CN109797171A - 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 - Google Patents

经修饰的t细胞、其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因编辑和肿瘤免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR‑T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。

Description

经修饰的T细胞、其制备方法及用途
本申请是申请号为201880002752.8、申请日为2018年5月8日、发明名称为“经修饰的T细胞、其制备方法及用途”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因编辑和肿瘤免疫疗法领域。具体而言，本发明涉及通过基因编辑制备经修饰的T细胞例如CAR-T细胞的方法，以及通过所述方法制备的经修饰的T细胞及其用途。
背景技术
T细胞在抗肿瘤免疫中发挥重要作用。然而，在肿瘤患者体内，局部的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)含量很少，其获取和体外扩增比较困难，且CTL的亲和力低，限制了其在肿瘤的临床治疗中的应用。
T细胞过继转移是近年来获得较高关注的特异性、低毒性的抗肿瘤方法，包括例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对T细胞进行遗传修饰是最常用的生成肿瘤特异性T细胞的方法。
TCR基因转移技术是从肿瘤反应性T细胞中克隆TCR的α和β链，通过基因工程技术，以逆转录病毒或慢病毒作为载体，对初始T细胞进行抗原特异性TCR修饰，从而赋予T细胞特异性识别和杀伤肿瘤细胞的能力，并提高T细胞与肿瘤的亲和力。利用TCR基因转移技术对患者自体来源的T细胞进行TCR基因修饰，经体外扩增，获取大量具有特异高效识别能力的T细胞，再过继回输给肿瘤患者，使之在体内发挥抗肿瘤作用。
CAR由胞外结构域、铰链、跨膜结构域和胞内结构域组成，所述胞外结构域通常衍生自单链可变片段(scFv)，所述胞内结构域具有一个、两个或三个(分别对应于第一、二、三代CAR)衍生自CD3Z和/或共刺激分子信号传导结构域(Kakarla and Gottschalk,2014)。尽管CAR-T细胞疗法在治疗CD19阳性的恶性血液肿瘤的早期临床研究中获得成功(Davialaet al,2014；Lee et al,2015；Maude et al,2014)，然而用CAR-T细胞靶向实体瘤抗原的临床应答非常有限。
因此，仍然需要获得能够有效抑制或杀伤肿瘤尤其是实体瘤的T细胞。
发明内容
在一方面，本发明提供一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中抑制性蛋白表达的步骤。
在一些实施方案中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3、Tim3及其组合。
在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1和TIM3的组合，PD1和CTLA-4的组合，PD1和LAG3的组合，CTLA-4和TIM3的组合，CTLA-4和LAG3的组合，TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和CTLA-4的组合，PD1、CTLA-4和LAG3的组合，CTLA-4、TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和LAG3的组合，或PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3的组合。
在一些实施方案中，通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统实施所述减少或消除。
在一些实施方案中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。
在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞内选自SEQ ID NO:5、6、13、17、22-26中一或多种的核苷酸序列。
在一些实施方案中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述CAR包含针对间皮素的scFv(P4)、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供一种通过本发明的方法制备的经修饰的T细胞。
在另一方面，本发明提供一种修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述T细胞中的抑制性蛋白的表达被减少或消除。
在一些实施方案中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3、Tim3及其组合。
在一些实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1和TIM3的组合，PD1和CTLA-4的组合，PD1和LAG3的组合，CTLA-4和TIM3的组合，CTLA-4和LAG3的组合，TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和CTLA-4的组合，PD1、CTLA-4和LAG3的组合，CTLA-4、TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和LAG3的组合，或PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3的组合。
在一些实施方案中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，所述肿瘤相关抗原选自CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。
在一些实施方案中，所述所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一些实施方案中，所述所述CAR包含针对间皮素的scFv(P4)、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、和CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方案中，所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供本发明的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物，包含本发明的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。
在本发明各方面的实施方案中，所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法或药物组合物治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。
在另一方面，本发明还提供试剂盒，其用于通过本发明的方法制备经修饰的T细胞。
附图说明
图1显示靶向LAG-3的sgRNA的设计和筛选。
图2显示敲除LAG-3对T细胞的影响，其中T-CTRL-UE和T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的T细胞，而LAG-3-KO表示RNP处理的T细胞。
图3显示在CAR-T细胞中敲除LAG-3的结果。
图4显示体外评估敲除LAG-3对CAR-T细胞的影响，其中CAR-T-CTRL-UE和CAR-T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的细胞，而LAG-3-KO-CAR-T表示RNP处理的细胞。
图5显示敲除LAG-3的CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用。
图6显示靶向CTLA-4的sgRNA的设计和筛选。
图7显示敲除CTLA-4对T细胞的影响，其中T-CTRL-UE和T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的T细胞，而CTLA-4-KO表示RNP处理的T细胞。
图8显示在CAR-T细胞中敲除CTLA-4的结果。
图9显示体外评估敲除CTLA-4对CAR-T细胞的影响，其中CAR-T-CTRL-UE和CAR-T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的细胞，而CTLA-4-KO-CAR-T表示RNP处理的细胞。
图10显示敲除CTLA-4的CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用。
图11显示靶向Foxp3的sgRNA的设计和筛选。
图12显示敲除Foxp3对T细胞的影响，其中T-CTRL-UE和T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的T细胞，而Foxp3-KO表示RNP处理的T细胞。
图13显示在CAR-T细胞中敲除Foxp3的结果。
图14显示体外评估敲除Foxp3对CAR-T细胞的影响，其中CAR-T-CTRL-UE和CAR-T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的细胞，而Foxp3-KO-CAR-T表示RNP处理的细胞。
图15显示敲除Foxp3的CAR-T细胞的体内抗肿瘤作用。
图16显示靶向Tim3的sgRNA的设计和筛选。
图17显示敲除Tim3对T细胞的影响，其中T-CTRL-UE和T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的T细胞，而Tim3-KO表示RNP处理的T细胞。
图18显示敲除Tim3对CAR-T细胞的影响，其中CAR-T-CTRL-UE和CAR-T-CTRL-E表示未经受或经受电穿孔的细胞，而Tim-3-KO-CAR-T表示RNP处理的细胞。
图19显示在CAR-T细胞中敲除PD1。
图20显示PD1敲除的抗-Meso CART细胞在体内能执行效应子功能。
图21显示PD1敲除的抗-Meso CART细胞在体外能执行效应子功能。
图22显示不同CAR结构。
图23显示具有不同CAR结构的CAR-T细胞的作用。
图24显示检测PD-1、LAG-3和/或TIM3基因的敲除效率。
图25显示PD-1、LAG-3和/或TIM3基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞(H226-PDL1-luci)的作用。
图26显示PD-1、LAG-3和/或TIM3基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞(CRL5826-PDL1)的作用，高效靶比(4:1)。
图27显示PD-1、LAG-3和/或TIM3基因敲除的P4 CAR-T细胞高效靶比对靶细胞(CRL5826-PDL1)的作用，低效靶比(0.1:1)。
图28显示显示PD-1、LAG-3和/或TIM3基因敲除的P4 CAR-T细胞对靶细胞(CRL5826-PDL1)的作用，低效靶比(0.02:1)。
图29显示敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(CRL5826)的作用，效靶比1:1。
图30显示敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(CRL5826-PDL1)的作用，效靶比1:1。
图31显示敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(OVCAR3或OVCAR3-PDL1)的作用，效靶比1:1。
图32显示培养24小时后，敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(HCT116或HCT116-PDL1)的作用，效靶比1:1。
图33显示培养48小时后，敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(HCT116或HCT116-PDL1)的作用，效靶比1:1。
图34显示培养4天后，敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(CRL5826或CRL5826-PDL1)的作用，效靶比0.1:1。
图35显示培养48小时后，敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞对靶细胞(OVCAR3或OVCAR3-PDL1)的作用，效靶比0.1:1。
具体实施方式
一、定义
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。例如，本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，并且在如下文献中有更全面的描述：Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，MolecularCloning：A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press：Cold SpringHarbor，1989(下文称为“Sambrook”)。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
“基因组”在用于真核细胞时不仅涵盖存在于细胞核中的染色体DNA，而且还包括存在于细胞的亚细胞组分(如线粒体、质体)中的细胞器DNA。
针对序列而言的“外源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是单链或双链RNA或DNA聚合物，任选地可含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基。核苷酸通过如下它们的单个字母名称来指代：“A”为腺苷或脱氧腺苷(分别对应RNA或DNA)，“C”表示胞苷或脱氧胞苷，“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷，“U”表示尿苷，“T”表示脱氧胸苷，“R”表示嘌呤(A或G)，“Y”表示嘧啶(C或T)，“K”表示G或T，“H”表示A或C或T，“I”表示肌苷，并且“N”表示任何核苷酸。
“多肽”、“肽”、和“蛋白质”在本发明中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和ADP-核糖基化。
如本发明所用，“表达构建体”是指适于感兴趣的核苷酸序列在细胞中表达的载体如重组载体。“表达”指功能产物的产生。例如，核苷酸序列的表达可指核苷酸序列的转录(如转录生成mRNA或功能RNA)和/或RNA翻译成前体或成熟蛋白质。
本发明的“表达构建体”可以是线性的核酸片段、环状质粒、病毒载体，或者，在一些实施方式中，可以是能够翻译的RNA(如mRNA)。
本发明的“表达构建体”可包含不同来源的调控序列和感兴趣的核苷酸序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和感兴趣的核苷酸序列。
“调控序列”和“调控元件”可互换使用，指位于编码序列的上游(5'非编码序列)、中间或下游(3'非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。表达调控元件指的是能够控制感兴趣的核苷酸序列转录、RNA加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。
调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子、增强子和多腺苷酸化识别序列。
“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。在本发明的一些实施方式中，启动子是能够控制细胞中基因转录的启动子，无论其是否来源于所述细胞。
如本文中所用，术语“可操作地连接”指调控元件(例如但不限于，启动子序列、转录终止序列等)与核酸序列(例如，编码序列或开放读码框)连接，使得核苷酸序列的转录被所述转录调控元件控制和调节。用于将调控元件区域可操作地连接于核酸分子的技术为本领域已知的。
“基因编辑”，也称为基因组编辑，其使用工程化的核酸酶或“分子剪刀”在生物体基因组中进行DNA插入、缺失或替换。基因编辑通过在基因组中期望的位置导致位点特异性双链断裂(DSB)，然后在修复DSB的过程中引入期望的DNA插入、缺失或取代。基因编辑通常使用大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR系统。
“大范围核酸酶”是一类具有巨大的识别位点(12-40bp的双链DNA序列)的脱氧核糖核酸内切酶，其识别位点在任何给定的基因组中通常只出现一次。例如，I-SceI大范围核酸酶所识别的18bp序列平均需要在比人基因组大20倍的基因组中才会偶然出现一次。
“锌指核酸酶”是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备的人工限制性酶。单个ZFN的锌指DNA结合结构域通常含有3-6个单独的锌指重复序列，每个锌指重复序列可以识别例如3bp。
“转录激活因子样效应物核酸酶”是可以经工程化而可以切割特定DNA序列的限制性酶，通常通过将转录激活因子样效应物(TALE)的DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而制备。TALE经工程化后可以结合几乎任何想要的DNA序列。
“成簇的规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)”是含有短的重复序列的原核DNA区段。CRISPR系统是原核免疫系统，其赋予对外来遗传元件如存在于质粒和噬菌体的元件的抗性，这种抗性提供后天免疫。在此系统中Cas蛋白或类似蛋白在RNA的指导下切割外来核酸。
如本文所用，术语“CRISPR核酸酶”通常指在天然存在的CRISPR系统中存在的核酸酶，以及其修饰形式、其变体(包括切口酶突变体)、或其催化活性片段。CRISPR核酸酶可以通过与向导RNA(如crRNA和任选的tracrRNA或人工gRNA(如sgRNA))一起相互作用来识别和/或切割靶核酸结构。该术语涵盖基于CRISPR系统的能够在细胞内实现基因编辑的任何核酸酶。
“Cas9核酸酶”和“Cas9”在本文中可互换使用，指的是包括Cas9蛋白或其片段(例如包含Cas9的活性DNA切割结构域和/或Cas9的gRNA结合结构域的蛋白)的RNA指导的核酸酶。Cas9是CRISPR/Cas(成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统)基因组编辑系统的组分，能在向导RNA的指导下靶向并切割DNA靶序列形成DNA双链断裂(DSB)。
“向导RNA”和“gRNA”在本文中可互换使用，通常由部分互补形成复合物的crRNA和tracrRNA分子构成，其中crRNA包含与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交并且指导CRISPR复合物(Cas9+crRNA+tracrRNA)与该靶序列序列特异性结合的序列。然而，本领域已知可以设计单向导RNA(sgRNA)，其同时包含crRNA和tracrRNA的特征。
“T细胞受体(TCR)”又称T细胞抗原受体，是T细胞特异性识别和结合抗原肽-MHC分子的分子结构，通常与CD3分子呈复合物形式存在于T细胞表面。大多数T细胞的TCR由α和β肽链组成，少数T细胞的TCR由γ和δ肽链组成。
“嵌合型抗原受体(CAR)”又称人工T细胞受体、嵌合型T细胞受体、嵌合型免疫受体，是一种人工设计的受体，可以赋予免疫效应细胞某一种特异性。普遍来讲，这一技术被用于赋予T细胞特异性识别肿瘤表面抗原的特性。通过这种方法，可以产生大量的靶向杀伤肿瘤细胞。
如本文所用“对象”是指患有或者易于患有可以通过本发明的方法、或药物组合物治疗的疾病(如癌症)的生物体。非限制性例子包括人、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、母牛、鹿，及其它非哺乳动物。在优选实施方案中，对象是人。
二、制备经修饰T细胞的方法
在第一方面，本发明提供一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中的抑制性蛋白表达的步骤。
本发明的T细胞可以是通过扩增抗原特异性T细胞或通过遗传工程化重定向T细胞而产生的用于继承性免疫疗法的T细胞。所述T细胞还可以是分离自对象的原代T细胞。在一些实施方式中，所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)的T细胞。在另一些实施方式中，所述T细胞是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
在一些实施方式中，所述方法还包括提供分离自对象的未经修饰的T细胞的步骤，以及向所述未经修饰的T细胞导入TCR或CAR的步骤。在一些实施方式中，向所述未经修饰的T细胞导入TCR或CAR的步骤在减少或消除T细胞中的抑制性蛋白表达的步骤之前或之后或同时进行。
在一些实施方式中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，例如胞外抗原结合结构域。
所述肿瘤相关抗原包括但不限于CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。在一优选实施方式中，所述抗原是间皮素。
本发明中，所述抗原结合结构域例如可以是单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的单克隆抗体。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv(P4)，例如，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：27。
在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，优选CD28跨膜结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：28的CD28跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述CAR进一步包括位于胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区域，例如，所述铰链区域为CD8铰链区，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：29的CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述CAR包含可用于T细胞活化的信号转导结构域，例如选自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号转导结构域。在一些优选实施方式中，所述CAR包含CD3ζ信号转导结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：30的CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还包含一或多个选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB和4-1BBL的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含CD28共刺激结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：31的CD28共刺激结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还可以包含用于显示或追踪CAR表达的报道分子，如GFP蛋白。
在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含针对间皮素的scFv P4、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号转导结构域和任选的GFP蛋白。在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
如本发明所用，T细胞“抑制性蛋白”是指与T细胞活性抑制相关的蛋白质，例如免疫抑制性蛋白。在一些具体实施方式中，所述抑制性蛋白选自PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3、Tim3及其任意组合。在一些具体实施方案中，所述抑制性蛋白选自PD1和TIM3的组合，PD1和CTLA-4的组合，PD1和LAG3的组合，CTLA-4和TIM3的组合，CTLA-4和LAG3的组合，TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和CTLA-4的组合，PD1、CTLA-4和LAG3的组合，CTLA-4、TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和LAG3的组合，或PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3的组合。在本发明中，减少或消除T细胞中的抑制性蛋白表达并不影响T细胞的扩增能力和其基本免疫特性，并能够通过解除免疫抑制而增强其生物学活性，例如抗肿瘤活性，尤其是抑制或杀伤实体瘤细胞的活性。
本领域已知若干在细胞中减少或消除蛋白质表达的方法。在一些实施方式中，通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。在另一些实施方式中，通过基因编辑的方法，例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。在本发明方法优选的实施方式中，使用CRISPR系统减少或消除T细胞中抑制性蛋白的表达。
在一些实施方式中，CRISPR系统使用的核酸酶(CRISPR核酸酶)例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。
在一些具体实施方式中，所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。在一些具体实施方式中，所述CRISPR系统例如CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞中选自SEQ ID NO:5、6、13、17、22、23、24、25、26中的一或多个核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述CRISPR系统在体外组装，并转入T细胞。在一些实施方式中，将编码所述CRIPSR系统的所有元件的表达构建体转入T细胞。在一些实施方式中，将编码所述CRIPSR系统的部分元件的表达构建体以及其它已转录或已翻译的元件转入T细胞。
本发明还提供一种用于制备经修饰的T细胞的CRISPR基因编辑系统，其包含以下i)至v)中至少一项：
i)CRISPR核酸酶，和至少一种向导RNA；
ii)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列的表达构建体，和至少一种向导RNA；
iii)CRISPR核酸酶，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
iv)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列的表达构建体，和包含编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
v)包含编码CRISPR核酸酶的核苷酸序列和编码至少一种向导RNA的核苷酸序列的表达构建体；
其中所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的抑制性蛋白编码基因例如PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3和/或Tim3。
在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1和TIM3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1和CTLA-4。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的CTLA-4和TIM3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的CTLA-4和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的TIM3和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1、TIM3和CTLA-4。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1、CTLA-4和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的CTLA-4、TIM3和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1、TIM3和LAG3。在一些具体实施方案中，所述至少一种向导RNA靶向T细胞中的PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3。
在一些实施方式中，所述CRISPR核酸酶例如可以选自Cas3、Cas8a、Cas5、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3、GSU0054、Cas10、Csm2、Cmr5、Cas10、Csx11、Csx10、Csf1、Cas9、Csn2、Cas4、Cpf1、C2c1、C2c3或C2c2蛋白，或这些核酸酶的功能性变体。在一些具体实施方式中，所述CRISPR核酸酶是Cas9核酸酶或其功能性变体。
在一些实施方案中，所述向导RNA靶向LAG-3基因的选自SEQ ID NO:1-5的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述向导RNA靶向CTLA-4基因的选自SEQ ID NO:6-10的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述向导RNA靶向Foxp3基因的选自SEQ ID NO:11-16的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述向导RNA靶向Tim3基因的选自SEQ ID NO:17-21的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述向导RNA靶向PD-1基因的选自SEQ ID NO:22和23的核苷酸序列。在优选的实施方式中，所述向导RNA靶向选自SEQ ID NO:5、6、13、17、22和23的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述向导RNA靶向LAG-3基因的SEQ ID NO:24(GCCAGGGGCTGAGGTCCCGG)的核苷酸序列。在优选实施方案中，所述向导RNA靶向CTLA-4基因的SEQ ID NO:25(GTTGAGTAAGGGGTGTACA)的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述向导RNA靶向Tim3基因的SEQ ID NO:26(CAGGGAACCTCGTGCCCGTC)的核苷酸序列。
在本发明的方法的一些实施方案中，包括将本发明的CRISPR基因编辑系统导入所述T细胞。在一些实施方案中，本发明的CRISPR基因编辑系统在导入所述T细胞后，导致减少或消除所靶向的蛋白的表达(敲低或敲除)。
本发明的CRISPR系统可以通过本领域已知的方法转入T细胞，例如：磷酸钙转染、原生质融合、电穿孔、脂质体转染、微注射、病毒感染(如杆状病毒、痘苗病毒、腺病毒和其他病毒)等。
本发明的经修饰的T细胞可以在任何修饰步骤之前或之后被活化和扩增。T细胞可以在体外或体内扩增。通常，本发明的T细胞可以例如通过与刺激CD3TCR复合物和T细胞表面上的共刺激分子以产生T细胞活化信号的试剂接触来扩增。例如，可以使用诸如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)、或有丝分裂凝集素如植物血凝素(PHA)的化学品来产生T细胞的活化信号。在一些实施方案中，T细胞群体可以通过在体外与例如抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定在表面上的抗CD2抗体接触被活化，或通过与蛋白激酶C激活剂(例如，苔藓抑素)连同钙离子载体的接触来活化。例如，在适合于刺激T细胞增殖的条件下，T细胞群可与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适用于T细胞培养的条件包括可能含有增殖和活力所必需的因子的合适培养基(例如Minimal Essential Media或RPMI Media1640、或X-vivo 5、(Lonza))，其中必需的因子包括血清(例如胎牛或人类血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp和TNF，或本领域技术人员已知的用于细胞生长的添加剂。其它用于细胞生长的添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉、和还原剂如N-乙酰-半胱氨酸和2-巯基乙酸。培养基可以包括RPMI1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer、氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或适量补充的血清(或血浆)或一组明确的激素、和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。靶细胞可以保持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(例如37℃)和环境(例如，空气加5％CO2)。
三、经修饰的T细胞
在本发明的另一方面，提供了经修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述经修饰的T细胞中的抑制性蛋白的表达被减少或消除。在一些实施方式中，所述经修饰的T细胞通过本发明的方法制备。
在一些具体实施方式中，所述表达被减少或消除抑制性蛋白选自PD1、LAG-3、CTLA-4、Foxp3、Tim3及其任意组合。在一些具体实施方案中，所述表达被减少或消除的抑制性蛋白选自PD1和TIM3的组合，PD1和CTLA-4的组合，PD1和LAG3的组合，CTLA-4和TIM3的组合，CTLA-4和LAG3的组合，TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和CTLA-4的组合，PD1、CTLA-4和LAG3的组合，CTLA-4、TIM3和LAG3的组合，PD1、TIM3和LAG3的组合，或PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3的组合。
在一些实施方式中，所述T细胞中编码所述抑制性蛋白的基因被敲除，例如通过导入本发明的基因编辑系统而敲除。
在本发明中，所述经修饰的T细胞具有与未修饰的T细胞相当的扩增能力和类似的免疫特性，并且由于免疫抑制被解除而具有增强的生物学活性，例如抗肿瘤活性，尤其是抑制或杀伤实体瘤细胞的活性。
本发明中，所述T细胞可以是包含外源T细胞受体(TCR)的T细胞，或者所述T细胞可以是包含嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(CAR-T细胞)。在本发明一些优选实施方式中，所述经修饰的T细胞是CAR-T细胞。
在一些实施方式中，所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，例如胞外抗原结合结构域。
所述肿瘤相关抗原包括但不限于CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123、CD138、ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)、腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)、成纤维细胞相关蛋白(fap)、CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、Foxp3、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)、TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)。在一优选实施方式中，所述抗原是间皮素。
本发明中，所述抗原结合结构域例如可以是单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的单克隆抗体。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv。在一优选实施方式中，所述抗原结合结构域是针对间皮素的scFv(P4)，其氨基酸序列示于SEQ ID NO：27。
在一些实施方式中，所述CAR包含跨膜结构域，例如CD8跨膜结构域或CD28跨膜结构域，优选CD28跨膜结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：28的CD28跨膜结构域。
在一些实施方式中，所述CAR进一步包括位于胞外抗原结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区域，例如，所述铰链区域为CD8铰链区，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：29的CD8铰链区。
在一些实施方式中，所述CAR包含可用于T细胞活化的信号转导结构域，例如选自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的信号转导结构域。在一些优选实施方式中，所述CAR包含CD3ζ信号转导结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：30的CD3ζ信号转导结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还包含一或多个选自CD3、CD27、CD28、CD83、CD86、CD127、4-1BB和4-1BBL的共刺激结构域。在一些实施方案中，所述CAR包含CD28共刺激结构域，例如氨基酸序列示于SEQ ID NO：31的CD28共刺激结构域。
在一些实施方式中，所述CAR还可以包含用于显示或追踪CAR表达的报道分子，如GFP蛋白。
在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含针对间皮素的scFv P4、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ信号转导结构域和任选的GFP蛋白。在本发明一些优选实施方式中，所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
在本发明一具体实施方式中，所述经修饰的T细胞是包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列的CAR的CAR-T细胞，其中选自以下的抑制蛋白或抑制蛋白的组合的表达被减少或消除：
i).PD1；
ii).LAG-3；
iii).CTLA-4；
iv).Foxp3；
v).Tim3；
vi).PD1和TIM3；
vii).PD1和CTLA-4；
viii).PD1和LAG3；
ix).CTLA-4和TIM3；
x).CTLA-4和LAG3；
xi).TIM3和LAG3；
xii).PD1、TIM3和CTLA-4；
xiii).PD1、CTLA-4和LAG3；
xiv).CTLA-4、TIM3和LAG3；
xv).PD1、TIM3和LAG3；或
xvi).PD1、CTLA-4、TIM3和LAG3。
本发明的T细胞可以通过各种非限制性方法从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在一些实施方案中，细胞可以衍生自健康供体或来自诊断为癌症的患者。在一些实施方案中，细胞可以是呈现不同表型特征的细胞的混合群体的一部分。
在本发明各方面的一些实施方案中，所述T细胞衍生自对象的自体细胞。如本文所用，“自体”是指用于治疗对象的细胞、细胞系或细胞群源自所述对象。在一些实施方案中，所述T细胞衍生自异体细胞，例如源自与所述对象人类白细胞抗原(HLA)相容的供体。可以使用标准方案将来自供体的细胞转化为非同种异体反应性细胞，并根据需要进行复制，从而产生可以施用至一个或多个患者的细胞。
本发明的CAR T细胞或TCR T细胞可以通过本领域已知的多种手段制备。例如，可以用包含CAR或TCR编码序列的表达构建体转导T细胞来获得CAR-T细胞或TCR-T细胞。本领域技术人员能够容易地构建适合于蛋白表达的表达构建体例如病毒载体。
四、药物组合物和应用
在本发明的另一方面，还提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包含本发明的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。此外，本发明还提供本发明的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
本文使用的“药学上可接受的载体”包括生理学相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，该载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
在本发明的另一方面，还提供一种用于治疗癌症的方法，包括给有需要的对象施用治疗有效量的本发明的经修饰的T细胞或本发明的药物组合物。
在一些实施方式中，所述方法还进一步包括给所述对象施用放疗和/或化疗和/或另外的肿瘤靶向药物(例如靶向其它抗原的单克隆抗体或小分子化合物)。
如本文所用，“治疗有效量”或“治疗有效剂量”或“有效量”指施用于对象之后至少足以产生疗效的物质、化合物、材料或细胞的量。因此，其为防止、治愈、改善、阻滞或部分阻滞疾病或病症的症状所必需的量。
例如，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地导致疾病症状的严重性降低，疾病无症状期的频率和持续时间增加，或者防止因疾病痛苦而引起的损伤或失能。例如，对于肿瘤的治疗，相对于未接受治疗的对象，“有效量”的本发明的细胞或药物组合物优选地将肿瘤细胞生长或肿瘤生长抑制至少约10％，优选至少约20％，更优选至少约30％，更优选至少约40％，更优选至少约50％，更优选至少约60％，更优选至少约70％，更优选至少约80％。抑制肿瘤生长的能力可以在预测对人类肿瘤的疗效的动物模型系统中评价。或者，也可以通过检查抑制肿瘤细胞生长的能力来评价，这种抑制可以通过本领域技术人员公知的试验在体外测定。
实际应用中，本发明药物组合物中细胞的剂量水平可能改变，以获得可有效实现对特定患者、组合物和给药方式的所需治疗反应，而对患者无毒性的活性成分的量。选择的剂量水平取决于多种药物代谢动力学因素，包括应用的本发明特定组合物的活性，给药途径，给药时间，应用的特定化合物的排泄速率，治疗的持续时间，与应用的特定组合物联合应用的其他药物、化合物和/或材料，接受治疗的患者的年龄、性别、体重、状况、总体健康情况和病史，以及医学领域中公知的类似因素。
令人惊奇的是，本发明的经修饰的T细胞，相对于对照T细胞(抑制蛋白的表达未被减少或消除)，能够以更低的剂量实现更优的治疗效果。这特别有利于减少制备时间和成本，同时能够减少高剂量施用时带来的副作用。
例如，本发明的经修饰的T细胞的施用剂量比所述抑制蛋白的表达未被减少或消除的对照T细胞的施用剂量低约2倍、低约3倍、低约4倍、低约5倍、低约6倍、低约7倍、低约8倍、低约9倍、低约10倍、低约15倍、低约20倍、低约30倍、低约40倍、低约50倍、低约100倍、低约150倍、低约200倍或更低。
可通过本发明的细胞或药物组合物治疗的癌症的非限制性的例子包括肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法或药物组合物治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。优选地，所述癌症是实体瘤癌症。
五、试剂盒
本发明还提供一种试剂盒，其用于本发明的制备经修饰T细胞的方法，所述试剂盒包含本文所述的用于制备经修饰的T细胞的CRISPR基因编辑系统，以及合适的将所述基因编辑系统导入细胞中的试剂。所述试剂盒还可以包含用于检测T细胞、分离T细胞、活化T细胞和/或扩增T细胞的试剂。所述试剂盒还可以包含用于将CAR或TCR导入T细胞的试剂、检测和/分离表达所述CAR或TCR的细胞的试剂。所述试剂盒还可以包含实施本发明方法的说明。
实施例
通过参考在此给出的一些具体实施例可获得对本发明的进一步的理解，这些实施例仅用于说明本发明，其无意于对本发明的范围做出任何限制。显然，可以对本发明作出多种改动和变化而不脱离本发明的实质，因此，这些改动和变化同样在本申请要求保护的范围内。
实验材料与方法
1.sgRNA的体外转录
首先由生物公司合成包含T7启动子和20bp靶序列(sgRNA)的正向引物，然后以pX330质粒(Addgene plasmid#4223)为PCR模板体外扩增T7-sgRNA PCR产物并利用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。再以纯化的T7-sgRNA PCR产物为模板，利用MEGAshortscript T7 kit(Thermo Fisher Scientific)体外转录sgRNA，并用MEGAclear columns(Thermo FisherScientific)回收sgRNA，用无RNA酶的去离子水溶解sgRNA，分装冻存或备用。
2.Cas9蛋白与sgRNA的复合
首先在无RNA酶的EP管中加入适量的相应的sgRNA，然后缓慢加入Cas9蛋白，轻混匀，室温孵育15分钟，形成RNP备用。
3.电穿孔转化方法
1)使用P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit；
2)向12孔板中加入1.5ml/孔完全培养基37摄氏度预热30min以上；同时用15ml离心管预热一支培养基；预热50ml PBS
3)向RNase-free EP管中分别加入相应的sgRNA，然后缓慢加入相应量的Cas9蛋白，轻轻混匀，室温孵育20min，形成RNP复合物；
4)配置电转缓冲液:100ul体系：nuclepfector溶液82μl+18μl supplement；
5)在sgRNA和cas9蛋白孵育的期间，准备电转所需的细胞：
6)收集活化3天的T细胞，并计数，取出所需要的细胞量(3e6细胞/样品)；
7)200g，室温离心5min；
8)弃上清，用预热好的PBS将细胞洗一次，200g，室温离心5min；
9)弃上清，尽量去除残留液体；
10)用配好的电转缓冲液重悬细胞，轻柔混匀；
11)从重悬好的细胞中取出200μl/样品(包括复孔)加入孵育好的RNP中，轻柔混匀，然后将混合物100μl/样品加入电转杯；
12)电转，程序为stimulated T cells(EO-115)；
13)迅速向电转后的电转杯中加入预热好的培养基500μl，用移液管轻混匀，吸出细胞，加入预热好的12孔板中，将细胞放回培养箱培养，37℃，5％CO2；
14)电转6小时后半量换液，小心从培养箱取出细胞，不要晃动，沿着孔壁小心吸出1ml/孔培养基，然后向培养孔中补充1ml预热好的T细胞培养基；
15)之后根据细胞生长状态，按时传代，维持细胞密度在1e6细胞/ml。
4.TIDE分析方法
收集细胞用细胞裂解液(100μg/ml ProteinaseK,10mMTris-HCl,2mM EDTA,2.5％Tween-20and 2.5％Triton-X 100)提取实验组和对照组基因组DNA。PCR体外扩增目的片段，并利用sanger测序。然后利用在线工具(http://tide.nki.nl)分析基因突变效率。
5.T细胞培养培养方法
T细胞完全培养基：X-VIVO15 medium+5％FBS(热灭活)+2mM L-谷氨酰胺+1mM丙酮酸钠+300U/ml IL-2。T细胞分离后用T细胞完全培养基调整细胞密度为1e6细胞/ml，用Human T-Activator CD3/CD28以1：1的比例激活。然后根据T细胞生长状态每2-3天换液传代。
6.T细胞免疫表型分析方法
通过流式细胞术的方法分析细胞亚群的变化，包括CD4、CD8、初始T细胞(CD45RO-/CD62L+,TN)、中央记忆T细胞(CD45RO+/CD62L+,TCM)、效应记忆T细胞(CD45RO+/CD62L-,TEM)。与未进行基因编辑的T细胞比较。
7.流式细胞方法
1)FACS buffer配置：2％FBS+1mM EDTA+98％PBS；
2)取1e6细胞，FACS缓冲液洗两遍；
3)用FACS缓冲液100ul重悬，混匀，加入适量相应流式抗体(用量参考说明书)混匀，室温避光染色10min；
4)FACS缓冲液洗涤两遍，再用缓冲液200-300μl重悬，混匀，一个小时以内上机检测；如果不能及时上机，需要用4％多聚甲醛固定。
8.细胞因子测量方法
将效应子(T细胞或CAR-T细胞)与表达CD19的Raji细胞、不表达CD19的K562细胞和以CD19修饰的K562细胞(称为K562-CD19或K19)或H226细胞和表达荧光素酶的H226细胞共培养。细胞比例为1:1(每孔的效应子和肿瘤细胞各104个)，在V形底96孔板中进行。使用完全RPM1640培养基，终体积200μL。培养24小时后，用ELISA试剂盒检测上清中的IL-2和IFN-γ。
9.肿瘤细胞裂解实验
根据基于流式细胞术的细胞毒性测定评估细胞毒性。用1μM的Celltrace Violet标记靶肿瘤细胞K19，然后将其与效应子细胞(T细胞、CAR-T细胞和基因敲除的CAR-T细胞)温育4小时。然后加入FITC-Annexin V和7-AAD(Biolegend)以确定死亡的靶细胞的比例。
或者，将肿瘤细胞以104/100ul的密度放到micro-assay-plate的96孔板中(greiner bio-one)。将CAR-T细胞精确计数，按不同的效应细胞:靶细胞比例进行稀释，加入到相应的孔中100ul，对照组是加入100ul的培养基。到达时间后，所有的孔加入Steady-Luciferase Assay System 10ul，5分钟后，在酶标仪下读数。得到读数后，计算杀伤的百分比：杀伤(％)＝100-(实验组读数/对照组读数)*100
实施例1、敲除CAR-T细胞中的LAG-3基因
1、筛选靶向T细胞上LAG-3最有效的sgRNA
为消除T细胞中的LAG-3表达，设计了五种sgRNA，靶向LAG-3的第一外显子。图1A以sgRNA5为例，图示了所述sgRNA在LAG-3基因座中的位置。
所涉及的sgRNA的靶向序列如表1所示。
表1、靶向LAG-3的sgRNA
sgRNA 靶序列 SEQ ID NO
sgRNA1 ATGTGGGAGGCTCAGTTCCT 1
sgRNA2 GCTGCAGAAACAGCAAGCCC 2
sgRNA3 TGCTGTTTCTGCAGCCGCTT 3
sgRNA4 GCTGTTTCTGCAGCCGCTTT 4
sgRNA5 GTTTCTGCAGCCGCTTTGGG 5
Cas9蛋白(3μg)和体外转录的sgRNA(3μg)进行复合，然后电穿孔进入原代CD3+T细胞中。用TIDE分析定量使用各sgRNA的基因编辑效率，选择用于进一步实验的最有效的sgRNA，结果示于图1B。如图所示，sgRNA5的敲除效率最高。通过克隆测序确定NHEJ修复导致的插入和缺失(indel)的出现。扩增了sgRNA5的靶区域，并鉴定了独立的突变。如图1C所示，所有突变精确发生在sgRNA靶向的区域。这些结果说明，通过基因编辑在原代T细胞中有效地敲除了LAG-3。
2、评估电穿孔和基因编辑对T细胞增殖和表型的作用
为了确定基因编辑对T细胞增殖和表型的作用，测试了LAG-3敲除的T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后第3天和第7天，计数总细胞数，从而测定对照T细胞和LAG-3敲除的T细胞的扩增倍数。结果如图2A所示，LAG-3敲除的T细胞保持正常的依赖抗CD3和抗CD28抗体刺激的增殖。
通过CD4、CD8表达以及naive(CD45RO-/CD62L+，TN)、中心记忆(CD45RO+/CD62L+，TCM)和效应记忆(CD45RO+/CD62L-，TEM)T细胞亚集的特性评估基因编辑的T细胞的免疫表型。结果显示，在LAG-3敲除的T细胞中显示CD4和TCM部分稍微更高。然而，这一作用似乎与电穿孔相关，因为这一特征在未编辑的但接受电穿孔的T细胞中也有显示(图2B)。总的来说，LAG-3敲除的T细胞展示与未编辑的T细胞相似的表型。
3、制备LAG-3敲除的CAR-T细胞
使用抗CD19 CAR-T细胞进行LAG-3基因编辑。
简单来说，在存在IL-2(50U/ml)的情况下，用抗CD3和抗CD28刺激活化CD19 CAR-T细胞三天。然后，使用电穿孔将包含sgRNA5的CRISPR-Cas9系统转入所述CAR-T细胞，在电穿孔后三天评估基因编辑效率。使用三个不同的供体评估了LAG-3敲除率，结果如图3A所示，观察到敲除率为40-70％。
此外，还通过流式细胞术确认检测了基因编辑后的CAR-T细胞上LAG-3的表达，结果如图3B所示。
4、表征LAG3敲除的CAR-T细胞
首先，评估了LAG3敲除的CAR-T细胞的增殖。如图4A所示，尽管基因编辑方法对细胞增殖有些影响，这些编辑的CAR-T细胞在抗CD3和抗CD28刺激下增殖良好。
在转染后第14天收获CAR-T细胞，进行免疫表型分析。如图4B所示，与未修饰的T细胞相似，LAG3敲除的CAR-T细胞没有显示任何显著CD4和CD8表达以及记忆T细胞表型特征的改变。也就是说，CRISPR-Cas9介导的LAG3破坏没有干扰T细胞免疫表型。
为评估LAG3敲除的CAR-T细胞的细胞毒性功能，测定LAG3敲除的CAR-T细胞释放IL-2和IFN-γ的能力，结果如图4C所示。LAG3敲除的CAR-T细胞释放的细胞因子的量与未编辑的CAR-T细胞相似。
此外，还检测了LAG3敲除的CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力。效应子细胞：靶细胞的比例为16:1、8:1和4:1。结果如图4D所示，说明LAG3敲除的CAR-T细胞至少保留与标准CAR-T细胞相等的抗肿瘤活性。
5、LAG-3敲除的CAR-T细胞在鼠异体移植模型中根除肿瘤
在第0天，对6-12周龄的NOD-Prkdc scid Il2rg null(NPG)小鼠腹腔内注射2×105Raji-荧光酶细胞。在第3天，小鼠接受腹腔内注射的1×107T细胞、CAR-T细胞或LAG-3敲除的CAR-T细胞，或PBS。
在第3天、第10天及第31天进行生物发光成像，检测用各种处理的NPG小鼠(n＝4)，成像结果如图5A所示；用T细胞、CAR-T细胞或LAG-3敲除的CAR-T细胞处理的小鼠的生物发光信号如图5B所示，数据显示为平均值±SEM，n＝4。这些数据说明破坏抑制性基因LAG-3在鼠异体移植模型中导致更有效的抗肿瘤应答。
对生存的小鼠进行监测，直到第60天。各组的小鼠生存百分比如图5C所示。
实施例2、敲除CAR-T细胞中的CTLA-4基因
1、筛选靶向CTLA-4的sgRNA
设计五种靶向CTLA-4基因座外显子1编码区的sgRNA，靶序列如SEQ ID NO:6-10(表2)，如图6A所示，sgRNA1的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色。
表2、靶向CTLA-4的sgRNA
Cas9蛋白(3μg)和体外转录的sgRNA(3μg)进行复合形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)，然后电穿孔进入原代1×106CD3+T细胞(活化三天后)。
用TIDE分析定量使用各sgRNA的敲除效率，并测序分析CTLA-4中的插入缺失频率。结果如图6B所示，sgRNA1的敲除效率最高，并且，在另一个供体(供体2)中用sgRNA1进行基因编辑也获得了显著的敲除效果。
亚克隆各样品的PCR产物，对各克隆的等位基因进行测序；将RNP转染的细胞中代表性突变的等位基因与野生型序列的比较。结果如图6C所示。sgRNA的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色，突变序列为红色。N/N是指含有突变的等位基因的克隆数/测序的总克隆数。
2、评估敲除CTLA-4对T细胞增殖和表型的作用
为了确定基因编辑对T细胞增殖和表型的作用，测试了CTLA-4敲除的T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后第3天和第7天，计数总细胞数，从而测定对照T细胞和CTLA-4敲除的T细胞的扩增倍数。结果如图7A所示，CTLA-4敲除的T细胞保持正常的依赖抗CD3和抗CD28抗体刺激的增殖。
通过CD4、CD8表达以及naive(CD45RO-/CD62L+,TN)、中心记忆(CD45RO+/CD62L+,TCM)和效应记忆(CD45RO+/CD62L-,TEM)T细胞亚集的特性评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行两次独立实验，结果显示为平均值±SEM。结果如图7B所示。
3、制备CTLA-4敲除的CAR-T细胞
使用抗CD19 CAR-T细胞进行CTLA-4基因编辑。
抗CD19 CAR-T细胞培养活化三天。然后，通过电穿孔将CRISPR-Cas9和sgRNA1的RNP转入CAR-T细胞，在电穿孔后三天评估基因编辑效率。使用三个不同的供体评估了CTLA-4敲除率，结果如图8A所示。
亚克隆各样品的PCR产物，对各克隆的等位基因进行测序；将RNP转染的细胞中代表性突变的等位基因与野生型序列的比较。结果如图8B所示。sgRNA的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色，突变序列为红色。N/N是指含有突变的等位基因的阳性克隆数/测序的总克隆数。
此外，在电穿孔后第3天，用流式细胞仪分析CTLA-4敲除的CAR-T细胞的CTLA-4表面表达，结果如图8C所示。
4、表征CTLA-4敲除的CAR-T细胞
为了确定基因编辑对CAR-T细胞增殖和表型的作用，在三个供体测试了CTLA-4敲除的CAR-T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后不同时间点计数总细胞数，从而测定对照CAR-T细胞和CTLA-4敲除的CAR-T细胞的扩增倍数。进行两次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图9A所示。
为体外表征CTLA-4敲除的抗CD19 CAR-T细胞，在电穿孔后进行培养。培养至电穿孔后第10天，通过CD4、CD8表达以及naive、中心记忆和效应子记忆T细胞亚集评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行三次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图9B所示。
还在三个独立供体中检测了代表性的IL-2和IFN-γ。结果如图12B所示，数据显示为平均值±SEM，n＝2。
此外，通过评估T细胞、CAR-T细胞和CTLA-4敲除的CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力测定了其细胞毒性。结果如图9D所示，效应子细胞：靶细胞的比例为10:1、5:1和2.5:1。
5、体内评估CTLA-4敲除的CAR-T细胞的抗肿瘤能力
在第0天，对6-12周龄的NOD-Prkdc scid Il2rg null(NPG)小鼠腹腔内注射2×105Raji-荧光酶细胞。在第3天，小鼠接受腹腔内注射的1×107T细胞、CAR-T细胞或CTLA-4敲除的CAR-T细胞，或PBS。
在第3天、第10天和第31天进行生物发光成像，检测用各种处理的NPG小鼠(n＝4)，成像结果如图10A所示；用T细胞、CAR-T细胞或CTLA-4敲除的CAR-T细胞处理的小鼠的生物发光信号如图10B所示，数据显示为平均值±SEM，n＝4。
对生存的小鼠进行计数，直到第60天。各组的小鼠生存百分比如图10C所示。
实施例3、敲除CAR-T细胞中的Foxp3基因
1、筛选靶向Foxp3的sgRNA
设计六种靶向Foxp3基因座外显子2编码区的sgRNA，序列如SEQ ID NO:11-15(表3)，如图11A所示，sgRNA3的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色。
表3、靶向Foxp3的sgRNA
sgRNA Foxp3靶序列 SEQ ID NO
sgRNA1 GGGCCGAGATCTTCGAGGCG 11
sgRNA2 TCGAAGATCTCGGCCCTGGA 12
sgRNA3 GCAGCTGCGATGGTGGCATG 13
sgRNA4 AGGGCCGAGATCTTCGAGGC 14
sgRNA5 GGCCCTGGAAGGTTCCCCCT 15
sgRNA6 TTTGGGTGCAGCCCTCCAGC 16
Cas9蛋白(3μg)和体外转录的sgRNA(3μg)进行复合形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)，然后电穿孔进入原代1×106CD3+T细胞(活化三天后)中。
用TIDE分析定量使用各sgRNA的敲除效率，测序分析了Foxp3插入缺失频率，结果如图11B所示，sgRNA3的敲除效率最高，并且，在另两个供体(D2和D3)中用sgRNA3进行基因编辑，也实现了有效的基因敲除。
亚克隆各样品的PCR产物，对各克隆的等位基因进行测序；将RNP转染的细胞中代表性突变的等位基因与野生型序列的比较。结果如图11C所示。sgRNA的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色，突变序列为红色。N/N是指含有突变的等位基因的克隆数/测序的总克隆数。
此外，在电穿孔后第3天，用流式细胞仪分析Foxp3敲除的T细胞的Foxp3表面表达，结果如图11D所示。
2、评估敲除Foxp3对T细胞增殖和表型的作用
为了确定基因编辑对T细胞增殖和表型的作用，测试了Foxp3敲除的T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后第3天和第7天，计数总细胞数，从而测定对照T细胞和Foxp3敲除的T细胞的扩增倍数，结果如图12A所示。Foxp3敲除的T细胞保持正常的依赖抗CD3和抗CD28抗体刺激的增殖。
通过CD4、CD8表达以及naive(CD45RO-/CD62L+,TN)、中心记忆(CD45RO+/CD62L+,TCM)和效应记忆(CD45RO+/CD62L-,TEM)T细胞亚集的特性评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行两次独立实验，结果显示为平均值±SEM。结果如图12B所示。
3、制备Foxp3敲除的CAR-T细胞
使用抗CD19 CAR-T细胞进行Foxp3基因编辑。
简单来说，培养CD19 CAR-T细胞三天进行活化。然后，通过电穿孔将CRISPR-Cas9和sgRNA3的RNP转入CAR-T细胞，在电穿孔后三天评估基因编辑效率。使用三个不同的供体评估了Foxp3敲除率，结果如图13A所示。
亚克隆各样品的PCR产物，对各克隆的等位基因进行测序；将RNP转染的细胞中代表性突变的等位基因与野生型序列的比较。结果如图13B所示。sgRNA的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色，突变序列为红色。N/N是指含有突变的等位基因的阳性克隆数/测序的总克隆数。
4、表征Foxp3敲除的CAR-T细胞
为了确定基因编辑对CAR-T细胞增殖和表型的作用，在三个供体测试了Foxp3敲除的CAR-T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后，计数总细胞数，从而测定对照CAR-T细胞和Foxp3敲除的CAR-T细胞的扩增倍数。进行两次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图14A所示。
为体外表征Foxp3敲除的抗CD19 CAR-T细胞，在电穿孔后进行培养。培养至电穿孔后第10天，通过CD4、CD8表达以及naive、中心记忆和效应记忆T细胞亚集评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行三次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图14B所示。
还在三个独立供体中检测了代表性的IL-2和IFN-γ。结果如图14C所示，数据显示为平均值±SEM，n＝2。
此外，通过评估T细胞、CAR-T细胞和Foxp3敲除的CAR-T细胞裂解细胞的能力测定了其细胞毒性。效应子细胞：靶细胞的比例为10:1、5:1和2.5:1。结果如图14D所示。
5、体内评估Foxp3敲除的CAR-T细胞的抗肿瘤能力
在第0天，对6-12周龄的NOD-Prkdc scid Il2rg null(NPG)小鼠腹腔内注射2×105Raji-荧光酶细胞。在第3天，小鼠接受腹腔内注射的1×107T细胞、CAR-T细胞或Foxp3敲除的CAR-T细胞，或PBS。
在第3天、第10天和第31天进行生物发光成像，检测用各种处理的NPG小鼠(n＝4)，成像结果如图15A所示；用T细胞、CAR-T细胞或Foxp3敲除的CAR-T细胞处理的小鼠的生物发光信号如图15B所示，数据显示为平均值±SEM，n＝4。
对生存的小鼠进行计数，直到第60天。各组的小鼠生存百分比如图15C所示。
实施例4、敲除CAR-T细胞中的Tim3基因
1、筛选靶向T细胞上Tim3的最有效的sgRNA
设计五种靶向Tim3基因座外显子2编码区的sgRNA，靶序列如SEQ ID NO:17-21(表4)。如图16A所示，sgRNA1的靶向序列为绿色，PAM序列为蓝色。
表4、靶向Tim3的sgRNA
sgRNA Tim3靶序列 SEQ ID NO
sgRNA1 CTGGTTTGATGACCAACTTC 17
sgRNA2 TGAAAAATTTAACCTGAAGT 18
sgRNA3 CTGAAGTTGGTCATCAAACC 19
sgRNA4 GAATGATGAAAAATTTAACC 20
sgRNA5 CCTGGTTTGATGACCAACTT 21
Cas9蛋白(3μg)和体外转录的sgRNA(3μg)进行复合形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)，然后电穿孔进入原代1×106CD3+T细胞(活化三天后)中。
用TIDE分析定量使用各sgRNA的敲除效率，测序分析了Tim3插入缺失频率，结果如图16B所示，sgRNA1的敲除效率最高，并且，在另外的供体(D2)来源的T细胞和CAR-T细胞中用sgRNA1进行基因编辑也得到了有效的敲除效果。
此外，在电穿孔后第3天，用流式细胞仪分析Tim3敲除的T细胞的Tim3表面表达，结果如图16C所示。
2、评估敲除Tim3对T细胞增殖和表型的作用
为了确定基因编辑对T细胞增殖和表型的作用，测试了Tim3敲除的T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后第3天和第7天，计数总细胞数，从而测定对照T细胞和Tim3敲除的T细胞的扩增倍数，结果如图17A所示。
通过CD4、CD8表达以及(CD45RO-/CD62L+,TN)、中心记忆(CD45RO+/CD62L+,TCM)和效应记忆(CD45RO+/CD62L-,TEM)T细胞亚集的特性评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行两次独立实验，结果显示为平均值±SEM。结果如图17B所示。
3、制备Tim3敲除的CAR-T细胞
使用抗CD19 CAR-T细胞进行Tim3基因编辑。
培养CD19 CAR-T细胞三天进行活化。然后，通过电穿孔将CRISPR-Cas9与sgRNA1的RNP转入CAR-T细胞。
4、体外表征Tim3敲除的CAR-T细胞
为了确定基因编辑对CAR-T细胞增殖和表型的作用，在三个供体测试了Tim3敲除的CAR-T细胞的增殖。电穿孔后培养。在电穿孔后，计数总细胞数，从而测定对照CAR-T细胞和Tim3敲除的CAR-T细胞的扩增倍数。进行两次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图18A所示。
为体外表征Tim3敲除的抗CD19 CAR-T细胞，在电穿孔后进行培养。培养至电穿孔后第10天，通过CD4、CD8表达以及naive、中心记忆和效应记忆T细胞亚集评估基因编辑的T细胞的免疫表型。进行三次独立实验，数据显示为平均值±SEM，结果如图18B所示。
还检测了代表性的IL-2和IFN-γ。结果如图18C所示，数据显示为平均值±SEM，n＝2。
实施例5、敲除CAR-T细胞中的PD1基因
1、制备PD1敲除的CAR-T细胞
设计了靶向PD1外显子1的sgRNA。其中sgRNA1靶向有义链而sgRNAp靶向反义链(见图19A)。
sgRNA1靶向的PD1基因序列为：GTCTGGGCGGTGCTACAACT(SEQ ID NO:22)；sgRNAp靶向的PD1基因序列为：ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG(SEQ ID NO:23)。
将所设计的sgRNA和Cas9蛋白通过电穿孔共转抗-Meso CART细胞。通过Surveyor测定显示PD1基因编辑效率达到27.9％。
2、PD1敲除的抗-Meso CART细胞在体内能执行效应子功能
将2x 106高表达PDL1和荧光素酶的H226细胞皮下注射进NPG小鼠胁腹构建人肺鳞癌小鼠模型。在第27天和第32天瘤内注射1x 107PD1-KO抗-间皮素(Meso)CART细胞、抗-Meso CART细胞和用作未处理对照的PBS。通过生物荧光成像检测肿瘤生长，每周拍摄。
结果如图20A和图20B所示。与未处理对照相比，PD1-KO抗-Meso CART细胞处理的小鼠中的H226生物荧光信号在第一次T细胞注射之后迅速降低至接近背景水平并且一直保持低信号水平。与未处理对照相比，抗-Meso CART细胞处理的小鼠中的H226生物荧光信号在第一次T细胞注射之后迅速降低，但是在第二次T细胞注射后生物荧光信号缓慢升高。此外，接受抗间皮素CAR-T细胞的小鼠、接受PD1敲除的抗间皮素CAR-T细胞的小鼠以及未接受治疗的对照小鼠的存活率示于图20C。接受PD1敲除的抗间皮素CAR-T细胞的小鼠显示更高的存活率。
3、PD1敲除的抗-Meso CART细胞在体外能执行效应子功能
表达荧光素酶的H226细胞(H226-luci)和小鼠成纤维细胞3T3或表达PDL1的3T3细胞(3T3-PDL1)分别和PD1-KO抗-Meso CART细胞、抗-Meso CART细胞以及普通未修饰T细胞以1:1、1:2或1:4的效应细胞:靶细胞比例共培养20小时。通过测量剩余肿瘤细胞的荧光素酶活性计算靶细胞裂解的百分比。
如图21A所示，当H226-luci和3T3细胞分别与PD1-KO抗-Meso CART细胞、抗-MesoCART细胞以及T细胞共培养时，PD1-KO抗-Meso CART细胞比抗-Meso CART细胞能够更高效地杀死靶H226细胞。
如图21B所示，当H226-luci和3T3-PDL1细胞分别与PD1-KO抗-Meso CART细胞、抗-Meso CART细胞以及T细胞共培养时，PD1-KO抗-Meso CART细胞比抗-Meso CART细胞能够更高效地杀死靶H226细胞。
实施例6、具有不同CAR结构的CAR-T细胞的作用
设计了4种结构的CAR(P4-z、P4-BBz、P4-28z和P4-28BBz，结构如图22所示，其中P4是抗间皮素scFv)，并制备CAR-T细胞。
以1:1的效应细胞:靶细胞比例，将所得到的CAR-T细胞与H226细胞共培养20h，测量IFN-γ和IL-2的释放。
以2:1的效应细胞:靶细胞比例，将所得到的CAR-T细胞与表达荧光素酶的H226细胞(H226-luci)共培养3天，通过测量剩余肿瘤细胞的荧光素酶活性计算靶细胞裂解的百分比。
如图23所示，与P4-z、P4-BBz和P4-28BBz相比，P4-28z显示更高的IFN-γ和IL-2的释放(图23A)，以及更高的特异性细胞裂解(图23B，*表示P<0.05，****表示P<0.0001)。
实施例7、CAR-T细胞中抑制蛋白的多种基因编辑
敲除抗间皮素CAR-T细胞中的PD-1、TIM-3和LAG-3中的一或多种，其中用靶向SEQID NO:22和/或SEQ ID NO:23的sgRNA敲除PD-1，用靶向SEQ ID NO:26的sgRNA敲除TIM-3，用靶向SEQ ID NO:25的sgRNA敲除CTLA-4，而用靶向SEQ ID NO:5和/或24的sgRNA敲除LAG-3。
1.分别产生敲除PD-1的P4 CAR-T细胞(PD1 KO)，敲除TIM3的P4 CAR-T细胞(TIM3KO)，敲除LAG3的P4 CAR-T细胞(LAG3 KO)，敲除PD1和TIM3的P4 CAR-T细胞(PD1 TIM3KO)，敲除PD1和LAG3的P4 CAR-T细胞(PD1 LAG3 KO)，以及敲除PD1、TIM3和LAG3的P4 CAR-T细胞(PD1 TIM3 LAG3 KO)。通过Surveyor测试和TIDE检测PD-1、LAG-3和TIM3基因的敲除效率，结果如图24所示。
将获得的细胞和未经敲除的P4 CAR-T细胞以及T细胞分别与表达PD-L1和荧光素酶的H226细胞(H226-PDL1-luci)、CRL5826细胞(CRL5826-PDL1)共培养。
如图25A所示，当效应细胞:靶细胞(H226-PDL1-luci)的比例为4:1时，共培养20h后，除P4(TIM3 KO)外，其它经敲除的CAR-T细胞都能比P4更高效杀地伤靶细胞；如图25B所示，当效应细胞:靶细胞(H226-PDL1-luci)的比例为0.1:1时，共培养6天后，所有经敲除的CAR-T细胞都能比P4更高效杀地伤靶细胞，*,P<0.05.**,P<0.01.***,P<0.001.****,P<0.0001。
图26显示，当效应细胞:靶细胞(CRL5826-PDL1)的比例为4:1时，共培养24小时(图26A)和48小时(图26B)后，经敲除的CAR-T细胞表现出不低于P4 CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果。
图27显示，当效应细胞:靶细胞(CRL5826-PDL1)的比例为0.1:1时，共培养4天(图27A)和6天(图27B)后，经敲除的CAR-T细胞均表现出明显比P4 CAR-T细胞更强的肿瘤杀伤效果。
图28显示，当效应细胞:靶细胞(CRL5826-PDL1)的比例为0.02:1时，共培养4天(图28A)和6天(图28B)后，经敲除的CAR-T细胞均表现出明显比P4 CAR-T细胞更强的肿瘤杀伤效果。
2.分别产生敲除PD-1、TIM3、CTLA4和LAG3的一或多种的CAR-T细胞，敲除PD1以P表示，敲除TIM3以T表示，敲除CTLA4以C表示，且敲除LAG3以L表示，敲除两个或更多个基因以相应的字母组合表示。例如PC表示敲除PD1和CTLA4，而PCTL表示这四个基因全部被敲除。
将所获得的经敲除的CAR-T细胞和P4 CAR-T细胞以及T细胞分别与表达荧光素酶的CRL5826细胞(CRL5826)、OVCAR3细胞(OVCAR3)和HCT116细胞(HCT116)，表达PDL1和荧光素酶的CRL5826细胞(CRL5826-PDL1)、OVCAR3细胞(OVCAR3-PDL1)和HCT116细胞(HCT116-PDL1)共培养。
图29显示，当效应细胞:靶细胞(CRL5826)的比例为1:1时，共培养24小时(图29A)和48小时(图29B)后，经敲除的CAR-T细胞表现出不低于P4 CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果。
图30显示，当效应细胞:靶细胞(CRL5826-PDL1)的比例为1:1时，共培养24小时(图30A)和48小时(图30B)后，经敲除的CAR-T细胞表现出不低于P4 CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果。
图31显示，当效应细胞:靶细胞的比例为1:1时，共培养24小时后，经敲除的CAR-T细胞表现出不低于P4 CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果。图31A中的靶细胞为表达荧光素酶的OVCAR3细胞(OVCAR3)，而图31B中的靶细胞为表达PDL1和荧光素酶的OVCAR3细胞(OVCAR3-PDL1)。
图32显示，当效应细胞:靶细胞的比例为1:1时，共培养24小时后，经敲除的CAR-T细胞表现出不低于P4 CAR-T细胞的肿瘤杀伤效果。图32A中的靶细胞为表达荧光素酶的HCT116细胞(HCT116)，而图32B中的靶细胞为表达PDL1和荧光素酶的HCT116细胞(HCT116-PDL1)。
图33显示，当效应细胞:靶细胞的比例为1:1时，共培养48小时后，经敲除的CAR-T细胞表现出比P4 CAR-T细胞更强的肿瘤杀伤效果。图33A中的靶细胞为表达荧光素酶的HCT116细胞(HCT116)，而图33B中的靶细胞为表达PDL1和荧光素酶的HCT116细胞(HCT116-PDL1)。
图34显示，当效应细胞:靶细胞的比例为0.1:1时，共培养4天后，经敲除的CAR-T细胞表现出明显比P4 CAR-T细胞更强的肿瘤杀伤效果。图34A中的靶细胞为表达荧光素酶的CRL5826细胞(CRL5826)，而图34B中的靶细胞为表达PDL1和荧光素酶的CRL5826细胞(CRL5826-PDL1)。
图35显示，当效应细胞:靶细胞的比例为0.1:1时，共培养48小时后，经敲除的CAR-T细胞表现出明显比P4 CAR-T细胞更强的肿瘤杀伤效果。图35A中的靶细胞为表达荧光素酶的OVCAR3细胞(OVCAR3)，而图35B中的靶细胞为表达PDL1和荧光素酶的OVCAR3细胞(OVCAR3-PDL1)。
实验结果说明，本发明的一或多种抑制性蛋白被敲除的CAR-T细胞在高效靶比下与未敲除CAR-T细胞效果相当，出乎意料的是，本发明的被敲除的CAR-T细胞在低效靶比、较长作用时间下优于未敲除CAR-T细胞。这特别有利于降低成本，减少制备时间，减少高剂量施用时带来的副作用。
序列表
SEQ ID NO:1 LAG-3 sgRNA1靶序列
ATGTGGGAGGCTCAGTTCCT
SEQ ID NO:2 LAG-3 sgRNA2靶序列
GCTGCAGAAACAGCAAGCCC
SEQ ID NO:3 LAG-3 sgRNA3靶序列
TGCTGTTTCTGCAGCCGCTT
SEQ ID NO:4 LAG-3 sgRNA4靶序列
GCTGTTTCTGCAGCCGCTTT
SEQ ID NO:5 LAG-3 sgRNA5靶序列
GTTTCTGCAGCCGCTTTGGG
SEQ ID NO:6 CTLA-4 sgRNA1靶序列
CCTTGGATTTCAGCGGCACA
SEQ ID NO:7 CTLA-4 sgRNA2靶序列
CCTTGTGCCGCTGAAATCCA
SEQ ID NO:8 CTLA-4 sgRNA3靶序列
TGAACCTGGCTACCAGGACC
SEQ ID NO:9 CTLA-4 sgRNA4靶序列
CATAAAGCCATGGCTTGCCT
SEQ ID NO:10 CTLA-4 sgRNA5靶序列
CTCAGCTGAACCTGGCTACC
SEQ ID NO:11 Foxp-3 sgRNA1靶序列
GGGCCGAGATCTTCGAGGCG
SEQ ID NO:12 Foxp-3 sgRNA2靶序列
TCGAAGATCTCGGCCCTGGA
SEQ ID NO:13 Foxp-3 sgRNA3靶序列
GCAGCTGCGATGGTGGCATG
SEQ ID NO:14 Foxp-3 sgRNA4靶序列
AGGGCCGAGATCTTCGAGGC
SEQ ID NO:15 Foxp-3 sgRNA5靶序列
GGCCCTGGAAGGTTCCCCCT
SEQ ID NO:16 Foxp-3 sgRNA6靶序列
TTTGGGTGCAGCCCTCCAGC
SEQ ID NO:17 Tim3 sgRNA1靶序列
CTGGTTTGATGACCAACTTC
SEQ ID NO:18 Tim3 sgRNA2靶序列
TGAAAAATTTAACCTGAAGT
SEQ ID NO:19 Tim3 sgRNA3靶序列
CTGAAGTTGGTCATCAAACC
SEQ ID NO:20 Tim3 sgRNA4靶序列
GAATGATGAAAAATTTAACC
SEQ ID NO:21 Tim3 sgRNA5靶序列
CCTGGTTTGATGACCAACTT
SEQ ID NO:22 PD1 sgRNA1靶序列
GTCTGGGCGGTGCTACAACT
SEQ ID NO:23 PD1 sgRNAp靶序列
ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG
SEQ ID NO:24 LAG-3 sgRNA6靶序列
GCCAGGGGCTGAGGTCCCGG
SEQ ID NO:25 CTLA-4 sgRNA6靶序列
GTTGAGTAAGGGGTGTACA
SEQ ID NO:26 Tim3 sgRNA6靶序列
CAGGGAACCTCGTGCCCGTC
SEQ ID NO:27 针对间皮素的scFv(P4)
QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVL
SEQ ID NO:28 CD28跨膜结构域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO:29 CD8铰链区
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:30 CD3ζ信号转导结构域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:31 CD28共刺激结构域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO:32 CAR
QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
序列表
SEQ ID NO: 1 LAG-3 sgRNA1靶序列
ATGTGGGAGGCTCAGTTCCT
SEQ ID NO: 2 LAG-3 sgRNA2靶序列
GCTGCAGAAACAGCAAGCCC
SEQ ID NO: 3 LAG-3 sgRNA3靶序列
TGCTGTTTCTGCAGCCGCTT
SEQ ID NO: 4 LAG-3 sgRNA4靶序列
GCTGTTTCTGCAGCCGCTTT
SEQ ID NO: 5 LAG-3 sgRNA5靶序列
GTTTCTGCAGCCGCTTTGGG
SEQ ID NO: 6 CTLA-4 sgRNA1靶序列
CCTTGGATTTCAGCGGCACA
SEQ ID NO: 7 CTLA-4 sgRNA2靶序列
CCTTGTGCCGCTGAAATCCA
SEQ ID NO: 8 CTLA-4 sgRNA3靶序列
TGAACCTGGCTACCAGGACC
SEQ ID NO: 9 CTLA-4 sgRNA4靶序列
CATAAAGCCATGGCTTGCCT
SEQ ID NO: 10 CTLA-4 sgRNA5靶序列
CTCAGCTGAACCTGGCTACC
SEQ ID NO: 11 Foxp-3 sgRNA1靶序列
GGGCCGAGATCTTCGAGGCG
SEQ ID NO: 12 Foxp-3 sgRNA2靶序列
TCGAAGATCTCGGCCCTGGA
SEQ ID NO: 13 Foxp-3 sgRNA3靶序列
GCAGCTGCGATGGTGGCATG
SEQ ID NO: 14 Foxp-3 sgRNA4靶序列
AGGGCCGAGATCTTCGAGGC
SEQ ID NO: 15 Foxp-3 sgRNA5靶序列
GGCCCTGGAAGGTTCCCCCT
SEQ ID NO: 16 Foxp-3 sgRNA6靶序列
TTTGGGTGCAGCCCTCCAGC
SEQ ID NO: 17 Tim3 sgRNA1靶序列
CTGGTTTGATGACCAACTTC
SEQ ID NO: 18 Tim3 sgRNA2靶序列
TGAAAAATTTAACCTGAAGT
SEQ ID NO: 19 Tim3 sgRNA3靶序列
CTGAAGTTGGTCATCAAACC
SEQ ID NO: 20 Tim3 sgRNA4靶序列
GAATGATGAAAAATTTAACC
SEQ ID NO: 21 Tim3 sgRNA5靶序列
CCTGGTTTGATGACCAACTT
SEQ ID NO: 22 PD1 sgRNA1靶序列
GTCTGGGCGGTGCTACAACT
SEQ ID NO: 23 PD1 sgRNAp靶序列
ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG
SEQ ID NO: 24 LAG-3 sgRNA6靶序列
GCCAGGGGCTGAGGTCCCGG
SEQ ID NO: 25 CTLA-4 sgRNA6靶序列
GTTGAGTAAGGGGTGTACA
SEQ ID NO: 26 Tim3 sgRNA6靶序列
CAGGGAACCTCGTGCCCGTC
SEQ ID NO: 27 针对间皮素的scFv(P4)
QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVL
SEQ ID NO: 28 CD28跨膜结构域
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV
SEQ ID NO: 29 CD8铰链区
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO: 30 CD3ζ信号转导结构域
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO: 31 CD28共刺激结构域
RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
SEQ ID NO: 32 CAR
QVQLQQSGPGLVTPSQTLSLTCAISGDSVSSNSATWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRMSINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARGMMTYYYGMDVWGQGTTVTVSSGILGSGGGGSGGGGSGGGGSQPVLTQSSSLSASPGASASLTCTLRSGINVGPYRIYWYQQKPGSPPQYLLNYKSDSDKQQGSGVPSRFSGSKDASANAGVLLISGLRSEDEADYYCMIWHSSAAVFGGGTQLTVLTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

Claims (21)

1.一种制备经修饰的T细胞的方法，包括减少或消除T细胞中抑制性蛋白表达的步骤，其中所述抑制性蛋白选自Tim3、PD1或其组合。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中通过反义RNA、antagomir、siRNA、shRNA、大范围核酸酶、锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或CRISPR系统实施所述减少或消除。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述CRISPR系统是CRISPR/Cas9系统。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述CRISPR/Cas9系统靶向所述细胞内选自SEQ IDNO:17-23、SEQ ID NO:26中一或多种的核苷酸序列。
6.根据权利要求2-5任一项所述的方法，其中所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原的抗原结合结构域，其中所述肿瘤相关抗原选自表皮生长因子受体(EGFR)、间皮素或其组合。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
8.根据权利要求2-7任一项所述的方法，其中所述CAR包含针对间皮素或表皮生长因子受体(EGFR)的scFv、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域，优选地，所述CAR包含针对间皮素的scFv(P4)、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域的序列分别如SEQ ID NO:27、29、28、31和30所示。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
10.通过权利要求1-9任一项所述的方法制备的经修饰的T细胞。
11.修饰的T细胞，其中与未修饰的T细胞相比，所述T细胞中的抑制性蛋白TIM3和/或PD1的表达被减少或消除。
12.根据权利要求11所述的经修饰的T细胞，其中所述T细胞是包含外源T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。
13.根据权利要求12所述的经修饰的T细胞，其中所述TCR或CAR包含针对肿瘤相关抗原EGFR和/或间皮素的抗原结合结构域。
14.根据权利要求13所述的经修饰的T细胞，其中所述肿瘤相关抗原选自EGFR、间皮素或其组合。
15.根据权利要求13-14任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述抗原结合结构域选自单克隆抗体、合成的抗体、人抗体、人源化抗体、单域抗体、抗体单链可变区，以及其抗原结合片段。
16.根据权利要求12-15任一项所述的经修饰的T细胞，其中所述CAR包含针对间皮素或表皮生长因子受体(EGFR)的scFv、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域，优选地，所述CAR包含针对间皮素的scFv(P4)、CD8铰链区、CD28跨膜结构域、CD28共刺激结构域和CD3ζ信号转导结构域的序列分别如SEQ ID NO:27、29、28、31和30所示。
17.根据权利要求16所述的经修饰的T细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO：32所示氨基酸序列。
18.根据权利要求10-17任一项所述的经修饰的T细胞在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
19.用于治疗癌症的药物组合物，包含根据权利要求10-17任一项所述的经修饰的T细胞和药学可接受的载体。
20.根据权利要求18所述的用途或权利要求19所述的药物组合物，其中所述癌症选自肺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、恶性血液病、头颈癌、胶质瘤、胃癌、鼻咽癌、喉癌、宫颈癌、子宫体瘤和骨肉瘤。可以用本发明的方法或药物组合物治疗的其他癌症的例子包括：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、前列腺癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、肛区癌、睾丸癌、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、阴户癌、何杰金病、非何杰金氏淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、慢性或急性白血病(包括急性髓细胞样白血病、慢性髓细胞样白血病、急性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管发生、脊柱肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮状癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱发的癌症，包括石棉诱发的癌症，以及所述癌症的组合。
21.一种试剂盒，其用于根据权利要求1-9任一项所述的制备经修饰的T细胞的方法，所述试剂盒包含权利要求4或5中所定义的用于制备经修饰的T细胞的CRISPR系统，以及合适的将所述CRISPR系统导入细胞中的试剂，任选地，所述试剂盒还包含用于检测T细胞、分离T细胞、活化T细胞和/或扩增T细胞的试剂；任选地，所述试剂盒还包含用于将CAR或TCR导入T细胞的试剂、检测和/分离表达所述CAR或TCR的细胞的试剂；任选地，所述试剂盒还包含实施根据权利要求1-9任一项所述的制备经修饰的T细胞的方法的说明。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021047386A1 (zh) * 2019-09-10 2021-03-18 普米斯生物技术(珠海)有限公司 靶向caix抗原的纳米抗体及其应用
CN114480292A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 苏州恒康生命科学有限公司 利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用
WO2022152266A1 (zh) * 2021-01-18 2022-07-21 上海邦耀生物科技有限公司 用于基因编辑的组合物及其应用

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7069152B2 (ja) 2016-10-31 2022-05-17 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 遺伝子組換えにより内在性ｆｏｘｐ３遺伝子の発現が安定化されたｃｄ４ ｔ細胞を使用した自己免疫疾患の治療方法
CN109554348A (zh) * 2017-09-27 2019-04-02 亘喜生物科技（上海）有限公司 可诱导分泌抗cd47抗体的工程化免疫细胞
KR20210005146A (ko) * 2018-04-27 2021-01-13 시애틀 칠드런즈 호스피탈 디/비/에이 시애틀 칠드런즈 리서치 인스티튜트 유전자 편집된 t 세포에서의 인간 foxp3의 발현
JP2021521856A (ja) * 2018-04-27 2021-08-30 シアトル チルドレンズ ホスピタル （ディービーエイ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート） 遺伝子編集されたｃｄ３４＋細胞におけるｆｏｘｐ３の発現
GB2589246A (en) 2018-05-16 2021-05-26 Synthego Corp Methods and systems for guide RNA design and use
CN110760001B (zh) * 2019-07-29 2023-03-24 浙江启新生物技术有限公司 Gm-csf敲低及其中和单链抗体分泌的嵌合抗原受体t细胞构建与应用
WO2022170193A2 (en) * 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 (tim3) compositions and methods for immunotherapy
CN117940153A (zh) * 2021-08-24 2024-04-26 因特利亚治疗公司 用于基于细胞的疗法的程序性细胞死亡蛋白1(pd1)组合物和方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016130726A1 (en) * 2015-02-10 2016-08-18 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
CN106480097A (zh) * 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3225453A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106163547A (zh) * 2014-03-15 2016-11-23 诺华股份有限公司 使用嵌合抗原受体治疗癌症
WO2016130726A1 (en) * 2015-02-10 2016-08-18 Minerva Biotechnologies Corporation Humanized anti-muc1* antibodies
CN106480097A (zh) * 2016-10-13 2017-03-08 南京凯地生物科技有限公司 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANA C. ANDERSON: "Tim-3: An Emerging Target in the Cancer Immunotherapy Landscape", 《CANCER IMMUNOLOGY RESEARCH》 *
KAORI SAKUISHI,ET AL: "Targeting Tim-3 and PD-1 pathways to reverse T cell exhaustion and restore anti-tumor immunity", 《JEM》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021047386A1 (zh) * 2019-09-10 2021-03-18 普米斯生物技术(珠海)有限公司 靶向caix抗原的纳米抗体及其应用
WO2022152266A1 (zh) * 2021-01-18 2022-07-21 上海邦耀生物科技有限公司 用于基因编辑的组合物及其应用
CN114807155A (zh) * 2021-01-18 2022-07-29 华东师范大学 用于基因编辑的组合物及其应用
CN114480292A (zh) * 2022-01-24 2022-05-13 苏州恒康生命科学有限公司 利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用
CN114480292B (zh) * 2022-01-24 2024-04-05 苏州恒康生命科学有限公司 利用shRNA沉默人Tim-3基因构建CAR-T细胞的方法及其应用

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