨特等級之細胞質信號傳導序列介導：藉由TCR起始抗原依賴性一級活化者(一級胞內信號傳導結構域)及以抗原獨立方式起作用以提供二級或協同刺激信號者(二級細胞質域，例如共同刺激結構域)。
一級細胞質信號傳導結構域圖刺激方式或抑制方式調控TCR複合物之一級活化。以刺激方式起作用之一級胞內信號傳導結構域可含有稱為基於免疫受體酪胺酸之活化基元或ITAM的信號傳導基元。
尤其適用於本發明的含有一級胞內信號傳導結構域之ITAM之實例包括以下者：CD3 ζ、常見FcR γ(FCER1G)、Fc γ RIIa、FcR β(Fc ε R1b)、CD3 γ、CD3 δ、CD3 ε、CD79a、CD79b、DAP10及DAP12。在一個實施例中，本發明之CAR包含胞內信號傳導結構域，例如CD3-ζ之一級信號傳導結構域。
在一個實施例中，一級信號傳導結構域包含經修飾ITAM結構域，例如相較於原生ITAM結構域具有改變(例如增加或降低)之活性 的突變ITAM結構域。在一個實施例中，一級信號傳導結構域包含含有經修飾ITAM之一級胞內信號傳導結構域，例如含有最佳化及/或截斷ITAM之一級胞內信號傳導結構域。在一實施例中，一級信號傳導結構域包含一個、兩個、三個、四個或以上ITAM基元。
在本發明中具有特定用途的含有一級胞內信號傳導結構域之分子的其他實例包括DAP10、DAP12及CD32者。
CAR之胞內結構域可包含CD3-ζ信號傳導結構域本身或其可與適用於本發明之CAR情形中的任何其他所要胞內信號傳導結構域組合。舉例而言，CAR之胞內信號傳導結構域可包含CD3 ζ鏈部分及共同刺激信號傳導結構域。共同刺激信號傳導結構域係指包含共同刺激分子之胞內結構域的CAR之一部分。共同刺激分子為除淋巴細胞對抗原有效反應所需之抗原受體或其配位體以外的細胞表面分子。此類分子之實例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1(亦稱為PD1)、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3及特異性結合CD83之配位體，及其類似物。舉例而言，CD27共同刺激已展示活體外提高人類CART細胞之擴展、效應功能及存活率且活體內加強人類T細胞持久性及抗腫瘤活性(Song等人.Blood.2012；119(3)：696-706)。此類共同刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、NKG2D、 CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76及PAG/Cbp。
本發明之CAR的細胞質部分內的胞內信號傳導結構域可以隨機或指定順序彼此連接。視情況而言，長度為2至10個胺基酸(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸)的短寡或多肽連接子可在胞內信號傳導結構域之間形成鍵聯。在一個實施例中，甘胺酸-絲胺酸二聯體可用作適合連接子。在一個實施例中，例如丙胺酸、甘胺酸之單個胺基酸可用作適合連接子。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含兩個或兩個以上，例如2、3、4、5個或以上共同刺激信號傳導結構域。在一實施例中，兩個或兩個以上(例如2、3、4、5個或以上)共同刺激信號傳導結構域藉由連接子分子(例如本文所述之連接子分子)分離。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含兩個共同刺激信號傳導結構域。在一些實施例中，連接子分子為甘胺酸殘基。在一些實施例中，連接子為丙胺酸殘基。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD28之信號傳導結構域。在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域。在一個態樣中，4-1BB之信號傳導結構域為SEQ ID NO：16之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD3-ζ之信號傳導結構域為SEQ ID NO：17之信號傳導結構域。
在一個態樣中，胞內信號傳導結構域經設計以包含CD3-ζ之信號傳導結構域及CD27之信號傳導結構域。在一個態樣中，CD27之信號傳導結構域包含胺基酸序列 QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP(SEQ ID NO：8)。在一個態樣中，CD27之信號傳導結構域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO：19)之核酸序列編碼。
在一個態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步包含第二CAR，例如包括例如針對相同目標(間皮素)或不同目標(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、claudin6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞尚志間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的不同抗原結合域之第二CAR。在一個實施例中，CAR表現細胞包含靶向第一抗原且包括具有共同刺激信號傳導結構域而非一級信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第一CAR，及靶向第二不同抗原且包括具有一級信號傳導結構域而非共同刺激信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域的第二CAR。共同刺激信號傳導結構域(例如4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置於第一CAR上，且一級信號傳導結構域(例如CD3 ζ)置於第二CAR上可將CAR活性限於表現兩個目標之細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞包含第一間皮素CAR，其包括間皮素結合域、跨膜結構域及共同刺激結構域，及第二CAR，其靶向除間皮素以外之抗原(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞 上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17，例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域。在另一實施例中，CAR表現細胞包含第一間皮素CAR，其包括間皮素結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域，及第二CAR，其靶向除間皮素以外的抗原(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17，例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括至抗原之抗原結合域、跨膜結構域及共同刺激信號傳導結構域。
在一個實施例中，CAR表現細胞包含本文所述之間皮素CAR及抑制CAR。在一個實施例中，抑制CAR包含結合正常細胞(例如亦表現間皮素之正常細胞)而非癌細胞上發現之抗原的抗原結合域。在一個實施例中，抑制CAR包含抑制分子之抗原結合域、跨膜結構域及胞內結構域。舉例而言，抑制CAR之胞內結構域可為PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β之胞內結構域。
在一個實施例中，當CAR表現細胞包含兩個或兩個以上不同CAR時，不同CAR之抗原結合域可是的抗原結合域不彼此相互作用。舉例而言，表現第一及第二CAR之細胞可具有第一CAR之抗原結合域，例如片段形式，例如scFv，其不與第二CAR之抗原結合域形式關聯，例 如該CAR之抗原結合域為VHH。
在一些實施例中，抗原結合域包含單個結構域抗原結合(SDAB)分子，包括互補決定區為單個結構域多肽之部分的分子。實例包括(但不限於)重鏈可變結構域、天然缺乏輕鏈之結合分子、來源於習知4-鏈抗體之單個結構域、工程改造結構域及除來源於抗體之骨架以外的單結構域骨架。SDAB分子可為此項領域中之任一者，或任何未來單結構域分子。SDAB分子可來源於任何物種，包括(但不限於)小鼠、人類、駱駝、大羊駝、七鰓鰻、魚、鯊魚、山羊、家兔及牛。此術語亦包括天然存在之單結構域抗體分子，其來自除駱駝及鯊魚以外的物種。
在一個態樣中，SDAB分子可來源於魚中存在之免疫球蛋白的可變區，諸如來源於鯊魚血清中存在的稱為新穎抗原受體(NAR)之免疫球蛋白同型者。製造來源於NAR(「IgNAR」)之可變區的單結構域分子之方法描述於WO 03/014161及Streltsov(2005)Protein Sci.14：2901-2909中。
根據另一態樣，SDAB分子為天然存在之單結構域抗原結合分子，其稱為缺乏輕鏈之重鏈。此類單結構域分子揭示於例如WO 9404678及Hamers-Casterman,C.等人，(1993)Nature 363：446-448中。為了清晰之原因，此來源於天然缺乏輕鏈之重鏈分子的可變域在本文中稱為VHH或奈米抗體，以與四鏈免疫球蛋白之習知VH區分。此類VHH分子可來源於駱駝科物種，例如駱駝、大羊駝、單峰駝、羊駝及原駝。除駱駝科以外的其他物種可產生天然缺乏輕鏈之重鏈分子；此類VHH在本發明之範疇內。
SDAB分子可重組、CDR移植、人類化、駱駝化、去免疫及/或活體外產生(例如藉由噬菌體呈現選擇)。
亦已發現，具有複數個嵌合性膜嵌入受體(包含在受體之抗原結 合域之間相互作用的抗原結合域)之細胞可能不合需要，因為其抑制抗原結合域中之一或多者結合其同源抗原的能力。因此，本文揭示具有第一及第二非天然產生嵌合性膜嵌入受體(包含使此類相互作用降至最低的抗原結合域)之細胞。本文亦揭示編碼第一及第二非天然產生嵌合性膜嵌入受體(包含使此類相互作用降至最低的抗原結合域)之核酸，以及製備及使用此類細胞及核酸的方法。在一實施例中，第一及第二非天然存在之嵌合性膜嵌入受體中之一者的抗原結合域包含scFv，且另一者包含單VH結構域，例如駱駝科、鯊魚或七鰓鰻單VH結構域，或來源於人類或小鼠序列之單VH結構域。
在一些實施例中，本發明包含第一及第二CAR，其中第一及第二CAR中之一者的抗原結合域不包含可變輕結構域及可變重結構域。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域為scFv，且另一者不為scFv。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含單VH結構域，例如駱駝科、鯊魚或七鰓鰻單VH結構域，或來源於人類或小鼠序列之單VH結構域。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含奈米抗體。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含駱駝科VHH結構域。
在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv，且另一者包含單VH結構域，例如駱駝科、鯊魚或七鰓鰻單VH結構域，或來源於人類或小鼠序列之單VH結構域。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv，且另一者包含奈米抗體。在一些實施例中，第一及第二CAR中之一者的抗原結合域包含scFv，且另一者包含駱駝科VHH結構域。
在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一CAR之抗原結合域與其同源抗原之結合不因存在第二CAR而實質上降低。在一些實施例中，第一CAR之抗原結合域與其同源抗原在第二CAR存在下之結合 為第一CAR之抗原結合域與其同源抗原在無第二CAR存在下之結合的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在一些實施例中，當存在於細胞表面上時，第一及第二CAR之抗原結合域的彼此關聯小於兩者皆為scFv抗原結合域的情況。在一些實施例中，第一及第二CAR之抗原結合域的彼此關聯小於兩者皆為scFv抗原結合域之情況的85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%。
在另一態樣中，本文所述之CAR表現細胞可進一步表現另一試劑，例如提高CAR表現細胞之活性或適合性之試劑。舉例而言，在一個實施例中，試劑可為抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的試劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子。在一些實施例中，抑制分子(例如PD1)可降低CAR表現細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在實施例中，例如本文所述，試劑，例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如抑制蛋白或系統，例如叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)可用於抑制調節或調控(例如抑制)CAR表現細胞中之T細胞功能之分子的表現。在一實施例中，試劑為shRNA，例如本文所述之shRNA。在一實施例中，抑制CAR表現細胞內之調節或調控(例如抑制)T細胞功能之試劑。舉例而言，抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子表現的dsRNA分子連接至編碼CAR之組分(例如全部組分)的核酸。
在一個實施例中，抑制抑制分子之試劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導結構域)有關。在一個實施例中，試劑包含例如抑制分子之第一 多肽，諸如PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β T，或此等中任一者之片段(例如此等中任一者之胞外域的至少一部分)，及為本文所述之胞內信號傳導結構域(例如包含共同刺激結構域(例如本文所述之41BB、CD27或CD28)及/或一級信號傳導結構域(例如本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，該試劑包含PD1或其片段之第一多肽(例如PD1之胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導結構域的第二多肽(例如本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)。PD1為受體之CD28家族之抑制成員，該家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8：765-75)。PD1之兩個配位體PD-L1及PD-L2已展示在與PD1結合時下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中大量存在(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫抑制可藉由抑制PD1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。
在一個實施例中，該試劑包含抑制分子(例如程式化死亡1(PD1))之胞外域(ECD)，其可稠合至跨膜結構域及胞內信號傳導結構域，諸如41BB及CD3 ζ(在本文中亦稱為PD1 CAR)。在一個實施例中，PD1 CAR與本文所述之間皮素CAR組合使用時提高T細胞之持久性。在一個實施例中，CAR為包含SEQ ID NO：24中以下劃線指示的PD1之胞外域及SEQ ID NO：24之胺基酸1-21處之信號序列的PD1 CAR。在一個實施例中，PD1 CAR包含SEQ ID NO：24胺基酸序列。
(SEQ ID NO：24)。
在一個實施例中，無N端信號序列之PD1 CAR包含下文提供之胺基酸序列(SEQ ID NO：22)。
(SEQ ID NO：22)。
在一個實施例中，試劑包含編碼具有N端信號序列之PD1 CAR(例如本文所述之PD1 CAR)的核酸序列。在一個實施例中，PD1 CAR之核酸序列顯示於下文中，在SEQ ID NO：23中用下劃線示出PD1 ECD (SEQ ID NO：23)。
在另一態樣中，本發明提供CAR表現細胞(例如CART細胞)群體。在一些實施例中，CAR表現細胞群體包含表現不同CAR之細胞的混合物。舉例而言，在一個實施例中，CART細胞群體可包括表現具有本文所述之抗CD19結合域的CAR之第一細胞，及表現具有不同抗 CD19結合域(例如與第一細胞表現之CAR中的抗間皮素結合域不同的本文所述之抗間皮素結合域)之CAR的第二細胞。作為另一實例，CAR表現細胞群體可包括表現包括例如如本文所述之抗間皮素結合域之CAR的第一細胞，及表現包括至除間皮素以外之目標(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)的抗原結合域之CAR的第二細胞。在一個實施例中，CAR表現細胞群體包括例如表現包括一級胞內信號傳導結構域之CAR的第一細胞及表現包括二級信號傳導結構域之CAR的第二細胞。
在另一態樣中，本發明提供一種細胞群體，其中該群體中之至少一個細胞表現具有本文所述之抗間皮素結合域的CAR，且第二細胞表現另一試劑，例如提高CAR表現細胞之活性或功能的試劑。舉例而言，在一個實施例中，該試劑可為調節或調控(例如抑制)T細胞功能的試劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子，例如本文所述之試劑。在一些實施例中，抑制分子可例如降低CAR表現細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。在一個實施例中，抑制抑制分子之試劑包含第一多肽(例如抑制分子)，其與向細胞提供正信號之第二多肽(例如本文所述之胞內信號傳導結構域)有關。在一個實施例中，試劑包含例如抑制分子之第一多肽，諸如PD1、PD-L1、CTLA4、 TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β，或此等中任一者之片段(例如此等中任一者之胞外域的至少一部分)，及為本文所述之胞內信號傳導結構域(例如包含共同刺激結構域(例如本文所述之41BB、CD27或CD28)及/或一級信號傳導結構域(例如本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。在一個實施例中，試劑包含PD1之第一多肽或其片段(例如PD1之胞外域的至少一部分)，及本文所述之胞內信號傳導結構域(例如本文所述之CD28信號傳導結構域及/或本文所述之CD3 ζ信號傳導結構域)的第二多肽。
在一個態樣中，本發明提供包含投與CAR表現細胞群體(例如CART細胞，例如表現不同CAR之細胞的混合物)與另一試劑(例如激酶抑制劑，諸如本文所述之激酶抑制劑)之組合的方法。在另一態樣中，本發明提供包含投與細胞群體(其中該群體之至少一個細胞表現具有如本文所述之抗間皮素結合域的CAR，且第二細胞表現另一試劑，例如提高CAR表現細胞之活性或適合性的試劑)與另一試劑(例如激酶抑制劑，諸如本文所述之激酶抑制劑)之組合的方法。
可調控嵌合性抗原受體
在一些實施例中，需要CAR活性可受控制的可調控CAR(RCAR)使CAR療法之安全性及功效最佳。存在許多可調控CAR活性之方式。舉例而言，使用例如稠合至二聚化結構域之卡斯蛋白酶誘導細胞凋亡(參看例如Di等人，N Egnl.J.Med.2011年11月3日；365(18)：1673-1683)可用作本發明之CAR療法的安全性開關。在一態樣中，RCAR包含一組多肽，在最簡單實施例中通常兩個，其中本文所述之標準CAR的組分(例如抗原結合域及胞內信號傳導結構域)分配於各別多肽或成員上。在一些實施例中，多肽組包括當存在二聚化分子時可使多肽彼此偶合之二聚化開關，例如可使抗原結合域偶合至胞內信號傳導結構 域。
在一態樣中，RCAR包含兩個多肽或成員：1)胞內信號傳導成員，其包含胞內信號傳導結構域(例如本文所述之一級胞內信號傳導結構域)及第一開關結構域；2)抗原結合成員，其包含抗原結合域(例如靶向如本文所述之間皮素)及第二開關結構域。視情況而言，RCAR包含本文所述之跨膜結構域。在一實施例中，跨膜結構域可安置於胞內信號傳導成員上、抗原結合成員上或其兩者上。(除非另外指示，否則當本文描述RCAR的成員或要素時，順序可如所提供，但亦可包括其他順序。換言之，在一實施例中，順序如文字所陳述，但在其他實施例中，順序可不同。例如，跨膜區之單側上的要素順序可與實例不同，例如開關結構域相對於胞內信號傳導結構域之位置可不同，例如逆轉)。
在一實施例中，第一及第二開關結構域可形成胞內或胞外二聚化開關。在一實施例中，二聚化開關可為均二聚化開關，例如其中第一及第二開關結構域相同，或雜二聚化開關，例如其中第一及第二開關結構域彼此不同。
在實施例中，RCAR可包含「多重開關」。多重開關可包含雜二聚化開關結構域或均二聚化開關結構域。多重開關在第一成員(例如抗原結合成員)及第二成員(例如胞內信號傳導成員)上獨立包含複數個(例如2、3、4、5、6、7、8、9或10個)開關結構域。在一實施例中，第一成員可包含複數個第一開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域，且第二成員可包含複數個第二開關結構域，例如基於FRB之開關結構域。在一實施例中，第一成員可包含第一及第二開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域及基於FRB之開關結構域，且第二成員可包含第一及第二開關結構域，例如基於FKBP之開關結構域及基於FRB之開關結構域。
在一實施例中，胞內信號傳導成員包含一或多個胞內信號傳導結構域，例如一級胞內信號傳導結構域，及一或多個共同刺激信號傳導結構域。
在一實施例中，抗原結合成員可包含一或多個胞內信號傳導結構域，例如一或多個共同刺激信號傳導結構域。在一實施例中，抗原結合成員包含複數個(例如2或3個)本文所述之共同刺激信號傳導結構域，例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40，且在實施例中，無一級胞內信號傳導結構域。在一實施例中，抗原結合成員自胞外至胞內方向包含以下共同刺激信號傳導結構域：41BB-CD27；41BB-CD27；CD27-41BB；41BB-CD28；CD28-41BB；OX40-CD28；CD28-OX40；CD28-41BB；或41BB-CD28。在此等實施例中，胞內結合成員包含CD3ζ結構域。在一個此類實施例中，RCAR包含(1)抗原結合成員，其包含例如本文所述之抗原結合域、跨膜結構域及兩個共同刺激結構域及第一開關結構域；及(2)胞內信號傳導結構域，其包含跨膜結構域或膜繫栓結構域及至少一個一級胞內信號傳導結構域，及第二開關結構域。
一項提供RCAR之實施例中，抗原結合成員不繫栓至CAR細胞之表面。此使得具有胞內信號傳導成員之細胞方便地與一或多個抗原結合域配成對，而不需使用編碼該抗原結合成員之序列轉化細胞。在此類實施例中，RCAR包含：1)胞內信號傳導成員，其包含：第一開關結構域、跨膜結構域、胞內信號傳導結構域(例如一級胞內信號傳導結構域)及第一開關結構域；及2)抗原結合成員，其包含：例如本文所述之抗原結合域及第二開關結構域，其中該抗原結合成員不包含跨膜結構域或膜繫栓結構域，及視情況不包含胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，RCAR可進一步包含3)第二抗原結合成員，其包含：第二抗原結合域，例如所結合之抗原不同於抗原結合域所結合之抗原 的第二抗原結合域；及第二開關結構域。
本文亦提供RCAR，其中該抗原結合成員包含雙特異性活化及靶向能力。在此實施例中，抗原結合成員可包含複數個(例如2、3、4或5個)抗原結合域(例如scFv)，其中各抗原結合域結合至目標抗原，例如不同抗原或相同抗原，例如同一抗原之相同或不同抗原決定基。在一實施例中，複數個抗原結合域串聯，且視情況在各抗原結合域之間安置連接子或鉸鏈區。本文描述合適連接子及鉸鏈區。
一個實施例提供具有允許開關增殖作用之組態的RCAR。在此實施例中，RCAR包含：1)胞內信號傳導成員，其包含：視情況存在之跨膜結構域或膜繫栓結構域；一或多個共同刺激信號傳導結構域，例如選自41BB、CD28、CD27、ICOS及OX40，及開關結構域；及2)抗原結合成員，其包含：例如本文所述之抗原結合域、跨膜結構域及一級胞內信號傳導結構域，例如CD3ζ結構域，其中抗原結合成員不包含開關結構域，或不包含與胞內信號傳導成員上之開關結構域二聚化的開關結構域。在一實施例中，抗原結合成員不包含共同刺激信號傳導結構域。在一實施例中，胞內信號傳導成員包含來自均二聚化開關之開關結構域。在一實施例中，胞內信號傳導成員包含雜二聚化開關之第一開關結構域且RCAR包含第二胞內信號傳導成員，其包含雜二聚化開關之第二開關結構域。在此類實施例中，第二胞內信號傳導成員包含與胞內信號傳導成員相同之胞內信號傳導結構域。在一實施例中，二聚化開關為胞內。在一實施例中，二聚化開關為胞外。
在本文所述之任何RCAR構型中，第一及第二開關結構域包含如本文所述之基於FKBP/FRB之開關。
本文亦提供包含本文所述之RCAR的細胞。經工程改造以表現RCAR之任何細胞均可用作RCARX細胞。在一實施例中，RCARX細胞為T細胞，且稱為RCART細胞。在一實施例中，RCARX細胞為NK 細胞，且稱為RCARN細胞。
本文亦提供包含RCAR編碼序列之核酸及載體。編碼RCAR之多種要素的序列可安置於相同核酸分子上，例如相同質體或載體，例如病毒載體，例如豆狀病毒載體。在一實施例中，(i)編碼抗原結合成員之序列及(ii)編碼胞內信號傳導成員之序列可為呈現於上同一核酸上，例如載體。可例如藉由使用各別啟動子或藉由使用雙順反子轉錄產物(其可導致藉由裂解單個轉譯產物或藉由轉譯兩個各別蛋白質產物產生兩個蛋白質)製造相應蛋白質。在一實施例中，編碼可裂解肽之序列(例如P2A或F2A序列)安置於(i)與(ii)之間。在一實施例中，編碼IRES(例如EMCV或EV71 IRES)之序列安置於(i)與(ii)之間。在此等實施例中，(i)及(ii)以單個RNA形式轉錄。在一實施例中，第一啟動子可操作地連接於(i)且第二啟動子可操作地連接於(ii)，使得(i)及(ii)以各別mRNA形式轉錄。
或者，編碼RCAR之多種要素的序列可安置於不同核酸分子上，例如不同質體或載體，例如病毒載體，例如豆狀病毒載體。舉例而言，(i)編碼抗原結合成員之序列可呈現於第一核酸(例如第一載體)上，且(ii)編碼胞內信號傳導成員之序列可呈現於第二核酸(例如第二載體)上。
二聚化開關
二聚化開關可為非共價或共價的。在非共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間的非共價相互作用。在共價二聚化開關中，二聚化分子促進開關結構域之間的共價相互作用。
在一實施例中，RCAR包含基於FKBP/FRAP或FKBP/FRB之二聚化開關。FKBP12(FKBP或FK506結合蛋白)為充當天然產物免疫抑制藥物(雷帕黴素)之初始胞內目標的大量細胞質蛋白質。雷帕黴素結合至FKBP及大型PI3K同源物FRAP(RAFT，mTOR)。FRB為FRAP之93 個胺基酸部分，亦即用於結合FKBP-雷帕黴素複合物(Chen,J.,Zheng,X.F.,Brown,E.J.& Schreiber,S.L.(1995)Identification of an 11-kDa FKBP12-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a critical serine residue.Proc Natl Acad Sci U S A 92：4947-51.)
在實施例中，基於FKBP/FRAP(例如FKBP/FRB)之開關可使用二聚化分子，例如雷帕黴素或雷帕黴素類似物。
FKBP之胺基酸序列如下： (SEQ ID NO：382)
在實施例中，FKBP開關結構域可包含FKBP之FRB結合片段，例如SEQ ID NO：382之帶下劃線部分，其為： (SEQ ID NO：383)
FRB之胺基酸序列如下：ILWHEMWHEG LEEASRLYFG ERNVKGMFEV LEPLHAMMER GPQTLKETSF NQAYGRDLME AQEWCRKYMK SGNVKDLTQA WDLYYHVFRR ISK(SEQ ID NO：384)
本文所用之術語「基於FKBP/FRAP(例如FKPP/FRB)之開關」係指二聚化開關，其包含：第一開關結構域，包含FRB結合片段或FKBP類似物，例如RAD001，且與SEQ ID NO：382或383之FKBP序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%一致性或與其之差異不超過30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸殘基；及第二開關結構域，其包含FKBP結合片段或FRB類似物，且與SEQ ID NO：384之FRB序列具有至少70、75、80、85、90、95、96、97、98或99%一致性或與其之差異不超過30、25、20、15、10、5、4、3、2或1個胺基酸殘基。在一實施例中，本文所述之RCAR包含一個包含SEQ ID NO：382(或SEQ ID NO：383)中所揭示之胺基酸殘基的開 關結構域，且一個開關結構域包含SEQ ID NO：384中所揭示之胺基酸殘基。
在實施例中，FKBP/FRB二聚化開關包含經修飾FRB開關結構域，其呈現經改變(例如增加之)二聚化分子(例如雷帕黴素或雷帕羅吉，例如RAD001)親和力。在一實施例中，經修飾FRB開關結構域包含一或多個突變，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10個或以上選自胺基酸位置L2031、E2032、S2035、R2036、F2039、G2040、T2098、W2101、D2102、Y2105及F2108處之突變，其中野生型胺基酸突變成任何其他天然存在之胺基酸。在一實施例中，突變FRB在E2032處包含突變，其中E2032突變成苯丙胺酸(E2032F)、甲硫胺酸(E2032M)、精胺酸(E2032R)、纈胺酸(E2032V)、酪胺酸(E2032Y)、異白胺酸(E2032I)，例如SEQ ID NO：385，或白胺酸(E2032L)，例如SEQ ID NO：386。在一實施例中，突變FRB在T2098處包含突變，其中T2098突變成苯丙胺酸(T2098F)或白胺酸(T2098L)，例如SEQ ID NO：387。在一實施例中，突變FRB在E2032及T2098處包含突變，其中E2032突變成任何胺基酸，且其中T2098突變成任何胺基酸，例如SEQ ID NO：388。在一實施例中，突變FRB包含E2032I及T2098L突變，例如SEQ ID NO：389。在一實施例中，突變FRB包含E2032L及T2098L突變，例如SEQ ID NO：340。
其他適合二聚化開關包括基於GyrB-GyrB之二聚化開關、基於赤黴素之二聚化開關、標籤/黏合劑二聚化開關及鹵基-標籤/搭扣-標籤二聚化開關。遵照本文提供之指導，此類開關及相關二聚化分子對一般技術者將顯而易知。
二聚化分子
二聚化分子促進開關結構域之間的關聯。二聚化分子相互作用或開關結構域之間的關聯的存在允許與第一開關結構域有關(例如稠合)之多肽以及與第二開關結構域有關(例如稠合)之多肽之間的信號轉導。例如在本文所述之系統中所量測，非限制性含量之二聚化分子信號轉導的存在增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、5、10、50、100倍。
雷帕黴素及雷帕黴素類似物(有時稱為雷帕羅吉)，例如RAD001，可用作本文所述之基於FKBP/FRB之二聚化開關中的二聚化分子。在一實施例中，二聚化分子可選自雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、RAD001(依維莫司(everolimus))、佐他莫司(zotarolimus)、坦羅莫司(temsirolimus)、AP-23573(地磷莫司(ridaforolimus))、拜利莫司(biolimus)及AP21967。適於與基於FKBP/FRB之二聚化開關一起使用的額外雷帕黴素類似物進一步描述於題目為「組合療法」之章節，或題目為「例示性mTOR抑制劑」的子章節中。
RNA轉染
本文揭示製造活體外轉錄之RNA CAR的方法。本發明亦包括可直接轉染至細胞中之CAR編碼RNA構築體。一種產生用於轉染之 mRNA的方法，其可涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現核酸及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾(SEQ ID NO：35)的構築體。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括CAR之序列。
在一個態樣中，間皮素CAR由信使RNA(mRNA)編碼。在一個態樣中，編碼間皮素CAR之mRNA引入T細胞中用於產生CART細胞。
在一個實施例中，活體外轉錄之RNA CAR可以短暫轉染形式引入至細胞中。藉由使用聚合酶鏈反應(PCR)產生之模板活體外轉錄產生RNA。來自任何來源之所關注DNA可藉由PCR使用適當引子及RNA聚合酶直接轉化成用於活體外mRNA合成的模板。DNA來源可為例如染色體組DNA、質體DNA、噬菌體DNA、cDNA、合成DNA序列或任何其他適當DNA來源。用於活體外轉錄之所要模板為本發明之CAR。舉例而言，RNA CAR之模板包含具有抗腫瘤抗體之單鏈可變域的胞外區；鉸鏈區、跨膜結構域(例如CD8a之跨膜結構域)；及包括胞內信號傳導結構域(例如包含CD3-ζ之信號傳導結構域及4-1BB之信號傳導結構域)的細胞質區。
在一個實施例中，待用於PCR之DNA含有開放閱讀框架。DNA可來自生物體基因組的天然存在之DNA序列。在一個實施例中，核酸可包括一些或全部5'及/或3'未轉譯區域(UTR)。核酸可包括外顯子及內含子。在一個實施例中，待用於PCR之DNA為人類核酸序列。在另一實施例中，待用於PCR之DNA為包括5'及3'UTR之人類核酸序列。DNA或者可為通常不表現於天然存在之生物體中的人工DNA序列。例示性人工DNA序列為含有接合在一起形成編碼融合蛋白之開放閱讀框架的基因部分之序列。接合在一起之DNA部分可來自單個生物體或一種以上生物體。
使用PCR產生用於活體外轉錄用於轉染之mRNA之模板。此項技術中熟知進行PCR之方法。用於PCR之引子經設計以具有與待用作PCR模板之DNA區域實質上互補的區域。術語「實質上互補」係指引子序列中之大部分或全部鹼基互補或一或多個鹼基不互補或不匹配的的核苷酸序列。實質上互補序列能夠與預期DNA目標在用於PCR之黏接條件下黏接或雜交。引子可經設計以與DNA模板之任何部分實質上互補。舉例而言，引子可經設計以擴增通常在細胞中轉錄之核酸部分(開放閱讀框架)，包括5'及3' UTR。引子亦可經經設計以擴增編碼所關注之特定結構域的核酸部分。在一個實施例中，引子經設計以擴增人類cDNA之編碼區，包括全部或部分5'及3' UTR。適用於PCR之引子可藉由此項技術中熟知的合成方法產生。「正向引子」為含有與在待擴增DNA序列上游的DNA模板上之核苷酸實質上互補之核苷酸區的引子。術語「上游」係指相對於編碼股的待擴增DNA序列之5'位置。 「反向引子」為含有與在待擴增DNA序列下游之雙股DNA模板實質上互補的核苷酸區的引子。術語「下游」係指相對於編碼股的待擴增DNA序列之3'位置。
適用於PCR之任何DNA聚合酶可用於本文揭示之方法中。試劑及聚合酶購自許多來源。
亦可使用能夠促進穩定性及/或轉譯效率之化學結構。RNA較佳具有5'及3' UTR。在一個實施例中，5' UTR的長度為1至3000個核苷酸。待添加至編碼區的5'及3' UTR序列之長度可藉由不同方法改變，包括(但不限於)設計黏接至UTR之不同區域的PCR引子。使用此方法，一般技術者可在經轉錄RNA之轉染後改變實現最佳轉譯效率所需的5'及3' UTR長度。
5'及3' UTR可為針對所關注核酸的天然存在之內源性5'及3' UTR。或者，可藉由將UTR序列併入至正向及反向引子或藉由模板之 任何其他修飾添加並非所關注核酸之內源的UTR序列。並非所關注核酸之內源的UTR序列之用途可適用於改變RNA之穩定性及/或轉譯效率。舉例而言，已知3' UTR序列中之AU增濃要素可降低mRNA之穩定性。因此，可選擇及設計3'UTR以基於此項技術中熟知之UTR特性提高轉錄RNA之穩定性。
在一個實施例中，5' UTR可含有內源性核酸之克紮克序列(Kozak sequence)。或者，當藉由如上文所述之PCR添加並非所關注核酸之內源的5' UTR時，共同克紮克序列可藉由添加5' UTR序列重新設計。克紮克序列可提高一些RNA轉錄物的轉譯效率，但看起來並非為所有RNA所需使能夠有效轉移。此項技術中已知許多mRNA需要克紮克序列。在其他實施例中，5' UTR可為RNA基因組在細胞中穩定之RNA病毒之5'UTR。在其他實施例中，多種核苷酸類似物可用於3'或5' UTR以阻礙mRNA之核酸外切酶分解。
為了使能夠無需基因選殖即自DNA模板合成RNA，轉錄啟動子應連接至待轉錄序列上游之DNA模板。當充當RNA聚合酶之啟動子的序列添加至正向引子之5'端時，RNA聚合酶啟動子併入待轉錄之開放閱讀框架上游的PCR產物中。在一個較佳實施例中，啟動子為如本文別處所述之T7聚合酶啟動子。其他適用啟動子包括(但不限於)T3及SP6 RNA聚合酶啟動子。此項技術中已知T7、T3及SP6啟動子的共同核苷酸序列。
在一較佳實施例中，mRNA具有判斷核糖體結合、轉譯起始及細胞中之mRNA穩定性的5'端上之封端及3'聚(A)尾。在圓形DNA模板上，例如質體DNA，RNA聚合酶產生不適於在真核細胞中表現的長多聯產物。在3' UTR之末端經線性化之質體DNA的轉錄產生正常尺寸之mRNA，其即使在轉錄後經聚腺苷酸化亦在真核轉染中無效。
在直鏈DNA模板上，噬菌體T7 RNA聚合酶可使轉錄之3'端延伸 超過模板之最後一個鹼基(Schenborn及Mierendorf,Nuc Acids Res.,13：6223-36(1985)；Nacheva及Berzal-Herranz,Eur.J.Biochem.,270：1485-65(2003))。
將聚A/T伸長部整合至DNA模板中的習知方法為分子選殖。然而，整合至質體DNA中之聚A/T序列可使質體不穩定，此為獲自細菌細胞之質體DNA模板通常高度混雜有缺失及其他畸變之原因。此使選殖程序不僅費力且費時，但通常不可靠。此為為何一種用聚A/T 3'伸長部建構DNA模板而不高度需要選殖之原因。
可藉由在PCR期間使用含有聚T尾(諸如100T尾(SEQ ID NO：31))之反向引子(尺寸可為50-5000 T(SEQ ID NO：32))或在PCR之後藉由包括(但不限於)DNA接合或活體外重組之任何其他方法產生轉錄DNA模板之聚A/T區段。聚(A)尾亦向RNA提供穩定性及減少其分解。一般而言，聚(A)尾之長度與經轉錄RNA之穩定性正相關。在一個實施例中，聚(A)尾為100至5000個腺苷(SEQ ID NO：33)。
RNA之聚(A)尾在使用聚(A)聚合酶(諸如大腸桿菌聚A聚合酶(E-PAP))活體外轉錄之後可進一步延長。在一個實施例中，將聚(A)尾之長度由100個核苷酸增至300至400個核苷酸(SEQ ID NO：34)，導致RNA之轉譯效率提高約兩倍。此外，不同化學基團與3'端之連接可提高mRNA穩定性。此類連接可含有經修飾/人工核苷酸、適體及其他化合物。舉例而言，ATP類似物可使用聚(A)聚合酶併入聚(A)尾中。ATP類似物可進一步提高RNA穩定性。
5'封端亦向RNA分子提供穩定性。在一較佳實施例中，本文揭示之方法產生的RNA包括5'封端。使用此項技術中已知及本文所述之技術提供5'封端(Cougot等人，Trends in Biochem.Sci.,29：436-444(2001)；Stepinski等人，RNA,7：1468-95(2001)；Elango等人，Biochim.Biophys.Res.Commun.,330：958-966(2005))。
藉由本文揭示之方法產生的RNA亦可含有內部核糖體入口位點(IRES)序列。IRES序列可為任何病毒、染色體或人工設計序列，其引發封端獨立性核糖體結合於mRNA且促進轉譯之起始。可包括適於細胞電穿孔之任何溶解物，其可含有有助於細胞滲透率及活力之因素，諸如糖、肽、脂質、蛋白質、抗氧化劑及界面活性劑。
RNA可使用許多不同方法中之任一者引入目標細胞中，例如包括(但不限於)以下之市售方法：電穿孔(Amaxa Nucleofector-II(Amaxa Biosystems,Cologne,Germany))、(ECM 830(BTX)(Harvard Instruments,Boston,Mass.)或基因脈衝發生器II(Gene Pulser II)(BioRad,Denver,Colo.)、細胞融合儀(Multiporator)(Eppendort,Hamburg Germany)、使用脂質體轉染之陽離子脂質體介導之轉染、聚合物封裝、肽介導之轉染或生物彈粒子傳遞系統，諸如「基因槍」(參看例如Nishikawa等人，Hum Gene Ther.,12(8)：861-70(2001))。
編碼CAR之核酸構築體
本發明提供CAR轉殖基因，其包含編碼一或多個本發明之CAR構築體的核酸序列。在一個態樣中，CAR轉殖基因以信使RNA轉錄物形式提供。在一個態樣中，CAR轉殖基因以DNA構築體形式提供。
因此，在一個態樣中，本發明係關於一種編碼嵌合性抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中該CAR包含抗間皮素結合域(例如人類抗間皮素結合域)、跨膜結構域及包含刺激結構域之胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，抗間皮素結合域為本文所述之抗間皮素結合域，例如包含選自由SEQ ID NO：87-111組成之群的序列或與其具有95-99%一致性之序列的抗間皮素結合域。在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共同刺激結構域之序列。在一個實施例中，跨膜結構域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、 CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含序列SEQ ID NO：6，或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，抗間皮素結合域經鉸鏈區(例如本文所述之鉸鏈)連接至跨膜結構域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5，或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，經分離核酸分子進一步包含編碼共同刺激結構域之序列。在一個實施例中，共同刺激結構域為選自由以下組成之群的蛋白質之功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。此類共同刺激分子之其他實例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2R β、IL2R γ、IL7R α、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76及PAG/Cbp。在一個實施例中，共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：7或與其具有95-99%一致性的序列。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，或 與其具有95-99%一致性的序列，及序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10，或與其具有95-99%一致性的序列，其中包含胞內信號傳導結構域之序列在相同框架中且以單個多肽鏈形式表現。在另一態樣中，本發明係關於編碼CAR構築體之經分離核酸分子，該構築體包含SEQ ID NO：1之前導序列、具有選自由以下組成之群之序列的scFv結構域：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62(或與其具有95-99%一致性的序列)、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5(或與其具有95-99%一致性的序列)之鉸鏈區、具有序列SEQ ID NO：6(或與其具有95-99%一致性的序列)之跨膜結構域、具有序列SEQ ID NO：7(或與其具有95-99%一致性的序列)之4-1BB共同刺激結構域或具有序列SEQ ID NO：8(或與其具有95-99%一致性的序列)之CD27共同刺激結構域，及具有序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10(或與其具有95-99%一致性的序列)的CD3 ζ刺激結構域。
在另一態樣中，本發明係關於核酸分子編碼之經分離多肽分子。在一個實施例中，經分離多肽分子包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO： 82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86，或與其具有95-99%一致性的序列。
在另一態樣中，本發明係關於一種編碼嵌合性抗原受體(CAR分子)之經分離核酸分子，該CAR分子包含抗間皮素結合域、跨膜結構域及包含刺激結構域之胞內信號傳導結構域，且其中編碼抗間皮素結合域之核酸包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128、SEQ ID NO：129、SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131、SEQ ID NO：132、SEQ ID NO：133、SEQ ID NO：134，或與其具有95-99%一致性的序列。
在一個實施例中，經編碼CAR分子進一步包含編碼共同刺激結構域之序列。在一個實施例中，共同刺激結構域為選自由以下組成之群之蛋白質的功能性信號傳導結構域：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)及4-1BB(CD137)。在一個實施例中，共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：7。在一個實施例中，跨膜結構域為選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。在一個實施例中，跨膜結構域包含序列SEQ ID NO：6。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及ζ之功能性信號傳導結構域。在一個實施例中，胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及序列SEQ ID NO：9，其中該等包含胞內信號傳導結構域之序列在相同框架中且以單個多肽鏈形式表現。在一 個實施例中，抗間皮素結合域由鉸鏈區連接至跨膜結構域。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：2。在一個實施例中，鉸鏈區包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5。
在另一態樣中，本發明係關於一種經分離CAR分子，其包含SEQ ID NO：1之前導序列、具有選自由SEQ ID NO：39-62組成之群的序列或與其具有95-99%一致性之序列的scFv結構域、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：5之鉸鏈區、具有序列SEQ ID NO：6之跨膜結構域、具有序列SEQ ID NO：7之4-1BB共同刺激結構域或具有序列SEQ ID NO：8之CD27共同刺激結構域，及具有序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10之CD3 ζ刺激結構域。在一個實施例中，經編碼CAR分子包含選自由SEQ ID NO：63-86組成之群的序列或與其具有95-99%一致性之序列。
本發明進一步提供包含CAR轉殖基因之載體。在一個態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞中，例如T細胞或NK細胞。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體，一或多個質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及豆狀病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞或NK細胞中表現CAR構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞或人類NK細胞。
本發明亦包括CAR編碼RNA構築體，其可直接轉染至細胞(例如T細胞或NK細胞)中。一種用於產生用於轉染之mRNA之方法，其涉及用專門設計之引子活體外轉錄(IVT)模板，隨後添加聚A，產生含有3'及5'未轉譯序列(「UTR」)、5'封端及/或內部核糖體入口位點(IRES)、待表現基因及長度通常為50-2000個鹼基之聚A尾的構築體。所產生之RNA可有效轉染不同種類之細胞。在一個態樣中，模板包括CAR之序列。
在一個態樣中，間皮素CAR轉殖基因由信使RNA(mRNA)編碼。在一個態樣中，將編碼間皮素CAR轉殖基因之mRNA引入T細胞中用於產生CART細胞或NK細胞。
載體
本發明亦提供插入有本發明之DNA的載體。來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為實現長期基因轉移之適合工具，因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之傳播。慢病毒載體具有優於來源於onco-反轉錄病毒(諸如鼠類白血病病毒)之載體的額外優勢，因為其可轉導非增殖性細胞，諸如肝細胞。其亦具有低免疫原性之額外優勢。
在一個實施例中，包含編碼本發明之所要CAR之核酸的載體為DNA、RNA、質體、腺病毒載體、慢病毒載體或反轉錄病毒載體。
在另一實施例中，包含編碼本發明之所要CAR之核酸的載體為腺病毒載體(A5/35)。在另一實施例中，編碼CAR之核酸的表現可使用轉座子(諸如睡美人(sleeping beauty)、CRISPR、CAS9及鋅指核酸酶)實現。參看例如June等人，2009 Nature Reviews Immunology 9.10：704-716，其以全文引用的方式併入本文中。
簡言之，編碼CAR之天然或合成核酸之表現通常藉由將編碼CAR多肽或其部分之核酸可操作地連接至啟動子，且將構築體併入至表現載體來實現。載體可適於複製及整合真核生物。典型選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及適用於調節所要核酸序列表現之啟動子。
本發明之表現構築體亦可用於使用標準基因傳遞方案的核酸免疫接種及基因療法。基因傳遞方法為此項技術中已知的。參看例如美國專利第5,399,346號、第5,580,859號、第5,589,466號，其以全文引用的方式併入本文中。在另一實施例中，本發明提供基因療法載體。
核酸可選殖至許多類型載體中。舉例而言，核酸可選殖至載體中，包括(但不限於)質體、噬菌粒、噬菌體衍生物、動物病毒及黏質體。尤其受關注之載體包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。
此外，表現載體可以病毒載體形式提供給細胞。病毒載體技術為此項技術中熟知的且描述於例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1卷-第4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)，及其他病毒學及分子病毒學手冊中。適用作載體之病毒包括(但不限於)反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有至少一種生物體中起作用之複製起點、啟動子序列、適宜限制核酸內切酶位點及一或多種可選標記物(例如WO 01/96584；WO 01/29058；及美國專利第6,326,193號)。
已針對基因轉移至哺乳動物細胞中開發出許多基於病毒之系統。舉例而言，反轉錄病毒提供基因傳遞系統之適宜平台。所選基因可插入至中載體中且使用此項技術中已知之技術封裝於反轉錄病毒粒子中。重組病毒可接著經分離及活體內或離體傳遞至個體之細胞中。許多反轉錄病毒系統為此項技術中已知的。在一些實施例中，使用腺病毒載體。此項技術中已知許多腺病毒載體。在一個實施例中，使用慢病毒載體。
額外啟動子要素(例如強化子)調節轉錄起始頻率。通常，此等定位於起始位點上游30-110bp區中，儘管許多啟動子已顯示含有亦在起始位點下游之功能性要素中。啟動子要素之間的間距通常為靈活的，使得當要素倒置或相對於彼此移動時時保留啟動子功能。在胸苷激酶(tk)啟動子中，啟動子要素之間的間距在活性開始減退之前可增加至相隔50bp。視啟動子而定，個別要素開起來可合作地或獨立地起活 化轉錄功能。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。
能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR轉殖基因之啟動子實例為EF1α啟動子(EF1a或EF1α)。原生EF1a啟動子驅使延長因子-1複合物之α子單元的表現，該複合物負責將胺基醯基tRNA酶促傳遞至核糖體。EF1a啟動子已廣泛用於哺乳動物表現質體且已顯示有效驅使CAR表現轉殖基因選殖至豆狀病毒載體。參看例如Milone等人，Mol.Ther.17(8)：1453-1464(2009)。在一個態樣中，EF1a啟動子包含作為SEQ ID NO：11提供之序列。
啟動子之另一實例為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。此啟動子序列為能夠驅使高程度表現任何可操作地連接至其上之聚核苷酸序列的強構成啟動子序列。然而，亦可使用其他構成性啟動子序列，包括(但不限於)猴病毒40(SV40)早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)長末端重複序列(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽類白血病病毒啟動子、埃-巴二氏病毒即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒啟動子(Rous sarcoma virus promoter)，以及人類基因啟動子，諸如(但不限於)肌動蛋白啟動子、肌球蛋白啟動子、延長因子-1α啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。此外，本發明應不限於構成啟動子之使用。誘導型啟動子亦預期作為本發明之部分。誘導型啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要此類表現時打開其可操作地連接之聚核苷酸序列表現或不需要時關閉表現。誘導型啟動子之實例包括(但不限於)金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
為了評定CAR多肽或其部分之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或其兩者以促進自設法經病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記 物可為攜帶於各別DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物及報導基因皆可側接適當調節序列以使能夠在宿主細胞中表現。適用可選標記物包括例如耐抗生素基因，諸如neo及其類似物。
報導基因用於鑑別潛在經轉染細胞及評估調節序列功能性。一般而言，報導基因為接受生物體或組織中不存在或表現且編碼表現藉由一些容易偵測之特性(例如酶促活性)顯現之多肽的基因。在DNA已引入受體細胞中之後的適合時間分析報導基因之表現。適合報導基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯基轉移酶、分泌之鹼磷酸酯酶之基因或綠色螢光蛋白質基因(例如Ui-Tei等人，2000 FEBS Letters 479：79-82)。適合表現系統為熟知的且可使用已知技術製備或商業購買。一般而言，具有顯示報導基因最高表現程度之最小5'側接區的構築體鑑別為啟動子。此類啟動子區域可連接至報導基因且用於評估能夠調節啟動子驅使轉錄之試劑。
在一個實施例中，載體可進一步包含編碼第二CAR之核酸。在一個實施例中，第二CAR包括至以下之抗原結合域，例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2。在一個實施例中，載體包含編碼第一CAR之核酸序列，該第一CAR靶向第一抗原且包括具有共同刺激信號傳導結構域但無一級信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR靶向第二不同抗原且包括具有一級信號傳導結構域但無共同刺激信號傳導結構域之胞內信號傳導結構域。在一個實施例中，載體包含編碼第一間 皮素CAR之核酸，該第一間皮素CAR包括間皮素結合域、跨膜結構域及共同刺激結構域；及編碼第二CAR之核酸，該第二CAR靶向除間皮素以外之抗原(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17；例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域。在另一實施例中，載體包含編碼第一間皮素CAR之核酸，該第一間皮素CAR包括間皮素結合域、跨膜結構域及一級信號傳導結構域；及編碼第二CAR之核算，該第二CAR靶向除間皮素以外的抗原(例如除基質細胞上之間皮素以外的目標，例如FAP；除前列腺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如雄激素受體、OR51E2、PSMA、PSCA、PDGRF-β、TARP、GloboH、MAD-CT-1或MAD-CT-2；除卵巢癌細胞上之間皮素以外的目標，例如Tn、PRSS21、CD171、Lewis Y、葉酸受體α、緊密連接蛋白6、GloboH或精蛋白17，例如除肺癌細胞上之間皮素以外的目標，例如VEGF、HER3、IGF-1R、EGFR、DLL4或Trop-2)且包括抗原之抗原結合域、跨膜結構域及共同刺激信號傳導結構域。
在一個實施例中，載體包含編碼本文所述之間皮素CAR的核酸及編碼抑制CAR之核酸。在一個實施例中，抑制CAR包含結合正常細胞(例如亦表現CLL之正常細胞)而非癌細胞上發現之抗原的抗原結合域。在一個實施例中，抑制CAR包含抑制分子之抗原結合域、跨膜結構域及胞內結構域。舉例而言，抑制CAR之胞內結構域可為PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/ 或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β之胞內結構域。
在一個實施例中，載體包含編碼本文所述之間皮素CAR的核酸及抑制核酸，例如dsRNA，例如如本文所述之siRNA或shRNA。
向細胞中引入及表現基因之方法為此項技術中已知的。在表現載體之情形中，載體容易藉由此項技術中之任何方法引入宿主細胞(例如哺乳動物、細菌、酵母或昆蟲細胞)中。舉例而言，表現載體可藉由物理、化學或生物方式轉移至宿主細胞中。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之物理方法包括磷酸鈣沈澱、脂質體轉染、粒子轟擊、顯微注射、電穿孔及其類似方法。用於製造包含載體及/或外源性核酸之細胞的方法為此項技術中熟知的。參看例如Sambrook等人，2012,MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，第1卷-第4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。用於將聚核苷酸引入宿主細胞中之較佳方法為脂質體轉染，例如使用脂染胺(Life Technologies)。
用於將所關注聚核苷酸引入至宿主細胞的生物方法包括使用DNA及RNA載體。病毒載體及尤其反轉錄病毒載體已成為最廣泛用於將基因插入至哺乳動物(例如人類細胞)中之方法。其他病毒載體可來源於慢病毒、痘病毒、I型單純疱疹病毒病毒、腺病毒及腺相關病毒及其類似病毒。參看例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。
用於將聚核苷酸引入至宿主細胞中之化學方式包括膠態分散系統，諸如大分子複合物、奈米囊劑、微球、珠粒及基於脂質之系統，包括水包油乳液、微胞、混合微胞及脂質體。用作活體外及活體內傳送媒劑之例示性膠態系統為脂質體(例如人工膜泡)。可獲得的此項技術中靶向傳遞核酸之其他方法，諸如用靶向奈米粒子或其他適合亞微米尺寸傳遞送系統傳遞聚核苷酸。
在利用非病毒傳遞系統的情況下，例示性傳遞媒劑為脂質體。預期使用脂質調配物將核酸引入至宿主細胞(活體外、離體或活體內)。在另一態樣中，核酸可與脂質有關。與脂質有關之核酸可囊封於脂質體之水性內部中，穿插於脂質體之脂質雙層內，經與脂質體及寡核苷酸有關之連接分子連接至脂質體、包覆於脂質體中，與脂質體複合，分散於含有脂質之溶液中，與脂質混合，與脂質組合，以懸浮液形式含於脂質中，含有微胞或與微胞複合，或另外與脂質關聯。與組合物有關之脂質、脂質/DNA或脂質/表現載體不限於溶液中之任何特定結構。舉例而言，其可存在於雙層結構中，以微胞形式存在或具有「塌陷」結構。其亦可簡單地穿插於溶液中，可能形成尺寸或形狀上不均勻的聚集物。脂質為可為天然存在脂質或合成脂質的脂肪物質。舉例而言，脂質包括細胞質中天然存在之脂肪滴以及含有長鏈脂族烴及其衍生物之化合物類別(諸如脂肪酸、醇、胺、胺基醇及醛)。
適用之脂質可獲自商業來源。舉例而言，二肉豆蔻基磷脂醯膽鹼(「DMPC」)可獲自Sigma,St.Louis,MO；磷酸三十二烷基酯(「DCP」)可獲自K & K Laboratories(Plainview,NY)；膽固醇(「Choi」)可獲自Calbiochem-Behring；二肉豆蔻基磷脂醯甘油(「DMPG」)及其他脂質可獲自Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL.)。氯仿或氯仿/甲醇中之脂質儲備溶液可在約-20℃下儲存。氯仿用作僅有溶劑，因為其比甲醇容易蒸發。「脂質體」為涵蓋藉由產生封閉脂質雙層或聚集物形成的多種單層及多層脂質媒劑的通用術語。脂質體之特徵為具有囊泡結構，其具有磷脂雙層膜及內部水性介質。多層脂質體具有藉由水性介質分隔之多個脂質層。其在磷脂懸浮於過量水溶液中時自發地形成。脂質組分在形成封閉結構之前進行自身重排且在脂質雙層之間捕獲水及溶解之溶解物(Ghosh等人，1991 Glycobiology 5：505-10)。然而，亦涵蓋在溶液中具有與正常囊泡結 構不同之結構的組合物。舉例而言，脂質可採用膠束結構或僅以脂質分子之非均勻聚集物形式存在。亦預期脂染胺-核酸複合物。
不管用於將外源性核酸引入宿主細胞或另外使細胞暴露於本發明之抑制劑的為何種方法，為了確認宿主細胞中重組DNA序列之存在，可進行多種分析。此類分析法包括例如熟習此項技術者熟知的「分子生物」分析法，諸如南方及北方墨點法、RT-PCR及PCR；「生物化學」分析法，諸如偵測特定肽之存在或不存在，例如藉由免疫方式(ELISA及西方墨點法)或藉由本文所述之分析法鑑別在本發明之範疇內的試劑。
本發明進一步提供包含CAR編碼核酸分子之載體。在一個態樣中，CAR載體可直接轉導至細胞中，例如T細胞或NK細胞。在一個態樣中，載體為選殖或表現載體，例如包括(但不限於)以下之載體，一或多個質體(例如表現質體、選殖載體、微環、微載體、雙微染色體)、反轉錄病毒及豆狀病毒載體構築體。在一個態樣中，載體能夠在哺乳動物T細胞中表現CAR構築體。在一個態樣中，哺乳動物T細胞為人類T細胞。在一個態樣中，哺乳動物細胞為人類NK細胞。
細胞來源
在擴展及基因修飾之前，細胞(例如T細胞或NK細胞)之來源獲自個體。術語「個體」欲包括可引起免疫反應之活生物體(例如哺乳動物)。個體之實例包括人類、犬、貓、小鼠、大鼠及其轉殖基因物種。T細胞可獲自許多來源，包括周邊血液單核細胞、骨髓、淋巴結組織、臍帶血、胸腺組織、來自感染部位之組織、腹水、肋膜積液、脾臟組織及腫瘤。在本發明之某些態樣中，可使用許多此項技術中可獲得之T細胞株。在本發明之某些態樣中，T細胞可獲自使用熟習此項技術者已知的許多技術(諸如FicollTM分離)自個體收集之血液單元。在一個較佳態樣中，藉由清除術獲得來自個體之循環血液的細胞。清 除術產物通常含有淋巴細胞，包括T細胞、單核細胞、粒細胞、B細胞、其他成核白血球、紅血球及血小板。在一個態樣中，藉由清除術收集之細胞可經洗滌以移除血漿部分且將細胞置於適當緩衝液或培養基中以用於後續處理步驟。在本發明之一個態樣中，用磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)洗滌細胞。在一替代態樣中，洗滌溶液缺乏鈣且可缺乏鎂或可缺乏許多(若並非全部二價陽離子)。在無鈣存在下初始活化步驟可能導致放大之活化。如一般技術者將容易瞭解，洗滌步驟可藉由熟習此項技術者已知的方法實現，諸如藉由根據製造商說明書使用半自動「流通」離心(例如Cobe 2991細胞處理器、Baxter CytoMate或Haemonetics細胞保存器5)。洗滌後，可將細胞再懸浮於多種生物相容性緩衝劑中，諸如不含Ca不含Mg之PBS、PlasmaLyte A或其他具有或不具有生理食鹽水溶液之緩衝液。或者，可移除清除術樣品之非所要組分且細胞直接再懸浮於培養基中。
在一個態樣中，藉由溶解紅血球及例如藉由經PERCOLLTM梯度離心或藉由逆流離心淘析耗盡單核細胞，自周邊血液淋巴細胞分離T細胞。T細胞之特異性子群體(諸如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T細胞)可藉由正選擇或負選擇技術進一步分離。舉例而言，在一個態樣中，藉由與抗CD3/抗CD28(例如3x28)結合之珠粒(諸如DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T)一起培育足以正選擇所要T細胞之時間段來分離T細胞。在一個態樣中，該時間段為約30分鐘。在另一態樣中，時段在30分鐘至36小時或更長及其間所有整數值範圍內。在另一態樣中，該時間段為至少1、2、3、4、5或6小時。在另一較佳態樣中，該時間段為10至24小時。在一個態樣中，培育時間段為24小時。為了自患有白血病之患者分離T細胞，使用較長培育時間(諸如24小時)可提高細胞產量。在相較於其他細胞類型存在很少T細胞的任何情形中可使用較長培育時間分離T細胞，諸如自腫 瘤組織或免疫功能不全個體分離腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)。此外，使用較長培育時間可提高捕捉CD8+ T細胞之效率。因此，藉由簡單縮短或延長時間使T細胞結合於CD3/CD28珠粒及/或藉由增加或降低珠粒比T細胞之比率(如本文進一步描述)，在培養開始時或該方法其間之其他時間點較佳可選擇T細胞之子群。此外，藉由增加或降低珠粒或其他表面上抗-CD3及/或抗-CD28抗體之比率，在培養開始時或在其他所要時間點較佳可選擇T細胞子群。熟習此項技術者將瞭解本發明情形中亦可使用多個選擇回合。在某些態樣中，可能需要進行選擇程序且在活化及擴展過程中使用「未經選擇之」細胞。「未經選擇之」細胞亦可進行其他選擇回合。
可使用於負選擇細胞相異的針對表面標記物之抗體組合實現藉由負選擇增濃T細胞群體。一種方法為經負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術分選及/或選擇細胞，該負磁性免疫黏附或流動式細胞量測術使用針對負選擇細胞上呈現之細胞表面標記物之單株抗體混合物。舉例而言，為了藉由負選擇增濃CD4+細胞，單株抗體混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR及CD8之抗體。在某些態樣中，可能需要增濃或正選擇通常表現CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+及FoxP3+之調節T細胞。或者，在某些態樣中，藉由抗C25結合之珠粒或其他類似選擇方法耗盡T調節細胞。
在一個實施例中，可選擇表現以下中之一或多者的T細胞群體：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、顆粒酶B及穿孔素，或其他適當分子，例如其他細胞激素。可例如藉由PCT公開案第WO 2013/126712號中所述之方法確定篩選細胞表現之方法。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏甘油二酯激酶(DGK)。DGK缺乏細胞包括不表現DGK RNA或蛋白質之細胞或具有降低或抑制之 DGK活性。DGK缺乏細胞可藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止DGK表現。或者，DGK缺乏細胞可藉由用本文所述之DGK抑制劑處理來產生。
在一個實施例中，T細胞群體缺乏Ikaros。Ikaros缺乏細胞包括不表現Ikaros RNA或蛋白質之細胞，或具有降低或抑制之Ikaros活性，Ikaros缺乏細胞可藉由遺傳方法產生，例如投與RNA干擾劑(例如siRNA、shRNA、miRNA)以減少或防止Ikaros表現。或者，Ikaros缺乏細胞可藉由用Ikaros抑制劑(例如來那度胺(lenalidomide))處理產生。
在實施例中，T細胞群體缺乏DGK及缺乏Ikaros，例如不表現DGK及Ikaros，或具有降低或抑制之DGK及Ikaros活性。此類DGK及Ikaros缺乏細胞可藉由本文所述之任何方法產生。
為了藉由正選擇或負選擇分離所要細胞群體，細胞濃度及表面(例如粒子，諸如珠粒)可變化。在某些態樣中，可能需要顯著降低珠粒及細胞在其中混合在一起的體積(例如提高細胞濃度)以確保細胞與珠粒最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用2,000,000,000個細胞/毫升之濃度。在一個態樣中，使用1,000,000,000個細胞/毫升之濃度。在另一態樣中，使用大於100,000,000個細胞/毫升。在另一態樣中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/毫升。在另一態樣中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，可使用125,000,000或150,000,000個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴展。此外，使用高細胞濃度使得更有效捕捉可能弱表現所關注目標抗原之細胞(諸如CD28陰性T細胞)或自存在許多腫瘤細胞之樣品(例如白血病血液、腫瘤組 織等)更有效捕捉細胞。此類細胞群體可具有治療價值且將需要獲得。舉例而言，使用高濃度細胞允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在相關態樣中，可能需要使用較低濃度之細胞。藉由顯著稀釋T細胞及表面(例如粒子，諸如珠粒)之混合物，使粒子與細胞之間的相互作用降至最低。此選擇表現大量待結合於粒子之所要抗原的細胞。舉例而言，CD4+ T細胞表現較大量CD28且在稀濃度下比CD8+ T細胞更有效捕捉。在一個態樣中，所用細胞濃度為5×10e6/ml。在其他態樣中，所用濃度可為約1×105/ml至1×106/ml，及其間之任何整數值。
在其他態樣中，細胞可在2-10℃或室溫下在旋轉器上培育持續變化之時間長度或變化之速度下培育。
T用於刺激之細胞亦可在洗滌步驟後經冷凍。不希望受理論束縛，凍結及隨後解凍步驟藉由在細胞群體中移除粒細胞及一定程度上移除單核細胞來提供更均勻產物。在移除血漿及血小板之洗滌步驟後，細胞可懸浮於冷凍溶液中。儘管許多冷凍溶液及參數為此項技術中已知且將適用於此情形，但一種方法涉及使用含有20% DMSO及8%人類血清白蛋白之PBS，或含有10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO，或31.25% Plasmalyte-A、31.25%右旋糖5%、0.45% NaCl、10%聚葡萄糖40及5%右旋糖、20%人類血清白蛋白及7.5% DMSO之培養基或含有例如Hespan及PlasmaLyte A之其他適合細胞冷凍培養基，細胞接著在每分鐘1°之速率下冷凍至-80℃且以氣相儲存於液氮儲存槽中。可使用受控冷凍以及在-20℃下或在液氮中不受控冷凍之其他方法。
在某些態樣中，將低溫保藏之細胞如本文所述解凍及洗滌，且在室溫下靜置一小時，隨後使用本發明之方法活化。
本發明之情形中亦預期在可能需要如本文所述擴展細胞之前一段時間自個體收集血液樣品或清除術產物。因而，待擴展之細胞來源可在任何必要時間點收集，且分離及冷凍所要細胞(諸如T細胞)以隨後用於針對許多將受益於T細胞療法之疾病或病狀(諸如本文所述者)之T細胞療法中。在一個態樣中，血液樣品或清除術取自一般健康個體。在某些態樣中，血液樣品或清除術取自處於產生疾病之風險中但尚未產生疾病的一般健康個體，且所關注細胞經分離及冷凍以供隨後使用。在某些態樣中，T細胞可擴展、冷凍及稍後使用。在某些態樣中，在診斷出如本文所述之特定疾病後不久但在任何處理之前自患者收集樣品。在另一態樣中，細胞在許多相關治療模式之前自血液樣品分離或自個體清除，包括(但不限於)使用諸如那他珠單抗(natalizumab)、艾法珠單抗(efalizumab)、抗病毒劑(antiviral agents)、化學療法(chemotherapy)、放射(radiation)、免疫抑制劑(immunosuppressive agents)，諸如環孢靈(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲胺喋呤(methotrexate)、黴酚酸酯(mycophenolate)及FK506，或其他免疫燒蝕劑，諸如CAMPATH、抗CD3抗體、環磷醯胺(cytoxan)、氟達拉賓(fludarabine)、環孢靈(cyclosporin)、FK506、雷帕黴素、黴酚酸(mycophenolic acid)、類固醇(steroids)、FR901228之試劑處理及照射。此等藥物抑制鈣依賴性磷酸酯酶鈣調神經磷酸酯酶(環孢靈及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導重要之p70S6激酶(雷帕黴素)。(Liu等人，Cell 66：807-815,1991；Henderson等人，Immun.73：316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。在另一態樣中，細胞分離用於患者且冷凍用於隨後與以下結合使用(例如之前、同時或之後)：骨髓或幹細胞移植、使用諸如氟達拉濱(fludarabine)之T細胞消融療法、外光束放射療法(XRT)、環磷醯胺，或諸如OKT3或CAMPATH之抗體。在一個態樣中，細胞先前分離 且可冷凍以隨後用於在B細胞消融療法之後處理，諸如與CD20(例如美羅華(Rituxan))反應之試劑。
在本發明之另一態樣中，T細胞在給個體留下功能性T細胞之治療後直接獲自患者。就此而言，已觀測到在某些癌症治療之後，詳言之使用破壞免疫系統之藥物治療之後，在患者通常將自治療恢復期間的緊接治療之後，獲得之T細胞品質可最佳或針對其離體擴展之能力有所改良。同樣，在使用本文所述之方法離體操作之後，此等細胞可針對增強移植及活體內擴展呈較佳狀態。因此，在此回收階段收集血細胞(包括T細胞、樹突狀細胞或造血譜系之其他細胞)涵蓋於本發明之情形中。此外，在某些態樣中，移動(例如用GM-CSF移動)及調節方案可用於建立個體內之條件，其中尤其在治療之後的制定時間窗其間宜再增殖、再循環、再生及/或擴展特定細胞類型。說明性細胞類型包括T細胞、B細胞、樹突狀細胞及免疫系統之其他細胞。
在一實施例中，NK細胞獲自個體。在另一實施例中，NK細胞為NK細胞株，例如NK-92細胞株(Conkwest)。
同種異體CAR
在本文所述之實施例中，免疫效應細胞可為同種異體免疫效應細胞，例如T細胞或NK細胞。舉例而言，細胞可為同種異體T細胞，例如缺乏功能性T細胞受體(TCR)及/或人類白細胞抗原(HLA)(例如I級HLA及/或II級HLA)表現之同種異體T細胞。
缺乏功能性TCR之T細胞可例如經工程改造使得其不在其表面上表現任何功能性TCR，經工程改造使得其不表現一或多個包含功能性TCR之子單元或經工程改造使得其在其表面產生極少功能性TCR。或者，T細胞可表現實質上受損之TCR，例如藉由表現突變或截斷形式的一或多個TCR子單元。術語「實質上受損之TCR」意謂此TCR將不會在宿主中引起不利免疫反應。
本文所述之T細胞可例如經工程改造使得其不在其表面上表現功能性HLA。舉例而言，本文所述之T細胞可經工程改造使得HLA(例如1級HLA及/或II級HLA)之細胞表面表現下調。
在一些實施例中，T細胞可缺乏功能性TCR及功能性HLA，例如I級HLA及/或II級HLA。
缺乏功能性TCR及/或HLA表現之經修飾T細胞可藉由任何適合方式獲得，包括一或多個TCR或HLA子單元之基因剔除或阻斷基因表現。舉例而言，T細胞可包括使用siRNA、shRNA、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)阻斷TCR及/或HLA基因表現。
在一些實施例中，同種異體細胞可為不表現或例如藉由本文所述之任何方法低程度表現抑制分子之細胞。舉例而言，細胞可為不表現或低程度表現抑制分子之細胞，該抑制分子例如可降低CAR表現細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。抑制分子之抑制，例如在DNA、RNA或蛋白質水準上之抑制，可使CAR表現細胞效能最佳。在實施例中，可使用例如如本文所述之抑制核酸(例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA)、叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)。
抑制TCR或HLA之siRNA及shRNA
在一些實施例中，可使用靶向T細胞中編碼TCR及/或HLA之核酸的siRNA或shRNA抑制TCR表現及/或HLA表現。
可使用任何習知表現系統(例如慢病毒表現系統)實現T細胞中siRNA及shRNAs之表現。
下調TCR之組分之表現的例示性shRNA描述於例如US公開案第2012/0321667號中。下調I級HLA及/或II級HLA基因表現之例示性siRNA及shRNA描述於例如美國公開案第US 2007/0036773號中。
抑制TCR或HLA之CRISPR
如本文所用之「CRISPR」或「TCR及/或HLA之CRISPR」或「抑制TCR及/或HLA之CRISPR」係指一組叢集規律性間隔之短回文重複序列或包含此類重複組之系統。如本文所用，「Cas」係指CRISPR相關蛋白質。「CRISPR/Cas」系統係指來源於CRISPR及Cas之系統，其可用於沉默或突變TCR及/或HLA基因。
天然存在之CRISPR/Cas系統在約40%定序真細菌基因組及90%定序古菌中發現。Grissa等人，(2007)BMC Bioinformatics 8：172。此系統為原核免疫系統類型，其賦予外來遺傳要素(諸如質體及噬菌體)以抗性且提供後天性免疫性形式。Barrangou等人，(2007)Science 315：1709-1712；Marragini等人，(2008)Science 322：1843-1845。
CRISPR/Cas系統已經修飾以用於在諸如小鼠或靈長類動物之真核生物中的基因編輯(沉默、提高或改變特異性基因)。Wiedenheft等人，(2012)Nature 482：331-8。此藉由向真核細胞中引入含有特異性設計之CRISPR及一或多個適當Cas的質體來實現。
CRISPR序列有時稱為CRISPR基因座，包含交替重複序列及間隔基。在天然存在之CRISPR中，間隔基通常包含細菌外源之序列，諸如一種或噬菌體序列；在TCR及/或HLA CRISPR/Cas中系統，間隔基來源於TCR或HLA基因序列。
來自CRISPR基因座之RNA藉由Cas蛋白質組成性表現及處理成小RNA。此等包含側接重複序列之間隔基。RNA指導其他Cas蛋白質在RNA或DNA程度沉默外源性遺傳要素。Horvath等人，(2010)Science 327：167-170；Makarova等人，(2006)Biology Direct 1：7。間隔基因此 用作RNA分子之模板，類似於siRNA。Pennisi(2013)Science 341：833-836。
因為此等天然存在於許多不同類型之細菌中，所以CRISPR之精確排列及結構、Cas基因之功能及數目以及其產物在各物種之間略有不同。Haft等人，(2005)PLoS Comput.Biol.1：e60；Kunin等人，(2007)Genome Biol.8：R61；Mojica等人，(2005)J.Mol.Evol.60：174-182；Bolotin等人，(2005)Microbiol.151：2551-2561；Pourcel等人，(2005)Microbiol.151：653-663；及Stern等人，(2010)Trends.Genet.28：335-340。舉例而言，Cse(Cas亞型，大腸桿菌)蛋白質(例如CasA)形成功能性複雜級聯，其將CRISPR RNA轉錄物加工成保留級聯之間隔基-重複單元。Brouns等人，(2008)Science 321：960-964。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR轉錄物。大腸桿菌中基於CRISPR之噬菌體滅活需要級聯及Cas3，而非Cas1或Cas2。強烈火球菌(Pyrococcus furiosus)及其他原核生物中之Cmr(Cas RAMP模組)蛋白質與識別及裂解互補目標RNA的小CRISPR RNA形成功能性複合物。較簡單CRISPR系統依賴於蛋白質Cas9，其為具有兩個活性切割位點之核酸酶，雙螺旋的每條股各一個。組合Cas9與經修飾CRISPR基因座RNA可用於基因編輯系統中。Pennisi(2013)Science 341：833-836。
CRISPR/Cas系統可因此用於編輯TCR及/或HLA基因(添加或缺失鹼基對)，或引入過早停止，因此降低TCR及/或HLA表現。或者可使用CRISPR/Cas系統，如RNA干擾、以可逆方式關閉TCR及/或HLA基因。在哺乳動物細胞中，例如，RNA可將Cas蛋白質引導至TCR及/或HLA啟動子，空間上阻斷RNA聚合酶。
可使用此項技術中已知中技術產生抑制TCR及/或HLA的人工CRISPR/Cas系統，例如美國公開案第20140068797號及Cong(2013)Science 339：819-823中所述。亦可產生此項技術中已知的抑制TCR及/ 或HLA的其他人工CRISPR/Cas系統，例如Tsai(2014)Nature Biotechnol.,32：6 569-576、美國專利第8,871,445號；第8,865,406號；第8,795,965號；第8,771,945號及第8,697,359號中所述。
抑制TCR及/或HLA之TALEN
「TALEN」或「至HLA及/或TCR之TALEN」或「抑制HLA及/或TCR之TALEN」係指轉錄活化因子樣效應子核酸酶，一種可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。
藉由使TAL效應子DNA結合域稠合至DNA裂解結構域人工製造TALEN。轉錄活化因子樣作用(TALE)可經工程改造以結合任何所要DNA序列，包括HLA或TCR基因之一部分。藉由組合工程改造之TALE與DNA裂解結構域，可產生可任何所要DNA序列(包括HLA或TCR序列)特異之限制酶。此等可接著引入細胞中，其中其可用於基因組編輯。Boch(2011)Nature Biotech.29：135-6；及Boch等人，(2009)Science 326：1509-12；Moscou等人，(2009)Science 326：3501。
TALE為黃單胞菌屬細菌分泌之蛋白質。DNA結合域含有高度保存之重複33-34個胺基酸序列，第12及第13胺基酸除外。此等兩個位置高度變化，顯示與特異性核苷酸識別的強相關性。其可因此經工程改造以結合於所要DNA序列。
為了製造TALEN，TALE蛋白質稠合至核酸酶(N)，其為野生型或突變FokI核酸內切酶。已對FokI作出若干突變使其用於TALEN；此等例如改良裂解特異性或活性。Cermak等人，(2011)Nucl.Acids Res.39：e82；Miller等人，(2011)Nature Biotech.29：143-8；Hockemeyer等人，(2011)Nature Biotech.29：731-734；Wood等人，(2011)Science 333：307；Doyon等人，(2010)Nature Methods 8：74-79；Szczepek等人，(2007)Nature Biotech.25：786-793；及Guo等人，(2010)J.Mol.Biol.200：96。
FokI結構域用作二聚體，需要兩個具有獨特DNA結合域之構築體，該等結合域針對目標基因組中之位點且具有適當方向及間距。TALE DNA結合域與FokI裂解結構域之間的胺基酸殘基數目以及兩個個別TALEN結合位點之間的鹼基數目看起來皆為實現高活性水準之重要參數。Miller等人，(2011)Nature Biotech.29：143-8.
可在細胞內部使用HLA或TCR TALEN產生雙股斷裂(DSB)。若修復機制經非同源端接合不恰當地修復斷裂，則可在斷裂處引入突變。舉例而言，不當修復可能介紹框移突變。或者，外來DNA可與TALEN一起引入細胞中；視外來DNA序列及染色體序列而定，此過程可用於校正HLA或TCR基因中之缺陷或將此類缺陷引入至wt HLA或TCR基因中，因此降低HLA或TCR表現。
對HLA或TCR中之序列特異的TALEN可使用此項技術中已知之任何方法建構，包括多種使用模組組分之流程。Zhang等人，(2011)Nature Biotech.29：149-53；Geibler等人，(2011)PLoS ONE 6：e19509。
抑制HLA及/或TCR之鋅指核酸酶
「ZFN」或「鋅指核酸酶」或「至HLA及/或TCR之ZFN」或「抑制HLA及/或TCR之ZFN」係指鋅指核酸酶，一種可用於編輯HLA及/或TCR基因之人工核酸酶。
與TALEN一樣，ZFN包含稠合至DNA結合域之FokI核酸酶結構域(或其衍生物)。在ZFN之情況中，DNA結合域包含一或多個鋅指。Carroll等人，(2011)Genetics Society of America 188：773-782；及Kim等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：1156-1160。
鋅指為藉由一或多個鋅離子穩定之小蛋白質結構基元。鋅指可包含例如Cys2His2，且可識別約3-bp序列。具有已知特異性之多個鋅指可組合產生多指多肽，其識別約6、9、12、15或18-bp序列。多種 選擇及模組總成技術為用於產生識別特異性序列(包括噬菌體呈現)、酵母單雜交系統、細菌單雜交及雙雜交系統及哺乳動物細胞之鋅指(及其組合)。
與TALEN一樣，ZFN必須二聚化以裂解DNA。因此，需要一對ZFN來靶向非回文DNA位點。兩種個別ZFN必須結合DNA之相對股，將其核酸酶適當地隔開。Bitinaite等人，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10570-5。
亦與TALEN一樣，ZFN可在DNA中形成雙股斷裂，其在未適當修復的情況中可形成框移突變，導致細胞中之HLA及/或TCR的表現及量降低。ZFN亦可與同源重組一起用於在HLA或TCR基因中突變。
對HLA及/或TCR中之序列特異的ZFN可此項技術中已知之任何方法建構。參看例如Provasi(2011)Nature Med.18：807-815；Torikai(2013)Blood 122：1341-1349；Cathomen等人，(2008)Mol.Ther.16：1200-7；及Guod等人，(2010)J.Mol.Biol.400：96；美國專利公開案2011/0158957；美國專利公開案2012/0060230。
細胞之活化及擴展
細胞一般可使用如下所述之方法活化及擴展，例如美國專利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；及美國專利申請公開案第20060121005號。
一般而言，本發明之T細胞可藉由與連接有刺激CD3/TCR複合物相關信號之試劑以及刺激T細胞表面上之共同刺激分子的配位體之表面接觸來擴展。詳言之，T細胞群體可如本文所述刺激，諸如藉由與抗CD3抗體或其抗原結合片段，或固定於表面上之抗CD2抗體，或藉由與蛋白激酶C活化因子(例如苔蘚蟲素)以及鈣離子載體接觸。為了 共同刺激T細胞表面上之輔助分子，使用結合輔助分子之配位體。舉例而言，T細胞群體可與抗CD3抗體及抗CD28抗體在適於刺激T細胞增殖之條件下接觸。為了刺激CD4+ T細胞或CD8+ T細胞之增殖，抗CD3抗體及抗CD28抗體。可使用之抗CD28抗體實例包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diaclone,Besanon，法國)，可依此項技術中通常已知之其他方法使用(Berg等人，Transplant Proc.30(8)：3975-3977,1998；Haanen等人，J.Exp.Med.190(9)：13191328,1999；Garland等人，J.Immunol Meth.227(1-2)：53-63,1999)。
在某些態樣中，針對T細胞之一級刺激信號及協同刺激信號可藉由不同方案提供。舉例而言，提供各信號之試劑可在溶液中或偶接至表面。當偶合至表面時，試劑可偶合至同一表面(亦即「順」形式)或不同表面(亦即「反」形式)。或者，一種試劑可偶合至表面且另一試劑在溶液中。在一個態樣中，提供協同刺激信號之試劑結合至細胞表面且提供一級活化信號之試劑在溶液中或偶合至表面。在某些態樣中，兩種試劑皆可在溶液中。在一個態樣中，該等試劑可為可溶性形式，接著交聯至表面(諸如表現Fc受體之細胞或抗體或將結合於該等試劑之其他結合劑)。就此而言，人工抗原呈現細胞(aAPC)參看例如美國專利申請公開案第20040101519號及第20060034810號，其預期在本發明中用於活化及擴展T細胞。
在一個態樣中，兩種試劑固定於珠粒上(同一珠粒，亦即「順」；或不同珠粒，亦即「反」)。舉例而言，提供一級活化信號之試劑為抗CD3抗體或其抗原結合片段且提供協同刺激信號之試劑為抗CD28抗體或其抗原結合片段；且兩種試劑以等效分子量共同固定於同一珠粒。在一個態樣中，使用結合於用於CD4+ T細胞擴展及T細胞生長之珠粒的1：1比率之各抗體。在本發明之某些態樣中，使用一定比率之結合於珠粒之抗CD3：CD28抗體，使得T細胞擴展相較於使用1：1比率 觀測到的擴展增加。在一個特定態樣中，相較於使用1：1比率觀測到的擴展，觀測到自約1倍增至約3倍。在一個態樣中，結合於珠粒之CD3：CD28抗體之比率在100：1至1：100以及其間之全部整數值範圍內。在本發明之一個態樣中，結合於粒子之抗CD28抗體比抗CD3抗體多，亦即CD3：CD28之比率小於一。在本發明之某些態樣中，結合於珠粒的抗CD28抗體比抗CD3抗體之比率大於2：1。在一個特定態樣中，使用1：100 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在一個態樣中，使用1：75 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在另一態樣中，使用1：50 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在一個態樣中，使用1：30 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在一個態樣中，使用1：10 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在一個態樣中，使用1：3 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。在另一態樣中，使用3：1 CD3：CD28比率的結合於珠粒之抗體。
可使用1：500至500：1及其間之任何整數值的粒子比細胞比率刺激T細胞或其他目標細胞。如一般技術者容易瞭解，粒子比細胞之比率可視相對於目標細胞之粒徑而定。舉例而言，小尺寸珠粒可僅結合少數細胞，而較大珠粒可結合許多細胞。在某些態樣中，細胞比粒子之比率在1：100至100：1及其間之任何整數值範圍內且在其他態樣中，包含1：9至9：1及其間之任何整數值的比率亦可用於刺激T細胞。導致T細胞刺激的抗CD3及抗CD28偶合粒子比T細胞之比率可如上所述變化，然而某些較佳值包括1：100、1：50、1：40、1：30、1：20、1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1及15：1，一個較佳比率為至少1：1粒子比T細胞。在一個態樣中，使用1：1或小於更小的粒子比細胞之比率。在一個特定態樣中，較佳粒子：細胞比率為1：5。在其他態樣中，粒子比細胞之比率可視刺激天數而變化。舉例而言，在一個態樣中，第一天粒子比 細胞之比率為1：1至10：1，且此後每天或每隔一天向細胞添加額外粒子直至10天，最終比率為1：1至1：10(以添加當天的細胞數計)。在一個特定態樣中，刺激第一天粒子比細胞之比率為1：1且在刺激第三天及第五天調整至1：5。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1：1，且刺激第三天及第五天為1：5。在一個態樣中，刺激第一天粒子比細胞之比率為2：1且刺激第三天及第五天調整至1：10。在一個態樣中，每天或每隔一天添加粒子直至第一天的最終比率為1：1，且刺激第三天及第五天為1：10。熟習此項技術者將瞭解多種其他比率可為適用於本發明。詳言之，比率將視粒徑以及細胞尺寸及類型而變化。在一個態樣中，第一天使用之大多數典型比率在1：1、2：1及3：1的鄰域中。
在本發明之其他態樣中，細胞(諸如T細胞)與試劑塗佈之珠粒組合，隨後分離珠粒與細胞，接著培養細胞。在替代態樣中，在培養之前，試劑塗佈之珠粒及細胞不分離，而是一起培養。在另一態樣中，珠粒及細胞首先藉由施加力(諸如磁力)集中，導致細胞表面標記物之接合增加，藉此誘導細胞刺激。
舉例而言，細胞表面蛋白質可藉由使連接有抗CD3及抗CD28之順磁性珠粒(3×28珠粒)與T細胞接觸而接合。在一個態樣中，在例如PBS的緩衝液(不具有二價陽離子，諸如鈣及鎂)中組合細胞(例如104之109個T細胞)及珠粒(例如1：1比率之DYNABEADS® M-450 CD3/CD28順磁性珠粒)。此外，一般技術者容易瞭解可使用之任何細胞濃度。舉例而言，樣品中的目標細胞可能極少且僅占0.01%樣品，或全部樣品(亦即100%)可包含所關注目標細胞。因此，任何細胞數目均在本發明之情形中。在某些態樣中，可能需要顯著降低粒子與細胞混合在一起的體積(亦即提高細胞濃度)以確保細胞與粒子最大接觸。舉例而言，在一個態樣中，使用約2,000,000,000個細胞/毫升之濃 度。在一個態樣中，使用大於100,000,000個細胞/毫升。在另一態樣中，使用10,000,000、15,000,000、20,000,000、25,000,000、30,000,000、35,000,000、40,000,000、45,000,000或50,000,000個細胞/毫升。在另一態樣中，使用75,000,000、80,000,000、85,000,000、90,000,000、95,000,000或100,000,000個細胞/毫升之濃度。在其他態樣中，可使用125,000,000或150,000,000個細胞/毫升之濃度。使用高濃度可導致增加之細胞產量、細胞活化及細胞擴展。此外，使用高細胞濃度允許更有效捕捉可能弱表現所關注目標抗原之細胞，諸如CD28陰性T細胞。此類細胞群體可具有治療價值且在某些態樣中將需要獲得。舉例而言，使用高濃度細胞允許更有效選擇通常具有較弱CD28表現之CD8+ T細胞。
在本發明之一個態樣中，可培養混合物若干小時(約3小時)至約14天或其間之任何小時整數值。在一個態樣中，混合物可培養21天。在本發明之一個態樣中，珠粒及T細胞一起培養約八天。在一個態樣中，珠粒與T細胞一起培養2-3天。亦可能需要若干刺激循環使得T細胞培養時間可為60天或以上。適於T細胞培養之條件包括可含有增殖及活力必需之因素的適當培養基(例如最低限度必需培養基或RPMI培養基1640或X-vivo 15(Lonza))，包括血清(例如胎兒牛或人類血清)、介白素-2(IL-2)、胰島素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ及TNF-α或熟習此項技術者已知的用於細胞生長的任何其他添加劑。用於細胞生長之其他添加劑包括(但不限於)界面活性劑、人血漿蛋白粉及還原劑，諸如N-乙醯基-半胱胺酸及2-巰基乙醇。培養基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15及X-Vivo 20、Optimizer，添加有胺基酸、丙酮酸鈉及維生素，無血清或補充有適量血清(或血漿)或限定激素組，及/或足以T細胞生長及擴展之量的細胞激素。抗生素(例如青黴素及鏈黴素)僅 包括於實驗培養物中，而不在待輸注至個體之細胞培養物中。目標細胞保持於支持生長必需之條件下，例如適當溫度(例如37℃)及氛圍(例如空氣加5% CO2)。
已暴露於不同刺激時間之T細胞可呈現不同特徵。舉例而言，典型血液或球形周邊血液單核細胞產物具有大於細胞毒性或抑制劑T細胞群體(TC、CD8+)的輔助T細胞群體(TH、CD4+)。藉由刺激CD3及CD28受體離體擴展T細胞產生在約第8天至第9天之前主要由TH細胞組成的T細胞群體，而在約第8天至第9天之後，T細胞群體包含愈來愈大之TC細胞群體。因此，視治療目的而定，向個體輸注主要包含TH細胞的T細胞群體可能有利。類似地，若已分離TC細胞之抗原特異性亞型，則可能適宜將此亞型擴展至較大程度。
此外，除了CD4及CD8標記物之外，其他表型標記物顯著變化，但大部分在細胞擴展製程過程中可再現。因此，此類再現性使能夠針對特定目的調整活化T細胞產物。
一旦建構間皮素CAR，則可使用多種分析法來評估分子活性，諸如(但不限於)在抗原刺激後擴展T細胞之能力、在無再刺激存在下支撐T細胞擴展及適當活體外及動物模型中之抗癌活性。下文詳細描述評估間皮素CAR之作用的分析法。
一級T細胞中CAR表現之西方墨點分析可用於偵測單體及二聚體之存在。參看例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，表現CAR之T細胞(CD4+及CD8+ T細胞之1：1混合物)活體外擴展超過10天，隨後在還原條件下細胞溶解且SDS-PAGE。藉由西方墨點法使用TCR-ζ鏈之抗體偵測含有全長TCR-ζ細胞質域及內源性TCR-ζ鏈之CAR。在非還原條件下使用相同T細胞子組用於SDS-PAGE分析以允許評估共價二聚體形成。
可藉由流動式細胞量測術量測CAR+ T細胞在抗原刺激後的活體 外擴展。舉例而言，CD4+及CD8+ T細胞之混合物用αCD3/αCD28aAPC刺激，隨後在待分析啟動子控制下用表現GFP之慢病毒載體轉導。例示性啟動子包括CMV IE基因、EF-1α、泛素C或磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子。在第6天藉由流動式細胞量測術評估CD4+及/或CD8+ T細胞子組培養物之GFP螢光。參看例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。或者，在第0天用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激CD4+及CD8+ T細胞之混合物，且在第1天使用表現CAR之雙順反子豆狀病毒載體以及使用2A核糖體跳印式序列之eGFP用CAR轉導。例如在抗CD3及抗CD28抗體(K562-BBL-3/28)存在下用表現hCD32及4-1BBL之K562細胞再刺激培養物，隨後洗滌。每隔一天向培養物添加100IU/ml外源性IL-2。藉由流動式細胞量測術使用基於珠粒之計數列舉GFP+ T細胞。參看例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。
亦可量測在無再刺激存在下的持久CAR+ T細胞擴展。參看例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，在第0天使用αCD3/αCD28塗佈之磁性珠粒刺激且在第1天用指定CAR轉導後，在培養第8天使用Coulter Multisizer III粒子計數器量測平均T細胞體積(fl)。
上文已描述細胞增殖及細胞激素產量之評定，例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，藉由在微量滴定板中混合經洗滌T細胞與目標細胞(諸如表現間皮素之K562-Meso、Ovcar3、Ovcar8、SW1990、Panc02.03細胞或CD32及CD137(KT32-BBL))直至1：1最終T細胞：目標細胞比率來評定CAR介導之增殖。向具有KT32-BBL細胞之培養物中添加抗CD3(純系OKT3)及抗CD28(純系9.3)單株抗體用作刺激T細胞增殖之陽性對照，因此此等信號支撐長期CD8+ T細胞離體擴展。如製造廠所述使用CountBrightTM螢光珠粒 (Invitrogen,Carlsbad,CA)及流動式細胞量測術在培養物中列舉T細胞。藉由GFP表現使用以eGFP-2A連接之CAR表現慢病毒載體工程改造之T細胞鑑別CAR+ T細胞。對於不表現GFP之CAR+ T細胞，使用生物素標記之重組間皮素蛋白質及二級抗生素蛋白-PE結合物偵測CAR+ T細胞。T細胞上之CD4+及CD8+表現亦同時使用特異性單株抗體(BD Biosciences)偵測。根據製造商說明對使用人類TH1/TH2細胞激素細胞學珠粒陣列套組(BD Biosciences,San Diego,CA)再刺激24小時後收集的清液層進行細胞激素量測。使用FACScalibur流式細胞儀評定螢光，且根據製造商說明分析資料。
可藉由本文所述之方法評定細胞毒性，例如在實例中或藉由標準51Cr釋放分析法。參看例如Milone等人，Molecular Therapy 17(8)：1453-1464(2009)。簡言之，在37℃下，在頻繁攪拌下，用51Cr(如NaCrO4,New England Nuclear,Boston,MA)負載目標細胞(例如表現間皮素之BHK或CHO細胞)持續2小時，在完全RPMI中洗滌兩次且接種至微量滴定板中。在各孔中，在完全RPMI中，混合不同效應細胞：目標細胞(E：T)比率之效應子T細胞與目標細胞。亦製備僅含有培養基(自發釋放，SR)或1% triton-X 100清潔劑溶液(總釋放，TR)之額外孔。在37℃下培育4小時後，自各孔採集清液層。接著使用γ粒子計數器(Packard Instrument Co.,Waltham,MA)量測釋放之51Cr。各條件至少重複進行三次，且使用下式計算溶解百分比：溶解%=(ER-SR)/(TR-SR)，其中ER表示各實驗條件釋放之平均51Cr。亦可使用替代細胞毒性分析法，諸如基於流動之細胞毒性分析法。
可使用磕頭蟲紅及磕頭蟲綠螢光素酶同時追蹤腫瘤進展及T細胞運輸，每次使用相同螢光素受質但在可見光譜之相對端發光。
包括本文實例章節中所述以及此項技術中已知之其他分析法亦可用於評估本發明之間皮素CAR構築體。
間皮素表現疾病及病症之治療應用
本發明提供用於治療與間皮素有關之疾病及病症的組合物及方法。與間皮素有關之疾病或病症的實例為間皮瘤。
惡性間皮瘤為身體內臟器官襯裡細胞薄層(稱為間皮)中發生的癌症類型。存在三種經識別之間皮瘤類型。胸膜間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤或MPM)為最常見疾病形式，占約70%病例，且存在於稱為胸膜之分襯裡中。腹膜間皮瘤存在於稱為腹膜之腹部空腔襯裡中。心包間皮瘤起源於襯裡心臟之心包中。
若個體暴露於石棉，則該個體可處於產生間皮瘤之風險中。暴露於石棉及吸入石棉粒子可引起間皮瘤。在大多數情況下，暴露於石棉之個體中直至發生暴露許多年後才出現間皮瘤症狀。
胸膜間皮瘤之症狀包括例如下背痛或側胸痛，及呼吸短促。其他症狀包括吞咽困難、持續性咳嗽、發熱、體重減輕或疲乏。一些患者經歷的額外症狀為肌肉無力、感官能力損失、咳血、面部及手臂腫脹及嘶啞。在疾病早期階段，諸如1期間皮瘤，症狀可為輕度的。患者一般報導似乎從未停止的胸部一個區域疼痛、體重減輕及發熱。
腹膜間皮瘤起源於腹部且因此，症狀通常包括腹痛、體重減輕、噁心及嘔吐。腹部可能出現流體聚集以及癌症之結果。腹膜間皮瘤起源於腹部且通常將擴散至包括肝臟、脾臟或腸之區域中的其他器官。嚴重腹痛為患者首先經歷之最常見抱怨。腹部亦可能存在不適程度之流體聚集。其他腹膜間皮瘤症狀可包括腸蠕動困難、噁心及嘔吐、發熱及足膨脹。
心包間皮瘤為最少見形式之間皮瘤。如名稱所表明，心包間皮瘤涉及心臟。此罕見的類型之間皮瘤癌症侵襲心包，即包圍心臟之囊。隨著癌症進展，心臟不能向身體有效傳遞氧，導致健康以愈來愈快之速率進一步減退。最通常與心包間皮瘤有關之症狀模擬心臟病發 作之症狀：噁心、胸痛及呼吸短促。
受益於本發明之治療的個體包括患有間皮瘤之個體，或懷疑患有間皮瘤之個體，例如由存在一或多種本文所述之症狀及/或暴露於石棉所證明。在特定實施例中，間皮瘤為胸膜間皮瘤(例如惡性胸膜間皮瘤)。在其他態樣中，可治療具有癌變前病狀(諸如胸膜斑塊、良性間皮瘤或間皮增生)之個體。
與間皮素有關之疾病或病症的另一實例為胰臟癌。可使用本文所述之方法治療的胰臟癌包括(但不限於)外分泌胰臟癌及內分泌胰臟癌。外分泌胰臟癌包括(但不限於)腺癌、腺泡細胞癌瘤、腺鱗癌瘤、膠體癌瘤、具有破骨細胞樣巨細胞之未分化癌瘤、肝癌瘤、管內乳頭狀黏液性贅瘤、黏液性囊性贅瘤、胰母細胞瘤、漿液性囊腺瘤、印戒細胞癌、實體及假乳頭狀腫瘤、胰管癌瘤及未分化癌瘤。在一些實施例中，外分泌胰臟癌為胰管癌瘤。內分泌胰臟癌症包括(但不限於)胰島素瘤及胰高血糖素瘤。
在一些實施例中，胰臟癌為任何初期胰臟癌、非轉移性胰臟癌、原發性胰臟癌、經切除之胰臟癌、晚期胰臟癌、局部晚期胰臟癌、轉移性胰臟癌、不可切除性胰臟癌、正在緩解之胰臟癌、反覆性胰臟癌、輔助設置之胰臟癌或新輔助設置之胰臟癌。在一些實施例中，胰臟癌為局部晚期胰臟癌、不可切除性胰臟癌或轉移性胰管癌瘤。在一些實施例中，胰臟癌耐基於吉西他濱之療法。在一些實施例中，胰臟癌為基於吉西他濱之療法難治癒。
在其他態樣中，與間皮素表現有關之病症為卵巢癌。卵巢癌根據腫瘤組織學分類。表面上皮細胞基質腫瘤亦稱為卵巢上皮細胞癌瘤，為最常見卵巢癌類型。其包括漿液腫瘤(包括漿液性乳頭狀囊腺癌)、子宮內膜樣腫瘤及黏液性囊腺癌。
本文所述之方法可用於治療多個階段之卵巢癌，例如I期、II 期、III期或IV期。例如當卵巢癌移除時，可進行分級。卵巢癌如下分級：I期癌症限於一個或兩個卵巢。若一個或兩個卵巢受累且已擴散至子宮及/或輸卵管或骨盆中之其他部位，則癌症為II期。若一個或兩個卵巢受累且已擴散至淋巴結或骨盆外之其他部位但仍在腹腔內(諸如腸道或肝臟之表面)，則癌症為III期癌症。若一個或兩個卵巢受累且癌症已擴散至腹部外部或肝臟內部，則癌症為IV期癌症。
在一些實施例中，卵巢癌耐一或多種化學治療劑。在一些實施例中，卵巢癌為一或多種化學治療劑難治癒的。
可使用本文所述之CAR組合物治療的其他癌症包括例如腦癌、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸直腸癌、肝癌、腎癌、淋巴瘤、白血病、肺癌(例如肺腺癌)、黑素瘤、轉移性黑素瘤、間皮瘤、神經母細胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰臟癌、腎癌、皮膚癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)、子宮癌及其任何組合。
本發明提供用於抑制間皮素表現細胞群體增殖或減少間皮素表現細胞群體之方法，該等方法包含使包含間皮素表現細胞之細胞群體與結合間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞接觸。在一特定實施例中，本發明提供用於抑制表現間皮素之癌細胞群體增殖或減少表現間皮素之癌細胞群體的方法，該等方法包含使間皮素表現癌細胞群體與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞接觸。在另一實施例中，本發明提供抑制表現間皮素之癌細胞群體增殖或減少表現間皮素之癌細胞群體，該等方法包含使間皮素表現癌細胞群體與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞接觸。在某些實施例中，本發明之間皮素CAR表現細胞使患有間皮瘤或另一與間皮素表現細胞有關之癌症的個體或動物模型中的細胞及/或癌細 胞的數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體為人類。
本發明亦提供用於預防、治療及/或管理與間皮素表現細胞有關之病症(例如間皮瘤)的方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮瘤CAR表現細胞。在一個態樣中，個體為人類。
本發明提供用於預防與間皮素表現細胞有關之癌症復發的方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞。在另一實施例中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞與有效量之另一療法的組合。
在一個態樣中，本發明係關於一種載體，其包含編碼可操作地連接於啟動子以在哺乳動物免疫效應細胞中表現之間皮素CAR的序列。在一個態樣中，本發明提供一種表現間皮素CAR之重組免疫效應細胞，其用於治療間皮素表現腫瘤。在一個態樣中，本發明之間皮素CAR表現細胞能夠接觸表面上表現至少一種本發明之間皮素CAR的腫瘤細胞，使得間皮素CAR表現細胞回應於抗原活化且CAR表現細胞靶向癌細胞，且抑制癌症生長。
在一個態樣中，本發明係關於一種抑制間皮素表現癌細胞生長之方法，其包含使腫瘤細胞與間皮素CAR表現細胞接觸使得CAR表現細胞回應於抗原活化且靶向癌細胞，其中癌症生長得以抑制。在一個態樣中，活化CART靶向及殺死癌細胞。
在一個態樣中，本發明係關於一種治療個體中之癌症的方法。該方法包含向個體投與間皮素CAR表現細胞使得個體中之癌症得以治療。可藉由本發明之間皮素CAR表現細胞治療的癌症之實例為與間皮 素表現有關之癌症。在一個態樣中，與間皮素表現有關之癌症係選自間皮瘤、胰臟癌、卵巢癌及肺癌。
本發明包括一種類型之細胞療法，其中免疫效應細胞(例如T細胞或NK細胞)經遺傳修飾以表現嵌合性抗原受體(CAR)且CAR表現細胞輸注至有需要的接受者中。輸注之細胞能夠殺死接受者中之腫瘤細胞。不同於抗體療法，CAR修飾之免疫效應細胞能夠活體內複製，導致可能引起持久腫瘤控制之長期持續性。在各種態樣中，向患者或其後代投與細胞，在向患者投與該細胞後在患者體內保持至少四個月、五個月、六個月、七個月、八個月、九個月、十個月、十一個月、十二個月、十三個月、十四個月、十五個月、十六個月、十七個月、十八個月、十九個月、二十個月、二十一個月、二十二個月、二十三個月、兩年、三年、四年或五年。
本發明亦包括一種類型之細胞療法，其中免疫效應細胞了例如藉由活體外轉錄之RNA修飾以短暫表現嵌合性抗原受體(CAR)且CAR表現細胞輸注至有需要的接受者中。輸注之細胞能夠殺死接受者中之癌細胞。因此，在各種態樣中，向患者投與之細胞在向患者投與之後存在少於一個月，例如三週、兩週、一週。
不希望受任何特定理論束縛，CAR修飾之免疫效應細胞引起的抗癌免疫性反應可為主動或被動免疫反應，或者可歸因於直接對比間接免疫反應。在一個態樣中，CAR轉導之T細胞回應於表現間皮素之人類癌細胞呈現特異性促炎性細胞激素分泌及強效細胞溶解活性，且介導旁觀殺傷及介導現有人類腫瘤消退。舉例而言，間皮素表現腫瘤之異質場內的抗原較少之腫瘤細胞可能對間皮素重導向T細胞的間接損壞敏感，該等間皮素重導向T細胞先前已針對相鄰抗原陽性癌細胞反應。
在一個態樣中，攜帶完全人類scFv之本發明之CAR修飾免疫效應 細胞可為用於哺乳動物離體免疫接種及/或活體內療法的疫苗類型。在一個態樣中，哺乳動物為人類。
關於離體免疫接種，在向哺乳動物投與細胞之前，活體外進行以下中之至少一者：i)擴展細胞，ii)向細胞中引入編碼CAR之核酸或iii)低溫保藏細胞。
離體程序為此項技術中熟知的且在下文中更完全論述。簡言之，細胞自哺乳動物(例如人類)分離且使用表現本文揭示之CAR的載體遺傳修飾(亦即活體外轉導或經轉染)。向哺乳動物接受者投與CAR修飾之細胞提供治療益處。哺乳動物接受者可為人類且CAR修飾細胞可關於接受者為自體的。或者，細胞關於接受者可為同種異體、同系或異種的。
用於離體擴展造血幹細胞及祖細胞之程序描述於以引用的方式併入本文中的美國專利第5,199,942號中，且可應用於本發明之細胞。其他適合方法為此項技術中已知的，因此本發明不限於任何特定離體擴展細胞之方法。簡言之，T細胞之離體培養及擴展包含：(1)藉由周邊血液採集或骨髓外植體自哺乳動物收集CD34+造血幹細胞及祖細胞；及(2)離體擴展此類細胞。除了美國專利第5,199,942號中描述之細胞生長因子之外，諸如flt3-L、IL-1、IL-3及c-套組配位體之其他因素可用於培養及擴展該等細胞。
除了在離體免疫接種方面使用基於細胞之疫苗之外，本發明亦提供用於活體內免疫接種以針對患者中之抗原引起免疫反應的組合物及方法。
一般而言，如本文所述活化及擴展之細胞可用於治療及預防免疫功能不全個體中產生的疾病。詳言之，本發明之CAR修飾之免疫效應細胞用於治療與間皮素表現有關的疾病、病症及病狀。在某些態樣中，本發明之細胞用於治療處於產生與間皮素表現有關之疾病、病症 及病狀風險中的患者。因此，本發明提供用於治療或預防與間皮素表現有關之疾病、病症及病狀的方法，其包含向有需要之個體投與治療有效量的本發明之CAR修飾之T細胞。
本發明之CAR修飾之T細胞可單獨投與或作為與稀釋劑及/或其他組分(諸如IL-2或其他細胞激素或細胞群體)組合的醫藥組合物形式投與。
本發明亦提供用於抑制間皮素表現細胞群體增殖或減少間皮素表現細胞群體的方法，該等方法包含使包含間皮素表現細胞之細胞群體與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞(例如間皮素CART亦稱作「CART-MSLN」)接觸。在一特定態樣中，本發明提供用於抑制表現間皮素之癌細胞群體增殖或減少表現間皮素之癌細胞群體的方法，該等方法包含使間皮素表現癌細胞群體與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞接觸。在一個態樣中，本發明提供用於抑制表現間皮素之癌細胞群體增殖或減少表現間皮素之癌細胞群體的方法，該等方法包含使間皮素表現癌細胞群體與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞接觸。在某些態樣中，本發明之間皮素CAR表現細胞使患有間皮瘤或另一與間皮素表現細胞有關之癌症的個體或動物模型中的細胞及/或癌細胞之數量、數目、量或百分比相對於陰性對照減少至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少65%、至少75%、至少85%、至少95%或至少99%。在一個態樣中，個體為人類。
本發明亦提供用於預防、治療及/或管理與間皮素表現細胞有關之疾病(例如間皮瘤)的方法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞。在一個態樣中，個體為人類。
本發明提供用於預防與間皮素表現細胞有關之癌症復發的方 法，該等方法包含向有需要之個體投與結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞。在一個態樣中，該等方法包含向有需要之個體投與有效量之結合至間皮素表現細胞的本發明之間皮素CAR表現細胞與有效量之另一療法的組合。
組合療法
本文所述之CAR表現細胞可投與其他已知藥劑及療法組合使用。如本文中所用，「組合」投與意謂在個體受病症折磨之病程期間向個體傳遞兩種(或兩種以上)不同治療，例如在個體已診斷患有病症之後及在病症治癒或消除或出於其他原因治療停止之前，傳遞兩種或兩種以上治療。在一些實施例中，當開始提供第二治療時，第一治療之提供仍存在以使得投與存在重疊。此在本文中有時係指「同時」或「並行傳遞」。在其他實施例中，一種治療之傳遞在另一治療傳遞開始之前結束。在任一情況之一些實施例中，治療由於組合投與而更有效。舉例而言，相較於在無第一治療存在下投與第二治療可見，第二治療更有效，例如使用較少第二治療即可見同等效果，或第二治療使症狀更大程度減輕，或對於第一治療可見相似情形。在一些實施例中，傳遞使得症狀減輕或與病症有關之其他參數大於在無另一治療存在下用一種治療傳遞所觀測到的參數。兩種治療之作用可部分加合，完全加合或大於加合。傳遞可使得所傳遞之第一治療之作用在傳遞第二治療時仍可偵測。
本文所述之CAR表現細胞及至少一種額外治療劑可在相同或各別組合物中同時投與或依序投與。對於依序投與，本文所述之CAR表現細胞可首先投與，且接著投與額外試劑，或投與順序可顛倒。
在其他態樣中，本文所述之CAR表現細胞與以下組合用於治療方案中：手術、化學療法、放射、免疫抑制劑(諸如環孢靈、硫唑嘌呤、甲胺喋呤、黴酚酸酯及FK506)、抗體或其他免疫燒蝕劑(諸如 CAMPATH、抗CD3抗體或其他抗體療法)、細胞毒素、氟達拉濱、環孢靈、FK506、雷帕黴素、黴酚酸、類固醇、FR901228、細胞激素及照射。肽疫苗，諸如Izumoto等人，2008 J Neurosurg 108：963-971中所述。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞可與化學治療劑組合使用。例示性化學治療劑包括蒽環黴素(例如小紅莓(例如脂質體小紅莓))、長春花生物鹼(例如長春鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞賓(vinorelbine))、烷基化劑(例如環磷醯胺、達卡巴嗪(decarbazine)、美法侖、異環磷醯胺、替莫唑胺)、免疫細胞抗體(例如阿來木單抗(alemtuzamab)、吉妥單抗(gemtuzumab)、利妥昔單抗(rituximab)、托西莫單抗(tositumomab))、抗代謝產物(包括例如葉酸拮抗劑、嘧啶類似物、嘌呤類似物及腺苷脫胺酶抑制劑(例如氟達拉濱))、mTOR抑制劑、TNFR糖皮質激素誘導之TNFR相關蛋白質(GITR)促效劑、蛋白酶體抑制劑((例如阿克拉黴素A、膠毒素或硼替佐米)、免疫調節劑(諸如撒利多胺(thalidomide)或撒利多胺衍生物(例如來那度胺(來那度胺)))。
一般考慮用於組合療法之化學治療劑包括阿那曲唑(anastrozole)(Arimidex®)、比卡魯胺(bicalutamide)(Casodex®)、硫酸博萊黴素(bleomycin sulfate)(Blenoxane®)、白消安(busulfan)(Myleran®)、白消安注射劑(Busulfex®)、卡培他濱(capecitabine)(Xeloda®)、N4至戊氧基羰基-5-去氧基-5-氟胞嘧啶核苷、卡鉑(卡鉑)(Paraplatin®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)(Leukeran®)、順鉑(cisplatin)(Platinol®)、克拉屈濱(cladribine)(Leustatin®)、環磷醯胺(cyclophosphamide)(Cytoxan®或Neosar®)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)(Cytosar-U®)、阿糖胞苷脂質體注射劑(DepoCyt®)、達卡 巴嗪(dacarbazine)(DTIC-Dome®)、放線菌素d(dactinomycin)(Actinomycin D、Cosmegan)、鹽酸道諾黴素(daunorubicin hydrochloride)(Cerubidine®)、檸檬酸道諾黴素脂質體注射劑(DaunoXome®)、地塞米松、多西他賽(docetaxel)(Taxotere®)、鹽酸阿黴素(doxorubicin hydrochloride)(Adriamycin®、Rubex®)、依託泊苷(依託泊苷)(Vepesid®)、磷酸氟達拉賓(fludarabine phosphate)(Fludara®)、5-氟尿嘧啶(Adrucil®、Efudex®)、氟他胺(flutamide)(Eulexin®)、特紮替濱(tezacitibine)、吉西他濱(二氟去氧胞苷)、羥脲(hydroxyurea)(Hydrea®)、伊達比星(Idarubicin)(Idamycin®)、異環磷醯胺(ifosfamide)(IFEX®)、伊立替康(irinotecan)(Camptosar®)、L-天冬醯胺酶(ELSPAR®)、甲醯四氫葉酸鈣、美法侖(Alkeran®)、6-巰基嘌呤(Purinethol®)、甲胺喋呤(Folex®)、米托蒽醌(Novantrone®)、麥羅塔(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)(Taxol®)、菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、噴司他丁(pentostatin)具有卡莫司汀植入物之聚苯丙生20(Gliadel®)、檸檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)(Nolvadex®)、替尼泊甙(teniposide)(Vumon®)、6-硫代鳥嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉紮明(tirapazamine)(Tirazone®)、注射用鹽酸拓朴替康(Hycamptin®)、長春鹼(Velban®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春瑞賓(Navelbine®)。
例示性烷基化劑包括(但不限於)氮芥、乙烯亞胺衍生物、烷基磺酸酯、亞硝基脲及三氮烯)：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Mustard®、Chlorethaminacil®、Demethyldopan®、Desmethyldopan®、Haemanthamine®、Nordopan®、Uracil nitrogen mustard®、Uracillost®、Uracilmostaza®、Uramustin®、Uramustine®)、雙氯乙基甲胺(Mustargen®)、環磷醯胺(Cytoxan®、Neosar®、Clafen®、Endoxan®、Procytox®、RevimmuneTM)、異環磷醯胺(Mitoxana®)、美 法侖(Alkeran®)、苯丁酸氮芥(Leukeran®)、哌泊溴烷(Amedel®、Vercyte®)、曲他胺(Hemel®、Hexalen®、Hexastat®)、三伸乙基硫代磷胺、替莫唑胺(Temodar®)、噻替派(Thioplex®)、白消安(Busilvex®、Myleran®)、卡莫司汀(carmustine)(BiCNU®)、洛莫司汀(lomustine)(CeeNU®)、鏈脲菌素(streptozocin)(Zanosar®)及達卡巴嗪(Dacarbazine)(DTIC-Dome®)。額外例示性烷基化劑包括(但不限於)奧沙利鉑(Oxaliplatin)(Eloxatin®)；替莫唑胺(Temozolomide)(Temodar®及Temodal®)；放線菌素d(亦稱為放線菌素-D，Cosmegen®)；美法侖(亦稱為L-PAM、L-溶肉瘤素及苯丙胺酸氮芥、Alkeran®)；六甲蜜胺(亦稱為六甲蜜胺(HMM)、Hexalen®)；卡莫司汀(Carmustine)(BiCNU®)；苯達莫司汀(Bendamustine)(Treanda®)；白消安(Busulfex®及Myleran®)；卡鉑(Paraplatin®)；洛莫司汀(Lomustine)(亦稱為CCNU、CeeNU®)；順鉑(亦稱為CDDP、Platinol®及Platinol®-AQ)；苯丁酸氮芥(Leukeran®)；環磷醯胺(Cytoxan®及Neosar®)；達卡巴嗪(Dacarbazine)(亦稱為DTIC、DIC及咪唑羧醯胺、DTIC-Dome®)；六甲蜜胺(Altretamine)(亦稱為六甲蜜胺(HMM)、Hexalen®)；異環磷醯胺(Ifex®)；普萊德莫司汀(Prednumustine)；丙卡巴肼(Procarbazine)(Matulane®)；氮芥(Mechlorethamine)(亦稱為氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)及甲氯乙胺鹽酸鹽，Mustargen®)；鏈脲菌素(Streptozocin)(Zanosar®)；噻替派(亦稱為硫代磷醯胺、TESPA及TSPA，Thioplex®)；環磷醯胺(Endoxan®、Cytoxan®、Neosar®、Procytox®、Revimmune®)；及苯達莫司汀HCl(Treanda®)。
例示性mTOR抑制劑包括例如坦羅莫司(temsirolimus)；地磷莫司(ridaforolimus)(正式稱為地非洛莫司(deferolimus)、二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E, 26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669，且描述於PCT公開案第WO 03/064383號中)；依維莫司(everolimus)(Afinitor®或RAD001)；雷帕黴素(AY22989、Sirolimus®)；司馬匹莫德(simapimod)(CAS 164301-51-3)；埃西莫司(emsirolimus)、(5-{2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基))甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；及N2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-，內鹽(SF1126，CAS 936487-67-1)及XL765。
例示性免疫調節劑包括例如阿夫妥珠單抗(afutuzumab)(獲自Roche®)；派非格司亭(pegfilgrastim)(Neulasta®)；來那度胺(CC-5013，Revlimid®)；沙立度胺(Thalomid®)；艾可米得(actimid)(CC4047)；及IRX-2(包括介白素1、介白素2及干擾素γ之人類細胞激素混合物，CAS 951209-71-5，獲自IRX療法)
例示性蒽環黴素包括例如小紅莓(Adriamycin®及Rubex®)；博萊黴素(lenoxane®)；道諾黴素(鹽酸道諾黴素、柔紅黴素及鹽酸紅比黴素，Cerubidine®)；道諾黴素脂質體(檸檬酸道諾黴素脂質體，DaunoXome®)；米托蒽醌(DHAD，Novantrone®)；表柔比星(EllenceTM)；伊達比星(Idamycin®、Idamycin PFS®)；絲裂黴素C(Mutamycin®)；格爾德黴素(geldanamycin)；除莠黴素(herbimycin)；拉維黴素(ravidomycin)；及去乙醯基拉維黴素(desacetylravidomycin)。
例示性長春花生物鹼包括例如酒石酸長春瑞濱(Navelbine®)、長春新鹼(Oncovin®)及長春地辛(Eldisine®)；長春鹼(亦稱為硫酸長春鹼、長春花鹼(vincaleukoblastine)及VLB，Alkaban-AQ®及Velban®)；及長春瑞濱(Navelbine®)。
例示性蛋白酶體抑制劑包括硼替佐米(Velcade®)；卡非唑米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基環氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)胺基)-1-側氧基-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-嗎啉基乙醯胺基)-4-苯基丁醯胺基)-戊醯胺)；馬瑞唑米(marizomib)(NPI-0052)；檸檬酸依薩唑米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；迪蘭唑米(delanzomib)(CEP-18770)；及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-絲胺醯基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-環氧乙烷基]-2-側氧基-1-(苯基甲基)乙基]-L-絲胺醯胺(ONX-0912)。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞與靶向GITR及/或調節GITR功能之分子(諸如GITR促效劑及/或耗盡調節T細胞(Tregs)之GITR抗體)組合向個體投與。在一個實施例中，在CAR表現細胞之前投與GITR結合分子及/或調節GITR功能之分子(例如GITR促效劑及/或Treg耗盡GITR抗體)。舉例而言，在一個實施例中，GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。例示性GITR促效劑包括例如GITR融合蛋白及抗GITR抗體(例如二價抗GITR抗體)，諸如美國專利第6,111,090號、歐洲專利第090505B1號、美國專利第8,586,023號、PCT公開案第WO 2010/003118號及2011/090754號中所描述之GITR融合蛋白，或例如美國專利第7,025,962號、歐洲專利第1947183B1號、美國專利第7,812,135號、美國專利第8,388,967號、美國專利第8,591,886號、歐洲專利第EP 1866339號、PCT公開案第WO 2011/028683號、PCT公開案第WO 2013/039954號、PCT公開案第WO2005/007190號、PCT公開案第WO 2007/133822號、PCT公開案第WO2005/055808號、PCT公開 案第WO 99/40196號、PCT公開案第WO 2001/03720號、PCT公開案第WO99/20758號、PCT公開案第WO2006/083289號、PCT公開案第WO 2005/115451號、美國專利第7,618,632號及PCT公開案第WO 2011/051726號中所描述之抗GITR抗體。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞與mTOR抑制劑(例如本文所述之mTOR抑制劑，例如雷帕羅吉，諸如依維莫司)組合向個體投與。在一個實施例中，mTOR抑制劑在CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，mTOR抑制劑可在細胞清除術之前投與。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞與GITR促效劑(例如本文所述之GITR促效劑)組合向個體投與。在一個實施例中，GITR促效劑在CAR表現細胞之前投與。舉例而言，在一個實施例中，GITR促效劑可在細胞清除術之前投與。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞與蛋白質酪胺酸磷酸酯酶抑制劑(例如本文所述之蛋白質酪胺酸磷酸酯酶抑制劑)組合向個體投與。在一個實施例中，蛋白質酪胺酸磷酸酯酶抑制劑為SHP-1抑制劑，例如本文所述之SHP-1抑制劑，諸如葡萄糖酸銻鈉。在一個實施例中，蛋白質酪胺酸磷酸酯酶抑制劑為SHP-2抑制劑，例如本文所述之SHP-2抑制劑。
在一個實施例中，本文所述之CAR表現細胞可與激酶抑制劑組合使用。在一個實施例中，激酶抑制劑為CDK4抑制劑，例如本文所述之CDK4抑制劑，例如CDK4/6抑制劑，諸如6-乙醯基-8-環戊基-5-甲基-2-(5-哌嗪基-1-基-吡啶-2-基胺基)-8H-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-酮鹽酸鹽(亦稱作帕博西里(palbociclib)或PD0332991)。在一個實施例中，激酶抑制劑為BTK抑制劑，例如本文所述之BTK抑制劑，諸如依魯替尼(ibrutinib)。在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如本文 所述之mTOR抑制劑，諸如雷帕黴素、雷帕黴素類似物、OSI-027。mTOR抑制劑可為例如mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑，例如本文所述之mTORC1抑制劑及/或mTORC2抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑為MNK抑制劑，例如本文所述之MNK抑制劑，諸如4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。MNK抑制劑可為例如MNK1a、MNK1b、MNK2a及/或MNK2b抑制劑。在一個實施例中，激酶抑制劑為本文所述之雙重PI3K/mTOR抑制劑，諸如PF-04695102。在一個實施例中，激酶抑制劑為DGK抑制劑，例如本文所述之DGK抑制劑，諸如DGKinh1(D5919)或DGKinh2(D5794)。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之CDK4抑制劑：阿洛新A(aloisine A)；夫拉平度(flavopiridol)或HMR-1275、2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(3S,4R)-3-羥基-1-甲基-4-哌啶基]-4-色酮；克卓替尼(crizotinib)(PF-02341066；2-(2-氯苯基)-5,7-二羥基-8-[(2R,3S)-2-(羥基甲基)-1-甲基-3-吡咯啶基]-4H-1-苯并哌喃-4-酮鹽酸鹽(P276-00)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基]-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265)；依地蘇蘭(indisulam)(E7070)；羅斯維汀(roscovitine)(CYC202)；帕博西里(palbociclib)(PD0332991)；戴那西里(dinaciclib)(SCH727965)；N-[5-[[(5-第三丁基噁唑-2-基)甲基]硫基]噻唑-2-基]哌啶-4-甲醯胺(BMS 387032)；4-[[9-氯-7-(2,6-二氟苯基)-5H-嘧啶并[5,4-d][2]苯并氮呯-2-基]胺基]-苯甲酸(MLN8054)；5-[3-(4,6-二氟-1H-苯并咪唑-2-基)-1H-吲唑-5-基]-N-乙基-4-甲基-3-吡啶甲胺(AG-024322)；4-(2,6-二氯苯甲醯胺基)-1H-吡唑-3-甲酸N-(哌啶-4-基)醯胺(AT7519)；4-[2-甲基-1-(1-甲基乙基)-1H-咪唑-5-基]-N-[4-(甲基磺醯基)苯基]-2-嘧啶胺(AZD5438)；及XL281(BMS908662)。
在一個實施例中，激酶抑制劑為CDK4抑制劑，例如帕博西里 (PD0332991)，且帕博西里係以每日約50mg、60mg、70mg、75mg、80mg、90mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg(例如75mg、100mg或125mg)之劑量投與一段時間，例如每日以上述劑量持續28天週期中之14天至21天或每日以上述劑量持續21天週期中之7天至12天。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或以上週期的帕博西里。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之BTK抑制劑：依魯替尼(PCI-32765)；GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。在一較佳實施例中，BTK抑制劑不降低或抑制介白素-2-誘導型激酶(ITK)之激酶活性，且係選自GDC-0834；RN-486；CGI-560；CGI-1764；HM-71224；CC-292；ONO-4059；CNX-774；及LFM-A13。
在一個實施例中，激酶抑制劑為BTK抑制劑，例如依魯替尼(PCI-32765)，且依魯替尼以每日約250mg、300mg、350mg、400mg、420mg、440mg、460mg、480mg、500mg、520mg、540mg、560mg、580mg、600mg(例如250mg、420mg或560mg)之劑量投與一段時間，例如每日以上述劑量持續21天的週期或每日以上述劑量持續28天的週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依魯替尼。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之mTOR抑制劑：坦羅莫司；地磷莫司二甲基亞膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五側氧基-11,36-二氧雜-4-氮雜三環[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基環己基酯，亦稱為AP23573及MK8669；依維莫司(RAD001)；雷帕黴素(AY22989)；司馬匹莫德；(5-{2,4-雙[(3S)-3- 甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502)；及N2-[1,4-二側氧基-4-[[4-(4-側氧基-8-苯基-4H-1-苯并哌喃-2-基)嗎啉鎓-4-基]甲氧基]丁基]-L-精胺醯基甘胺醯基-L-α-天冬胺醯基L-絲胺酸-(SEQ ID NO：272)內鹽(SF1126)；及XL765。
在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如雷帕黴素，且雷帕黴素以每日約3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg(例如6mg)之劑量投與一段時間，例如每日以上述劑量持續21天的週期或每日以上述劑量持續28天的週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的雷帕黴素。在一個實施例中，激酶抑制劑為mTOR抑制劑，例如依維莫司，且依維莫司以每日約2mg、2.5mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、11mg、12mg、13mg、14mg、15mg(例如10mg)之劑量投與一段時間，例如每日以上述劑量持續28天的週期。在一個實施例中，投與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個或12個以上週期的依維莫司。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之MNK抑制劑：CGP052088；4-胺基-3-(對氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶(CGP57380)；尾孢醯胺(cercosporamide)；ETC-1780445-2；及4-胺基-5-(4-氟苯胺基)-吡唑并[3,4-d]嘧啶。
在一個實施例中，激酶抑制劑為選自以下之雙重磷脂醯環己六醇3-激酶(PI3K)及mTOR抑制劑：2-胺基-8-[反-4-(2-羥基乙氧基)環己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF-04691502)；N-[4-[[4-(二甲基胺基)-1-哌啶基]羰基]苯基]-N'-[4-(4,6-二-4-嗎啉基-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲(PF-05212384，PKI-587)；2-甲基- 2-{4-[3-甲基-2-側氧基-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氫-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基}丙腈(BEZ-235)；阿匹托里斯(apitolisib)(GDC-0980、RG7422)；2,4-二氟-N-{2-(甲基氧基)-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺(GSK2126458)；8-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-(哌嗪-1-基)-3-(三氟甲基)苯基)-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-酮順丁烯二酸(NVP-BGT226)；3-[4-(4-嗎啉基吡啶并[3',2'：4,5]呋喃并[3,2-d]嘧啶-2-基]苯酚(PI-103)；5-(9-異丙基-8-甲基-2-(N-嗎啉基)-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(VS-5584、SB2343)；及N-[2-[(3,5-二甲氧基苯基)胺基]喹喏啉-3-基]-4-[(4-甲基-3-甲氧基苯基)羰基]胺基苯基磺醯胺(XL765)。
亦可使用抑制鈣依賴性磷酸酯酶鈣調神經磷酸酶(環孢靈及FK506)或抑制對生長因子誘導之信號傳導重要之p70S6激酶(雷帕黴素)之藥物。(Liu等人，Cell 66：807-815,1991；Henderson等人，Immun.73：316-321,1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun.5：763-773,1993)。在另一態樣中，本發明之細胞組合物可與以下結合向患者投與(例如之前、同時或之後)：骨髓移植、使用諸如氟達拉濱之T細胞消融療法、外光束放射療法(XRT)、環磷醯胺，及/或諸如OKT3或CAMPATH之抗體。在一個態樣中，本發明之細胞組合物在B細胞消融療法(諸如與CD20反應之試劑，例如美羅華(Rituxan))之後投與。舉例而言，在一個實施例中，個體可進行使用高劑量化學療法，隨後周邊血液幹細胞移植的標準治療。在某些實施例中，在移植後，個體接受本發明之擴展免疫細胞輸注。在另一實施例中，在手術之前或之後投與擴展之細胞。
在一個實施例中，可向個體投與減輕或改善與投與CAR表現細胞有關之副作用的試劑。與投與CAR表現細胞有關之副作用包括(但不限於)CRS及噬血細胞性淋巴組織細胞增生症(HLH)，亦稱為巨噬細胞 活化症候群(MAS)。CRS之症狀包括高熱、噁心、短暫低血壓、低氧及其類似症狀。CRS可包括臨床構成病徵及症狀，諸如發熱、疲乏、食慾不振、肌痛、關節疼痛、噁心、嘔吐及頭痛。CRS可包括臨床皮膚病征及症狀，諸如皮疹。CRS可包括臨床腸胃病征及症狀，諸如噁心、嘔吐及腹瀉。CRS可包括臨床呼吸道病徵及症狀，諸如呼吸急促及血氧過低。CRS可包括臨床心血管病徵及症狀，諸如心動過速、加寬之脈衝壓力、低血壓、增加之心輸出量(早期)及潛在減少之心輸出量(晚期)。CRS可包括臨床凝血病徵及症狀，諸如升高之d-二聚體、具有或不具有出血之纖維蛋白原血症。CRS可包括臨床腎臟病徵及症狀，諸如氮血症。CRS可包括臨床肝臟病徵及症狀，諸如轉氨酶升高及高膽紅素血症。CRS可包括臨床神經病征及症狀，諸如頭痛、精神狀態變化、意識模糊、譫妄、喚詞困難或弗蘭克失語症(frank aphasia)、幻覺、顫抖、癡呆(dymetria)、步態改變及癲癇。
因此，本文所述之方法可包含向個體投與本文所述之CAR表現細胞及進一步投與一或多種控制可溶性因子含量升高之試劑，該含量升高由使用CAR表現細胞治療引起。在一個實施例中，個體中升高之可溶性因子為IFN-γ、TNFα、IL-2及IL-6中之一或多者。在一實施例中，個體中升高之因子為IL-1、GM-CSF、IL-10、IL-8、IL-5及fraktalkine中之一或多者。因此，投與以治療此副作用之試劑可為抵消此等可溶性因子中之一或多者之試劑。在一個實施例中，抵消此等可溶性形式中之一或多者的試劑為抗體或其抗原結合片段。此類試劑之實例包括(但不限於)類固醇(例如皮質類固醇)、TNFα抑制劑及IL-6抑制劑。TNFα抑制劑之實例為抗TNFα抗體分子，諸如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab)、片段產品(pegol)及戈利木單抗(golimumab)。TNFα抑制劑之另一實例為融合蛋白，諸如依那西普(entanercept)。TNFα之小分子抑制劑包括 (但不限於)黃嘌呤衍生物(例如己酮可可鹼)及安非他酮。IL-6抑制劑之實例為抗IL-6抗體分子或抗IL-6受體抗體分子，諸如托西利單抗(toc)、薩瑞魯單抗(sarilumab)、艾思莫單抗(elsilimomab)、CNTO 328、ALD518/BMS-945429、CNTO 136、CPSI-2364、CDP6038、VX30、ARGX-109、FE301及FM101。在一個實施例中，抗IL-6抗體分子為托西利單抗。基於IL-1R之抑制劑的實例為阿那白滯素(anakinra)。
在一些實施例中，向個體投與皮質類固醇，尤其諸如甲潑尼龍、氫皮質酮。
在一些實施例中，向個體投與血管加壓劑，諸如去甲腎上腺素、多巴胺、苯腎上腺素、腎上腺素、血管加壓素或其組合。
在一實施例中，可向個體投與退熱劑。在一實施例中，可向個體投與鎮痛劑。
在一個實施例中，可向個體投與提高CAR表現細胞之活性或適合性的試劑。舉例而言，在一個實施例中，試劑可為抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子的試劑。在一些實施例中，調節或調控T細胞功能之分子為抑制分子。在一些實施例中，抑制分子(例如程式化死亡1(PD1))可降低CAR表現細胞建立免疫效應子反應之能力。抑制分子之實例包括PD1、PD-L1、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4及TGFR β。抑制例如藉由抑制DNA、RNA或蛋白質含量來調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子可使CAR表現細胞效能最佳。在實施例中，例如本文所述，試劑，例如抑制核酸，例如dsRNA，例如siRNA或shRNA；或例如抑制蛋白或系統，例如叢集規律性間隔之短回文重複序列(CRISPR)、轉錄活化因子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸內切酶(ZFN)可用於抑制調節 或調控(例如抑制)CAR表現細胞中之T細胞功能之分子的表現。在一實施例中，該試劑為shRNA。在一實施例中，抑制CAR表現細胞內之調節或調控(例如抑制)T細胞功能之試劑。在此等實施例中，抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現的dsRNA分子連接至編碼CAR之組分(例如全部組分)的核酸。在一實施例中，編碼抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現的dsRNA分子之核酸分子可操作地連接於啟動子，例如源自H1或U6之啟動子，使得抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現的dsRNA分子表現，例如表現於CAR表現細胞內。參看例如Tiscornia G.,「Development of Lentiviral Vectors Expressing siRNA,」第3章， Gene Transfer：Delivery and Expression of DNA and RNA (Friedmann及Rossi編).Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,USA,2007；Brummelkamp TR等人，(2002)Science 296：550-553；Miyagishi M等人，(2002)Nat.Biotechnol.19：497-500在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子呈現於包含編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸分子之相同載體(例如豆狀病毒載體)上。在此類實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子位於載體(例如豆狀病毒載體)上，編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸的5'或3'。編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子可在與編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸相同或不同之方向轉錄。在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子呈現於除包含編碼CAR之組分(例如全部組分)之核酸的載體以外之載體上。在一實施例中，編碼dsRNA分子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子短暫表現於CAR表現細胞內。在一實施例中，編碼dsRNA分 子(抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現)之核酸分子穩定整合至CAR表現細胞之基因組中。圖47描繪用於表現CAR之組分(例如全部組分)之載體的實例，其具有抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現的dsRNA分子。
下文提供適用於抑制調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子之表現的dsRNA分子之實例，其中調節或調控(例如抑制)T細胞功能之分子為PD-1。
下表16中提供PDCD1(PD1)RNAi劑之名稱(來源於其在小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2中之位置)，以及表示DNA序列的SEQ ID NO：280-327。有義(S)及反義(AS)序列在此表中皆以19mer及21mer序列形式呈現。亦應注意，位置(PoS，例如176)來源於小鼠PDCD1基因序列NM_008798.2中之位置編號。SEQ ID NO在對應於「有義19」SEQ ID NO：280-291；「有義21」SEQ ID NO：292-303；「反義21」SEQ ID NO：304-315；「反義19」SEQ ID NO：316-327的12個組中指示。
下表17中提供PDCD1(PD1)RNAi試劑之名稱(來源於其在人類PDCD1基因序列中之位置)，以及表示DNA序列之SEQ ID NO.323-370。有義(S)及反義(AS)序列以19mer及21mer序列形式呈現。SEQ ID NO在對應於「有義19」SEQ ID NO：328-339；「有義21」SEQ ID NO：340-351；「反義21」SEQ ID NO：352-363；「反義19」SEQ ID NO：364-375的12個組中指示。
在一個實施例中，抑制信號之抑制劑可為例如結合至抑制分子的抗體或抗體片段。舉例而言，試劑可為結合至PD1、PD-L1、PD-L2或CTLA4(例如伊派利單抗(ipilimumab)(亦稱作MDX-010及MDX-101，且作為Yervoy®出售；Bristol-Myers Squibb；曲美單抗(Tremelimumab)(IgG2單株抗體，獲自Pfizer，先前稱為替西單抗(ticilimumab)，CP-675,206)))的抗體或抗體片段。在一實施例中，試劑為結合至TIM3之抗體或抗體片段。在一實施例中，試劑為結合至LAG3之抗體或抗體片段。
PD-1為CD28受體家族之抑制成員，該受體家族亦包括CD28、CTLA-4、ICOS及BTLA。PD-1在經活化之B細胞、T細胞及骨髓細胞上表現(Agata等人1996 Int.Immunol 8：765-75)。PD-1之兩個配位體 PD-L1及PD-L2已展示在與PD-1結合時下調T細胞活化(Freeman等人，2000 J Exp Med 192：1027-34；Latchman等人2001 Nat Immunol 2：261-8；Carter等人2002 Eur J Immunol 32：634-43)。PD-L1在人類癌症中大量存在(Dong等人2003 J Mol Med 81：281-7；Blank等人2005 Cancer Immunol.Immunother 54：307-314；Konishi等人2004 Clin Cancer Res 10：5094)。免疫抑制可藉由抑制PD-1與PD-L1之局部相互作用來逆轉。PD-1、PD-L1及PD-L2之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所述之本發明之CAR組合使用。舉例而言，尼沃單抗(nivolumab)(亦稱作BMS-936558或MDX1106；Bristol-Myers Squibb)為完全人類IgG4單株抗體，其特異性阻斷PD-1。與PD-1特異性結合之尼沃單抗(純系5C4)及其他人類單株抗體揭示於US 8,008,449及WO2006/121168中。皮立珠單抗(Pidilizumab)(CT-011；Cure Tech)為結合至PD-1之人類化IgG1k單株抗體。皮立珠單抗及其他人類化抗-PD-1單株抗體揭示於WO2009/101611中。派立珠單抗(先前稱為拉立珠單抗(lambrolizumab)，且亦稱為MK03475；Merck)為結合至PD-1之人類化IgG4單株抗體。派立珠單抗及其他人類化抗-PD-1抗體揭示於US 8,354,509及WO2009/114335中。MEDI4736(Medimmune)為結合至PDL1且抑制配位體與PD1相互作用之人類單株抗體。MDPL3280A(Genentech/Roche)為結合至PD-L1之人類Fc最佳化IgG1單株抗體。MDPL3280A及其他針對PD-L1之人類單株抗體揭示於美國專利第7,943,743號及美國公開案第20120039906號中。其他抗PD-L1結合劑包括YW243.55.S70(重鏈及輕鏈可變區顯示於WO2010/077634中之SEQ ID NO 20及21中)及MDX-1 105(亦稱作BMS-936559，及例如WO2007/005874中所揭示之抗PD-L1結合劑)。AMP-224(B7-DCIg；Amplimmune；例如WO2010/027827及WO2011/066342中所揭示)為阻斷PD-1與B7-H1之間的相互作用之PD-L2 Fc融合可溶性受體。其他抗 PD-1抗體包括AMP 514(Amplimmune)，尤其例如US 8,609,089、US 2010028330及/或US 20120114649中所揭示之抗PD-1抗體。
TIM3(T細胞免疫球蛋白-3)尤其在IFN-g-分泌CD4+ T輔助因子1及CD8+ T細胞毒性1細胞中亦負調控T細胞功能，且在T細胞耗盡中起關鍵作用。抑制TIM3與其配位體(例如半乳糖凝集素-9(Gal9)、磷脂醯絲胺酸(PS)及HMGB1)之間的相互作用可提高免疫反應。TIM3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，靶向TIM3之抗體、抗體片段、小分子或肽抑制劑結合至TIM3之IgV結構域以抑制與其配位體的相互作用。抑制TIM3之抗體及肽揭示於WO2013/006490及US20100247521中。其他抗TIM3抗體包括RMT3-23之人類化型式(揭示於Ngiow等人，2011,Cancer Res,71：3540-3551中)及純系8B.2C12(揭示於Monney等人，2002,Nature,415：536-541中)。抑制TIM3及PD-1之雙特異性抗體揭示於US20130156774中。
在其他實施例中，提高CAR表現細胞活性之試劑為CEACAM抑制劑(例如CEACAM-1、CEACAM-3及/或CEACAM-5抑制劑)。在一個實施例中，CEACAM之抑制劑為抗CEACAM抗體分子。例示性抗CEACAM-1抗體描述於WO 2010/125571、WO 2013/082366、WO 2014/059251及WO 2014/022332中，例如單株抗體34B1、26H7及5F4；或其重組形式，例如US 2004/0047858、US 7,132,255及WO 99/052552中所述。在其他實施例中，抗CEACAM抗體結合至CEACAM-5，例如Zheng等人，PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii：e12529(DOI：10：1371/journal.pone.0021146)中所述，或與CEACAM-1及CEACAM-5交叉反應，例如WO 2013/054331及US 2014/0271618中所述。
不希望受理論束縛，咸信諸如CEACAM-1及CEACAM-5之癌胚抗 原細胞黏附分子(CEACAM)至少部分介導、抑制抗腫瘤免疫反應(參看例如Markel等人，J Immunol.2002年3月15日；168(6)：2803-10；Markel等人，J Immunol.2006年11月1日；177(9)：6062-71；Markel等人，Immunology.2009年2月；126(2)：186-200；Markel等人，Cancer Immunol Immunother.2010年2月；59(2)：215-30；Ortenberg等人，Mol Cancer Ther.2012年6月；11(6)：1300-10；Stern等人，J Immunol.2005年6月1日；174(11)：6692-701；Zheng等人，PLoS One.2010年9月2日；5(9).pii：e12529)。舉例而言，CEACAM-1已描述為TIM-3之異嗜性配位體且在TIM-3介導之T細胞耐受性及耗盡中起作用(參看例如WO 2014/022332；Huang等人，(2014)Nature doi：10.1038/nature13848)。在實施例中，CEACAM-1及TIM-3之共同阻斷已顯示提高異種移植結腸直腸癌模型中之抗腫瘤免疫反應(參看例如WO 2014/022332；Huang等人(2014)，上文所述)。在其他實施例中，共同阻斷CEACAM-1及PD-1降低T細胞耐受性，例如WO 2014/059251中所述。因此，CEACAM抑制劑可與本文所述之其他免疫調節劑(例如抗PD-1及/或抗TIM-3抑制劑)一起用於提高針對癌症之免疫反應，例如黑素瘤、肺癌(例如NSCLC)、膀胱癌、結腸癌、卵巢癌及如本文所述之其他癌症
LAG3(淋巴細胞活化基因-3或CD223)為在活化之T細胞及B細胞上表現之細胞表面分子，其已顯示在CD8+ T細胞耗盡中起作用。LAG3及其配位體之抗體、抗體片段及其他抑制劑在此項技術中可獲得且可與本文所述之CD19 CAR組合使用。舉例而言，BMS-986016(Bristol-Myers Squib)為靶向LAG3之單株抗體。IMP701(Immutep)為拮抗劑LAG3抗體且IMP731(Immutep及GlaxoSmithKline)為耗盡LAG3抗體。其他LAG3抑制劑包括IMP321(Immutep)，其為LAG3及Ig之可溶性部分的重組融合蛋白，其結合至II級MHC分子且活化抗原呈現細 胞(APC)。其他抗體揭示於例如WO2010/019570中。
在一些實施例中，提高CAR表現細胞活性之試劑可為例如包含第一結構域及第二結構域之融合蛋白，其中第一結構域為抑制分子或其片段，且第二結構域為與正信號有關之多肽，例如包含如本文所述之胞內信號傳導結構域的多肽。在一些實施例中，與正信號有關之多肽可包括CD28、CD27、ICOS之共同刺激結構域，例如CD28、CD27及/或ICOS之胞內信號傳導結構域，及/或例如本文所述之CD3 ζ的一級信號傳導結構域。在一個實施例中，融合蛋白由表現CAR之相同細胞表現。在另一實施例中，融合蛋白由例如不表現間皮素CAR之T細胞的細胞表現。
在一個實施例中，提高本文所述之CAR表現細胞活性之試劑為miR-17-92。
與低劑量之mTOR抑制劑組合
在一個實施例中，表現CAR分子(例如本文所述之CAR分子)的細胞與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑組合投與。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過90%，至少10%但不超過90%，至少15%但不超過90%，至少20%但不超過90%，至少30%但不超過90%，至少40%但不超過90%，至少50%但不超過90%，至少60%但不超過90%或至少70%但不超過90%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過80%，至少10%但不超過80%，至少15%但不超過80%，至少20%但不超過80%，至少30%但不超過80%，至少40%但不超過80%，至少50%但不超過80%，或至少60%但不超過80%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過70%，至少10%但不超過70%，至少15%但不超過70%，至少20%但不 超過70%，至少30%但不超過70%，至少40%但不超過70%，或至少50%但不超過70%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過60%，至少10%但不超過60%，至少15%但不超過60%，至少20%但不超過60%，至少30%但不超過60%，或至少40%但不超過60%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過50%，至少10%但不超過50%，至少15%但不超過50%，至少20%但不超過50%，至少30%但不超過50%，或至少40%但不超過50%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過40%，至少10%但不超過40%，至少15%但不超過40%，至少20%但不超過40%，至少30%但不超過40%，或至少35%但不超過40%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少5%但不超過30%，至少10%但不超過30%，至少15%但不超過30%，至少20%但不超過30%，或至少25%但不超過30%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過20%，至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過30%，至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過35%，至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過40%，或至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過45%之mTOR抑制。
在一實施例中，mTOR抑制劑之劑量關聯或提供至少1%、2%、3%、4%或5%但不超過90%之mTOR抑制。
如本文所論述，mTOR抑制程度可表示為P70 S6抑制程度，例如mTOR抑制程度可藉由P70 S6活性中降低之水準，例如藉由P70 S6受 質之磷酸化降低測定。mTOR抑制水準可藉由本文所述之方法來評估，例如Boulay分析法。
例示性MTOR抑制劑
如本文所用，術語「mTOR抑制劑」係指抑制細胞中之mTOR激酶的化合物或配位體或其醫藥學上可接受之鹽。在一實施例中，mTOR抑制劑為異位抑制劑。在一實施例中，mTOR抑制劑為催化抑制劑。
異位mTOR抑制劑包括中性三環化合物雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、與雷帕黴素相關之化合物，亦即具有與雷帕黴素類似的結構及功能之化合物，其包括例如雷帕黴素衍生物、雷帕黴素類似物(亦稱作雷帕羅吉)及抑制mTOR活性之其他巨環內酯化合物。
雷帕黴素為藉由具有式A中所示之結構的吸水鏈黴菌(Streptomyces hygroscopicus)產生的已知巨環內酯抗生素。
參看例如McAlpine,J.B.等人，J.Antibiotics(1991)44：688；Schreiber,S.L.等人，J.Am.Chem.Soc.(1991)113：7433；美國專利第3,929,992號。存在針對雷帕黴素提出之各種編號方案。為避免混淆， 當在本文中命名特異性雷帕黴素類似物時，該等名稱參考使用式A之編號方案的雷帕黴素。
適用於本發明中之雷帕黴素類似物為例如O取代之類似物，其中雷帕黴素之環己基環上之羥基經OR1置換，其中R1為羥基烷基、羥基烷氧基烷基、醯基胺基烷基或胺基烷基；例如RAD001，如US 5,665,772及WO94/09010中所描述，亦稱為依維莫司，其內容以引用的方式併入。其他適合雷帕黴素類似物包括在26或28位置處經取代之類似物。雷帕黴素類似物可為上述類似物之差向異構體，尤其在位置40、28或26經取代之類似物的差向異構體，且可視情況進一步經氫化，例如US 6,015,815、WO95/14023及WO99/15530中所述，其內容以引用的方式併入；例如US 7,091,213、WO98/02441及WO01/14387中所描述之ABT578，亦稱為佐他莫司或雷帕黴素類似物，其內容以引用的方式併入；例如AP23573，亦稱為地磷莫司。
適用於本發明之來自US 5,665,772之雷帕黴素類似物的實例包括(但不限於)40-O-苯甲基-雷帕黴素、40-O-(4'-羥基甲基)苯甲基-雷帕黴素、40-O-[4'-(1,2-二羥基乙基)]苯甲基-雷帕黴素、40-O-烯丙基-雷帕黴素、40-O-[3'-(2,2-二甲基-1,3-二氧戊環-4(S)-基)-丙-2'-烯-1'-基]-雷帕黴素、(2'E,4'S)-40-O-(4',5'-二羥基戊-2'-烯-1'-基)-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙氧羰基甲基-雷帕黴素、40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(3-羥基)丙基-雷帕黴素、40-O-(6-羥基)己基-雷帕黴素、40-O-[2-(2-羥基)乙氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-[(3S)-2,2-二甲基二氧戊環-3-基]甲基-雷帕黴素、40-O-[(2S)-2,3-二羥基丙-1-基]-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯基氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-嗎啉基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、40-O-(2-N-咪唑基乙醯氧基)乙基-雷帕黴素、40-O-[2-(N-甲基-N'-哌嗪基)乙醯氧基]乙基-雷帕黴素、39-O-去甲基-39,40-O,O-伸乙基-雷帕黴素、(26R)-26-二 氫-40-O-(2-羥基)乙基-雷帕黴素、40-O-(2-胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-菸鹼醯胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-(N-甲基-咪唑并-2'-基乙氧羰胺基)乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-乙氧基甲醯基胺基乙基)-雷帕黴素、40-O-(2-甲苯基磺醯胺基乙基)-雷帕黴素及40-O-[2-(4',5'-二乙氧羰基-1',2',3'-三唑-1'-基)-乙基]-雷帕黴素。
已知適用於本發明之其他雷帕黴素類似物為雷帕黴素之環己基環上之羥基及/或在28位置處之羥基經羥基酯基置換的類似物，例如見於US RE44,768中之雷帕黴素類似物，例如坦羅莫司(temsirolimus)。
適用於本發明之其他雷帕黴素類似物包括彼等類似物：其中在16位置處之甲氧基經較佳為(視情況經羥基取代之)炔基氧基、苯甲基、鄰甲氧基苯甲基或氯苯甲基之另一取代基置換，及/或其中39位置處之甲氧基連同39碳一起缺失使得雷帕黴素之環己基環變為缺少39位置甲基氧基之環戊基環；該等類似物如例如WO95/16691及WO96/41807中所描述，其內容以引用的方式併入。類似物可進一步經修飾以使得雷帕黴素之40位置處之羥基經烷基化及/或32-羰基減少。
來自WO95/16691之雷帕黴素類似物包括(但不限於)16-去甲氧基-16-(戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(炔丙基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-(4-羥基-丁-2-炔基)氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-苯甲氧基-雷帕黴素、16-去甲氧基-16-鄰-甲氧基苯甲基-雷帕黴素、16-去甲氧基-40-O-(2-甲氧基乙基)-16-戊-2-炔基)氧基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羥基甲基-42-去 甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-羧基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(4-甲基-哌嗪-1-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-(嗎啉-4-基)羰基-42-去甲基-雷帕黴素、39-去甲氧基-40-去氧基-39-[N-甲基,N-(2-吡啶-2-基-乙基)]胺甲醯基-42-去甲基-雷帕黴素及39-去甲氧基-40-去氧基-39-(對甲苯磺醯基亞肼基甲基)-42-去甲基-雷帕黴素。
來自WO96/41807之雷帕黴素類似物包括(但不限於)32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-脫氧-40-O-(2-羥基-乙基)-雷帕黴素、16-O-戊-2-炔基-32-(S)-二氫-40-O-(2-羥乙基)-雷帕黴素、32(S)-二氫-40-O-(2-甲氧基)乙基-雷帕黴素及32(S)-二氫-40-O-(2-羥基乙基)-雷帕黴素。
另一適合雷帕黴素類似物為如US2005/0101624中所述之烏米莫司(umirolimus)，其內容以引用的方式併入。
RAD001另外稱為依維莫司(everolimus)(Afinitor®)，其具有化學名稱(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羥基-12-{(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-(2-羥基乙氧基)-3-甲氧基環己基]-1-甲基乙基}-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧雜-4-氮雜-三環[30.3.1.04,9]六(三十烷)-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮。
異位mTOR抑制劑之其他實例包括西羅莫司(雷帕黴素，AY-22989)、40-[3-羥基-2-(羥基甲基)-2-甲基丙酸酯]-雷帕黴素(亦稱為坦羅莫司或CCI-779)及地磷莫司(AP-23573/MK-8669)。異位mTor抑制劑之其他實例包括佐他莫司(ABT578)及烏米莫司。
或者或另外，已發現催化ATP-競爭性mTOR抑制劑直接靶向mTOR激酶結構域且靶向mTORC1及mTORC2兩者。此等相較於諸如雷帕黴素之異位mTOR抑制劑亦為mTORC1之更有效抑制劑，因為其 調節耐雷帕黴素mTORC1輸出，諸如4EBP1-T37/46磷酸化及封端依賴性轉譯。
催化抑制劑包括：BEZ235或2-甲基-2-[4-(3-甲基-2-側氧基-8-喹啉-3-基-2,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基)-苯基]-丙腈，或單甲苯磺酸鹽形式。BEZ235之合成描述於WO2006/122806中；CCG168(另外稱為AZD-8055，Chresta,C.M.等人，Cancer Res,2010,70(1),288-298)，其具有化學名稱{5-[2,4-雙-((S)-3-甲基-嗎啉-4-基)-吡啶并[2,3d]嘧啶-7-基]-2-甲氧基-苯基}}-甲醇；3-[2,4-雙[(3S)-3-甲基嗎啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基]-N-甲基苯甲醯胺(WO09104019)；3-(2-胺基苯并[d]噁唑-5-基)-1-異丙基-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-胺(WO10051043及WO2013023184)；A N-(3-(N-(3-((3,5-二甲氧基苯基)胺基)喹喏啉-2-基)胺磺醯基)苯基)-3-甲氧基-4-甲基苯甲醯胺(WO07044729及WO12006552)；PKI-587(Venkatesan,A.M.,J.Med.Chem.,2010,53,2636-2645)，其具有化學名稱1-[4-[4-(二甲基胺基)哌啶-1-羰基]苯基]-3-[4-(4,6-二(N-嗎啉基)-1,3,5-三嗪-2-基)苯基]脲；GSK-2126458(ACS Med.Chem.Lett.,2010,1,39-43)，其具有化學名稱2,4-二氟-N-{2-甲氧基-5-[4-(4-噠嗪基)-6-喹啉基]-3-吡啶基}苯磺醯胺；5-(9-異丙基-8-甲基-2-(N-嗎啉基)-9H-嘌呤-6-基)嘧啶-2-胺(WO10114484)；(E)-N-(8-(6-胺基-5-(三氟甲基)吡啶-3-基)-1-(6-(2-氰基丙-2-基)吡啶-3-基)-3-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2(3H)-亞基)氰胺(WO12007926)。
催化mTOR抑制劑之其他實例包括8-(6-甲氧基-吡啶-3-基)-3-甲基-1-(4-哌嗪-1-基-3-三氟甲基-苯基)-1,3-二氫-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮(WO2006/122806)及Ku-0063794(Garcia-Martinez JM等人，Biochem J.,2009,421(1),29-42.。Ku-0063794為雷帕黴素之哺乳動物目標的特異性抑制劑(mTOR)。)WYE-354為催化mTOR抑制劑之另一實例(Yu K等人，(2009).Biochemical,Cellular,and In vivo Activity of Novel ATP- Competitive and Selective Inhibitors of the Mammalian Target of Rapamycin.Cancer Res.69(15)：6232-6240)。
根據本發明適用的mTOR抑制劑亦包括其前藥、衍生物、醫藥學上可接受之鹽或前述中之任一者之類似物。
基於此項技術中公認的方法，基於本文所述之特定劑量，諸如RAD001之mTOR抑制劑可經調配以便於傳遞。詳言之，美國專利6,004,973(以引用的方式併入本文中)提供可與本文所述之mTOR抑制劑一起使用的調配物之實例。
MTOR抑制劑之評估
mTOR使激酶P70 S6磷酸化，從而活化P70 S6K激酶且允許其使其受質磷酸化。mTOR抑制程度可表示為P70 S6激酶抑制程度，例如mTOR抑制程度可藉由P70 S6激酶活性之降低水準，例如藉由P70 S6激酶受質之磷酸化降低測定。吾人可在無抑制劑存在下(例如在投與抑制劑之前)及在抑制劑存在下(或在投與抑制劑之後)，藉由量測P70 S6激酶活性(P70 S6激酶使受質磷酸化之能力)來測定mTOR抑制水準。P70 S6激酶抑制之水準提供mTOR抑制水準。因此，若P70 S6激酶抑制40%，則如藉由P70 S6激酶活性所量測之mTOR活性抑制40%。本文所提及之抑制程度或水準為在給藥間隔期間之平均抑制水準。舉例而言，若抑制劑每週給予一次，則藉由在間隔期間(亦即一週)之平均抑制水準提供抑制水準。
以引用的方式併入本文中之Boulay等人，Cancer Res,2004,64：252-61教示可用於評定mTOR抑制水準之分析法(在本文中稱為Boulay分析法)。在一實施例中，分析法依賴於在投與mTOR抑制劑(例如RAD001)之前及之後自生物樣品量測P70 S6激酶活性。可在用mTOR抑制劑處理之後的預選時間取樣，例如在處理24、48及72小時之後。可使用例如來自皮膚或周邊血液單核細胞(PBMC)之生物樣 品。自樣品製備總蛋白質萃取物。使用特異性識別P70 S6激酶之抗體，藉由免疫沈澱將P70 S6激酶與蛋白質萃取物分離。經分離之P70 S6激酶之活性可以活體外激酶分析法量測。可用40S核糖體子單元受質(其為P70 S6激酶之內源性受質)及γ32P在允許受質磷酸化之條件下培育經分離之激酶。隨後可使反應混合物在SDS-PAGE凝膠上解析且使用磷光成像儀(PhosphorImager)分析32P信號。與40S核糖體子單元尺寸相對應之32P信號指示磷酸化受質及P70 S6激酶活性。激酶活性之提高及降低可藉由定量磷酸化受質之32P信號之區域及強度(例如使用ImageQuant,Molecular Dynamics)，向定量信號分配任意單元值且將投與後的值與投與之前的值或參考值比較來計算。舉例而言，可使用下式計算激酶活性抑制百分比：1-(投與後獲得之值/投與之前獲得之值)×100。如上文所述，本文所提及之抑制程度或水準為劑量間隔的平均抑制水準。
用於評估例如P70 S6激酶活性之激酶活性的方法亦提供於US 7,727,950中，其以引用的方式併入本文中。
mTOR抑制水準亦可藉由PD1陰性T細胞與PD1陽性T細胞之比率變化來評估。可藉由此項技術中已知之方法鑑別來自周邊血液之T細胞為PD1陰性或陽性。
低劑量mTOR抑制劑
本文所述之方法使用低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，劑量之mTOR抑制劑，例如異位mTOR抑制劑，包括雷帕羅吉，諸如RAD001。相比而言，完全或幾乎完全抑制mTOR路徑之抑制劑水準為免疫抑制且用於例如預防器官移植排斥反應。此外，完全抑制mTOR之高劑量之雷帕羅吉亦抑制腫瘤細胞生長且用於治療多種癌症(參看例如Antineoplastic effects of mammalian target of rapamycine inhibitors.Salvadori M.World J Transplant.2012年10月24日；2(5)：74- 83；Current and Future Treatment Strategies for Patients with Advanced Hepatocellular Carcinoma：Role of mTOR Inhibition.Finn RS.Liver Cancer.2012年11月；1(3-4)：247-256；Emerging Signaling Pathways in Hepatocellular Carcinoma.Moeini A,Cornellà H,Villanueva A.Liver Cancer.2012年9月；1(2)：83-93；Targeted cancer therapy-Are the days of systemic chemotherapy numbered？Joo WD,Visintin I,Mor G.Maturitas.2013年9月20日.；Role of natural and adaptive immunity in renal cell carcinoma response to VEGFR-TKIs and mTOR inhibitor.Santoni M,Berardi R,Amantini C,Burattini L,Santini D,Santoni G,Cascinu S.Int J Cancer.2013年10月2日)。
本發明至少部分基於以下出人意料的發現：遠低於當前臨床環境中所使用劑量之mTOR抑制劑劑量對於提高個體中之免疫反應及提高PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率具有優良的作用。出人意料地，僅產生mTOR活性部分抑制之低劑量之mTOR抑制劑能夠有效地改良人類個體中之免疫反應且提高PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率。
或者或另外，不希望受任何理論束縛，咸信低劑量、低免疫增強劑量之mTOR抑制劑例如相較於未經治療之個體可增加(例如至少短暫增加)原生T細胞數目。或者或另外，再次雖然不希望受理論束縛，但咸信在用mTOR抑制劑治療足夠時間量或足夠給藥之後產生以下中之一或多者：例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上以下標記物中之一或多者之表現增加：CD62L高、CD127高、CD27+及BCL2；例如在例如記憶T細胞前體細胞之記憶T細胞上KLRG1表現減少；及記憶T細胞前體細胞之數目增加，該等細胞例如具有以下特徵中 之任一者或組合之細胞：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及BCL2增加；且其中例如相比於未經治療之個體，上文所述之變化中之任一者例如至少短暫出現(Araki,K等人(2009)Nature 460：108-112)。記憶T細胞前體細胞為分化程序早期之記憶T細胞。舉例而言，記憶T細胞具有以下特徵中之一或多者：CD62L高增加、CD127高增加、CD27+增加、KLRG1降低及/或BCL2增加。
在一實施例中，本發明係關於mTOR抑制劑之組合物或劑型，該mTOR抑制劑例如異位mTOR抑制劑(例如雷帕羅吉、雷帕黴素或RAD001)或催化mTOR抑制劑，當按所選給藥方案例如每日一次或每週一次投與mTOR抑制劑時，其與以下有關：與完全或顯著免疫抑制無關但與免疫反應增強有關之mTOR抑制水準。
mTOR抑制劑，例如異位mTOR抑制劑(例如雷帕羅吉、雷帕黴素或RAD001)或催化mTOR抑制劑，可提供於持續釋放調配物中。本文所述之組合物或單位劑型中之任一者可提供於持續釋放調配物中。在一些實施例中，與立即釋放調配物相比，持續釋放調配物將具有較低生物可用性。例如，在實施例中，為了獲得與立即釋放調配物類似的治療作用，持續釋放調配物將具有約2倍至約5倍、約2.5倍至約3.5倍或約3倍立即釋放調配物中所提供之抑制劑的量。
在一實施例中，提供通常用於每週投與一次，每單位劑型具有0.1至20、0.5至10、2.5至7.5、3至6或約5mg的例如RAD001之立即釋放形式。對於每週一次投與，此等立即釋放調配物對應於分別具有0.3至60、1.5至30、7.5至22.5、9至18或約15mg mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)的持續釋放形式。在實施例中，兩種形式皆以每週一次基礎投與。
在一實施例中，提供通常用於每日一次投與，每單位劑型具有 0.005至1.5、0.01至1.5、0.1至1.5、0.2至1.5、0.3至1.5、0.4至1.5、0.5至1.5、0.6至1.5、0.7至1.5、0.8至1.5、1.0至1.5、0.3至0.6或約0.5mg的例如RAD001之立即釋放形式。對於每日一次投與，此等立即釋放形式對應於分別具有0.015至4.5、0.03至4.5、0.3至4.5、0.6至4.5、0.9至4.5、1.2至4.5、1.5至4.5、1.8至4.5、2.1至4.5、2.4至4.5、3.0至4.5、0.9至1.8或約1.5mg mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)的持續釋放形式。對於每週一次投與，此等立即釋放形式對應於分別具有0.1至30、0.2至30、2至30、4至30、6至30、8至30、10至30、1.2至30、14至30、16至30、20至30、6至12或約10mg mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)之持續釋放形式。
在一實施例中，提供通常用於每日一次投與，每單位劑型具有0.01mg至1.0mg的例如RAD001之立即釋放形式。對於每日一次投與，此等立即釋放形式對應於分別具有0.03mg至3mg之mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)的持續釋放形式。對於每週一次投與，此等立即釋放形式對應於分別具有0.2mg至20mg之mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)的持續釋放形式。
在一實施例中，提供通常用於每週一次投與，每單位劑型具有0.5mg至5.0mg之例如RAD001之立即釋放形式。對於每週一次投與，此等立即釋放形式對應於分別具有1.5mg至15mg之mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑，例如雷帕黴素或RAD001)的持續釋放形式。
如上文所述，mTOR路徑之一個目標為P70 S6激酶。因此，適用於本文所述之方法及組合物之mTOR抑制劑之劑量為足以實現相對於無mTOR抑制劑存在下之P70 S6激酶活性，P70 S6激酶活性抑制不超過80%之彼等劑量，如例如藉由本文所述之分析法，例如Boulay分析 法量測。在另一態樣中，本發明提供足以實現相對於無mTOR抑制劑存在下之P70 S6激酶活性，不超過38% P70 S6激酶活性抑制之量的mTOR抑制劑。
在一個態樣中，例如如藉由本文所述之分析法，例如Boulay分析法量測，適用於本發明之方法及組合物的mTOR抑制劑之劑量例如當向人類個體投與時足以實現90+/-5%(亦即85-95%)、89+/-5%、88+/-5%、87+/-5%、86+/-5%、85+/-5%、84+/-5%、83+/-5%、82+/-5%、81+/-5%、80+/-5%、79+/-5%、78+/-5%、77+/-5%、76+/-5%、75+/-5%、74+/-5%、73+/-5%、72+/-5%、71+/-5%、70+/-5%、69+/-5%、68+/-5%、67+/-5%、66+/-5%、65+/-5%、64+/-5%、63+/-5%、62+/-5%、61+/-5%、60+/-5%、59+/-5%、58+/-5%、57+/-5%、56+/-5%、55+/-5%、54+/-5%、54+/-5%、53+/-5%、52+/-5%、51+/-5%、50+/-5%、49+/-5%、48+/-5%、47+/-5%、46+/-5%、45+/-5%、44+/-5%、43+/-5%、42+/-5%、41+/-5%、40+/-5%、39+/-5%、38+/-5%、37+/-5%、36+/-5%、35+/-5%、34+/-5%、33+/-5%、32+/-5%、31+/-5%、30+/-5%、29+/-5%、28+/-5%、27+/-5%、26+/-5%、25+/-5%、24+/-5%、23+/-5%、22+/-5%、21+/-5%、20+/-5%、19+/-5%、18+/-5%、17+/-5%、16+/-5%、15+/-5%、14+/-5%、13+/-5%、12+/-5%、11+/-5%或10+/-5% P70 S6激酶活性抑制。
個體中之P70 S6激酶活性可使用此項技術中已知之方法量測，諸如根據美國專利7,727,950中所述之方法，藉由磷酸P70 S6K含量及/或磷酸P70 S6含量之免疫墨點分析或藉由活體外激酶活性分析法量測。
如本文所用，關於mTOR抑制劑之劑量，術語「約」係指高達+/-10%之mTOR抑制劑之量的變化，但可不包括關於所述劑量的變化。
在一些實施例中，本發明提供包含向個體投與目標最低含量內之劑量的mTOR抑制劑，例如異位抑制劑，例如RAD001之方法。在 一些實施例中，最低含量顯著低於與用於器官移植及癌症患者之給藥方案有關的最低含量。在一實施例中，投與mTOR抑制劑(例如RAD001或雷帕黴素)導致為產生免疫抑制或抗癌作用之最低含量的½、1/4、1/10或1/20之最低含量。在一實施例中，投與例如RAD001或雷帕黴素之mTOR抑制劑以產生一最低含量，該最低含量低於用於免疫抑制或抗癌指示之FDA批准包裝插頁上所提供之最低含量的½、1/4、1/10或1/20。
在一實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.1至10ng/ml、0.1至5ng/ml、0.1至3ng/ml、0.1至2ng/ml或0.1至1ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)。
在一實施例中本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.2至10ng/ml、0.2至5ng/ml、0.2至3ng/ml、0.2至2ng/ml或0.2至1ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)
在一實施例中本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.3至10ng/ml、0.3至5ng/ml、0.3至3ng/ml、0.3至2ng/ml或0.3至1ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)。
在一實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.4至10ng/ml、0.4至5ng/ml、0.4至3ng/ml、0.4至2ng/ml或0.4至1ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)。
在一實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供0.5至10ng/ml、0.5至5ng/ml、0.5至3ng/ml、0.5至2ng/ml或0.5至1ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)。
在一實施例中，本文所揭示之方法包含向個體投與提供1至10ng/ml、1至5ng/ml、1至3ng/ml或1至2ng/ml之目標最低含量之劑量的mTOR抑制劑(例如異位抑制劑，例如RAD001)。
如本文所用，術語「最低含量」係指在即將下一次給藥之前血 漿中之藥物濃度或兩次給藥之間的最小藥物濃度。
在一些實施例中，RAD001之目標最低含量在約0.1ng/ml至4.9ng/ml之間的範圍內。在一實施例中，目標最低含量低於3ng/ml，例如在0.3ng/ml或以下至3ng/ml。在一實施例中，目標最低含量低於3ng/ml，例如為0.3ng/ml或以下至1ng/ml。
在另一態樣中，本發明可利用除RAD001以外之mTOR抑制劑，其為與生物等效於針對RAD001所規定之目標最低含量之目標最低含量有關的量。在一實施例中，除RAD001以外之mTOR抑制劑之目標最低含量為與本文所述之RAD001之最低含量提供相同水準之mTOR抑制(如例如藉由本文所述之方法所量測，例如P70 S6K抑制)的含量。
醫藥組合物：mTOR抑制劑
在一個態樣中，本發明係關於醫藥組合物，其包含mTOR抑制劑，例如如本文所述之mTOR抑制劑，其經調配用於與本文所述之CAR細胞組合。
在一些實施例中，mTOR抑制劑經調配以與額外(例如本文所述)組合投與。
一般而言，本發明化合物將以如上文所述之治療有效量經此項技術中已知的任何常見及可接受模式(單獨或與一或多種治療劑組合)投與。
可使用習知溶解及混合程序來製備醫藥調配物。舉例而言，將主體原料藥(例如mTOR抑制劑或穩定形式之化合物(例如與環糊精衍生物或其他已知複合劑複合))在本文所述之一或多種賦形劑存在下，溶解於適合溶劑中。mTOR抑制劑通常調配成醫藥劑型，以提供容易控制劑量之藥物且為患者提供美觀且容易操作的產品。
本發明之化合物可呈醫藥組合物形式藉由任何習知途徑投與： 詳言之經腸，例如經口，例如以錠劑或膠囊形式；或非經腸，例如以可注射溶液或懸浮液之形式；局部地，例如以洗劑、凝膠、軟膏或乳膏之形式；或以經鼻或栓劑之形式投與。若mTOR抑制劑與如本文所述之另一試劑組合(同時或分別地)投與，則在一個態樣中，兩種組分可藉由相同途徑(例如非經腸)投與。或者，可藉由與mTOR抑制劑不同的途徑投與另一藥劑。舉例而言，可經口投與mTOR抑制劑且可非經腸投與另一藥劑。
持續釋放
本文所揭示之mTOR抑制劑(例如異位mTOR抑制劑或催化mTOR抑制劑)可呈包含本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的經口固體劑型形式作為醫藥調配物提供，該等固體劑型滿足產品穩定性要求及/或具有優於立即釋放(IR)錠劑的有利藥物動力學特性，諸如降低平均血漿峰值濃度，降低藥物吸收程度及血漿峰值濃度的患者間及患者內變化性，降低Cmax/Cmin比率及/或降低食物影響性。所提供之醫藥調配物可允許更精確劑量調整及/或減少不良事件頻率，因此向使用本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的患者提供較安全治療。
在一些實施例中，本發明提供本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的穩定延長釋放調配物，其為多顆粒系統且可具有功能層及包衣。
如本文所用之術語「延長釋放多顆粒調配物」係指能夠經延長時間段(例如經至少1、2、3、4、5或6小時)釋放本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的調配物。延長釋放調配物可含有基質及由例如如本文所述之特殊賦形劑製成的包衣，其以使得在攝取之後的延長時間段期間可獲得活性成份的方式調配。
術語「延長釋放(extended release)」可與術語「持續釋放」(SR) 或「延長釋放(prolonged release)」互換使用。根據pharmacopoeias Ph.Eur.(第7版)mongraph for tablets and capsules and USP general chapter<1151>for pharmaceutical dosage forms中之定義，術語「延長釋放」係關於在經口給藥之後並未立即而是在延長期間釋放活性原料藥的醫藥調配物。根據「Guidance for Industry：「Dissolution Testing of Immediate Release Solid Oral Dosage Forms」(FDA CDER,1997)之定義，如本文所用之術語「立即釋放」(IR)係指醫藥調配物在少於60分鐘內釋放85%之活性原料藥。在一些實施例中，術語「立即釋放」意謂例如如本文所述之溶解分析法中所量測，在30分鐘之時間內自錠劑釋放依維莫司。
本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的穩定延長釋放調配物特徵可為使用此項技術中已知之分析法(諸如如本文所述之溶解分析法)的活體外釋放曲線：在37℃下用900mL含有0.2%十二烷基硫酸鈉之磷酸鹽緩衝液pH 6.8填充溶解容器，且根據USP，分別藉由根據USP testing monograph 711及Ph.Eur.testing monograph 2.9.3.使用攪拌槳法在75rpm下進行溶解。
在一些實施例中，本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的穩定延長釋放調配物根據以下釋放規格在活體外釋放分析法中釋放mTOR抑制劑：0.5h：<45%，或<40，例如<30%
1h：20-80%，例如30-60%
2h：>50%，或>70%，例如>75%
3h：>60%，或>65%，例如>85%，例如>90%。
在一些實施例中，本文所揭示之mTOR抑制劑(例如雷帕黴素或RAD001)的穩定延長釋放調配物在活體外溶解分析法中不早於45min、60min、75min、90min、105min或120min釋放50%之mTOR 抑制劑。
醫藥組合物及治療
本發明之醫藥組合物可包含CAR表現細胞(例如複數種如本文所述之CAR表現細胞)與一或多種醫藥學上或生理學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑的組合。此類組合物可包含緩衝劑，諸如中性緩衝生理食鹽水、磷酸鹽緩衝生理食鹽水及其類似物；碳水化合物，諸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露糖醇；蛋白質；多肽或胺基酸，諸如甘胺酸；抗氧化劑；螯合劑，諸如EDTA或麩胱甘肽；佐劑(例如氫氧化鋁)；及防腐劑。在一個態樣中，本發明之組合物調配用於靜脈內投與。
本發明之醫藥組合物可以適於待治療(或預防)疾病之方式投與。儘管可藉由臨床試驗確定適當劑量，但投與量及頻率將由諸如以下之因素決定：患者之條件，及患者之疾病的類型及嚴重程度。
在一個實施例中，醫藥組合物實質上不含，例如不存在可偵測含量的例如選自由以下組成之群的污染物：內毒素、黴漿菌、複製勝任型慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、殘餘抗CD3/抗CD28塗佈之珠粒、小鼠抗體、彙聚人類血清、牛血清白蛋白、牛血清、培養基組分、載體包裝細胞或質體組分、細菌及真菌。在一個實施例中，細菌為選自由以下組成之群的至少一者：糞產鹼桿菌(Alcaligenes faecalis)、白色念珠菌(Candida albicans)、大腸桿菌、流行性嗜血桿菌(Haemophilus influenza)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitides)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)及A群化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes group A)。
當指示「免疫有效量」、「抗癌有效量」、「癌症抑制有效量」或「治療量」時，待投與之本發明之組合物的精確量可由醫師考慮個體 之年齡、體重、腫瘤尺寸、感染或癌轉移程度及患者(個體)條件的差異來決定。通常可規定包含本文所述之免疫效應細胞之醫藥組合物可以104至109個細胞/公斤體重，在一些情況下105至106個細胞/公斤體重(包括彼等範圍內之全部整數值)之劑量投與。免疫效應細胞組合物亦可以此等劑量多次投與。細胞可藉由使用免疫療法中通常已知之輸注技術投與(參看例如Rosenberg等人，New Eng.J.of Med.319：1676,1988)。
在某些態樣中，可能需要向個體投與活化免疫效應細胞，隨後重新抽血(或進行清除術)，根據本發明自其活化細胞，及用此等經活化及擴展之細胞重新輸注患者。此過程可每幾週進行多次。在某些態樣中，細胞可自抽出的10cc至400cc血液活化。在某些態樣中，細胞自抽取的20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc血液活化。
可以任何適宜方式投與標的組合物，包括藉由氣霧劑吸入、注射、攝入、輸注、植入或移植。可藉由反式動脈內、皮下、皮內、瘤內、結節內、髓內、肌肉內、靜脈內(i.v.)注射或腹膜內向患者投與本文所述之組合物。在一個態樣中，藉由皮內或皮下注射向患者投與本發明之T細胞組合物。在一個態樣中，藉由靜脈內注射投與本發明之免疫效應細胞組合物。免疫效應細胞之組合物可直接注射至腫瘤、淋巴結或感染部位。
在一特定例示性態樣中，個體可經歷白細胞去除術，其中將白細胞收集、增濃或離體耗盡以選擇及/或分離所關注細胞，例如T細胞。此等T細胞分離物可藉由此項技術中已知之方法擴展及處理，使得可引入一或多種本發明之CAR構築體，藉此產生本發明之CAR T細胞。有需要之個體可隨後經歷使用高劑量化學療法繼之以周邊血液幹細胞移植的標準治療。在某些態樣中，在移植之後或同時，個體接受 本發明之經擴展CAR T細胞輸注。在另一態樣中，在手術之前或之後投與經擴展細胞。
上述待向患者投與的治療之劑量將隨所治療之準確病狀性質及治療接受者而變化。可根據此項技術中接受之實踐對用於人類投與之劑量按比例調整。CAMPATH之劑量例如對成年患者而言將在1至約100mg範圍內，通常每日投與持續1至30天之時間。較佳每日劑量為每日1至10mg，然而在一些情況下，可使用高達每日40mg之較大劑量(描述於美國專利第6,120,766號中)。
在一個實施例中，CAR例如使用活體外轉錄引入免疫效應細胞中，且個體(例如人類)接受本發明之CAR表現細胞的初始投與，及一或多次本發明之CAR表現細胞的隨後投與，其中一或多次隨後投與在前一次投與之後小於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。在一個實施例中，每週向個體(例如人類)投與本發明之CAR表現細胞的一次以上投與，例如每週投與2、3或4次本發明之CAR表現細胞的投與。在一個實施例中，個體(例如人類個體)每週接受一次以上CAR表現細胞投與(例如每週2、3或4次投與)(在本文中亦稱為週期)，隨後一週不投與CAR表現細胞，接著向個體投與一或多次額外投與CAR表現細胞(例如每週一次以上CAR表現細胞投與)。在另一實施例中，個體(例如人類個體)接受一個以上CAR表現細胞週期，且各週期之間的時間為小於10、9、8、7、6、5、4或3天。在一個實施例中，每隔一天投與CAR表現細胞，每週3次投與。在一個實施例中，投與本發明之CAR表現細胞持續至少兩週、三週、四週、五週、六週、七週、八週或八週以上。
在一個態樣中，使用慢病毒載體(諸如慢病毒)產生間皮素CAR表現細胞。彼方式產生之CAR表現細胞將具有穩定CAR表現。
在一個態樣中，在轉導後，CAR表現細胞短暫表現CAR載體持續 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15天。可藉由RNA CAR載體傳遞實現CAR短暫表現。在一個態樣中，藉由電穿孔將CAR RNA轉導至T細胞中。
在一個實施例中，劑量及/或給藥時程為圖6中所提供者。
使用短暫表現CAR表現細胞(特定言之使用攜帶鼠類scFv之CAR表現細胞)治療之患者中可能產生的潛在問題為多次治療後的全身性過敏反應。
不受此理論束縛，咸信此類過敏性反應可由產生體液抗CAR反應(亦即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。當存在十天至十四天抗原暴露中斷時，認為患者之抗體製造細胞經歷IgG同型(不引起全身性過敏反應)至IgE同型的類別轉換。
若患者在短暫CAR療法過程中處於產生抗CAR抗體反應(諸如由RNA轉導產生者)之高風險中，則CAR表現細胞輸注中斷不應持續超過十天至十四天。
使用具有人類(而非鼠類)scFv之CAR可降低具有抗CAR反應之患者的可能性及強度。
實例
參考以下實驗性實例，進一步詳細描述本發明。除非另外規定，否則提供此等實例僅出於說明的目的，且不欲限制。因此，本發明決不應解釋為限於以下實例，但確切而言應解釋為涵蓋由於本文所提供之教示而變得明顯的任何及所有變體。
實例1：產生CAR構築體
待用於最終CAR構築體之ScFv來源於人類scFV文庫淘選。
人類scFv片段之胺基酸序列提供於上文表2中且人類scFv片段之核酸序列提供於上文表3中。完全CAR構築體使用表2之scFv片段與下文所示之額外序列SEQ ID NO：1-2、6-7、9-10、12-13、17-18、20-21及36-37產生，產生完全CAR構築體。
●前導序列(胺基酸序列)(SEQ ID NO：1)MALPVTALLLPLALLLHAARP
●前導序列(核酸序列)(SEQ ID NO：12)ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC
●CD8鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：2)TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
●CD8鉸鏈(核酸序列)(SEQ ID NO：13)
● 跨膜(胺基酸序列)(SEQ ID NO：6)IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
●CD8跨膜(核酸序列)(SEQ ID NO：17)
●ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT4-1BB胞內域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：7) KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
●4-1BB胞內域(核酸序列)(SEQ ID NO：18)
● ζ結構域(胺基酸序列)(SEQ ID NO：9)
●CD3 ζ(核酸序列)(SEQ ID NO：20)
● ζ結構域(胺基酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)(SEQ ID NO：10)
●CD3 ζ(核酸序列；NCBI參考序列NM_000734.3)；(SEQ ID NO：21)
●IgG4鉸鏈(胺基酸序列)(SEQ ID NO：36)
●IgG4鉸鏈(核苷酸序列)(SEQ ID NO：37)
此等純系在來源於CD3ζ鏈之共同刺激結構域的信號結構域中均含有Q/K殘基變化。
CAR scFv片段接著選殖至慢病毒載體中，在單個編碼框架中形成全長CAR構築體，且使用EF1 α啟動子進行表現(SEQ ID NO：11)。
EF1 α啟動子 (SEQ ID NO：11)。
Gly/Ser(SEQ ID NO：25)GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO：26)：此序列可涵蓋1-6「Gly Gly Gly Gly Ser」重複單元GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO：27)GGGGSGGGGS GGGGSGGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO：28)GGGGSGGGGS GGGGS
Gly/Ser(SEQ ID NO：29)GGGS
聚A(SEQ ID NO：30)
此序列可涵蓋50-5000個腺嘌呤。
聚A(SEQ ID NO：31)
聚A(SEQ ID NO：32)
此序列可涵蓋50-5000個胸腺嘧啶。
聚A(SEQ ID NO：33)
此序列可涵蓋100-5000個腺嘌呤。
聚A(SEQ ID NO：34)
聚A(SEQ ID NO：35)
Gly/Ser(SEQ ID NO：38)：此序列可涵蓋1-10個「Gly Gly Gly Ser」重複單元GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS GGGSGGGSGG GSGGGSGGGS
實例2：用於CAR療法的人類抗間皮素scFv構築體之表現及表徵
進行額外分析以表徵人類抗間皮素scFv構築體，例如質譜分析、尺寸排阻層析及表面電漿子共振(SPR)。藉由SPR測定間皮素之胞外域上的結合親和力及抗原決定基結合(相較於SS1抗原決定基)。下文描述此分析之分析法及結果。
表現scFv候選物及生物素標記人類間皮素
為了評定藉由噬菌體淘選鑑別之人類抗間皮素scFv之結合及生物物理學特徵，scFv構築體連同人類間皮素胞外域(人類MSLN ECD)一起自HEK293F細胞短暫產生及純化。亦產生SS1 scFv作為參考，其為鼠類抗間皮素scFv。所測試之人類抗間皮素scFv為M5、M11、M12、M14、M16、M17、M21及M23(參看表14)。外部合成編碼M5(SEQ ID NO：43)、M11(SEQ ID NO：49)、M12(SEQ ID NO：50)、M14(SEQ ID NO：52)、M16(SEQ ID NO：54)、M17(SEQ ID NO：55)、M21(SEQ ID NO：59)、M23(SEQ ID NO：61)及SS1(SEQ ID NO：275)以及人類MSLN ECD(SEQ ID NO：276)之scFv構築體之胺基酸的質體。使用構築體之C端上的7x或8xHis標籤產生ScFv。人類scFv構築體(M5、M11、M12、M14、M16、M17、M21及M23)具有短連接子序列，包含將scFv之C端連接至8xHis標籤之N端的序列GS，例如GSHHHHHHHH(SEQ ID NO：277)。人類間皮素ECD使用C端Avi-標籤(SEQ ID NO：276)產生且使用來自Avidity,LLC之BirA酶進行活體外部位選擇性生物素標記。使用標準方法進行HEK293F細胞中之短暫表現及純化。對於scFv，簡言之，100ml 3×106個細胞/ml的HEK293F細胞用100μg質體及300μg聚乙烯亞胺轉染。細胞在37℃及8% CO2下培育且在80rpm下旋轉。六天後，藉由在3500g下離心20分鐘採集細胞。清液層藉由使在4℃下scFv結合至200μl Ni-NTA瓊脂糖珠粒(Qiagen)隔夜純化。蛋白質使用200μl 300mM咪唑溶離且針對磷酸鹽緩衝生理食鹽水透析。
下文提供具有His標籤的SS1 scFv序列： (SEQ ID NO：275)
下文提供具有C端Avi-標籤之人類間皮素ECD的序列： (SEQ ID NO：276)
質譜分析
為了確認一致性，使用與質譜偶合之高效液相層析(HPLC-MS)分析經純化scFv。各1μg注射至加熱至60℃的Poros R1/10 2.1mm×100mm管柱(Life Technologies)上。在Waters BioAcquity UPLC上進行分離。移動相A為0.1%甲酸；移動相B為含0.1%甲酸之25%乙腈、75%異丙醇。在15分鐘內使用25-50%移動相B之梯度在0.5mL/min下溶離scFv。使用Waters Xevo-Tof儀器進行質譜偵測，該儀器以電噴霧正離子模式操作用20-50V的錐形電壓斜坡自600-4000m/z掃描。所得質譜對峰值寬度取平均值且使用來自Waters之MaxEnt1算法去卷積以測定所表現scFv之質量。
尺寸排阻層析分析
進行尺寸排阻層析以測定所表現scFv之低聚狀態。各25μg注射至加熱至35℃的TSKGel Super SW3000 4.6mm×300mm管柱(Tosoh Bioscience)上。scFv以0.3mL/min在750mM精胺酸、1mM EDTA、20mM磷酸鈉、250mM氯化鈉，pH 7.2中溶離；在280nm下監測UV吸光度。
表面電漿子共振(SPR)
在Biacore T200系統上量測純化scFv之結合親和力。簡言之，重組人類生物素標記之間皮素ECD以150RU之密度固定在抗生蛋白鏈菌 素(SA)感測器晶片表面上。在恆定流動速率下在三倍連續稀釋下降經純化scFv注射至晶片上。分別監測蛋白質複合物之締合速率及解離速率持續270秒及400秒。針對空白固定流槽及緩衝液空白進行二次參考。當可能時使用朗格繆爾1：1結合模型(Langmuir 1：1 binding model)測定親和力，對於當由於快速打開及關閉速率而不可能精確擬合之彼等scFV，使用穩態模型。
為了測定各scFv相較於SS1的相對結合抗原決定基，以180秒之接觸時間藉由固定於抗生蛋白鏈菌素感測晶片上的生物素標記之間皮素ECD捕捉50nM SS1，導致70RU之相對密度。接著立即將100nM(M5、M11、M12、M14、M16、M17、M21或M23)純化scFv注射至晶片上以將SS1/間皮素複合物的解離降至最低。監測二級scFv之結合持續270秒。
結果
藉由HPLC-MS測定的scFv之觀測治療與基於胺基酸序列的理論值相符。基於分析型尺寸排阻層析，表現之scFv在43%單體至>98%單體範圍內。相較於對間皮素ECD具有0.1nM之明顯親和力的SS1對照scFV，所選scFv呈現0.9nM至114nM的大範圍親和力(表14)。SS1、M5及M11的代表性SPR感應圖分別顯示於圖41A、圖41B及圖41C中。
如其注射時在分析法中之反應增加所判斷，相對抗原決定基分組(圖42)表明M12、M14、M16、M17、M21、M23為與SS1競爭性結合人類間皮素之競爭性結合劑，而M5及M11看似結合於獨特抗原決定基。
1高聚集物含量/低單體%可導致親和力測定由於潛在親和性作用而較不精確。
2當可能時使用1：1結合模型測定親和力，對於因為快速打開及關閉速率而不可能精確擬合之彼等scFv，使用穩態模型。
3未測定之低濃度排除精確判定單體%。
實例3：攜帶人類scFv之CART的分析及活體外活性
抗MSLN抗體之單鏈可變片段選殖至具有CD3ζ鏈及4-1BB共同刺激分子之慢病毒CAR表現載體中，且最佳構築體基於MSLN CAR轉導之T細胞(「CART-MSLN」或「CART-MSLN T細胞」)回應於MSLN表現(「MSLN+」)目標的效應子T細胞反應的量及品質選擇。效應子T細胞反應包括(但不限於)細胞擴展、增殖、加倍、細胞激素產生及目標細胞殺死或細胞溶解活性(去顆粒)。
產生CART-MSLN
編碼慢病毒轉移載體之人類scFv用於產生封裝至VSVg假型慢病毒粒子中之染色體組材料。慢病毒轉移載體DNA與三種封裝組分VSVg、gag/pol及rev混合，VSVg、gag/pol及rev與脂染胺試劑組合將其一起轉染至Lenti-X 293T細胞(Clontech)中。
30小時後，收集培養基，過濾且儲存在-80℃下。藉由以來自正常清血供體之血液為起始物質產生治療CART-MSLN，該供體之原生T細胞藉由T細胞、CD4+及CD8+淋巴細胞的陰性選擇獲得。在37℃下，在5% CO2下，在RPMI1640、10%加熱不活化胎牛血清(FCS)、2 mM L-麩醯胺酸、1×青黴素/鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM NaPyruvate、10mM Hepes及55μM2-巰基乙醇)中，藉由1：3比率之CD3×28珠粒(Dynabeads® Human T-Expander CD3/CD28,Invitrogen)活化此等細胞。在24孔板的每孔0.5mL培養基中，在1×106個T細胞中培養T細胞。24小時後，T細胞破裂且添加0.5mL非濃縮或較小體積之濃病毒清液層。T細胞開始以對數生長模式分裂，此藉由量測每毫升細胞計數監測，且T細胞每兩天在新鮮培養基中稀釋。在約10天後，隨著T細胞開始停止，對數生長衰減。減緩生長速率及約300fl的T細胞尺寸之組合判斷T細胞狀態為低溫保藏用於隨後分析。
在低溫保藏之前，藉由流動細胞學分析在FACS-CantoII或FACS Fortessa上測定轉導之細胞百分比(在細胞表面上表現間皮素特異性CAR)及彼表現之相對螢光強度。比較來自彼FACS之相對螢光強度之直方圖顯示轉導T細胞之百分比。病毒轉導顯示與轉導效率、轉導細胞百分比有關的相當表現量。結果指示當與未轉導之T細胞(「UTD」)及SS1 CART-MSLN相比較時，不存在攜帶人類scFv之CAR-MSLN對細胞正常擴展能力的可偵測之負作用。
評估CART-MSLN重定向T細胞之細胞溶解活性及細胞激素分泌。
為了評估CART-MSLN T細胞殺死及分泌細胞激素的功能性能力，將細胞解凍及恢復隔夜。除了攜帶人類scFv之CART-MSLN以外，攜帶鼠類scFv「SS1」之CART-MSLN(參看WO2013/040577)用作對照。攜帶對照SS1 scFV之CART-MSLN(亦稱作SS1 CART-MSLN)在全部分析中用於比較分析法變化及/或用作對照。攜帶SS1 scFV之CART細胞以及全部其他攜帶人類scFv之MSLN-CART均在研究級(亦即非臨床級別)製造條件下產生。CD19-BBz或Iso1-BBz用作背景CART作用的非靶向CAR。
T細胞殺滅針對K562，即慢性骨髓性白血病細胞株。藉由轉導產 生K652 MSLN+(K562-Meso)細胞。非MSLN表現K5652用作對照。對於基於流動之細胞毒性分析法，目標細胞用羧基螢光素丁二醯亞胺酯(CSFE)染色以定量其存在。在10：1、3：1及1：1效應子：目標細胞比率下滴定來量測CART-MSLN之細胞溶解活性，其中效應子定義為表現抗MSLN嵌合受體之T細胞。藉由混合適當數目之T細胞與恆定數目之目標細胞來起始分析。20小時後，將板離心且移除全部體積之各混合物。洗滌各孔中之剩餘細胞集結粒且細胞用活/死標記物7AAD染色。最終洗滌後，集結細胞再懸浮於具有預定數目之珠粒計數的特定體積中。藉由CantoII流動式細胞量測術收集細胞染色資料且用FloJo軟體使用珠粒定量結果來分析。
根據基於20小時流動之殺死分析法繪圖，該等分析法使用滴定效應子比目標(E：T)比率，其中效應子CART-MSLN細胞靶向CSFE標記之K562(圖3A.非表現MSLN對照)及K562-Meso(圖3B，K562細胞經轉導以表現MSLN)。比較此等殺死曲線，滴定效應細胞之量顯示表現MSLN之彼等細胞被破壞。來自相同供體且使用攜帶人類scFv之CAR-MSLN細胞或SS1 CAR-MSLN細胞轉導之T細胞能夠選擇性殺死MSLN+目標。全部CART-MSLN細胞之細胞溶解活動與鼠類SS1 CART-MSLN類似且相當。其顯示全部CART-MSLN細胞在轉導時變得具有間皮素反應性且獲得殺死表現高含量間皮素之目標細胞的能力。為了量測攜帶人類scFv之CART-MSLN的細胞激素產量，將細胞解凍且恢復隔夜。除了人類化CART-MSLN之外，SS1 CART-MSLN(鼠類scFv)用於比較目的。CD19-BBz CART用作背景CART細胞作用的非靶向對照。SS1 CART-MSLN在全部分析法中用於比較分析法變化。T細胞針對K562、慢性骨髓性白血病細胞株(MSLN+及MSLN)、MLSN表現卵巢癌細胞株Ovcar8及胰臟癌細胞株SW1990及Panc0203。當藉由流動式細胞量測術分析MSLN表現時，相較於MSLN+ K562細胞，偵 測到Ovcar8上10倍較低MSLN表現；SW1990的表現比Ovcar8低10倍。Panc0203上之MSLN表現不可藉由流動式細胞量測術偵測，但藉由RNA分析為陽性的。此外，PMA/伊屋諾黴素用於評估T細胞對內源性免疫信號反應的可能性。分析法僅測試1：1之效應子：目標比率。當移除培養基用於使用IFN-γCBA-Flex套組(用於人類細胞激素偵測)進行細胞激素分析時，在混合細胞後進行分析24小時。
在暴露於不表現MSLN之對照K562細胞後，分析CART-MSLN細胞產生的細胞激素背景含量。使用PMA/伊屋諾黴素刺激T細胞的潛在細胞激素分泌指示細胞群體具有分泌細胞激素的略微變化之可能性。藉由使特異性IFNγ釋放根據最大釋放(PMA/伊屋諾黴素)標準化來處理差異。
資料顯示當用K562表現MSLN培養時，大多數攜帶人類scFv之CART-MSLN及鼠類SS1 CART-MSLN產生IFNγ。當用內源性表現MSLN之癌細胞(較低含量)培養時，僅少數CART反應(M5、11、14、15、16、17及SS1)，而兩個CART M5及M11顯示優良IFNγ含量。較低內源性MSLN含量可能較好反映腫瘤細胞上天然表現之間皮素含量，彼等具有彼等scFV之CART可能具有比具有SS1構築體之CART提高的治療反應。
實例4：用於慢病毒產生之CART的臨床試驗
將自患有間皮素表現癌症(諸如嚴重上皮細胞卵巢癌、惡性胸膜間皮瘤(malignant plural mesothelioma)或胰臟癌)者選擇患者。
CART-MSLN細胞之製造及釋放測試將藉由臨床細胞及疫苗製造(CVPF)在University of Pennsylvania進行。將由患者之清除術產物製造CART-MSLN產物。
將在University of Pennsylvania Apheresis center進行約10L清除術程序(在第一次CAR T細胞給藥之前4週)。在此程序期間獲得來自患 者之PBMC用於CAR T細胞。打算自單次白細胞去除術採集至少5×109個白血球來製造CAR T細胞。亦獲得及低溫保藏針對FDA回顧需求及研究的基線血液白細胞。間皮素修飾T細胞產物預期準備好在約4週後釋放。
如實例2中所述使用自各患者分離之細胞(亦即自體T細胞)製備慢病毒產生之CART。自各患者T細胞製備之CART-MSLN表現人類scFv(包括M5及M11)或SS1。
在細胞培養結束時，在袋中之可輸注低溫培養基中低溫保藏細胞。第1組之劑量為1-5×107個CAR T細胞，第2組及第3組為1-5×108個CAR轉導之細胞，根據全部細胞中2-50%轉導細胞之範圍計算。含有自體修飾之CAR T細胞產物的袋將在University of Pennsylvania的醫院的CVPF儲存於受控制及監測的冷凍機中。輸注袋在需要之前將儲存於冷凍機。
各劑量將封裝及低溫保藏於1個輸液袋中，體積取決於總細胞數目、轉導效率功能；最小體積將為每袋10mL。各袋將含有低溫培養基的等分試樣(體積取決於總細胞劑量)。
第1組個體(N=3-6)在第0天將接受自體1-5×107個CART-MSLN細胞的單次平緩靜脈內給藥。第2組個體(N=3-6)在第0天將接受自體1-5×108個CART-MSLN細胞的單次平緩靜脈內給藥。第1組及第2組之個體在CART-MSLN細胞之前將不接受任何淋巴消耗化學療法。第3組(N=6)在自體1-5×108個CART-MSLN細胞的單次平緩靜脈內給藥之前兩天將靜脈內接受1.5g/m2環磷醯胺。
預期接受環磷醯胺之患者可能經歷作為治療副作用的噁心及嘔吐。可在輸注化學療法之前根據機構標準投與針對噁心的抗催吐劑預防術前用藥。特定藥劑之選擇由研究者之判斷決定，但不應使用皮質類固醇，因為其免疫抑制作用。
T細胞輸注後的副作用可包括短暫發熱、發冷、寒戰、肌痛/關節痛、頭痛、疲乏及/或噁心。在CAR T細胞輸注之前，個體將藉由口服乙醯胺苯酚650mg及口服或IV苯海拉明鹽酸鹽來預先用藥。若禁用苯那君(Benadryl)，則將投與H2-阻斷劑，諸如雷尼替丁(ranitidine)。此等藥劑可根據需要每六小時重複。若乙醯胺苯酚不能緩解患者持續發熱，則可處方非類固醇消炎藥的病程。推薦患者不接受全身皮質類固醇，諸如氫皮質酮、潑尼松、潑尼龍(Solu-Medrol)或地塞米松(Decadron)。若需要皮質類固醇用於急性輸注反應，則推薦100mg氫皮質酮的初始劑量。
●一袋CART-MSLN細胞將藉由乾冰上的研究協調器或CVPF織品自CVPF輸送至CTRC的個體床邊。
●經轉染T細胞將由CVPF工作人員中的一員在個體床邊在37℃水浴中解凍。將溫和按摩袋子直至細胞剛剛解凍。若CAR T細胞產物看起來具有袋破壞或漏泄，或看起來有其他損壞，則不應輸注，且應根據下文規定返還CVPF。
●細胞將在解凍後約10-15分鐘內趁冷輸注至個體。經轉染T細胞將經具有3通活栓之18號無乳膠Y型輸血器快速靜脈內輸注。輸注時無白細胞過濾器。將藉由重力輸注進行給藥。若藉由重力之輸注速率太慢，則經轉染T細胞藥品可經活栓吸入注射器中且以所需速率手動輸注。袋中不應留有冷凍凝塊。
●在輸注之前，兩名個體將在個體在場情況下獨立地檢驗各袋之標籤上的資訊且確認資訊與參與者正確匹配。
●在輸注經轉染T細胞期間及之後對患者進行監測。將在給藥之前及輸注完成後每15分鐘持續2小時獲得及立即記錄溫度、血壓、心跳速率、呼吸速率及脈動式測氧法。
●應急醫學設備(亦即急救車)必需可用於在輸注期間，在個體具 有過敏性反應或嚴重降血壓危機或任何其他輸注反應的情況下的緊急情形。
●若無症狀出現且個體生命體征在輸注後2小時保持正常，則個體將回家，且指示產生任何症狀應返回醫院。若生命體征量測值不穩定，則將繼續約每15分鐘獲得直至個體生命體征穩定或醫師釋放患者。將醫生認為個體可安全離開之前將要求個體不要離開。
●在經轉導之CAR T細胞給藥完成後的60分鐘(+5分鐘)內，將獲得血液樣品用於經轉導CAR T細胞數目及細胞激素含量的基線判斷。
●將指示個體在第一次輸注後24小時內返回CTRC或Perelman Center根據SOE進行血液測試及隨訪檢查。
對於攜帶scFv之CART，可根據需要重複細胞劑量。
描述性統計將應用於判斷CART-MSLN細胞至血液(及視情況存在之腫瘤)的相對持久性及運輸。將以圖形方式呈現關於血液中CAR T細胞之數目、HAMA含量及可溶性生物標記物含量的追蹤的資料。將測定與放射及腫瘤負荷之其他標準量測的相關性。針對比例及方式將計算95%信賴區間。
在規定AE報導週期的方案期間，將收集及評估全部患者之不良事件。AE將使用National Cancer Institute(NCI)-Common Toxicity Criteria(v4)根據嚴重程度分級。將描述全部不良事件且針對不良事件率將產生精確95%信賴區間(針對全部及嚴重類別)。將持續監測資料作為過度毒性之證據。結果將列表及概括。
將在精確95%信賴區間中概括臨床反應率。無進展及整體存活率及臨床反應持續時間的分佈將使用Kaplan-Meier曲線以圖形方式呈現。將呈現兩年存活率。將藉由彼等具有可量測疾病之個體中的腫瘤反應率來測定功效之基本證據。將使用輸注後第28天、第3個月及第6個月的放射影像(亦即CT影像)及血清生物標記物評定腫瘤反應。
●將根據實體腫瘤反應評估準則(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST 1.1)、胸膜間皮瘤之修正RECIST準則(modified RECIST criteria for pleural mesothelioma)及免疫相關反應準則(Immune-Related Response Criteria，iRRC)量測放射反應。
●將根據各疾病之標準評估血清生物標記物反應；另外全部個體將具有SMRP量測。舉例而言，在CAR T細胞投與之後，患有胰臟癌之個體將監測CA19-9、CEA及血清間皮素相關蛋白質[SMRP]含量)。患有卵巢癌之個體將監測CA125血清含量，亦SMRP。患有間皮瘤之個體將量測SMRP血清含量。在所有情況下，血清生物標記物將不用作腫瘤反應之單獨量測，因為CART-MSLN細胞可影響此等生物標記物測量中所用之分析法。
●將描述性分析資料的整體反應率、無進展存活率及整體存活率。
將評估輸注後高達2年或直至個體開始癌症相關療法的PFS及OS。
將進行包括細胞激素含量之血液監測的安全性評估。個體將連續入選。將錯開輸注以允許各組中之入選個體之間的28天安全性評定。
實例5：RNA產生CART之臨床試驗
自體T細胞經工程改造以除上文所述之人類4-1BB及CD3ζ信號傳導結構域之外表現識別間皮素之胞外SS1 CAR構築體以及跨膜結構域。參見例如WO2013/040577，實例1. Production of CAR-containing Nucleic Acids
根據下文建構SS1-CAR。含有人類anti間皮素scFv之CAR亦使用類似方法建構。
使用兩種不同質體選殖ss1.bbz片段。間皮素scFv片段(ss1)首先由 Translational Research Program(TRP)laboratory自先前公佈之Dr.Pastan之構築體(Chowdhury等人，1998)選殖。人類CD8α鉸鏈及跨膜結構域連同41BB及CD3ζ序列藉由PCR自先前所述之pELNS.CD19-BB-ζ質體(Milone等人，2009)選殖。本文揭示鉸鏈、跨膜及胞內信號傳導結構域之序列。ss1.bbz片段首先在pGEM.GFP.64A載體(Eli Gilboa提供且描述於Boczkowsk,D等人，2000中)中選殖。藉由添加兩個3' UTR β血球蛋白重複序列及150bp聚A序列(SEQ ID NO：271)(置換pGEM.GFP.64A中之64聚A序列(SEQ ID NO：273))提高增強型轉殖基因表現來修飾此載體(Holtkamp 2006)。藉由將ss1.bbz.2bgUTR.150A片段自pGEM次選殖至pDrive載體中產生臨床使用之GMP順應性質體。藉由UA雜交針對高效選殖PCR產物設計pDrive選殖載體(Qiagen)。允許對重組純系進行安比西林(ampicillin)及卡那黴素(kanamycin)，且伴隨普遍定序引子位置，及皆用於活體外轉錄的T7及SP6啟動子。首先，藉由Hind III及NdeI(填補鈍端)自pGEM載體切割ss1.bbz.2bgUTR.150A且藉由KpnI及NotI(填補鈍端)次選殖至pDrive切片中。具有正確方向之插入物為確認產生pDrive.ss1.bbz.2bgUTR.150A之序列。藉由用AhdI及BciVI雙重消化刪除pDrive載體中之安比西林耐藥基因。為了消除自CAR ORF內的固有開放閱讀框架(ORF)轉譯的潛在異常蛋白質，尺寸大於60bp之全部固有ORF藉由突變誘發PCR突變，而ss1 CAR之ORF保持完整。所得質體命名為pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A，如圖1中所示。
用於引入自體T細胞中之CAR核酸的產生如下進行。根據CVPF SOP 1188將最終pD-A.ss1.bbz.OF.2bg.150A構築體引入OneShot TOP10化學勝任大腸桿菌細胞(Invitrogen)中。根據SOP 1191使用QIAfilter Plasmid Giga DNA分離套組，自兩份1.25L含有100μg/ml卡那黴素之LB培養基產生製備為一份批料的高達10mg質體DNA。在37℃下，用 SpeI限制酶一次性使1mg DNA線性化隔夜。在使用Qiagen Plasmid Maxi套組大規模純化之前，藉由凝膠電泳確認線性化。
藉由利用mScript mRNA系統自質體轉錄RNA且使用RNeasy Maxi套組(Qiagen)分離。活體外轉錄之RNA在濃度為1mg/mL之0.5mL等分試樣中低溫保藏。在70℃下在mRNA變性緩衝液(Invitrogen,Carlsbad,CA)中變性15分鐘且藉由UV分光光度法(OD260/280)定量後，藉由1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA品質及量。
CAR T細胞產物製造.
在CAR T細胞第一次給藥之前約4週進行7至12L清除術程序。在此程序期間獲得用於CAR T細胞之PBMC。打算自單次白細胞去除術採集至少5×109個白血球來製造CAR T細胞。
藉由在CaridianBCT Elutra上經逆流離心淘析消耗單核細胞自白細胞去除術產物增濃CD3+ T細胞，CaridianBCT Elutra採用單次使用封閉系統拋棄式設定。第0天，T細胞製造程序藉由用抗CD3/CD28單株抗體塗佈之磁性珠粒活化開始，且擴展在靜態組織培養袋中開始。第5天後，需要時，細胞將轉移至WAVE生物反應器用於額外擴展。培養結束時，細胞耗盡磁性珠粒、洗滌且使用Haemonetics細胞保存器系統濃縮。採集後細胞在37℃下培育隔夜用於第二天造成電穿孔。細胞洗滌且再懸浮於電穿孔緩衝液(Maxcyte)中，且裝載至Maxcyte處理總成。細胞用ss1 RNA電穿孔，且恢復4小時，接著在可輸注低溫保藏培養基中調配。
封裝
1×108或1×109±20%經修飾CAR T細胞將在保持於濕潤冰上之IV輸注袋中供應。各袋將含有低溫培養基之等分試樣(體積取決於劑量)，該培養基含有以下可輸注級試劑(體積%)：31.25勃脈力-A(plasmalyte-A)、31.25右旋糖(5%)、0.45 NaCl、高達7.50 DMSO、 1.00聚葡萄糖40及5.00人類血清白蛋白。袋子可在-135℃下冷凍。
CAR T細胞產物穩定性
ss1 CAR T細胞將在電穿孔後低溫保藏4小時，且在T細胞製造後三個月窗口內解凍及投與。已展示在-130℃下低溫保藏約30天之ss1CAR T細胞的間皮素scFv表現為97.4%，幾乎等同於低溫保藏時間(96.9%)，且其他低溫保藏之T細胞產物穩定至少6個月。相較於98.7%，基於錐蟲藍計數之解凍後活力為75.2%。表現資料表明最終產物在儲存用於試驗期間穩定，且額外劑量之標記瓶應滿足70%活力及20% CAR表現之釋放準則。ss1 CAR T細胞之額外小瓶將將低溫保藏後3、6、9及12個月後解凍，且測試活力及轉殖基因表現產生其他產物穩定性資料。
臨床試驗程序及結果：向患有惡性胸膜間皮瘤之患者投與自體間皮素重導向T細胞的I期臨床試驗如下進行。類似程序可用於治療胰臟癌患者之研究。
劑量
第1組患者(n=3)在第0天將接受使用平緩給藥抗meso RNA CAR T細胞的1×108單次輸注且在第7天一次1×109個RNA CAR T細胞輸注，在第7天輸注之前提供患者滿足方案指定之安全性評估。
第2組患者(n=6)將給予2次週期之經修飾CAR T細胞。一個週期由每隔一天(星期一、星期三、星期五)3次輸注組成。週期1由MWF(第0天、第2天、第4天)給予1×108個CAR T細胞的3次給藥組成；週期2由MWF(第7天、第9天、第11天)給予1×109個CAR T細胞的3次給藥組成。
每次輸注之目標劑量為1×108個細胞(一次劑量用於第1組且第1週劑量用於第2組)及1×109±20%細胞(一次劑量用於第1組且第2週劑量用於第2組)。最小可接受劑量為1×108。若總細胞擴展低於總可接受細 胞劑量，則患者可進行第二次清除術以試圖擴展更多細胞及滿足總目標劑量。若第二次清除術存在禁忌或若第二次清除術及擴展未能產生最小可接受劑量，則劑量將視為製造失敗。對於第1組患者，儘可能多的間皮素CAR電穿孔T細胞將製造/冷凍以降低個體將進行第二次白細胞去除術的幾率，在第二次白細胞去除術情況下其將遵照第1組方案。
若一個以上患者因經修飾CAR T細胞輸注產生DLT，則將發生劑量降級。在DLT事件中，劑量將降級10倍。因此，若108個CAR T細胞的週期1期間出現毒性，則全部輸注(劑量1至6)將降至107個CAR T細胞。在107個CAR T細胞的難處理毒性之情況下，試驗將停止。
使用短暫表現CAR T細胞(詳言之攜帶鼠類scFv之CART)治療的患者中可能產生的潛在問題為多次治療後全身性過敏反應。
不受此理論束縛，咸信此類過敏性反應可由產生體液抗CAR反應(亦即具有抗IgE同型之抗CAR抗體)之患者引起。當存在十天至十四天抗原暴露中斷時，認為患者之抗體製造細胞經歷IgG同型(不引起全身性過敏反應)至IgE同型的類別轉換。因此，對於短暫CART(諸如RNA電穿孔產生者)，CART輸注中斷應持續超過十至十四天。
此外，使用具有人類(而非鼠類)scFv之CAR可減少患者產生抗CAR反應之可能性及強度。
研究程序
研究由以下組成：1)篩選期，2)由清除術、CAR T細胞輸注、副作用評定及視情況存在之腫瘤生物活檢組成的干涉期，及3)隨訪。
篩選及基線評定
研究者必須解釋研究方案的性質及與個體詳細方案有關之風險。個體在研究參與之前必須在手寫知情同意書上簽名及註明日期。知情同意過程及日期將記錄在個體病歷及CRF中。在進行方案程序之 前必須獲得知情同意書。若在簽署知情同意書之前篩選所需之程序且程序滿足方案之時間限制，則此程序可用於篩選評估。
篩選程序(無需判定合格性)將在第一次給藥CAR T細胞6週內完成(除非另外說明，否則在SOE中)。在需要第二次清除術來擴展額外T細胞及實現目標細胞劑量之情況下，此時間窗口將不涵蓋全部程序。因此，在此特定情形中，6-8週時間用於進行基本篩選。 篩選程序包括：
■知情同意書
■確認ECOG效能狀態1
■製造效率判斷(對於前2名患者)：血液樣品送至CVPF以判斷T細胞製造可行性。在約1週內，CVPF將回復個體PBMC是否可能對大規模CAR T細胞製造程序足夠的結果。在進行任何額外研究程序之前必須已知結果。
■完整病史
■身體檢查包括生命體征、身高、體重及氧飽和度
■合併用藥評審
■血液學(具有差異之WBC、RBC、Hct、Hgb及血小板)
■PT及PTT
■化學性質(鈉、鉀、氯化物、碳酸氫鹽、脲氮、肌酐、葡萄糖、總蛋白質、白蛋白、鈣、鹼性磷酸酯酶、總膽紅素、ALT、AST)
■病毒篩選：HIV、HCV、HBV及CMV之血清學
■自體抗體組：ANA、ESR
■尿分析
■12導聯動態心電圖(ECG)
■血清βHCG妊娠(具有生育可能之女性)
■肺活量量測及DLCO
■具有對比的腫瘤評定胸部CT掃描，如臨床上指定之其他放射評估。PET/CT掃描視情況存在。
■病理學確認上皮細胞或混合(兩階段)間皮瘤且由方案特定病理學家染色間皮素。
白細胞去除術
7至12L清除術程序將在University of Pennsylvania Apheresis center進行(第一次CAR T細胞給藥之前4週)。在此程序期間獲得用於CAR T細胞之PBMC。打算自單次白細胞去除術採集至少5×109個白血球來製造CAR T細胞。若採集不成功，則患者將具有進行第二次白細胞去除術的選擇。亦獲得及低溫保藏針對FDA回顧需求及研究的基線血液白細胞。間皮素修飾T細胞產物預期準備好在約4週後釋放。全部患者在程序之前將進行標準白細胞去除術篩選。
預輸注評定(研究第-3天，第一次給藥之前)
此安全性評定包括身體檢查(例如生命體征、體重等)，合併用藥綜述、效能狀態、化學方法、具有差異之CBC、妊娠測試(尿液)尿分析、EKG、CXR及研究血液樣本。
CAR T細胞投與
在各CAR T細胞輸注之前，患者將進行有限問題定向PE、不良事件綜述、ECOG效能狀態、CBC、化學方法及尿分析。CAR T細胞輸注1天後個體將返回HUP(D1、D3、D8及D10)進行有限問題定向PE、不良事件綜述、合併用藥、ECOG效能狀態、CBC及化學方法。第7天，第1組患者將進行EKG。第14天，第2組患者亦將進行CXR及EKG。
經如上文所述投與CAR T細胞。將評定個體生命體征且在給藥之前，輸注結束及此後每15分鐘持續2小時進行脈動式測氧法且直至此等穩定。
輸注後評定
對於第1組患者，將在第一次輸注後1小時、4小時、1天及3天及第二次輸注後1小時、4小時、1天及3天、7天及14天監測血液中之細胞激素含量。在第一次輸注後，將收集用於移植分析(流動式細胞量測術及RT-PCR)之血液收集持續21天。
對於第2組(及延長之第1組)患者，將在每次輸注後1小時及額外時間點根據SOE檢測細胞激素含量。在第一次(第0天)CAR T細胞投與後收集主要安全性及移植資料持續35天。
CART細胞輸注後1天，抽血用於流動式細胞量測術及RT-PCR以評估循環CAR T細胞。將處理周邊血液樣品以分離：a)周邊血液單核細胞(PBMC)以評估免疫細胞表現型及功能，b)RNA以定量輸注CAR T細胞之短期持久性及分佈，及c)血清以定量及評估免疫細胞亞型及可溶性免疫及生長因子，評估抗輸注細胞免疫反應之產生及進行原型陣列分析(protoarray analyse)以評估經免疫抗原決定基擴散的體液抗腫瘤免疫反應之產生。
將在第2個月及第3個月(第1組)及最後CAR T細胞輸注後的第2個月、第3個月及第6個月(第2組及延長之第1組)對個體進行評定用於如上文所述之安全性評定。
腫瘤生物活檢及微清除術
對於第2組及延長之第1組，若腫瘤目測可及或藉由圖像引導之生物活檢可及，則符合條件之個體將在影像引導下進行直接腫瘤生物活檢或生物活檢以評估CAR T細胞存在及間皮素表現。對於第2組個體，次應安排在T細胞輸注後第14天。將量測全部腫瘤浸潤淋巴細胞之頻率及T細胞子群以及T細胞抗腫瘤反應之分子標記物的表現。若可獲得，則此等將與儲存手術腫瘤樣本之基線值比較。將給予個體拒絕腫瘤生物活檢之選擇。亦可提供腔內流體作為生物檢體。
進行微清除術(2L)用於研究目的及FDA「回顧」目的以保存CAR T細胞用於輸注後第21天的安全性分析。可收集血液樣品代替白細胞去除術。
腫瘤反應評定
對於第1組將在第35天及第2個月且對於第2組(及延長之第1組)將在最後CAR T細胞輸注後第35天、第2個月及第6個月或直至患者需要替代MPM療法進行腫瘤反應評定。將藉由使用胸部之對比的CT掃描以及如臨床上指定之其他程序進行腫瘤評定。
上述實例可使用攜帶人類scFv之CART，使用例如CAR構築體M5、M11、M14、M15、M16及M17中之scFv進行。
實例6：實體惡性病中CART-MSLN誘發之抗腫瘤活性
此實例存在兩個由進行中臨床試驗報導之案例，該等試驗指示靶向間皮素(CART-MSLN)之過繼轉移mRNA CAR T細胞(PBMC用間皮素CAR構築體電穿孔)可行且安全，無明顯證據表面對正常組織的偏離腫瘤準確毒性。此等案例亦表明CART-MSLN可浸潤且具有實體惡性病中之至腫瘤活性，諸如惡性胸膜間皮瘤(MPM)及胰臟癌。
個體17510-105患有MPM且給予3次CARTmeso輸注。個體21211-101患有轉移性胰臟癌(PDA)且藉由靜脈內輸注及2次瘤內注射給予8次CARTmeso劑量。兩患者皆為老年且在入選時患有先進化學療法難治癒之癌症且具有大範圍腫瘤負荷。
CART meso細胞之抗腫瘤臨床活性
兩種案例藉由電腦斷層攝影術(CT)成像評估腫瘤反應。此外，在輸注之前及之後藉由正電子發射斷層攝影法/電腦斷層攝影術(PET/CT)成像之[18F]2-氟-2-去氧-D-葡萄糖(FDG)親和性評估PDA患者(圖6)。MPM患者在接受CARTmeso輸注後經歷穩定疾病，然而，在時程2時在接受一次CARTmeso細胞輸注後產生確認之部分反應(圖 6A)。PDA患者在靜脈內CARTmeso療法3週後經受穩定疾病。藉由FDG PET/Ct成像，全部疾病位置可見最大標準化攝入值(SUVmax)降低。對於其他此代謝反應，測定各疾病部位的平均體積產物(MVPmean)中之變化(圖6B、6C及6D)。僅在腹膜病灶中觀測到MVPmean降低。為了進一步理解CARTmeso細胞療法對腹膜腫瘤負荷之影響，藉由流動式細胞量測術分析腹水流體。開始療法後第+3天及第+15天的腹水流體分析揭示共同表現間皮素及c-met之腫瘤細胞濃度降低40%。(圖6D)。總體而言，此等發現表明CARTmeso細胞輸注在此等患者中誘發抗腫瘤作用的作用。
亦在兩名患者中評估血清學腫瘤標記物。在CARTmeso細胞輸注之前及之後量測血清間皮素相關肽(SMRP)及CA19-9含量。對於MPM患者，時程2時接受第一次輸注後SMRP含量下降，與CT影像可見之腫瘤負荷減少一致。對於PDA患者，治療過程的CA19-9含量增加緩慢但保持穩定1個月。腫瘤內注射CARTmeso細胞完成後，CA19-9含量上升與疾病進展相符。
CARTmeso細胞之活體內持久性及運輸
開發qPCR分析法以偵測及定量輸注後患者中CARTmeso細胞之持久性。兩名患者之周邊血液、腹水及腫瘤樣品之分析呈現於圖7中。在各輸注後立即偵測兩名患者中之CARTmeso轉殖基因。與CARTmeso轉殖基因之可生物降解性質一致，觀測到含量連續數天逐漸降低。
在PDA患者中藉由在連續時間點收集腹水且藉由腫瘤生物檢體評估腫瘤組織中CARTmeso細胞之運輸。
在CARTmeso細胞輸注後誘導體液抗原決定基擴散
測試CARTmeso細胞是否能活體內夠識別及溶解原發性腫瘤細胞可能引起全身抗腫瘤免疫反應之假設。進行高產出量血清學分析以量 測對抗原之抗體反應的誘導，以偵測可能因腫瘤破壞及抗原決定基擴散而出現的多選殖免疫反應之產生。此等分析使用幾乎10,000種獨立人類蛋白質的治療誘導之igG反應的公正審訊。在PDA患者中，在第+44天偵測到新抗體反應超過100種蛋白質。類似地，MPM患者觀測到對蛋白質子組之抗體反應升高。總體而言，兩名患者中觀測到的此等抗體免疫反應與CAR T細胞介導之腫瘤破壞有關，該腫瘤破壞導致釋放在經典抗原決定基擴散過程中交叉呈現之自身蛋白質。
兩名患者的用於誘導抗腫瘤免疫反應之處理前及處理後血清亦藉由免疫墨點法使用來自人類MPM或PDA細胞株的純化腫瘤相關之蛋白質或蛋白質溶解物檢查。藉由免疫墨點上新頻帶之存在或預先存在頻帶強度增加來定義抗腫瘤免疫反應(圖9)。在兩名患者中，治療期間可見抗體模式改變，例如同種異體腫瘤細胞株中存在之抗體偵測蛋白質增加。此等發現連同原型陣列分析表明CARTmeso細胞輸注誘發抗腫瘤體液免疫反應。
實例7：改良實體腫瘤中CART功能之組合療法
使用過繼轉移之腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)的免疫療法受實體腫瘤微環境內T細胞功能性滅活限制。在此研究中，表現meso CAR之人類T細胞靜脈內注射至攜帶大型現有人類間皮素表現間皮瘤側腹腫瘤的免疫缺陷小鼠中。經分離meso-CAR T細胞(mesoCART)的分析顯示看起來多因素的效應功能快速損失。此等實驗之結果表明引起mesoCART效應功能損失之機制抑制劑可適用於活體內提高mesoCART治療功效之組合療法。
材料及方法
產生mesoCAR及慢病毒載體製備.如上文所述製備含有間皮素CAR ss1之慢病毒構築體。人類間皮素CAR構築體及表現其之T細胞亦可使用上述方法產生。
細胞株.使用來源於患者之腫瘤的人類間皮瘤細胞株-EMP(親本)。因為EMP不具有腫瘤相關抗原(TAA)間皮素之基線表現，其經慢病毒轉染以穩定表現人類間皮素(經轉導細胞株稱為EMMESO)。細胞亦經轉導以穩定表現螢火蟲螢光素酶(稱為EMPffluc，EMMESOffluc)。
T細胞效應子分析法.效應子T細胞與表現螢火蟲螢光素酶之腫瘤細胞以不同比率共同培養持續規定時間。共同培養培育期結束時，保存清液層用於藉由ELISA(Biolegend #430106)進行IFN含量，洗滌各孔，且用1×細胞分解緩衝液溶解剩餘腫瘤細胞30分鐘。使用螢光素酶分析系統在GloMax多重偵測系統(Promega.)上分析溶解產物中之螢光素酶活性。結果作為基於具有腫瘤(但非T細胞)之孔中的螢光素酶活性的殺死百分比報導。(殺死%=100-((來自具有效應子及目標細胞共同培養物之孔的RLU)/(來自具有目標細胞之孔的RLU)×100))。效應子比目標比率表示每個目標細胞之總T細胞。
動物.所有動物實驗均由適當機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。NOD/scid/IL2rγ-/-(NSG)小鼠在Animal Services Unit of the Wistar Institute and Children's Hospital of Philadelphia飼養。雌性小鼠在10至16週大時用於實驗。
活體內異種移植實驗.5×106個腫瘤細胞在X-活體內培養基(Lonza)及基質膠(BD Biosciences)中注射至NSG小鼠側腹中。形成腫瘤(100-200mm3)後，小鼠隨機分配至三個靜脈內(尾靜脈)處理組中之一者：1)20×106個未經轉導(NT)T細胞(Dynabead®活化T細胞)，2)20×106個mesoCAR T細胞(經mesoCAR轉導之Dynabead®活化T細胞)3)生理食鹽水。使用測徑規量測腫瘤且使用式(π/6)*(長度)*(寬度)2計算腫瘤體積。每組各含有10隻小鼠。活體內實驗重複三次。
結果 腫瘤浸潤CART中觀測到的功能低下
人類間皮素表現間皮瘤腫瘤細胞株EMMESO注射至NSG小鼠側腹且使其生長至100至200mm3之尺寸。此時，給予腫瘤攜帶小鼠一次20,000,000個T細胞(mesoCAR表現為約50%(資料未圖示))靜脈內注射。14天延遲後可見顯著腫瘤生長減緩(圖10)，然而，與經歷另一間皮瘤細胞株(Carpenito等人，Proc Natl Acad Sci USA,106(9)：3360-65(2009)；Zhao等人，Cancer Res,70(22)：9053-61(2010).)不同，未指出腫瘤消退或治癒。注射未經轉導之T細胞相較於生理食鹽水處理對照具有最小腫瘤作用(圖10)，指示用表現mesoCAR之T細胞處理的動物中觀測到的腫瘤生長降低為mesoCAR之結果。
進行多種分析以理解為何CART處理後未觀測到腫瘤消退。檢查EMMESCO腫瘤且發現mesoCART大量存在，然而，存在之T細胞功能低下。由於CAR TIL上之CAR表現水準等於或大於注射之前的細胞(圖11A及圖11B)，因此吾人比較其功能性活性。吾人在注射40天後自EMMESO腫瘤分離及分析mesoCAR TIL(全部研究在分離後立開始)且將其與用於原始注射及冷凍(「低溫mesoCAR」)同一批mesoCAR T細胞比較。在解凍及在37℃/5%CO2中培育18小時後研究此等細胞。當低溫mesoCAR T細胞及側腹mesoCAR TIL以20：1比率添加至經培養的表現螢火蟲螢光素酶之EMMESO細胞(EMMESOffluc)持續18小時時，低溫mesoCAR T細胞高效殺死腫瘤細胞(>95%)，而mesoCAR TIL經此相同時間段僅殺死約10%腫瘤細胞(圖11C，p<0.001)。
額外分析亦展示mesoCAR T細胞在暴露於抗原或PMA/伊屋諾黴素後不產生細胞激素，諸如IL-2及IFNg。對比而言，低溫meso CAR T細胞產生細胞激素。暴露於抗CD3/CD28塗佈之珠粒20分鐘後，mesoCAR T細胞亦藉由免疫墨點法顯示減少或不存在phosph-ERK表現展示降低之信號傳導。對比而言，低溫meso CAR T細胞在暴露於 珠粒後保持磷光體-ERK表現。
人類mesoCAR TIL表現提高抑制受體之含量
隨後，上文在分離自人類的功能低下TIL中所述之四種抑制受體(IR)之表現使用流動式細胞量測術評估：i)用於注射之低溫mesoCAR T細胞，ii)第39天來自EMMESO之新鮮經分離之mesoCAR TIL及iii)已自腫瘤移除24小時之「回收」mesoCAR TIL(表6)。CAR TIL表現高含量之抑制受體。自腫瘤微環境回收24小時後，此等含量一般低得多。對於CD4 CAR TIL，PD-1自73%至53%，LAG-3自63%至3%，且TIM3自24%至1%。2B4表現高且其餘在靜置後升高(67%至88%)。對於CD8 CAR TIL，PD-1自26%至21%，LAG-3自48%至13%，且TIM3自56%至1%。2B4表現高且其餘在靜置後升高(96%至98%)。
此等IR中之三者亦在可自EMMESO小鼠脾臟分離的人類T細胞上評估。有趣的是，脾臟T細胞上之PD-1、TIM3及LAG3之表現水準相較於TIL均較低(表7)，證實腫瘤微環境在上調IR中之關鍵作用。
人類mesoCAR TIL表現增加含量之胞內抑制酶類.
使用免疫墨點法檢驗TIL功能不全、SHP-1及DGK中牽涉之T細胞 功能之兩種內源抑制劑的表現水準(圖12)。DGK之兩種同功異構物(α及ζ)以及SHP1之磷酸化形式(pSHP1)的含量在自EMMESO側腹腫瘤新鮮分離之mesoCAR TIL中相較於靜置隔夜之TIL顯著升高。針對DGK亦使用流動式細胞量測術確認此結論，其中23%新鮮EMMESO TIL表現DGK。靜置隔夜也，表現不可檢測。
人類mesoCART細胞中之抑制劑阻斷提高其離體殺死功能。
由於此等表現資料，藉由在離體殺死及細胞激素釋放分析法期間引入可用阻斷劑來研究mesoCAR TIL中特異性抑制路徑之潛在功能性重要性。添加抗PDL1抗體顯著恢復殺死活性及能力以分泌IFNby，mesoCAR TIL(圖13A及圖13B)。10μg/ml抗PDL1抗體之相對高劑量基於先前公開之癌症免疫療法研究。添加I型或II型DGK抑制劑中之任一者顯著提高殺死能力(圖13C)，但不顯著提高腫瘤誘導之IFN分泌(圖13D)。添加SHP1抑制劑，葡萄糖酸銻鈉(SSG)略微抑制低溫mesoCAR T細胞之殺死能力，但顯著提高mesoCAR TIL之殺死能力(圖13E)，以及顯著增加mesoCAR TIL的腫瘤誘導之IFN分泌(圖13F)。對DGK抑制劑及SSG皆進行劑量反應曲線，且使用不直接誘導腫瘤細胞殺死的最高劑量。
綜合而言，此等實驗之結果表明CART活體內功能低下為可逆的。特定言之，調節降低CART功能之抑制劑機制可提高效應功能，且因此可提高治療功效。抑制劑受體之抑制劑(諸如PD-1、LAG3及TIM3)可適用於使用CART之組合療法以提高功效。
實例8：表徵人類meso CAR 產生人類CART-MSLN
自血液樣品分離正常個體之PBMC。用本文所述之含有人類間皮素CAR之慢病毒構築體轉導PBMC。前述實例中描述轉導及培養細胞產生CART-MSLN。產生之CART表現間皮素CAR及scFv構築體，該等 構築體包括M1、M2、M3、M4、M5、M6、M7、M8、M9、M10、M11、M12、M13、M14、M15、M16、M17、M18、M19、M20、M21、M22、M23及M24。亦產生對照CART，包括表現CAR-ss1之CART(鼠類抗間皮素scFv)(用於陽性對照)及抗CD19 CART(用於陰性對照)。
細胞激素分析法
評定藉由腫瘤細胞刺激後之細胞激素產量。表現M5、M11、M17、M21、ss1及CAR19之CART與不同腫瘤細胞株以1：1效應子比目標比率混合，且以每孔50,000個細胞接種。腫瘤細胞株為K562-meso(表現間皮素之CML細胞株)、Ovcar3(卵巢癌)、Ovcar8(卵巢癌)及SW1990(胰腺癌)。24小時後，進行CBA分析以測定IFNγ、TNF、IL-2及IL-4之細胞激素表現及/或分泌。
如圖15A中所示，CART-MSLN21(M21)導致藉由K562-Meso最強活化。CART-MSLN5及CART-MSLN11藉由SW1990刺激產生IFNγ。IL-2之產生/分泌與所測試之CART-MSLN類似(圖15C)。如圖15D中所示，幾乎不存在任何IL-4產量。其他研究亦顯示極極少IL-10產量。
殺死分析法
亦活體外評定CART-MSLN靶向及殺死腫瘤細胞之能力。使用基於螢光素酶之分析法，其使用表現螢光素酶報導子之腫瘤細胞株。目標細胞(腫瘤細胞)以20,000個目標/孔接種。以10：1、5：1、2.5：1及1：1之不同效應子：目標比率添加CART-MSLN。培養細胞20小時，且偵測各孔之發光以測定殺死目標細胞之百分比。螢光素酶表現Ovcar3(卵巢癌)及U87mg(神經膠母細胞瘤)細胞株用作目標細胞。
如圖16A中所示，表現M5、M11、M17及ss1之CART殺死目標腫瘤細胞時類似地良好進行。CART-MSLN21未觀測到殺死。對比而言，神經膠母細胞瘤細胞之任何CART構築體未觀測到殺死(圖16B)。 人類meso CAR組獲得類似結果，其中M11、M5、M17及SS1具有最高特異性Ovcar3細胞殺死(圖17A及圖17B)。
活體內小鼠模型
在Ovcar8異種移植模型中活體內評定CART-MSLN之抗腫瘤活性。第0天，將10×106個Ovcar8細胞皮下植入NSG小鼠中。第14天，靜脈內投與100μl劑量之2×106個CART細胞(表現M5、M11、M17、M21、SS1及CD19之CART，或未經轉導之細胞；總共10×106個T細胞)。在腫瘤細胞植入後，監測小鼠及腫瘤約40天。
此實驗之結果顯示表現M5及M11之CART在此模型中呈現強抗腫瘤活性(圖18)。當與模擬處理組相比時，M5及M11處理之小鼠展現統計顯著腫瘤減小(p<0.05)。
進行第二活體內異種移植實驗以評定第二組CART-MSLN細胞之抗腫瘤活性。10×106個OVCAR8-mcherry細胞注射至NSG小鼠中。腫瘤為150-250mm2時，將小鼠隨機分成處理組。表現M12、M14、M16、M23、ss1、CD19之CART或未經處理之細胞以100μl中10×106個T細胞之劑量注射。約40% T細胞表現CAR，且因此投與劑量時，約4×106個CART細胞傳遞至各動物。此實驗之結果顯示表現人類抗MSLN(M12、M14、M16及M23)之CART對腫瘤生長無作用(圖19)。此等結果與所評定之第一組CART-MSLN之結果一起指示M5及M11相較於所測試之另一CART-MSLN具有特異性抗腫瘤活性，且由此表明其用於癌症療法之其他研究的可能性。此外，CART-SS1在第一異種移植或第二異種移植實驗中不展現任何抗腫瘤活性，進一步指示含有M5及M11之CART-MSLN更有效降低腫瘤生長。
實例9：DGK抑制加強CART功效
前述研究(例如實例6中所述之實驗)已表明CAR T細胞在活體內(例如在腫瘤微環境中)隨時間損失功效。特定言之，注射至腫瘤小鼠 模型中之mesoCAR T細胞在T細胞輸注後自腫瘤分離((例如39天後，下文稱為腫瘤浸潤淋巴細胞，TIL)且評定其相較於新鮮解凍之mesoCAR T細胞的功能性活性。結果顯示在離體殺死分析法及IFNγ釋放分析法中，回應於抗原或CD3/CD28刺激(指示降低之T細胞活化)，自腫瘤分離之mesoCAR T細胞殺死腫瘤細胞之能力降低(圖20A)、IFNg產量降低(圖20B)及ERK信號傳導降低(如藉由西方墨點分析中之磷酸化所示，圖20C)。
可能解釋CAR T細胞活性在活體內隨時間降低之抑制機制包括：可溶性因子(TGFb、PGE2、腺苷、IL10、RAGE配位體等)、細胞與細胞接觸(PD-1、LAG3、CTLA4、TIM3、CD160等)及內源活化誘導之胞內負反饋系統(甘油二酯激酶：α及ζ同功異構物、Egr(2及3)、SHP-1、NFAT2、BLIMP-1、Itch、GRAIL、Cbl-b、Ikaros等)。T細胞活化可誘導諸如DGK之因子。DGK又藉由磷酸化DAG抑制DAG信號傳導。此限制DAG誘導之RAS-ERK-AP1路徑活化，該活化可導致T細胞活化。前述研究已顯示缺乏DGKα或DGKζ之小鼠導致表明增強型信號轉導且呈現更耐失能誘導刺激之CD4T細胞。
活體外細胞毒性及細胞激素釋放分析法
為了研究DGK抑制對CART細胞功效之作用，利用缺失DGK基因DGKα、DGKζ或兩者之轉殖基因小鼠。分離野生型及DGK缺乏小鼠之脾臟T細胞，且使用反轉錄病毒轉導以表現mesoCAR(SS1 BBZ)。 使用MIGR1 CAR作為對照。
使用與先前實例中所述者類似之方法進行細胞毒性分析法。野生型及DGK缺乏(KO)mesoCAR表現細胞在多種效應子：目標比率下培育且定量細胞毒性(殺死之目標細胞%)(圖21)。如圖21中所示，缺失DGK顯著提高CAR T細胞之效應功能，在低效應子：目標比率下尤其如此。
類似地，18小時後，檢查回應於變化效應子：目標比率之目標細胞的IFNγ釋放。如圖22中所示，發現DGK缺失顯著提高mesoCAR T細胞之效應功能，在低效應子：目標比率下尤其如此。
DGK缺乏mesoCAR T細胞相較於野生型mesoCAR T細胞之西方墨點分析顯示增加之ERK磷酸化(圖23)，指示DGK之存在抑制ERK信號傳導，而DGK缺失導致ERK信號傳導增加。DGK缺失背景中ERK信號傳導增加表明抑制DGK導致Ras-ERK-AP1路徑活化，且因此導致T細胞活化。
近期研究已顯示TGFβ儘管干擾RAS/ERK信號轉導但調節腫瘤浸潤CD8 T細胞之功能性，RAS/ERK為DGK缺乏賦予擴充之T細胞作用的相同信號分子。檢驗DGK缺乏mesoCAR T細胞對TGFβ之敏感度。用間皮素表現AE17腫瘤細胞+或-10ng/ml TGFβ培育WT及DGK缺乏mesoCAR T細胞18小時。量測此等T細胞之細胞毒性及IFNg產量。如圖24中所示，WT CAR T細胞中TGFβ將殺死抑制50%(箭頭)。然而，DGK缺失之CAR T細胞中未觀測到此TGFβ誘導之抑制，表明DGK缺乏細胞對TGFβ調節不敏感，且更耐諸如TGFβ之抑制劑刺激，此刻造成T細胞活性提高。
活體內mesoCAR及DGK抑制之治療功能
隨後，在DGK抑制或缺乏情形中檢驗mesoCAR T細胞之治療功效。將AE17meso腫瘤細胞(間皮瘤細胞)皮下注射至C57BL/6小鼠。當腫瘤達到100mm3時(約一週後)，經尾靜脈靜脈內注射10,000,000個mesoCAR T細胞。接著追蹤腫瘤體積至少18天。
DGK缺乏mesoCAR T細胞相較於野生型(WT)mesoCAR及未經處理之細胞展示增強及延長之抗腫瘤活性(圖25A)。特定言之，三種DGK缺乏mesoCAR T細胞中之每一者相較於野生型及未經處理之細胞顯示抑制腫瘤體積生長高達注射後18天。表現mesoCAR之DGKz缺乏 細胞亦顯示相較於小鼠中之野生型meso CAR T細胞保持及增殖更好(圖25B)。
此等結果共同顯示DGK抑制與mesoCAR T細胞處理之組合可改善療法中之mesoCAR T細胞活化及抗腫瘤活性。
實例10：抑制CAR-T細胞之Ikaros加強抗腫瘤能力
CAR T細胞療法中之嚴重障礙中之一者為上調T細胞信號傳導之內源陰性調節因子，諸如二醯基甘油激酶(DGK)。如實例9中所述，CAR T細胞已顯示在活體內隨時損失功效。T細胞功能之負調節因子(諸如DGK)的抑制顯示提高CAR表現T細胞之活性及功能。
T細胞功能之另一重要負調節因子為轉錄因子Ikaros。不同於主要在近端TCR信號傳導中起作用之DGK，Ikaros為藉由募集染色質重塑複合物(諸如Sin3A、CtBP及HDAC)負調節基因表現的鋅指DNA結合蛋白。Ikaros在CD4+ T及細胞CD8+ T細胞中起調節細胞激素產量及細胞溶解功能之作用。
在此實例中，活體外及活體內檢驗具有降低之Ikaros表現的反轉錄病毒轉導之CAR T細胞的抗腫瘤功效。
材料及方法
細胞株.小鼠AE17間皮瘤細胞描述於Jackman等人，J Immunol.2003；171：5051-63)中。藉由慢病毒轉導將人類間皮素引入AE17細胞中。3T3Balb/C細胞購自美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection)。藉由慢病毒轉導具有鼠類FAP之FAP-3T3親本株形成表現小鼠FAP之3T3BALB/C(3T3.FAP)細胞。
動物. 無病原體之C57BL/6小鼠購自Charles River Laboratories Inc.(Wilmington,MA)。Ikaros DN+/-小鼠含有一個野生型Ikaros對偶基因及一個缺失DNA結合域之Ikaros對偶基因(Winandy等人，Cell.1995；83：289-99)。Ikzf1+/-小鼠具有一個野生型Ikaros對偶基因及一個 缺失外顯子7之對偶基因(Avitah1等人，Immunity.1999；10：333-43)。用於全部實驗之動物為6至12週大的雌性小鼠且圈養於無病原體之動物設施中。
一級小鼠T淋巴細胞之分離、轉導及擴展. 一級鼠類脾臟T細胞如製造商(Miltenyi Biotec)建議使用「泛T細胞陰性選擇」套組分離，且在預先塗佈-CD3(1mg/mL)及-CD28(2mg/mL)之24孔板中活化(2mL具有100U/mL IL-2之補充RPMI-1640中4×106個細胞/孔)。48小時後，在塗佈withRetronectin(50μg/mL；Clontech)之24孔板中混合細胞(1×106個細胞/孔)與反轉錄病毒(1mL粗產物病毒清液層)且在室溫下，在1200g下，在無制動下離心45分鐘。培育隔夜後，細胞用50U/mL IL-2擴展額外48小時。
抗原或抗體塗佈之珠粒. 重組間皮素-胞外域蛋白質、牛血清白蛋白(Fisher Scientific)或抗CD3/抗CD28抗體(eBioscience)與甲苯磺醯基活化之4.5μm Dynabeads(Invitrogen,#140-13)根據製造商說明化學交聯。
免疫墨點法. 抗間皮素-CAR轉導之T細胞用BSA、間皮素或抗CD3抗體塗佈之珠粒(2：1珠粒比T細胞比率)培育5及20分鐘。總細胞溶解產物接著製備及免疫墨點用於磷酸化ERK、磷酸化AKT、磷酸化IKK、磷酸化JNK、磷酸化Lck、磷酸化PKC、磷酸化PLC或磷酸化ZAP70。全部抗磷酸基-蛋白質抗體購自Cell Signaling，但抗磷酸基-Lck除外，其購自Sigma Aldrich。至Ikaros之C端反應性山羊抗小鼠抗體(SC-9861)及山羊抗小鼠肌動蛋白抗體(SC-1615)購自Santa Cruz。測定β-肌動蛋白表現水準以校正負荷差異。
細胞毒性及IFN ELISA. AE17、AE17.meso、3T3及3T3.FAP細胞如所述用螢光素酶轉導(Moon等人，Clinical Cancer Research.2011；17：4719-30)。T細胞及目標細胞在指定比率下在96孔圓底板中一式三 份共同培養。18小時後，收集培養物清液層用於使用ELISA之IFN分析(小鼠IFN，BDOpEIA)。藉由使用上述分析法自細胞溶解產物偵測剩餘螢光素酶活性測定經轉導T細胞之細胞毒性(Riese等人，Cancer Res.2013；73：3566-77)。
CAR T細胞轉移至攜帶已建立之腫瘤的小鼠中. 向C57BL/6小鼠的背側-側腹皮下注射2×106個AE17.meso腫瘤細胞。攜帶大型已建立之腫瘤(100-150mm3)的小鼠隨機分配成接受野生型CAR T細胞、Ikaros缺乏CART細胞或其餘未經處理中之任一者(每組至少五隻小鼠，各實驗至少重複一次)。經尾靜脈投與1×107個T細胞。分別藉由電子標尺及測徑規量測腫瘤尺寸。
對於第9天T細胞活性評定，將脾臟及腫瘤如先前所述加工成單細胞懸浮液(Moon等人，Clinical Cancer Research.2014；20(16)：4262-73)。脾細胞及腫瘤單細胞懸浮液在Golgi Stop(BD Biosciences,0.66μl/ml)存在下用可溶性抗CD3/CD28抗體(1.0μg/ml)或佛波醇酯/伊屋諾黴素(PMA/I：30ng/ml,1μM)再刺激4-6小時，接著採集用於流動細胞學分析。
流動細胞學分析法. 針對抗小鼠IFN-γ(XMG1)、抗小鼠CD25(PC61)、抗小鼠IL-2(JES6-1A12)、抗小鼠CD8(53-6.7)、抗小鼠CD44(IM7)及抗小鼠CD4(GK1.5)之螢光染料結合之抗體購自Biolegend.Fixable,Live/Dead Aqua染料(L34957)購自Invitrogen。抗小鼠顆粒酶B(NGZB)及FoxP3(FJK-16s)之螢光染料抗體購自eBioscience。抗小鼠TNF-α(MP6-XT22)及抗小鼠CD69(H1.2F3)之螢光染料抗體購自BD Biosciences。對於胞內細胞激素染色，細胞用Golgi Stop(BD Biosciences,0.66μg/ml)處理4-6小時。採集後，細胞用1%三聚甲醛固定30分鐘，離心分離且用FACS緩衝液洗滌一次。細胞接著用BD Perm洗滌液(BD Biosciences)洗滌2次，接著在室溫下用細胞激素抗體染色 45分鐘。細胞在BD Perm洗滌液中洗滌2次，接著再懸浮於FACS緩衝液中。對於轉錄因子染色，細胞在冰上用螢光染料標記之初級抗體表面染色20分鐘。在FACS緩衝液中洗滌後，用來自eBioscience之Fix/Perm緩衝液固定細胞。固定後，細胞經滲透且用APC抗小鼠FoxP3染色。對於Ikaros染色，在用eBioscience FoxP3套組固定及滲透後使用家兔抗小鼠Ikaros(Abcam,ab26083,1：2000)。用Ikaros抗體染色後，洗滌細胞，接著用PE標記之抗家兔二次抗體(1：2000)染色。染色完成後，在CyanADP(Beckman Coulter)上處理細胞用於流動細胞學分析。
統計分析 .全部統計測試均使用GraphPad Prism進行。雙向ANOVA使用事後測試進行，* p<0.05，** p<0.01，*** p<0.001及**** p<0.0001。資料表示為平均值+/- SEM。
結果 擴充Ikaros含量降低之CAR表現T細胞中之細胞激素產量及細胞溶解介體釋放
由於Ikaros降低之細胞溶解T淋巴細胞(CTL)具有活體外及活體內增強之效應功能(O'Brien等人，J Immunol.2014；192：5118-29)，進行實驗以測試消耗Ikaros是否會提高+CAR T療法之功效。C57BL/6背景中自野生型C57BL/6及Ikaros-haplodeficient小鼠(Ikzf1 +/-)分離之T細胞反轉錄病毒轉導以表現間皮素CAR。離體活化、轉導及在IL2中擴展後，藉由流動式細胞量測術及西方墨點確認相較於野生型(WT)CAR T細胞，Ikzf1 +/- CAR T細胞繼續表現較少Ikaros蛋白質(圖26A)。
因為Ikaros為多種細胞激素基因基因座之轉錄抑制劑(Thomas等人，J Immunol.2007；179：7305-15；Bandyopadhyay等人，Blood.2006；109：2878-2886；Thomas等人，J of Biological Chemistry.2010；285：2545-53；及O'Brien等人，J Immunol.2014；192：5118-29)，其隨後 檢驗Ikaros減少是否導致CAR T細胞產生自分泌細胞激素及亦Ikaros-haplo缺乏CAR T細胞是否比其WT對應物對其目標抗原反應較好。WT及Ikzf1 +/- CAR T細胞皆用塗佈有BSA-(對照)或間皮素(CAR抗原)之珠粒以2：1珠粒：T細胞比率刺激6小時，且藉由流動式細胞量測術分析其產生IFNγ、TNFβ及IL2之能力。基線(BSA刺激)時，IFN產生之Ikzf1 +/- CAR T細胞相較於WT CAR T細胞存在約3倍提高(4.35%對比1.4%，圖26B)，但IL2製造細胞%中無顯著差異(圖26D)。用間皮素塗佈之珠粒刺激後，IFN-γ細胞激素產生Ikzf1 +/- CAR T細胞%顯著增加(25%)，而WT CAR T細胞中之反應適中(7%)。亦可見TNFα產量提高(圖26C)。為了研究細胞激素產量中之此增加廣泛存在於不同刺激或限於CAR抗原，用PMA及伊屋諾黴素處理WT及Ikzf+/- CAR T細胞6小時。在此情形下，Ikzf1 +/- CAR T細胞中相較於其野生型對應物中觀測到更多IFNγ、TNF-β及IL-2細胞激素製造細胞(圖26B-圖26D)。此等資料支持Ikaros為抑制T細胞或CAR T細胞之細胞激素產量的限制因素中之一者。
顯示CD3/CD28活化之Ikaros缺乏OT-I細胞中的重要細胞毒性介體顆粒酶B上調，且此提高其對OVA-表現EL4腫瘤細胞之細胞溶解活性(O'Brien等人，J Immunol.2014；192：5118-29)。假設攜帶CAR之Ikzf+/- T細胞中之顆粒酶B產量亦將提高。WT及Ikzf1 +/- CAR T細胞皆用BSA-(基線)或間皮素-(CAR抗原)塗佈之珠粒以2：1珠粒：T細胞比率刺激6小時。PMA/伊屋諾黴素用作該分析法之陽性對照。類似於上述資料，基線時Ikzf+/- CAR T細胞中之顆粒酶B含量高於WT CAR T細胞(BSA刺激；圖26E)。用間皮素塗佈之珠粒或PMA/伊屋諾黴素刺激後，WT及Ikzf+/- CAR T細胞中之顆粒酶B含量提高，但Ikzf+/- CAR T細胞中之產量高得多(圖26E)。為了判斷伴隨Ikaros降低之CAR T細胞之去顆粒中是否亦存在差異，評定抗原刺激後之CD107a表現。野生 型經轉導T細胞在抗原再刺激後具有中等CD107a表現水準，然而，Ikaros降低之T細胞展示增強之CD107a上調(圖26F)。因此，回應於再刺激，Ikaros降低之CTL相較於其野生型對應物去顆粒較多且釋放更多細胞毒性介體。
用顯性陰性對偶基因耗盡Ikaros提高CAR T細胞功能
除了具有較低Ikaros含量之細胞以外，對來自表現Ikaros之一個顯性陰性對偶基因(IkDN)之小鼠的T細胞進行研究。表現IkDN之轉殖基因小鼠具有正常淋巴性產生但周邊T細胞具有90%降低之Ikaros DNA結合活性(Thomas等人，J Immunol.2007；179：7305-15；及Winandy等人，Cell.1995；83：289-99)。自WT及IkDN小鼠脾臟分離之T細胞用血小板結合之抗CD3/CD28抗體活化，用間皮素CAR轉導，隨後用IL2擴展。藉由western確認IkDN CAR T細胞中之Ikaros基因表現阻斷。WT及IkDN CAR T細胞用BSA或間皮素塗佈之珠粒以2：1珠粒：T細胞比率再攻擊6小時，且分析其產生IFN及IL2之能力，以及回應於CAR抗原之去顆粒。類似於上述Ikzf1 +/-資料，觀測基線時的一些自分泌IFNγ產量(圖27A)，但不具有IL2(BSA刺激；圖27B)。CAR與其目標抗原間皮素接合時，IkDN T細胞比WT T細胞產生更多IFNγ(間皮素刺激；圖27A)。如CD107a上調所量測，野生型及IkDN CAR T細胞中之去顆粒皆類似(圖27D)。
Ikaros消耗不加強抗原刺激後的CAR T細胞之活化及信號傳導
由於Ikaros消耗加強細胞激素釋放及增加顆粒酶B含量及CAR T細胞之CD107a表現，探索可能機制。似乎合理的是，此等效應功能變化可能由野生型及Ikzf1 +/-轉導T細胞之活化差異引起。因此，在使用間皮素塗佈之珠粒刺激6小時及24小時後，藉由流動式細胞量測術量測CD69、CD25及4-1BB(T細胞活化之標記物)的含量。CD69為早期活化標記物，其藉由野生型及Ikzf1 +/-細胞上調至相同程度(圖 28A)。使用較長刺激，野生型及Ikzf1 +/- CAR表現T細胞繼續表現類似含量之CD69，但Ikzf1 +/-轉導T細胞展現提高之CD25表現(圖28B)。此可能不直接指示T細胞活化差異，然而，Ikzf1 +/-細胞增加之IL-2(圖28D)可用於CD25上之陽性前饋環IL-2Ra(Depper等人，Proc Natl Acad of Sci USA.1985；82：4230-4；及Nakajima等人，Immunity.1997；7：691-701)。4-1BB為TNF受體超家族之一員，其亦表現於活化T細胞上(Vinay等人，Seminars in Immunology.1998；10：481-9)且在抗原刺激後由CAR轉導野生型及Ikzf1 +/- T細胞以類似水準表現(圖28C)。因此，吾等WT及Ikzf1 +/-轉導之T細胞之間的功能性差異並非由於T細胞活化差異。
實例9及Riese等人，Cancer Research.2013；73：3566-77中所述之實驗表明消耗CAR T細胞中之酶二醯基甘油激酶(DGK)導致RAS/ERK信號傳導增加，此與增強之CAR T細胞活化良好相關。使用CD3/CD28抗體之TCR刺激後，檢驗WT及Ikaros缺乏T細胞中之一些信號傳導路徑。製備來自經刺激T細胞之溶解產物且針對自TCR之近端(PLC及Lck)及遠端(ERK1/2、JNK、AKT及IKKa)信號傳導中牽涉之多種磷酸基蛋白質進行免疫印記。Ikaros缺乏T細胞中存在一些TCR信號傳導蛋白質的構成性低含量基線活化，包括Lck、ERK及AKT(圖28D)。使用TCR/CD28刺激，比較WT及Ikaros缺乏T細胞時將所研究之全部蛋白質磷酸化至相同程度，但磷酸基-IKK除外，其在刺激後20分鐘中Ikaros缺乏T細胞中略微較高。為了判斷降低之Ikaros含量是否增加T細胞中之NFB路徑，針對IKK之下游目標IB再探測相同印記。WT及Ikaros耗盡T細胞之間的IB分解中不存在差異。為了研究CAR信號傳導，WT及IkDN間皮素CAR轉導T細胞皆使用間皮素塗佈之珠粒再刺激。類似於使用CD3/CD28刺激之資料，PLC及ERK之磷酸化中未發現差異(圖28E)。總之，此等資料指示Ikaros消耗不改變TCR/CAR 介導之信號傳導。
CAR T細胞中之Ikaros減少加強其對其目標細胞之反應.
由於效應因子產量由於具有降低之Ikaros的CAR T細胞增加，因此對其對其目標腫瘤細胞之活體外功效進行測試。表現mesoCAR之野生型Ikzf1 +/-及IkDN T細胞以不同比率與親本腫瘤細胞株AE17或間皮素表現細胞株AE17meso混合。當與親本細胞株混合時，野生型、Ikzf1 +/-及IkDN T細胞未能產生IFN-γ或回應於AE17溶解細胞(圖29A、圖29B及圖29C)。相比之下，當與AE17meso反應時，野生型T細胞之IFN-γ產生及細胞溶解隨著E：T比率增加而增加(圖29B及圖29C)。然而，Ikzf1 +/-及IkDN T細胞皆比野生型T細胞產生顯著更多IFN-γ且具有顯著增加之腫瘤溶解，即使在1.3：1之最低E：T比率下亦如此(圖29B及圖29C)。
為了研究此作用之普遍性，對表現不同CAR構築體之T細胞進行檢驗，該構築體靶向纖維母細胞活化蛋白(FAP-CAR)且具有與上文所用間皮素CAR相同之胞內信號傳導結構域。將自WT C57BL/6分離的相當轉導FAP-CAR脾臟T細胞之功效與來自Ikzf1 +/-小鼠者相比較。Ikzf1 +/- FAP-CAR T細胞更有效溶解3T3。FAP細胞(圖29D)比WT FAP CAR T細胞分泌更多IFN(圖29E)，活體外保留特異性。
消耗Ikaros提高CAR T細胞針對已形成之腫瘤的功效
隨後檢驗Ikaros降低之間皮素特異性T細胞(Ikzf1 +/-及IkDN)控制小鼠中已形成AE17meso腫瘤生長之能力。2,000,000個AE17meso腫瘤細胞注射至同系C57BL/6小鼠側腹且形成大型已形成腫瘤(約100-150mm3)。10,000,000個自WT或Ikaros缺乏(Ikzf1 +/-及IkDN)小鼠製備之CAR T細胞接著過繼轉移至攜帶彼等腫瘤之小鼠中，且隨後量測腫瘤。野生型轉導mesoCAR T細胞誘導輕度腫瘤生長抑制，而Ikzf1 +/-及IkDN轉導mesoCAR T細胞更顯著抑制AE17meso腫瘤生長(圖30A及 圖30B)。
亦研究Ikaros減少是否可提高FAP-CAR T細胞的治療可能性。用10,000,000個野生型或Ikzf1 +/-轉導抗小鼠FAP CAR T細胞過繼轉移具有已形成AE17meso腫瘤(100-150mm3)之小鼠。接受野生型轉導細胞之小鼠提供最小腫瘤延遲且AE17meso腫瘤繼續生長(圖30C)。相比之下，Ikzf1 +/-轉導T細胞能夠顯著延遲腫瘤生長。
Ikzf1+/- CAR T細胞比WT CAR T細胞保持更久且更耐免疫抑制腫瘤微環境
由於Ikaros抑制CAR T細胞之增強之功效，探索使用Ikzf1+/-mesoCAR T細胞之可能機制。為了進一步詢問此等mesoCAR T細胞如何在活體內免疫抑制腫瘤微環境中操作，採集過繼轉移後3及9天之腫瘤且評定其數目及功能性。此兩個時間點允許在抗腫瘤免疫反應期間的較早及較晚時間點表徵其活性。
轉移後第3天，吾人觀測到脾臟(圖31A)及腫瘤(圖31B)中野生型及Ikzf1+/- mesoCAR T細胞的類似頻率。此等類似含量指示野生型及Ikzf1+/- mesoCAR T細胞皆初始地同等良好運輸至腫瘤。評定第9天時間點時，脾臟中之野生型mesoCAR T細胞Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞數目下降。然而，當在此時間點檢驗腫瘤時，Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞數目相較於WT mesoCAR T細胞數目顯著增加(圖31B)。此等資料顯示在免疫抑制微環境中Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞比WT mesoCAR T細胞保持或增殖得好。
腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)回應於其在免疫抑制腫瘤微環境內的同源抗原變得功能低下且為與腫瘤進展有關的關鍵現象(Prinz等人，J Immunol.2012；188：5990-6000；及Kerkar等人，Cancer Res.2012；72：3125-30)。儘管第9天時腫瘤中存在更多Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞，但其仍可受腫瘤微環境不利地影響。為了評估功能性，在轉移後第9 天使用CD3/CD28抗體刺激自野生型及Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞分離之TILS且表徵溶解介體產量差異。轉移後第9天，脾臟中之野生型mesoCAR T細胞繼續產生一些中等含量之IFN(圖31C)。正如所料，來自腫瘤之經分離野生型T細胞相較於自脾臟分離之野生型T細胞產生少得多的此細胞激素。此指示野生型TIL在轉移後第9天開始變得功能低下。相比之下，脾臟Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞在基線及刺激時繼續產生更多IFN(圖31C)。相較於野生型TIL，Ikzf1 +/- TIL產生較高量之IFNγ。此等資料指示Ikzf1 +/- TIL可能對免疫抑制腫瘤微環境較不敏感。
回避TIL中通常所見之TCR信號傳導之近端缺陷(Prinz,PU等人，J.Immunol.2012；188：5990-6000)可藉由使用PMA/伊屋諾黴素(PMA/I)實現(Prinz等人，J Immunol.2012；188：5990-6000)。野生型及Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞使用PMA/I再刺激以判斷對TCR刺激不敏感之野生型及Ikzf1 +/- TIL是否仍能回應於其他刺激產生細胞激素。轉移後第9天，野生型TIL展示IFN-γ產量明顯降低(圖31C)，且此藉由用PMA/I刺激部分恢復(圖31D)。然而，脾臟及腫瘤分離Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞之刺激亦導致IFN-γ含量相較於野生型轉移之細胞增加。藉由經PMA/I刺激回避TCR信號傳導中之任何缺陷，此等結果表明IFNγ在染色質含量中產生不同且可能由於不同的Ikaros功能。
鑒於藉由轉移之Ikzf1 +/- T細胞的抗腫瘤活性增加，亦檢驗對免疫抑制腫瘤微環境之組合物的影響且在第9天評估調節T細胞(Treg)及骨髓衍生抑制細胞(MDSC)之數目。在轉移後第9天，觀測接受野生型或Ikzf1 +/- mesoCAR T細胞之宿主中之類似Treg含量(圖31E)。測定Ly6G-/CD11b+/CD206+巨噬細胞之存在，其通常表徵為免疫抑制及促腫瘤生成M2巨噬細胞。在第9天處理組中，全部3組之CD206表現類似(未處理、野生型及Ikzf1 +/-)(圖31F)。
Ikaros降低之T細胞對可溶性抑制因子TGF及腺苷較不敏感
為了進一步表徵免疫抑制腫瘤微環境與mesoCAR T細胞之相互作用，採用活體外培養系統。諸如IDO、IL-10、腺苷及TGF-β之可溶性抑制因子(Wang等人，Oncoimmunology.2013；2：e26492)已顯示造成抑制浸潤腫瘤淋巴細胞。測試選擇抑制因子對Ikaros缺乏CAR T細胞之活體外作用以判斷免疫抑制環境是否可影響其溶解功能。在TGF-β及腺苷存在下，野生型CAR T細胞產生IFN-γ之能力降低50%且其溶解功能降低(圖32)。Ikaros含量降低之CAR T細胞(Ikzf1 +/-及IkDN)在無抑制劑存在下繼續產生比其野生型對應物多的IFN γ，且在TGF β及腺苷存在下僅少量抑制(圖32A)。觀測到Ikzf1 +/-及IkDN CAR T細胞相較於野生型T細胞溶解功能增加(圖32B)。此等資料表明Ikaros降低之T細胞對TGFβ及腺苷抑制較不敏感。
論述
在此實例中，已鑑別出使CAR表現T細胞能夠存活且提高其於腫瘤環境中之效應功能的新方法：不活化轉錄抑制劑Ikaros，其已知抑制T細胞功能中涉及的不同基因陣列，例如細胞激素基因(IL2及IFNγ)、細胞溶解介體(顆粒酶B)及影響T細胞分化之關鍵T-方框轉錄因子(R-Bet及Eomes)。
上文所述實驗之重要發現為缺乏Ikaros功能之CAR T細胞限制腫瘤生長方面顯著優於野生型CAR T細胞(圖30)。在多個腫瘤模型中且使用兩種不同CAR構築體觀測到此等結果。由於Ikaros調控之大量基因，似乎合理的是Ikaros可調控通常對免疫抑制敏感的許多路徑。藉由降低CAR T細胞中之Ikaros含量增加IFN-g產量可導致腫瘤上之I級MHC表現上調，且藉此改良其免疫原性，改良抗血管生成活性及驅使STAT1介導之Th1細胞功能。增加之IFNγ的可能作用可能為腫瘤內巨噬細胞表現型之替代，然而，未觀測到巨噬細胞總數差異或M2樣 巨噬細胞之比例差異(如藉由CD206表現所量測)。增加之IL-2產量可亦增加CD4 Treg細胞之形成，然而，當比較用WT CAR T細胞處理之腫瘤及Ikaros缺乏CAR T細胞處理之腫瘤時未觀測到差異。
注射九天後，觀測到腫瘤浸潤淋巴細胞數目增加。此不可能由於運輸增加，因為第3天時WT相比於Ikaros缺乏TIL之數目類似。實情為，此等結果表明Ikaros缺乏TIL顯示增加之增殖或降低之抗原誘導細胞死亡(AICD)。活體外研究表明兩種類型之T細胞之間AICD類似，使得差異更可能是由於增加之增殖。此將與此等細胞產生的增加之IL-2相符。除了持久性增加之外，Ikaros缺乏TIL看起來較少功能低下。當腫瘤浸潤CAR T細胞用抗CD3抗體或PMA及伊屋諾黴素再刺激時，Ikaros缺乏之CAR TIL能夠比其野生型對應物產生更多IFNγ(圖31C及圖31D)。
活體外研究允許進一步研究支持觀測到之活體內抗腫瘤功效增加的機理。與已知Ikaros抑制功能相符，缺失一個Ikaros對偶基因(Ikzf+/-)或用Ikaros顯性陰性構築體(IkDN)置換其對偶基因中之一者導致基線自分泌IFNγ及顆粒酶B產量有一定增加之T細胞(圖26)，但更重要的是，在活體外TCR或CAR刺激後顯示顯著增強之細胞激素分泌及顆粒釋放。此伴隨增加之活體外腫瘤細胞殺死。為了測試Ikaros缺乏CAR T細胞是否具有比WT CAR T細胞低的活化臨限值，Dynabeads用少10倍的間皮素蛋白質塗佈且顯示Ikzf+/- CAR T細胞仍可對低密度間皮素抗原起反應以產生IFNγ及TNF-α，但WT CAR T細胞不能。Ikaros停用CAR T細胞亦更耐已知免疫抑制因素(諸如TGF-β及腺苷)抑制(圖32)。此可歸因於細胞激素(亦即IL2及IFNγ及T細胞效應子(亦即顆粒酶B)基因)在TCR/CAR活化後對於Ikaros缺乏T細胞中之轉錄更可及。此看似幫助補償免疫抑制腫瘤微環境內的次佳T細胞活化。
在先前研究中，例如實例9中，CAR T細胞中已藉由DGK消耗觀 測到類似表現型(亦即細胞溶解及IFN產量中之增加)，DGK為代謝第二信使二醯基甘油及限制RAS/ERK活化的酶。然而，隨著DGK缺失，CAR/TCR信號傳導路徑中觀測到明確變化。特定言之，在TCR及CAR活化後，RAS/ERK活化顯著增強。此導致如增加之CD69上調所量測增強之活化，然而產生諸如TRAIL、FasL及IFNγ之效應子分子。WT及DGK缺乏CAR T細胞之間的穿孔素及顆粒酶B類似。此研究中之極不同表現型具有Ikaros缺乏CAR T細胞。與DGK缺乏CAR T細胞相比，Ikaros缺乏CAR T細胞具有如CD69及CD25上調所示之類似CAR/TCR活化(圖28)，及如藉由多個TCR信號傳導分子之磷酸化(圖34)及鈣信號傳導所量測的類似CAR/TCR信號傳導。不同於DGK缺乏T細胞，Ikaros耗盡CAR T細胞在基線時具有較高顆粒酶B及IFN含量(圖26及圖27)，以及構成一些TCR信號傳導級聯(諸如ERK及Akt)之低水準活化(圖28)。此基線活化可歸因於T-bet之誘導(Thomas等人，J of Biol Chemistry.2010；285：2545-53)，其與其他轉錄因子(如Eomes)協作以轉活化IFN及顆粒酶B基因表現(Pearce等人，Science.2003；302：1041-3；及Intelkofer等人，Nat Immunol.2005；6：1236-44)。
此等發現提高治療靶向轉導人類T細胞中之Ikaros(在臨床試驗中)使用遺傳性或生物化學方法可能有益的可能性。遺傳性方法可在小鼠中模擬此等結果且包括使用shRNA阻斷CAR T細胞中之Ikaros的基因表現或使用顯性陰性構築體與內源性Ikaros競爭。另一選項將使用藥理學抑制劑暫時降低Ikaros含量。近期報導已指示免疫調節藥物來那度胺藉由E3連接酶複合物CRL4CRBN使Ikaros靶向泛素介導之分解(Gandhi等人，Br J Haematol.2013；164：811-21；Kronke等人，Science.2014；343：301-5；及Sakamaki等人，Leukemia.2013；28：329-37)。用來那度胺處理之CD3刺激之人類T細胞產生更多IL-2(Gandhi等人，Br J Haematol.2013；164：811-21)，其為Ikaros含量降低之T細胞的關鍵性 狀。在初步研究中，TCR/CD28刺激之間皮素-CAR轉導之人類PBMC在用來那度胺預處理後活體外產生更多IL-2及IFNγ。因此，CAR T細胞療法與活體內投與來那度胺之組合可提供藉由抑制Ikaros逆轉T細胞功能低下之治療策略。
總之，此實例首次表明靶向轉錄抑制劑可提高CAR介導之抗腫瘤免疫性。該機制涉及增強之細胞激素及效應功能而不改變信號轉導。可藉由使用顯性陰性構築體shRNA或藥理學抑制劑(如來那度胺)靶向CAR表現T細胞中之Ikaros將此方法轉譯成臨床。
實例11：人類卵巢癌中之Meso-CART
在此實例中，在晚期復發性嚴重卵巢癌之人類患者中測定靜脈內輸注經轉導以表現間皮素CAR之自體T細胞的安全性。
在規劃I階段研究(如實例3中所述)後建模單個患者治療方案以評定輸注表現間皮素CAR之自體T細胞(mesoCART)的安全性及可行性。來自患者之T細胞轉導以表現CAR，其包含融合至4-1BB及TCRzeta信號傳導結構域的胞外抗間皮素單鏈可變片段(scFv)。向患者輸注3×107個mesoCAR T細胞/m2，總計4.65×107個meso CAR T細胞。在輸注之前不給予具有化學療法之淋巴細胞刪除。
mesoCART輸注不具有急性毒性作用。患者經歷3級雙側胸膜積液、呼吸困難、發熱、低血壓及吸氣。不存在由關閉腫瘤/打開meso CART細胞之目標作用引起的臨床毒性，諸如心包炎或腹膜炎。在輸注後第21天，用托西利單抗(抗IL6)治療患者，該患者基於無法解釋之發熱、需要處理之低血壓、升高之鐵蛋白血清含量(>7000ng/mL)及CRP(>160mg/L)懷疑患有細胞激素釋放症候群(CRS)。
mesoCAR T細胞在周邊血液樣品以及來自肝臟及腹膜之腫瘤樣品中可偵測，在心包及胸膜液中數量最高。細胞激素評估顯示胸膜液內之IL-6顯著增加(增加超過基線>80倍)，在第22至23天達到峰值。血液 評估亦揭示血液中之IL-6含量升高(在第22天增加超過基線15倍)。TNFα或IFNγ含量中未偵測到升高。
初步結果顯示第21天進行的腹部及骨盆之CT影像顯示腹膜癌擴散相較於兩週前之CT影像改良最小。特定言之，一個腫瘤自3.4×3.1cm降低至3.0×2.6cm。左側胸膜液之細胞學在輸注後第8天顯示惡性，但在第21天及第26天，不存在惡性的證據。
此等結果顯示發現無淋巴細胞刪除之meso CART細胞輸注為可行且安全的。不存在輸注毒性，或危及生命之心包炎或腹膜炎的證據。此外，存在惡性胸膜積液消失所證明的治療功效之臨床證據。
實例12：具有變化胞內信號傳導結構域之CAR的短暫表現
在此實例中，檢驗獨特共同刺激結構域於CAR架構中之用途及其對細胞壽命、記憶體分化及細胞代謝特徵的作用。
開發新穎活體外T細胞刺激系統以研究單次CAR特異性刺激之後果及藉由多種CAR信號傳導內結構域分析信號傳導。編碼具有變化之胞內信號傳導結構域CD3ζ、CD28：z及4-1BB：z之抗間皮素SS1-CAR構築體之活體外轉錄之mRNA電穿孔至一級靜止人類T細胞中。藉由此方法獲得超過90% CAR陽性T細胞群體。檢驗CAR表現時，用固定於珠粒上之重組間皮素刺激T細胞，接著培養。因為RNA短暫表現，所以CAR在一輪刺激後自細胞表面消失，允許明確分析藉由單獨CAR之信號傳導(亦即無隨後來自額外間皮素結合事件之信號傳導)。此方法因此避免需要藉由內源性T細胞受體刺激及首次允許藉由CAR T細胞之替代抗原分析信號傳導之後果。此等實驗對一級周邊血液T細胞、經分選原生T細胞及臍帶血細胞進行。
多種CAR構築體(具有CD3ζ之SS-1、具有CD28：z之SS1及具有4-1BB：z之SS1)以等效水準表現於T細胞表面上。全部信號傳導結構域在與表現間皮素之目標細胞一起培養時均展示具有相當及特異性細胞溶 解能力。
藉由含有4-1BBz之CAR刺激之一級T細胞當與基於CD28之CAR時顯示優良存活率及擴展概況。基於4-1BB及CD28之CAR皆展示超過5個群體加倍。然而，基於4-1BB之CAR T細胞活體外增殖較長時間。基於4-1BB之CAR T細胞的表型分析揭示產生具有中樞-記憶體表面標記物之增加之細胞群體。相比之下，基於CD28之CAR迅速分化成CAR T細胞之效應子記憶體池。
含有CD28z之CAR產生顯著較高比例之效應子記憶單元，抑制PD-1、TIM3及LAG3分子之表現相對於其4-1BBz對應物適度提高。不論使用主體周邊血液T細胞、原生(CD45RO-CD95-CD62L+CCR7+分選)周邊血液T細胞或臍帶血T細胞的起始群體，此等結果保持一致。
培養物中使用Sea-Horse分析法(Seahorse Biosciences)的間皮素刺激之CAR T細胞之代謝分析揭示4-1BBz-CAR刺激之細胞中的脂質氧化相較於其CD28z對應物實質性提高。此外，微陣列研究已揭示在藉由不同CAR信號傳導結構域刺激後回收的細胞中之獨特基因簽名。
總之，此等結果顯示CAR T細胞視共同刺激結構域而定呈現不同的存活率及功能。此系統亦考慮新CAR設計之快速特徵化及功能性分析。
實例13：mTOR抑制對老年人中之免疫老化之作用
與老化最明確相關之路徑中之一者為mTOR路徑。已展示，mTOR抑制劑雷帕黴素延長小鼠壽命且改善老齡鼠之多種年齡相關之病狀(Harrison,DE等人，(2009)Nature 460：392-395；Wilkinson JE等人，(2012)Aging Cell 11：675-682；及Flynn,JM等人，(2013)Aging Cell 12：851-862)。因此，此等發現指示mTOR抑制劑可對人類老化及年齡相關之病狀具有有利作用。
在短期臨床試驗時間框中可研究的年齡相關之表型為免疫老 化。免疫老化為老年人中出現的免疫功能減退，導致易感染性增加且對包括流感接種疫苗之接種疫苗的反應降低。免疫功能隨著年齡增長而減退係歸因於免疫缺陷之累積，該等缺陷包括造血幹細胞(HSC)產生原生淋巴細胞之能力下降及對抗原刺激具有缺陷性反應之衰竭PD-1陽性淋巴細胞數量增加(Boraschi,D等人，(2013)Sci.Transl.Med.5：185ps8；Lages,CS等人，(2010)Aging Cell 9：785-798；及Shimatani,K等人，(2009)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106：15807-15812)。老年小鼠中之研究展示使用mTOR抑制劑雷帕黴素治療6週可復原提高原始淋巴細胞產量之HSC功能，提高對流感疫苗接種之反應且延長壽命(Chen,C等人，(2009)Sci.Signal.2：ra75)。
為了評定mTOR抑制對人類年齡相關之表型之作用及mTOR抑制劑RAD001是否改善免疫老化，評估接受RAD001或安慰劑之老年人志願者對流感疫苗之反應。本文所呈現之發現表明RAD001以良好耐受的劑量增強老年人志願者對流感疫苗之反應。RAD001亦降低隨著年齡增長累積的漸進式死亡(PD)-1陽性CD4及CD8 T淋巴細胞之百分比。此等結果顯示mTOR抑制對老年人志願者中之免疫老化具有有利作用。
如本文所述，使用mTOR抑制劑RAD001(雷帕黴素類似物)治療6週改良老年人類志願者對流感疫苗接種之反應。
方法 研究群體
在新西蘭及澳大利亞的9個地點征選無不穩定潛在醫學疾病、年齡>=65歲的老年志願者。篩選時的淘汰準則包括血紅蛋白<9.0g/dL；白血球計數<3,500/mm3；嗜中性白血球計數<2,000/mm3；或血小板計數<125,000/mm3；不受控制的糖尿病；不穩定的局部缺血性心臟病；臨床上顯著的潛在肺部疾病；免疫缺乏或接受免疫抑制療 法之病史；凝血病或需要長期抗凝之醫學病狀的病史；估計腎小球濾過率<30ml/min；存在嚴重不受控制的高膽固醇血症(>350mg/dL，9.1mmol/L)或高三酸甘油酯血症(>500mg/dL，5.6mmol/L)。
治療組之間的基線人口統計資料類似(表8)。218個入選個體中，211人完成研究。七個個體自研究退出。五個個體歸因於不良事件(AE)退出，一個個體撤回知情同意書且一個個體由於違背協定而離開研究。
**身體-質量指數為以千克計之重量除以以公尺計之高度平方
研究設計及執行
自2011年12月至2012年4月，218個老年志願者入選隨機化觀測者設盲安慰劑對照試驗。使用經驗證之自動化隨機取樣系統，以各治療組中5：2之RAD001與安慰劑之比率將個體隨機分入治療組。治療組為：RAD001 0.5mg每天或安慰劑
RAD001 5mg每週或安慰劑
RAD001 20mg每週或安慰劑
試驗為觀測者設盲的，因為RAD001 0.5mg每天及20mg每週之群組中之安慰劑略微不同於彼等群組中之RAD001錠劑。評估個體之 研究人員未看見研究藥物且因此完全不知情。所有群組之治療持續時間均為6週，在此期間個體在診所中每2週經受一次安全性評估。在個體已持續給藥4週之後，量測給藥前及給藥一小時後之RAD001穩態水準。在完成研究藥物之6週療程之後，向個體提供2週無藥物間歇以逆轉任何可能的RAD001誘發之免疫抑制，且隨後提供含有病毒株H1N1 A/California/07/2009、H3N2 A/Victoria/210/2009、B/Brisbane/60/2008的2012年季節性流感疫苗接種(Agrippal®,Novartis Vaccines and Diagnostics,Siena,Italy)。在流感疫苗接種四週之後，收集個體血清以用於流感效價量測。藉由標準血球凝集抑制分析法量測3種流感疫苗病毒株以及2種異源病毒株(A/H1N1病毒株A/New Jersy/8/76及A/H3N2病毒株A/Victoria/361/11)之抗體效價(Kendal,AP等人，(1982)Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance.Atlanta：Centers for Disease Control and Prevention B17-B35)。在如先前所描述之流感疫苗接種之前及流感疫苗接種4週之後取出的血清樣品中量測對A/H1N1/California/07/2009具有特異性之IgG及IgM含量(Spensieri,F.等人，(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110：14330-14335)。結果表示為螢光強度。
所有個體均提供書面知情同意書。根據優良臨床實驗規範(Good Clinical Practice)之原則進行研究且研究經適當的倫理委員會及管理機構批准。
安全性
用於血液學及生物化學安全性評估之不良事件評定及血液收集在研究訪問期間進行。亦在個體在其接受研究藥物之6週期間在家填寫的日誌中收集不良事件資訊。自知情同意書時刻起直至末次研究訪問30天之後收集所有不良事件資料。研究者將事件歸類為輕度、中度或重度。
統計分析
在無資訊先驗分佈之情況下，使用貝氏(Bayesian)回歸模型進行幾何平均效價比率之初步分析。在對數標度上針對各抗體效價擬合此模型。各模型中之初始結果為第84天量測值。第63天量測值包括在結果向量中。使用與先前表述混合之SAS 9.2 proc擬合模型。矩陣之協方差結構被認為是非結構化的(選項類型=UN)。使用平直先驗。就血清轉化率之二次分析而言，使用邏輯回歸。
治療意願群體定義為所有接受至少一種完全劑量之研究藥物且無影響療效資料之主要方案偏差的個體。總計218個入選研究中之個體中199人為治療意願群體。
免疫表型
自3個時間點收集之全血分離周邊血液單核細胞：基線；在研究藥物治療6週之後；及當研究於個體已停止接受研究藥物6週時及在流感疫苗接種4週之後結束時。如先前所描述，在美國加州斯坦福大學人類免疫監測中心(Human Immune Monitoring Center at Stanford University,CA,USA)藉由流動式細胞量測術，使用8種顏色免疫表型圖來分析七十六個PBMC亞群(Maecker,HT等人，(2012)Nat Rev Immunol.12：191-200)。藉由流動式細胞量測術，使用8種顏色凍乾免疫表型圖來分析七十六個PBMC亞群(BD Lyoplate,BD Biosciences,San Diego,CA)。存活率>80%且細胞產量為2×106或大於2×106之PBMC樣品包括在分析中。
針對RAD001給藥群組中之每一者計算基線至研究藥物治療第6週及基線至研究結束(第12週)之免疫表型相對變化。進行斯圖登(Student)T測試以檢查在針對安慰劑作用調整之後各給藥群組內基線至兩個血液取樣時間點之免疫表型相對變化是否分別明顯不等於零。在治療作用分析中未進行遺漏資料插補。因此若患者在基線具有遺漏 表型資料，則此患者不包括在此表型分析中。若患者在6週或12週具有遺漏表型資料，則隨後此患者因受影響之時間點而不在此表型分析中起作用。
在3個給藥組中進行76個表型中之608個測試以將治療作用與安慰劑作用進行比較。實施分層錯誤發現率(FDR)控制方法以控制與多重檢驗相關之誤報之發生又提供顯著更好的功效。細胞類型群組被視為分層因子且分別在各層內進行FDR(q值)計算。在對應q值0.1之0.05顯著性水準下捨棄所有虛無假設。在0.05顯著性水準及對應的q<0.1下拒絕之多重檢驗調整策略確保低於10%之發現為錯誤的。
在第二分析中，免疫表型在合併的治療及安慰劑組之間變化，其中所有三個RAD001給藥組均合併。為了測定哪個免疫表型在治療組與安慰劑組之間變化不同，在基線與研究藥物治療第6週之間及在基線與研究結束(第12週)之間計算各量測表型之患者自身細胞計數比率。比率被轉換為對數，且藉由分析各時間點之協方差來分析比率從而檢測合併治療組與安慰劑組之間的差異。進行76個表型之152個測試以將合併治療作用與安慰劑作用進行比較。實施分層錯誤發現率(FDR)控制方法以控制與多重檢驗相關之誤報之發生又提供顯著更好的功效(Benjamini,Y.等人，(1995)J.Roy.Statist.57：289-300；及Sun,L.等人，(2006)Genet.Epidemiol.30：519-530)。細胞類型群組被視為分層因子且分別在各層內進行FDR(q值)計算。在0.05顯著性水準及對應q值低於20%下拒絕所有虛無假設。此可解釋為僅拒絕P值低於0.05及機率低於20%之彼等假設，各觀測顯著結果歸因於多重檢驗。
結果
一般而言，RAD001為良好耐受的，尤其0.5mg每天及5mg每週之給藥方案。在研究期間未出現死亡。三個經歷四個嚴重不良事件(SAE)之個體被評定為與RAD001無關。4個SAE為先前完成5mg每週 RAD001 6週之6週療程、具有標準血小板計數之個體左眼視網膜出血伴隨後續失明；經安慰劑治療之個體劇烈的背部疼痛及經安慰劑治療之個體之重度胃腸炎。在任何治療組中之發病率均為>2%之治療相關之不良事件(AE)列表提供於表9中。RAD001相關之最常見AE為口腔潰瘍，其在大部分情況下嚴重程度為輕度。總體而言，接受RAD001之個體與經安慰劑治療之彼等個體具有類似的嚴重AE之發病率。僅一個嚴重AE被評定為與用20mg每週RAD001治療之個體之RAD001口腔潰瘍相關。
藉由量測2012年季節性流感疫苗之血清反應來評估RAD001提高老年志願者中之免疫功能的能力。3種流感疫苗病毒株中每一者在基 線及流感疫苗接種4週後之血球凝集抑制(HI)幾何平均效價(GMT)提供於表10中。初始分析變量為HI GMT比率(疫苗接種4週後/基線)。發動研究以能夠表明在3種流感疫苗病毒株中之至少2者中存在1)相對於安慰劑GMT增加1.2倍；及2)經安慰劑校正之GMT比率超過1的後驗機率不低於80%。選擇此終點是因為由MF-59疫苗佐劑誘發的流感GMT比率增加1.2倍與減少流感疾病有關(Iob,A等人，(2005)Epidemiol Infect 133：687-693)。
基線表示流感疫苗接種2週之前
第4週表示流感疫苗接種4週之後
N為每一群組之個體數目
GMT為幾何平均效價
GMT比率為疫苗接種4週後之GMT/基線之GMT
CV%指示變化係數
在意向治療(ITT)群體中，低免疫增強劑量RAD001(0.5mg每日 或5mg每週)群組而非較高劑量(20mg每週)群組符合研究之主要終點(圖33A)。此表明較低劑量之RAD001存在獨特的免疫調節機制及在較高劑量下mTOR抑制之已知免疫抑制作用可開始起作用。此外，結果表明在低免疫增強劑量RAD001治療之後在老年人中提高免疫功能之趨勢。
在亞群分析中，具有低基線流感效價(1：40)之個體子集與ITT群體相比，RAD001相關之效價增加更大(圖33B)。此等資料展示RAD001對增強基線不具有保護性(>1：40)效價且因此患有流感疾病之風險最高之個體的流感疫苗反應尤其有效。
RAD001濃度對比各流感疫苗病毒株效價增加之散佈圖展示倒數曝露/反應關係(圖34)。基於S6激酶(S6K)之mTOR介導性磷酸化之建模及模擬預測在給藥間隔期間20mg每週給藥方案幾乎完全抑制mTOR介導性S6K活性，5mg每週給藥方案抑制S6K活性超過50%且0.5mg每日給藥方案抑制S6K磷酸化約38%(Tanaka,C等人，(2008)J.Clin.Oncol 26：1596-1602)。因此，使用低免疫增強劑量RAD001之部分mTOR抑制(例如mTOR介導性S6K磷酸化)可能即使不比使用較高劑量RAD001之幾乎完全mTOR抑制對增強老年人之免疫反應更加有效，也與其同樣有效。
亦評估流感疫苗接種4週之後的血清轉化率。血清轉化定義為陰性疫苗接種前效價(亦即HI效價<1：10)至疫苗接種後HI效價1：40或相比於非陰性(1：10)疫苗接種前HI效價增加至少4倍的變化。在意向治療群體中，相比於安慰劑群組，RAD001群組之H3N2及B型病毒株之血清轉化率升高，雖然該升高不符合統計顯著性(表11)。在基線流感效價<=1：40之個體亞群中，RAD001治療亦提高H3N2及B型病毒株之血清轉化率且在每日0.5mg給藥群組中，就B型病毒株而言此等結果達到統計顯著性。此等資料進一步展示RAD001增強老年人對流感疫 苗接種之血清反應。
*RAD001與安慰劑之間的血清轉化幾率比明顯不等於1(藉由治療作為固定作用之邏輯回歸獲得之雙側p值<0.05)
當前季節性流感疫苗通常無法提供對以先前流行病毒變異體形式呈現之不斷出現的流感病毒株之足夠的保護。然而，相比於安慰劑，在mTOR抑制劑雷帕黴素存在下接受抗流感疫苗接種之小鼠產生更廣泛的流感血清反應。較廣泛血清反應包括由多種流感亞型表現之保守性抗原決定基之抗體，其提供抗疫苗中未含有之流感異源病毒株感染的保護(Keating,R等人，(2013)Nat Immunology 14：2166-2178)。為了測定RAD001是否增強老年志願者對流感之血清反應，量測流感疫苗中未含有之2種流感異源病毒株(A/H1N1病毒株A/New Jersey/8/76及A/H3N2病毒株A/Victoria/361/11)的HI效價。相比於安慰劑群組，RAD001群組中之異源病毒株之HI GMT比率增加更大(圖35)。另外，相比於安慰劑群組，RAD001群組中之異源病毒株之血清轉化率更高。就H3N2異源病毒株而言，每週5mg及20mg RAD001給藥群組中之血清轉化率之增加為統計顯著的(表12)。彙聚RAD001群組之H3N2血清轉化率為39%對比安慰劑群組為20%(p=0.007)。本文所呈現之結果表明mTOR抑制增強老年志願者對流感疫苗接種之血清反應且提高季節性流感疫苗中未含有之流感異源病毒株之抗體效價。
用雷帕黴素處理之小鼠中之流感異源病毒株血清反應的增強與B細胞中之類別轉換之抑制及抗流感IgM含量增加有關(Keating,R.等人，(2013)Nat Immunol 14：2166-2178)。然而，類別轉換抑制可能並未參與用RAD001治療之人類之增強的血清反應，因為RAD001治療群組與安慰劑治療群組之間的疫苗接種後抗流感IgM及IgG含量並無不同(圖36)。
*RAD001與安慰劑之間的血清轉化幾率比明顯不等於1(藉由治療作為固定作用之邏輯回歸獲得之雙側p值<0.05)
為了探尋RAD001增強老年志願者中之免疫功能之機制，在基線、在研究藥物治療6週之後及流感疫苗接種4週之後(在研究藥物停止6週之後)自個體獲得之PBMC樣品上進行免疫表型分析。雖然大多數PBMC子集百分比在RAD001群組與安慰劑群組之間並無不同，但相比於安慰劑群組，RAD001群組中之PD-1陽性CD4及CD8細胞百分比更低(圖37)。PD-1陽性CD4及CD8細胞隨著年齡增長而累積且對抗原刺激具有缺陷性反應，因為PD-1抑制T細胞受體誘發之T細胞增殖、細胞因子產生及溶細胞功能(Lages,CS等人，(2010)Aging Cell 9：785-798)。隨時間推移安慰劑群組中之PD-1陽性T細胞百分比增加。在第12週(疫苗接種4週後)此增加可歸因於流感疫苗接種，因為已展示流感病毒增加PD-1陽性T細胞(Erikson,JJ等人，(2012)JCI 122：2967-2982)。然而，在所有RAD001群組中，相比於基線，在第6 週及第12週之CD4 PD-1陽性T細胞百分比下降(圖37A)。在兩個較低劑量RAD001群組中，相比於基線，在第6週及第12週之CD8 PD-1陽性T細胞百分比亦下降(圖37B)。評估PD-1陰性CD4 T細胞百分比且相比於安慰劑群組，RAD001群組中之PD-1陰性CD4 T細胞百分比升高(圖37C)。
在更嚴格的統計分析下，其中針對基線PD-1表現差異彙聚且調整RAD001群組之結果，相比於p=0.03(q=0.13)之安慰劑群組(n=25)，在彙聚RAD群組(n=84)中在第6週PD-1陽性CD4 T細胞存在30.2%之統計顯著下降(圖38A)。相比於安慰劑群組，在第12週彙聚之RAD群體中之PD-1陽性CD4 T細胞下降32.7%，其中p=0.05(q=0.19)。圖38B展示相比於安慰劑群組(n=25)，在第6週彙聚RAD001群組(n=84)中之PD-1陽性CD8 T細胞有37.4%之統計顯著下降，其中p=0.008(q=0.07)。相比於安慰劑群組，在第12週彙聚RAD001中之PD-1陽性CD8 T細胞下降41.4%，其中p=0.066(q=0.21)。因此，圖37及圖38之結果共同表明RAD001相關之PD-1陽性CD4及CD8 T細胞百分比下降可有助於增強免疫功能。
結論
總之，本文所呈現之資料展示如藉由流感疫苗接種反應所評定，mTOR抑制劑RAD001改善人類老年人年齡相關之免疫功能減退，且此改善係經由可接受之風險/效益平衡獲得。在老年小鼠之研究中，使用mTOR抑制劑雷帕黴素處理6週不僅增強流感疫苗接種反應而且延長壽命，表明免疫老化之改善可能是對老化相關之表型更廣泛作用的標誌。
因為RAD001給藥在疫苗接種2週之前停止，RAD001之免疫增強作用可藉由在藥物處理停止之後持續的相關細胞群體之變化介導。本文所呈現之結果展示相比於安慰劑，RAD001降低耗盡PD-1陽性CD4 及CD8 T細胞百分比。PD-1表現由TCR信號傳導誘發且在包括慢性病毒感染之持續性抗原刺激之環境中保持高量。雖然不希望受理論束縛，但RAD001可能減少老年志願者中之慢性免疫活化且從而導致PD-1表現下降。如已針對免疫親和素環孢靈A所報導，RAD001亦可直接抑制PD-1表現(Oestreich,KJ等人，(2008)J Immunol.181：4832-4839)。RAD001誘發之PD-1陽性T細胞百分比下降可能提高T細胞反應品質。此與展示在小鼠及靈長類動物中mTOR抑制提高記憶CD8 T細胞疫苗接種反應品質的先前研究(Araki,K等人，(2009)Nature 460：108-112)一致。在老齡小鼠中，亦展示mTOR抑制增加造血幹細胞數目，導致原生淋巴細胞產量提高(Chen,C等人，(2009)Sci Signal 2：ra75)。雖然在此實例中未檢測到RAD001群組與安慰劑群組中之原生淋巴細胞百分比的顯著差異，但可進一步研究此可能機制。
可進一步研究RAD001增強流感異源病毒株血清反應的機制。亦展示流感疫苗接種之後雷帕黴素抑制B細胞中之類別轉換。因此，產生抗流感抗體之唯一抗體庫，其促進抗流感疫苗中未含有之流感病毒亞型致死性感染之交叉病毒株保護(Keating,R等人，(2013)Nat Immunol.14：2166-2178)。本文所述之結果未展示RAD001改變流感疫苗接種2週之前停止RAD001之老年個體中之B細胞類別轉換。雖然需要進一步闡明潛在機制，但本文所描述之提高的異源流感病毒株血清反應可在季節性疫苗與團體中之流行流感病毒株之間存在不佳匹配時增強數年內之流感疾病保護。
RAD001對流感抗體效價之作用與經批准增強老年人流感疫苗接種反應之MF59疫苗佐劑的作用相當(Podda,A(2001)Vaccine 19：2673-2680)。因此，如老年人中之有MF59佐劑之流感疫苗所表明，RAD001推動之流感疫苗接種抗體反應的增強可轉變為臨床效益(Iob,A等人，(2005)Epidemiol Infect.133：687-693)。然而，RAD001亦用於 抑制器官移植患者之免疫反應。此等看起來反常的發現提高mTOR抑制劑之免疫調節作用可為劑量及/或抗原依賴性的可能性(Ferrer,IR等人，(2010)J Immunol.185：2004-2008)。本文中可見倒數RAD001曝露/疫苗接種反應關係的趨勢。完全mTOR抑制有可能經由標準親環蛋白-雷帕黴素機制抑制免疫功能，而歸因於獨特的年齡相關之表型抑制，部分mTOR抑制至少在老年人中增強免疫功能。相關地，在包括老化動物模型中之造血幹細胞的多種組織中mTOR活性得到提高(Chen C.等人，(2009)Sci Signal 2：ra75及Barns,M.等人，(2014)Int J Biochem Cell Biol.53：174-185)。因此，與mTOR活性之更完全抑制相反，將mTOR活性調低至年輕組織中可見之水準，對於老化適應症可具有臨床效益。
諸如RAD001之mTOR抑制劑在治療年齡相關之病症時的安全概況一直備受關注。呈腫瘤學或器官移植適應症中所使用之劑量之RAD001的毒性包括口腔炎、腹瀉、噁心、血球減少症、高脂質血症及高血糖症之發病率，其對多種年齡相關之病症而言將為不可接受的。然而，此等AE與血液中之RAD001之最低含量相關。因此，選擇此研究中所使用之RAD001給藥方案以使最低含量最小化。每天0.5mg、每週5mg及每週20mg給藥群組之平均RAD001最低含量分別為0.9ng/ml、低於0.3ng/ml(量化下限)及0.7ng/ml。此等最低含量明顯低於與用於器官移植及癌症患者之給藥方案有關的最低含量。另外，限制為6週之治療療程降低了不良事件之風險。此等發現表明用於此研究中之給藥方案可具有就老年人之一些病狀而言可接受之風險/效益。儘管如此，在本文所描述之實驗中，即使當給藥低至每天0.5mg時，大量個體亦罹患口腔潰瘍。因此，低免疫增強劑量之RAD001的安全概況保證了進一步研究。與當前可獲得之雷帕羅吉相比，具有更清楚安全概況之mTOR抑制劑的發展可在將來為年齡相關之病狀提供 更好的治療選擇。
實例14：增強老年人個體中之疫苗免疫反應
老年人免疫功能降低導致感染之發生率提高且疫苗接種反應降低。作為測定mTOR抑制是否在人類中具有抗老化作用之第一步驟，如藉由老年志願者對疫苗接種之反應所評定，進行隨機化安慰劑對照試驗來測定mTOR抑制劑RAD001是否逆轉年齡相關之免疫功能減退。在所有情況下，獲得適當的專利同意書及研究經國家衛生管理局(national health authority)批准。
在研究中使用以下3種RAD001給藥方案：每週20mg(最低含量：0.7ng/ml)
每週5mg(最低含量低於偵測極限)
每天0.5mg(最低含量：0.9ng/ml)
選擇此等給藥方案是因為其具有與經批准用於移植及腫瘤學病症之RAD001劑量相比更低的最低含量。最低含量為體內藥物之最低含量。與每天10mg腫瘤學給藥方案有關之RAD001最低含量為約20ng/ml。與每天兩次0.75mg至1.5mg移植給藥方案有關之最低含量為大約3ng/ml。相比而言，與吾人之免疫接種研究中所使用之給藥方案有關的最低含量低3至20倍。
因為RAD001相關之AE與最低含量有關，所以預測3種給藥方案就標準志願者而言具有足夠的安全性。另外，預測3種劑量產生一系列mTOR抑制。P70 S6激酶(P70 S6K)為藉由mTOR磷酸化之下游目標。P70 S6K磷酸化水準用作mTOR活性之量度。基於在RAD001之臨床前及臨床研究中所獲得之P70 S6K磷酸化資料之建模及模擬，預計每週20mg幾乎完全抑制mTOR活性持續一整週，而預計每週5mg及每天0.5mg部分抑制mTOR活性。
將年齡>=65歲之老年志願者隨機分成3個RAD001治療組(每組50 個個體)或安慰劑組(每組20個個體)中之一者。用研究藥物治療個體6週，提高2週間歇，且隨後接受流感(Aggrippal,Novartis)及肺炎球菌(Pneumovax 23,Merck)疫苗接種。在疫苗接種4週之後，藉由流感疫苗中之3種流感病毒株(H1N1、H3N2及B型流感亞型)之血球凝集抑制分析，藉由量測幾何平均效價(GMT)來評定流感疫苗接種反應。研究之主要終點為(1)安全性及耐受性及(2)相比於安慰劑，在疫苗接種4週之後2/3之流感疫苗病毒株流感效價增加1.2倍。選擇此終點是因為流感效價增加1.2倍與疫苗接種後流感疾病減少有關，且因此臨床上相關。每週5mg及每天0.5mg之劑量為良好耐受的且不同於每週20mg之劑量，其符合GMT主要終點(圖33A)。在老年志願者中，相比於安慰劑，RAD001不僅提高流感疫苗接種反應，其亦提高肺炎球菌疫苗接種反應。肺炎球菌疫苗含有來自23肺炎球菌血清型之抗原。在吾人之個體中量測7種血清型之抗體效價。相比於安慰劑，在所有3個RAD群組中，6/7種血清型之抗體效價提高。
經組合之流感及肺炎球菌效價資料表明部分(低於80%至100%)mTOR抑制與更完全mTOR抑制相比，對逆轉年齡相關之免疫功能減退更有效。
實例15：低劑量mTOR抑制提高能量及運動
在臨床前模型中，使用雷帕羅吉雷帕黴素之mTOR抑制提高老齡鼠中之自發物理活性(Wilkinson等人Rapamycin slows aging in mice.(2012)Aging Cell；11：675-82)。相關地，亦報導在給藥一年之後進行的問卷調查中，相比於安慰劑，在實例2中所述之每天0.5mg給藥群組中的個體能量及運動能力提高(圖39)。此等資料表明使用雷帕羅吉之部分mTOR抑制除免疫功能外還對年齡相關之發病可具有有利作用。
實例16：使用RAD001之P70 S6激酶抑制
進行建模及模擬以預測預計部分抑制mTOR活性之RAD001之每天及每週劑量範圍。如上文所提及，mTOR使P70 S6K磷酸化且P70 S6K為與老化最緊密相關之mTOR之下游目標，因為基因剔除P70 S6K延長壽命。因此，對部分抑制P70 S6K活性之RAD001之劑量進行建模。預計在>=0.1mg及<20mg範圍內之每週給藥實現P70 S6K活性之部分抑制(圖40)。
就每天給藥而言，30pM至4nM之RAD001濃度部分抑制細胞株中之P70 S6K活性(表13)。預計用>=0.005mg至<1.5mg之每天RAD001劑量實現此等血清濃度。
結論
使用mTOR抑制劑劑量治療年齡相關之發病或一般增強免疫反應的方法僅部分抑制P70 S6K。使用低劑量之RAD001之部分mTOR抑制在老化適應症中之療效為出人意料的發現。在每週>=0.1mg至<20mg與每日>=0.005mg至<1.5mg之間的RAD001劑量範圍將實現部分mTOR抑制且因此預期對年齡相關之發病率或增強免疫反應具有療效。
實例17：卵巢癌中之MSLN CART
在如實例8中所述之活體內卵巢腫瘤小鼠模型中預先評定2×106個間皮素CAR T細胞之單次劑量的抗腫瘤活性。為了觀察此如實例8中所述之模型中M5及M11 CAR T細胞的抗腫瘤活性是否可能提高，在腫瘤植入14天後當腫瘤體積平均為150mm3時以4×106個間皮素CAR T細胞之較高劑量投與CAR T細胞，且投與隨訪相同劑量之CAR T細胞。五天後，一半小鼠給予第二相同劑量之CAR T細胞，以觀察此舉 是否會提高此模型中先前觀察到的抗腫瘤活性。
材料及方法：
細胞株： OVCAR8為來源於64歲患有卵巢腺癌之女性患者且已經轉導以表現mCherry之人類卵巢癌細胞株。細胞在含有10%胎牛血清之RMPI培養基中生長。此細胞株在組織培養燒瓶中生長黏附。當在側腹中皮下植入且與基質膠混合時，此細胞株在小鼠中形成腫瘤。在植入期間向細胞中添加基質膠以使基質在小鼠側腹中發展，提供腫瘤細胞開始在上面生長之結構。經10-12天，基質膠栓降解且剩餘之實體腫瘤由腫瘤細胞及周圍基質細胞形成。OVCAR8細胞經修飾以表現mCherry，使得腫瘤細胞生長亦可藉由小鼠之影像監測。
小鼠： 6週大NSG(NOD.Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl /SzJ)小鼠自Jackson Laboratory(庫存編號005557)收到。在實驗之前使動物在Novartis NIBRI動物設施中適應新環境至少3天。根據Novartis ACUC法規及準則處理動物。在腫瘤植入之前，在左側腹植入用於動物標識之電子應答器。在腫瘤植入之前，將小鼠之右側腹刮毛。
腫瘤植入： 用0.25%胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶化之後採集對數期之OVCAR8細胞。細胞在50ml離心管中在1200rpm下洗滌5分鐘，在生長培養基中一次，接著在冷無菌PBS中兩次。細胞以每毫升100×106之濃度再懸浮於PBS中且保持於冰上。含有細胞之PBS溶液接著與基質膠1：1混合，產生最終濃度為每毫升PBS-基質膠50×106個細胞。將細胞置於冰上且立即植入小鼠中。將200μl腫瘤皮下植入至右側腹中。
OVCAR8模型內源性表現間皮素且因此可用於測試間皮素引導之CAR T細胞的活體內功效。當皮下植入小鼠側腹中時此模型生長良好且可用測徑規量測腫瘤體積量測值。植入PBS與基質膠之50：50混合物中的10×106個腫瘤細胞後，形成腫瘤且可在一週內精確量測。13-15 天內，平均腫瘤體積為100-200mm3，60-65天時腫瘤達到最終體積(1000-1200mm3)。通常在腫瘤完全移植且基質膠再吸收後測試治療劑之抗腫瘤活性。因此，此模型存在可觀測CAR T細胞之抗腫瘤活性的大窗。
CAR T細胞給藥： 腫瘤植入14天後向小鼠給予4×106個CAR T細胞(13.3×106個總T細胞)。細胞在37℃水浴中部分解凍，接著藉由向含有細胞之試管中添加1ml冷無菌PBS完全解凍。經解凍之細胞轉移至15ml離心試管且用PBS調整至10ml之最終體積。在1000rpm下洗滌細胞兩次，每次10分鐘，接著在血球計上計數。接著將T細胞以每毫升冷PBS 133×106個細胞的濃度再懸浮，且保持於冰上直至給予小鼠。以每隻小鼠4×106個CAR T細胞劑量(13.3×106個總T細胞)經尾部靜脈向小鼠靜脈內注射100μl T細胞。每組七隻小鼠用100μl單獨PBS(PBS)或用同型CAR轉導之T細胞(同型)處理。每組14隻小鼠用SS1間皮素CAR T細胞、M5間皮素CAR T細胞或M11間皮素CAR T細胞處理。五天後，SS1、M5及M11組分成兩半且每組七隻小鼠用相同第二劑量之CAR T細胞處理。各組識別為SS1單次(一次SS1 CAR T細胞劑量)、SS1二次(兩次SS1 CAR T細胞劑量)、M5單次(一次M5 CAR T細胞劑量)、M5二次(兩次M5 CAR T細胞劑量)、M11單次(一次M11 CAR T細胞劑量)、M11二次(兩次M11 CAR T細胞劑量)。同型T細胞、SS1 T細胞、M5 T細胞及M11 T細胞均自相同供體平行製備。
動物監測： 每天監測小鼠之健康狀況，包括每週兩次體重量測。如下計算體重變化百分比：(BW現在-BW初始)/(BW初始)×100%。每週藉由測徑規量測監測腫瘤2-3次且使用橢球公式計算腫瘤體積(TV)：TV(mm3)=((長度×寬度2)×3.14159))/6。腫瘤體積報導為平均值+/-平均值之標準誤差(SEM)。治療/對照百分比(T/C)值使用下式計算： 若△T0，則T/C%=100×△T/△C；若△T<0，則回歸%=100×△T/T初始；其中T=藥物處理組在研究最後一天的平均腫瘤體積；T初始=藥物處理組在開始給藥當天之平均腫瘤體積；△T=藥物處理組在研究最後一天的平均腫瘤體積-藥物處理組在開始給藥當天之平均腫瘤體積；C=對照組在研究最後一天的平均腫瘤體積；及△C=對照組在研究最後一天的平均腫瘤體積-對照組在開始給藥當天之平均腫瘤體積。100%-42%範圍內之T/C值解釋為不具有或幾乎不具有抗腫瘤活性；42%且>10%之T/C值解釋為抗腫瘤活性或腫瘤生長抑制。T/C值10%或回歸值-10%解釋為腫瘤停滯。<-10%之回歸值報導為回歸。
結果：
在皮下卵巢腺癌異種移植模型中評定間皮素CAR T細胞之抗腫瘤活性。在第0天腫瘤細胞植入之後，腫瘤攜帶小鼠隨機分成治療組且在第14天在腫瘤植入後經側面胃部靜脈靜脈內投與4×106個CAR T細胞(13.3×106個總T細胞)。5天後向一半小鼠給予第二相同劑量之T細胞。監測腫瘤生長及動物健康直至動物到達終點。在第57天至第62天，當腫瘤開始顯示潰爛跡象導致動物身體條件評分改變時，向全部組中之小鼠實施安樂死。
在圖43中繪製全部處理組之平均值+/-SEM腫瘤體積。不接受任何T細胞之PBS處理組展示皮下植入NSG小鼠中之基線OVCAR8腫瘤生長動力學。同型處理組接受用對照CAR轉導之T細胞。此等細胞用作T細胞對照以顯示此模型中人類供體T細胞之非特異性反應。PBS及同型處理組在此研究全程皆顯示連續腫瘤進展。同型組顯示略微緩慢之腫瘤生長，因為供體T細胞之背景活性。類似於前述研究，4×106個CAR+ T細胞之單次劑量導致SS1處理組之腫瘤生長無變化。二次給藥 SS1 CAR T細胞類似地導致OVCAR8腫瘤生長無變化。M5及M11單次給藥組明確顯示抗腫瘤活性，與其先前給予2×106個CAR+ T細胞時一樣。M5及M11二次給藥組皆顯示相較於單次給藥組提高之抗腫瘤活性。此等組中之腫瘤顯示與腫瘤生長抑制相對之消退。M5二次劑量組展示七隻小鼠中有四隻完全消退，多個時間點無可量測之腫瘤。
第52天計算對比同型組之腫瘤體積改變(△T/C%)，其為腫瘤潰爛引起之小鼠移除之前的最後腫瘤體積量測。表14顯示各組之△T/C值。SS1單次及二次給藥組皆顯示無抗腫瘤活性，類似於PBS對照處理組。M5單次給藥組顯示△T/C值為30.28%之腫瘤生長抑制，而M5二次給藥組顯示回歸值-63.90%之消退。M11單次給藥組顯示△T/C值為52.91%之最小抗腫瘤活性，而M11二次給藥組亦展示回歸值為-15.80%之消退。
論述：
此研究展示間皮素特異性CAR T細胞(M5及M11)當在初始T細胞劑量五天後第二次給藥時能夠導致OVCAR8腫瘤消退。此反應連同單次給予M5及M11 CAR T細胞後的抗腫瘤活性均為持久的。此外，M5二次劑量組中七隻小鼠中有四隻展示完全消退，藉由測徑規或觸診量測不到腫瘤。
如上文可見，例如實例8中，單次給予2×106個M5或M11 CAR T 細胞之CAR T細胞顯示NSG小鼠中OVCAR8異種移植模型中的抗腫瘤活性及停滯程度。在此研究中，單次給予4×106個M5或M11 CAR T細胞顯示相同結果。相較於同型CAR T細胞或SS1 CAR T細胞，M5及M11組即使作為單次劑量亦顯示明確抗腫瘤活性(圖43)。投與第二劑量之SS1 CAR T細胞不顯示增加之抗腫瘤反應。然而，投與第二劑量之M5或M11 CAR T細胞導致提高之抗腫瘤反應且導致此兩組中之腫瘤消退。
M5及M11 CAR T細胞的增加之抗腫瘤活性可歸因於若干機制。首先為較大劑量之CAR T細胞實現OVCAR8模型中之消退。將CAR T細胞之劑量提高至例如8×106個CAR T細胞(例如單次給藥中)可提高抗腫瘤活性及導致消退。另一機制為額外劑量之CAR T細胞改善抗腫瘤活性及腫瘤消退。舉例而言，初始劑量可因為CAR T細胞之擴展及T細胞產生細胞激素導致一些抗腫瘤活性。在五天後細胞仍進行擴展時給予額外劑量(例如第二劑量)可因先前投與CAR T細胞已產生之細胞激素提高細胞活性。
此外，前述研究已顯示CAR T細胞浸潤至OVCAR8腫瘤中。亦在已接受二次劑量之CAR T細胞之小鼠中研究CAR T細胞浸潤以判斷是否存在CD8+(細胞毒性)T細胞之較大浸潤。亦藉由分析此等小鼠之脾臟及骨髓中之細胞來評估CAR T細胞之持久性。
實例18：藉由氫-氘交換質譜之抗原決定基定位
進行氫-氘交換(HDX)質譜以預測促成scFv構築體SS1及M5識別抗原決定基的間皮素區域。在HDX中，目標蛋白之醯胺主鏈之氫交換為氘。目標蛋白與結合蛋白(例如抗體)之間的相互作用「保護」目標蛋白之區域不被溶劑接近，藉此預防目標蛋白與結合蛋白之間界面處的氫交換。因此，HDX質譜可用於探測定位蛋白質結合界面，例如預測抗體之抗原決定基。
如實例2中所述，藉由針對SS1的基於SPR之抗原決定基分組的scFv構築體M5、M11、M12、M14、M16、M17、M21及M23之分析指示M5及M11結合於與SS1不同之抗原決定基。為了洞察可由SS1及M5結合之人類間皮素區域，如下進行HDX質譜。
表現質體之選殖
分別在5'及3'處使用限制位置HindIII及EcoRI將對應於間皮素之胺基酸Val 297-Gly 588的DNA片段(Uniprot Q13421)選殖至哺乳動物表現載體中。隨後，在對應於胺基酸METDTLLLWVLLLWVPGSTGDAAQPAASE(SEQ ID NO：376)之胺基端插入分泌信號。在羧基端，亦插入對應於胺基酸TRGSGKPIPNPLLGLDSTRTGHHHHHHHHHHHH(SEQ ID NO：377)之V5-His標籤。三個預定糖基化位置突變：N388Q、N496Q及N523Q。下文提供最終表現序列：糖基化缺乏間皮素(296-588；N388Q、N496Q、N523Q) (SEQ ID NO：378)
對應於M5 IgG之scFv(例如SEQ ID NO：43)類似地選殖至具有N端前導序列MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO：379)及C端八個組胺酸純化標籤GSHHHHHHHH(SEQ ID NO：380)之哺乳動物表現載體中。下文提供最終表現序列： (SEQ ID NO：381)
蛋白質表現及純化
間皮素及scFv M5皆在CMV啟動子控制下表現於Expi293表現系統(Life Technologies)中。使用Opti-MEM培養基(Life Technologies)中之1mg各經純化質體及5mg聚乙烯亞胺(PEI)將間皮素及scFv質體以2.3×106個細胞/mL之密度及>97%之活力共轉染至2L Expi293細胞中。間皮素亦遵照類似方案單獨轉染但使用1mg質體DNA及2.5mg PEI轉染至1L細胞中。轉染進行5天，接著當活力達到80%時採集細胞。
活力降至80%後，收集細胞及改良性培養基及在4000×g下旋轉10分鐘。改良性培養基接著經0.22μM過濾器過濾以清除任何殘渣，接著在4℃下與Roche's完全His-標籤純化樹脂一起攪拌隔夜。總計3mL珠粒添加至scFv-M5/間皮素改良性培養基中且1.5mL珠粒添加至單獨間皮素培養基中。
第二天早晨，將珠粒裝載至Bio-Rad Econo管柱上且用15管柱體積之50mM Tris.Cl pH=8.0，300mM NaCl，接著8管柱體積之50mM Tris.Cl pH=8.0、300mM NaCl、20mM咪唑洗滌。接著自具有50mM Tris.Cl pH=8.0、300mM NaCl、250mM咪唑之管柱溶離蛋白質。收集經溶離樣品且濃縮至6mL，且在20mM HEPES pH=7.4、150mM NaCl中裝載至連接至AKTAxpress(GE)之Superdex 75 16/60管柱上。收集對應於預期尺寸之間皮素：M5複合物或單獨間皮素之溶離物且濃縮至5mg/mL。
藉由氫-氘交換/質譜之抗原決定基定位
氫-氘交換(HDx)與質譜(MS)(Woods VL,Hamuro Y(2001)High Resolution,High-Throughput Amide Deuterium Exchange-Mass Spectrometry(DXMS)Determination of Protein Binding Site Structure and Dynamics：Utility in Pharmaceutical Design.J.Cell.Biochem.Supp.；84(37)：89-98.)之組合用於定位scFv抗體M5及SS1在人類間皮素 (296-588)(在本文中稱為hMSLN296-588(SEQ ID No 278))上之假定結合位點。在HDx中，蛋白質之可交換醯胺氫置換為氘。此過程對蛋白質結構/動力學及溶劑可接近性敏感，且因此能夠在配位體結合時經歷氘攝入減少之位置上報導。
使用與文獻中所述類似之方法進行HDx/MS實驗(Chalmers MJ,Busby SA,Pascal BD,He Y,Hendrickson CL,Marshall AG,Griffin PR(2006)Probing protein ligand interactions by automated hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.Anal.Chem.；78(4)：1005-1014.Chalmers,2006)。在Waters HDx/MS平台上進行實驗，該平台包括LEAP自動取樣器、nanoACQUITY UPLC及Synapt G2質譜儀。用於用氘標記hMSLN296-588之蛋白質主鏈的氘緩衝液為25mM HEPES、150mM NaCl，pH 7.4；溶液中之全部氘百分比為94.5%。對於無抗體存在之hMSLN296-588氘標記實驗，在4℃下使用100μl氘緩衝液稀釋400pmol hMSLN296-588(6.9μl體積)15分鐘。接著在2℃下用100μl冷凍淬滅緩衝液淬滅標記反應物三分鐘，隨後注射至LC-MS系統上用於自動胃蛋白酶消化及肽分析。
對於無scFv M5存在之hMSLN296-588氘標記實驗，在4℃下用100μl氘緩衝液稀釋400pmol與M5共表現之hMSLN296-588(6.9μl體積)持續15分鐘。接著在2℃下用100μl冷凍淬滅緩衝液淬滅標記反應物三分鐘，隨後注射至LC-MS系統上用於自動胃蛋白酶消化及肽分析。對於無scFV SS1存在之hMSLN296-588氘標記實驗，400pmol hMSLN296-588與480pmol SS1 scFv組合。在4℃下用hMSLN296-588培育SS1 30分鐘後，在4℃下使用100μl氘緩衝液稀釋6.9μl總體積15分鐘。接著在2℃下用100μl冷凍淬滅緩衝液淬滅標記反應物三分鐘，接著注射至LC-MS系統上用於自動胃蛋白酶消化及肽分析。
全部氘交換實驗均使用0.5M TCEP及3M脲(pH=2.6)淬滅。淬滅 後，在12℃下使用Poroszyme固定胃蛋白酶管柱(2.1×30mm)對經交換抗原進行線上胃蛋白酶消化，隨後捕捉於Waters Vanguard HSS T3捕捉管柱上。肽自捕捉管柱溶離且使用2至35% B之二元8.4分鐘梯度(移動相A為99.9%水及0.1%甲酸；移動相B為99.9%乙腈及0.1%甲酸)在40μl/min流動速率下在Waters BEH C18 1×100mm管柱(維持於1℃下)上分離。
藉由氘交換實驗監測的來自hMSLN296-588之肽指示於圖44(每個條表示一種肽)。實現hMSLN296-588的超過80%覆蓋率。
對於結合及未結合狀態之抗體(M5或SS1)之間的不同實驗，提供檢查兩種狀態之間的氘攝取差異的資訊。在圖45A及圖45B中，負值指示間皮素-抗體複合物相對於單獨間皮素經歷較少氘攝取。氘攝取降低可能由於保護區域免於可交換氘或氫鍵網路之穩定。相比之下，正值指示複合物相對於單獨間皮素經歷較多氘攝取。氘攝取提高可能由於氫鍵網路之穩定(亦即蛋白質局部去摺疊)。
若1)差異大於0.75Da或差異等於或小於0.75Da之情形中，2)當使用圖克測試(Tukey test)時差異大於0.2Da且統計顯著(p<0.01)，則apo間皮素與SS1或M5複合之間皮素之間的不同氘交換視為顯著。參見例如Houde D,Berkowitz SA,Engen JR(2010)The Utility of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry in Biopharmaceutical Comparability Studies.J.Pharma.Sci.；100(6)：2071-2086；Chalmers,MJ,Pascal BD,Willis S,Zhang J,iturria SJ,Dodge JA,Griffin PR(2011)Methods for the Analysis of High Precision Differential Hydrogen Deuterium Exchange Data Int.J.Mass Spectrom.；302(1-3)：59-68。
圖45A顯示間皮素上之胺基酸位置297至464處M5-間皮素複合物(黑色條)之不同氘攝取及SS1-間皮素複合物(灰色條)的不同攝取。此 區上M5結合至間皮素不產生保護且觀測到一些極微小不穩定。相比之下，SS1結合至間皮素在以下肽中引起顯著保護：297-315、315-322、316-325、337-346、337-349、350-375及369-376。肽297-315、315-322、316-325、337-346、337-349中之保護與公開之結晶學結構相符，在該結構中殘基E313、F317、K319、P343及Y346形成抗原決定基之顯著部分(Ma J,Tang WK,Esser L,Pastan I,Xia D(2012)Recognition of Mesotehlin by the Therapuetic Antibody MORAb-009 J.Biol.Chem.；(287)40：33123-33131.)。圖45B顯示間皮素上胺基酸位置458-586的不同氘攝取。在此區域上，M5之結合在以下肽中引起顯著保護：481-490、483-490、498-510、501-507、531-540、532-540、532-546、537-546、545-558、546-569、547-560、558-571、561-572。藉由比較重疊肽之保護，推斷M5-間皮素複合物中之區域485-490、498-507、532-537及545-572收到顯著保護。相比之下，SS1-間皮素複合物在使用上述準則明顯保護之區域458-586中不含有任何肽。
圖46提供M5及SS1複合物之經保護區域的概述。此等資料指示M5專門保護間皮素之C端側，且胺基酸殘基485-490、498-507、532-537及545-572可促成M5-間皮素相互作用。相比之下，SS1專門保護間皮素之N端側且SS1保護之區域及M5保護之區域中未觀測到重疊。針對SS1及M5觀測的兩種獨特保護模式指示M5可能結合與SS1所結合不同之抗原決定基。預期M11結合於與M5類似之區域？M11及M5具有高度同源性I，輕鏈及重鏈皆包括相同CDR3區域。
等效物
本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容皆以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考特定態樣揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不悖離本發明之真實精神及範疇的情況下 設計本發明之其他態樣及變化。隨附申請專利範圍意欲理解為包括所有此類態樣及等效變化。
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<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 377
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 380
<210> 381
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 381
<210> 382
<211> 132
<212> PRT
<213> 智人
<400> 382
<210> 383
<211> 108
<212> PRT
<213> 智人
<400> 383
<210> 384
<211> 93
<212> PRT
<213> 智人
<400> 384
<210> 385
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 385
<210> 386
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 386
<210> 387
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 387
<210> 388
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 任何胺基酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (78)..(78)
<223> 任何胺基酸
<400> 388
<210> 389
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 389
<210> 390
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人
<400> 390
<210> 391
<211> 383
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成多肽
<400> 391
<210> 392
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 392
<210> 393
<211> 1149
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成聚核苷酸
<400> 393
<210> 394
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 394
<210> 395
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 395
<210> 396
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 396
<210> 397
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 397
<210> 398
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 398
<210> 399
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<400> 399
<210> 400
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成7xHis標籤
<400> 400
<210> 401
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成8xHis標籤
<400> 401
<210> 402
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列之描述：合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> L-精胺醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (2)..(2)
<223> 甘胺醯基
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> L-β-天冬胺醯基
<400> 402

Claims (110)

  1. 一種編碼嵌合性抗原受體(CAR)之經分離核酸分子，其中該CAR包含：i)包含人類抗間皮素結合域之抗體或抗體片段，ii)跨膜結構域，及iii)包含刺激結構域之胞內信號傳導結構域，且其中該抗間皮素結合域包含包含表5中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)中之一或多者及包含表4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)中之一或多者。
  2. 如請求項1之經分離核酸分子，其包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，其中LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3包含表5中所列之胺基酸序列。
  3. 如請求項1之經分離核酸分子，其包含HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3包含表4中所列之胺基酸序列。
  4. 如請求項1之經分離核酸分子，其包含LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，其中LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3包含表5中所列之胺基酸序列，及HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3包含表4中所列之胺基酸序列。
  5. 如請求項1之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域包含表2中所列之任一輕鏈可變區的胺基酸序列。
  6. 如請求項1之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域包含表2中所列之任一重鏈可變區的胺基酸序列。
  7. 如請求項1之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域包含表2中所列之任何輕鏈可變區及表2中所列之任何重鏈可變區的胺基 酸序列。
  8. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域為scFv。
  9. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域包含輕鏈可變區，其包含與表2中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列或與表2中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
  10. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該抗間皮素結合域包含重鏈可變區，其包含與表2中所提供之重鏈可變區之胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列或與表2中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
  11. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼抗間皮素結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列。
  12. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該抗間皮素結合域之該核酸序列包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：87、SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO： 94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：110，或與其具有95-99%一致性之序列。
  13. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼CAR包括跨膜結構域，其包含選自由以下組成之群的蛋白質的跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
  14. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼跨膜結構域包含序列SEQ ID NO：6。
  15. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼跨膜結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：6相比包含至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾的胺基酸序列或與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有95-99%一致性之序列。
  16. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該跨膜結構域之該核酸序列包含序列SEQ ID NO：17或與其具有95-99%一致性之序列。
  17. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼抗間皮素結合域利用鉸鏈區連接至跨膜結構域。
  18. 如請求項17之經分離核酸分子，其中該經編碼鉸鏈區包含SEQ ID NO：2或與其具有95-99%一致性之序列。
  19. 如請求項17之經分離核酸分子，其中編碼該鉸鏈區之該核酸序列包含序列SEQ ID NO：13或與其具有95-99%一致性之序列。
  20. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其進一步包含編碼共同刺激結構域之序列。
  21. 如請求項20之經分離核酸分子，其中該共同刺激結構域為獲自選自由以下組成之群的蛋白質的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)及4-1BB(CD137)。
  22. 如請求項20或21之經分離核酸分子，其中該經編碼共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：7。
  23. 如請求項20或21之經分離核酸分子，其中該經編碼共同刺激結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：7具有95-99%一致性之序列。
  24. 如請求項20或21之經分離核酸分子，其中編碼該共同刺激結構域之該核酸序列包含序列SEQ ID NO：18或與其具有95-99%一致性之序列。
  25. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。
  26. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及/或序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10。
  27. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該胞內信號傳導結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有95-99% 一致性之序列。
  28. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中該經編碼胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10，其中包含該胞內信號傳導結構域之該等序列在相同框架中表現且呈單個多肽鏈形式。
  29. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其中編碼該胞內信號傳導結構域之該核酸序列包含序列SEQ ID NO：18或與其具有95-99%一致性之序列，及/或序列SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21或與其具有95-99%一致性之序列。
  30. 如前述請求項中任一項之經分離核酸分子，其進一步包含前導序列。
  31. 如請求項32之經分離核酸分子，其中該前導序列包含SEQ ID NO：1。
  32. 一種經分離多肽分子，其由如請求項1至32中任一項之核酸分子編碼。
  33. 如請求項32之經分離多肽，其包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83、SEQ ID NO：84、SEQ ID NO：85及SEQ ID NO：86。
  34. 一種經分離嵌合性抗原受體(CAR)分子，其包含人類抗間皮素結合域、跨膜結構域及胞內信號傳導結構域。
  35. 如請求項34之經分離CAR分子，其包含i)包括人類抗間皮素結合 域之抗體或抗體片段，ii)跨膜結構域及iii)胞內信號傳導結構域。
  36. 如請求項34或35中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域不與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域競爭結合人類間皮素。
  37. 如請求項34至36中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域與包含以下之抗原結合域競爭：a)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素結合域序列的一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素結合域序列的一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)；b)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素輕鏈胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素重鏈胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3；或c)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之序列。
  38. 如請求項34至37中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域結合至與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域所靶向之人類間皮素之抗原決定基不同的人類間皮素抗原決定基。
  39. 如請求項34至38中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域結合至人類間皮素之C端。
  40. 如請求項39之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域結合SEQ ID NO：278之胺基酸450-588內的抗原決定基。
  41. 如請求項40之經分離CAR分子，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO：278之胺基酸485-490、498-507、532-537或545-572或其任何子集或組合。
  42. 如請求項34至41中任一項之經分離CAR分子，其中該人類抗間皮素結合域包含一或多個包含表5中所列之胺基酸序列的輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及一或多個包含表4中所列之胺基酸序列的重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
  43. 如請求項34至42中任一項之經分離CAR分子，其包含具有表5中所列之胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3。
  44. 如請求項34至43中任一項之經分離CAR分子，其包含具有表4中所列之胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
  45. 如請求項34至44中任一項之經分離CAR分子，其包含具有表5中所列之胺基酸序列的LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及包含表4中所列之胺基酸序列的HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3。
  46. 如請求項59至45中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域為scFv。
  47. 如請求項34至46中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域包含表2中所列之胺基酸序列的輕鏈及重鏈。
  48. 如請求項34至47中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域包含：輕鏈可變區，其包含與表2中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列或與表2中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列。
  49. 如請求項34至48中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域包含重鏈可變區，其包含與表2中所提供之重鏈可變區的胺 基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列或與表2中所提供之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
  50. 如請求項34至49中任一項之經分離CAR分子，其中該抗間皮素結合域包含選自由以下組成之群的序列：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62，或與其具有95-99%一致性之序列。
  51. 如請求項34至50中任一項之經分離CAR分子，其中該跨膜包含選自由以下組成之群的蛋白質之跨膜結構域：T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3 ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137及CD154。
  52. 如請求項51之經分離CAR分子，其中該跨膜結構域包含序列SEQ ID NO：6。
  53. 如請求項51之經分離CAR分子，其中該跨膜結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：6相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾的胺基酸序列或與胺基酸序列SEQ ID NO：6具有95-99%一致性之序列。
  54. 如請求項34至53中任一項之經分離CAR分子，其中該人類抗間皮素結合域利用鉸鏈區連接至跨膜結構域。
  55. 如請求項54之經分離CAR分子，其中該鉸鏈區包含SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：36，或與其具有95-99%一致性之序列。
  56. 如請求項34至55中任一項之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含編碼共同刺激結構域之序列。
  57. 如請求項56之經分離CAR分子，其中該共同刺激結構域包含選自由以下組成之群的蛋白質的功能性信號傳導結構域：OX40、CD2、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、CD278(亦稱為「ICOS」)及4-1BB(CD137)。
  58. 如請求項56或57之經分離CAR分子，其中該共同刺激結構域包含序列SEQ ID NO：7。
  59. 如請求項56或57之經分離CAR分子，其中該共同刺激結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾的胺基酸序列或與胺基酸序列SEQ ID NO：7相比具有95-99%一致性之序列。
  60. 如請求項34至59之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含4-1BB之功能性信號傳導結構域及/或CD3 ζ之功能性信號傳導結構域。
  61. 如請求項60之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及/或序列SEQ ID NO：9。
  62. 如請求項60之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及/或序列SEQ ID NO：10。
  63. 如請求項34至55中任一項之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過20、10或5個修飾之胺基酸序列，或與胺基酸序列SEQ ID NO：7及/或胺基酸序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有95-99%一致性之序列。
  64. 如請求項34至55中任一項之經分離CAR分子，其中該胞內信號傳導結構域包含序列SEQ ID NO：7及序列SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10，其中包含該胞內信號傳導結構域之該等序列在相同框架中表現且呈單個多肽鏈形式。
  65. 如請求項59至64中任一項之經分離CAR分子，其進一步包含前導序列。
  66. 如請求項65之經分離CAR分子，其中該前導序列包含胺基酸序列SEQ ID NO：1或與胺基酸序列SEQ ID NO：1具有95-99%一致性之序列。
  67. 一種人類抗間皮素結合域，其包含SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62中之任何抗間皮素結合域的一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62中之任何人類抗間皮素結合域的一或多個重鏈互補決定區1(HC CDR1)、重鏈互補決定 區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)。
  68. 如請求項67之人類抗間皮素結合域，其中該人類抗間皮素結合域為包含以下胺基酸序列之輕鏈及重鏈的scFv：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61及SEQ ID NO：62。
  69. 如請求項67或68之人類抗間皮素結合域，其中該人類抗間皮素結合域包含：輕鏈可變區，其包含與：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62中所提供之輕鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列，或與：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO： 60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62中之胺基酸序列具有95-99%一致性之序列；及/或重鏈可變區，其包含與：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62中所提供之重鏈可變區的胺基酸序列相比具有至少一個、兩個或三個修飾但不超過30、20或10個修飾的胺基酸序列；或與：SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：46、SEQ ID NO：47、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61或SEQ ID NO：62中之胺基酸序列具有95-99%一致性的序列。
  70. 一種人類抗間皮素結合域，其中該抗間皮素結合域不與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域競爭結合人類間皮素。
  71. 如請求項70之人類抗間皮素結合域，其中該抗間皮素結合域與包含以下之抗原結合域競爭：a)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素結合域序列的一或多個輕鏈互補決定區1(LC CDR1)、輕鏈互補決定區2(LC CDR2)及輕鏈互補決定區3(LC CDR3)，及選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素結合域序列的一或多個重鏈互補決定 區1(HC CDR1)、重鏈互補決定區2(HC CDR2)及重鏈互補決定區3(HC CDR3)b)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素輕鏈胺基酸序列之LC CDR1、LC CDR2及LC CDR3，及選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之抗間皮素重鏈胺基酸序列之HC CDR1、HC CDR2及HC CDR3；或c)選自SEQ ID NO：43及SEQ ID NO：49之序列。
  72. 如請求項70或71中任一項之人類抗間皮素結合域，其中該抗間皮素結合域結合至與包含具有SEQ ID NO：279之序列的抗原結合域所靶向之人類間皮素抗原決定基不同的人類間皮素抗原決定基。
  73. 如請求項70至72中任一項之人類抗間皮素結合域，其中該抗間皮素結合域結合至人類間皮素之C端。
  74. 如請求項73之人類抗間皮素結合域，其中該抗間皮素結合域結合SEQ ID NO：278之胺基酸450-588內的抗原決定基。
  75. 如請求項74之人類抗間皮素結合域，其中該抗原決定基包含SEQ ID NO：278之胺基酸485-490、498-507、532-537或545-572或其任何子集或組合。
  76. 一種載體，其包含編碼如前述請求項中任一項之CAR的核酸分子。
  77. 如請求項76之載體，其中該載體係選自由以下組成之群：DNA、RNA、質體、慢病毒載體、腺病毒載體或反轉錄病毒載體。
  78. 如請求項76或77之載體，其進一步包含啟動子。
  79. 如請求項78之載體，其中該啟動子為EF-1啟動子。
  80. 如請求項79之載體，其中該EF-1啟動子包含序列SEQ ID NO：11。
  81. 如請求項76至78中任一項之載體，其中該載體為活體外轉錄之載體。
  82. 如請求項81之載體，其中該載體中之該核酸序列進一步包含聚(A)尾。
  83. 如請求項81中任一項之載體，其中該載體中之該核酸序列進一步包含3'UTR。
  84. 一種細胞，其包含如請求項76至83中任一項之載體。
  85. 如請求項84之細胞，其中該細胞為人類T細胞。
  86. 如請求項85之細胞，其中該T細胞為CD8+ T細胞。
  87. 一種製備細胞之方法，其包含用如請求項76至83中任一項之載體轉導T細胞。
  88. 一種產生RNA工程改造細胞之群體的方法，其包含將活體外轉錄之RNA或合成RNA引入至細胞中，其中該RNA包含編碼如前述請求項中任一項之CAR分子的核酸。
  89. 一種在哺乳動物中提供抗癌免疫性之方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之表現如前述請求項中任一項之CAR分子的細胞。
  90. 如請求項89之方法，其中該細胞為自體T細胞。
  91. 如請求項89或90之方法，其中該細胞為同種異體T細胞。
  92. 如請求項89至91中任一項之方法，其中該哺乳動物為人類。
  93. 一種治療患有與間皮素表現有關之疾病的哺乳動物的方法，其包含向該哺乳動物投與有效量之包含如前述請求項中任一項之CAR分子的細胞。
  94. 如請求項93之方法，其中該與間皮素表現有關之疾病係選自增生性疾病，諸如癌症或惡性或癌變前病狀，或為與間皮素表現有關之非癌症相關適應症。
  95. 如請求項93至94之方法，其中該疾病為選自由以下組成之群的與間皮素有關之癌症：間皮瘤、惡性胸膜間皮瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、鱗狀細胞肺癌或大細胞肺癌、胰臟癌、胰管腺癌、胰臟轉移癌、卵巢癌、結腸直腸癌及膀胱癌，或其任何組合。
  96. 如請求項93至95中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞與提高表現CAR分子之細胞之功效的藥劑組合投與。
  97. 如請求項93至96中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞與改善一或多種與投與表現CAR分子之細胞有關之副作用的藥劑組合投與。
  98. 如請求項93至97中任一項之方法，其中該等表現CAR分子之細胞與治療與間皮素有關之疾病的藥劑組合投與。
  99. 如請求項1至31中任一項之經分離核酸分子，如請求項32至33中任一項之經分離多肽分子、如請求項34至66中任一項之經分離CAR、如請求項67至75中任一項之抗間皮素結合域、如請求項76至83中任一項之載體或如請求項84至86中任一項之細胞，其用作藥劑。
  100. 如請求項1至31中任一項之經分離核酸分子、如請求項32至33中任一項之經分離多肽分子、如請求項34至66中任一項之經分離CAR、如請求項67至75中任一項之抗間皮素結合域、如請求項76至83中任一項之載體或如請求項84至86中任一項之細胞，其用於治療表現間皮素之疾病。
  101. 如請求項84至86中任一項之細胞，其進一步表現包含第一多肽之抑制分子，該第一多肽包含抑制分子之至少一部分且與包含來自胞內信號傳導結構域之正信號的第二多肽有關。
  102. 如請求項101之細胞，其中該第一多肽包含PD1之至少一部分且 該第二多肽包含共同刺激結構域及胞內信號傳導結構域。
  103. 如請求項96之方法，其中該藥劑為mTOR抑制劑且向該個體投與低免疫增強劑量之mTOR抑制劑，例如RAD001或雷帕黴素(rapamycin)。
  104. 如請求項103之方法，其中該mTOR抑制劑為RAD001。
  105. 如請求項103之方法，其中該劑量包含異位及催化mTOR抑制劑。
  106. 如請求項103之方法，其中該mTOR抑制劑之投與時間期足以在該個體之周邊血液中或自該個體分離之T細胞製劑中降低PD-1陽性T細胞之比例、增加PD-1陰性T細胞之比例或提高PD-1陰性T細胞/PD-1陽性T細胞之比率。
  107. 如請求項103之方法，其中該待工程改造以表現CAR之免疫效應細胞(例如T細胞)係在低免疫增強劑量之mTOR抑制劑投與足夠時間之後或投與充分劑量之後採集，使得該個體中或自該個體採集之PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)之含量或PD1陰性免疫效應細胞(例如T細胞)/PD1陽性免疫效應細胞(例如T細胞)之比率已至少短暫增加。
  108. 如請求項103之方法，其中mTOR抑制劑之劑量與例如藉由p70 S6激酶抑制法所量測的至少5%但不超過90%之mTOR抑制性有關。
  109. 如請求項103之方法，其中該mTOR抑制劑之劑量與例如藉由p70 S6激酶抑制所量測的至少10%但不超過40%之mTOR抑制性有關。
  110. 一種治療患有與間皮素表現有關之疾病的個體之方法，其包含向該個體投與有效量之包含如請求項1至31中任一項之核酸的細胞，其中該核酸使用活體外轉錄法引至T細胞或NK細胞中，且該 個體初始先接受投與包含該核酸之細胞，及隨後一或多次投與包含該核酸之細胞，其中該隨後一或多次投與係在該前一次投與之後小於15天，例如14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2天投與。
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