CN114807155A - 用于基因编辑的组合物及其应用 - Google Patents
用于基因编辑的组合物及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114807155A CN114807155A CN202110064928.6A CN202110064928A CN114807155A CN 114807155 A CN114807155 A CN 114807155A CN 202110064928 A CN202110064928 A CN 202110064928A CN 114807155 A CN114807155 A CN 114807155A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- cells
- another preferred
- gene editing
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 title claims abstract description 58
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 32
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 30
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 24
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 15
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 9
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 9
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 61
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 48
- 102100040678 Programmed cell death protein 1 Human genes 0.000 description 43
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 42
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 40
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 21
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 17
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 16
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 12
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 12
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 12
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 12
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 12
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 12
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 11
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 11
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 11
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 10
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 8
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 8
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- -1 CSPG Proteins 0.000 description 5
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 5
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 4
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000005206 flow analysis Methods 0.000 description 4
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 4
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 108091005958 mTurquoise2 Proteins 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 210000001266 CD8-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 102000012804 EPCAM Human genes 0.000 description 3
- 101150084967 EPCAM gene Proteins 0.000 description 3
- 102000010956 Glypican Human genes 0.000 description 3
- 108050001154 Glypican Proteins 0.000 description 3
- 108050007237 Glypican-3 Proteins 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 101150057140 TACSTD1 gene Proteins 0.000 description 3
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 2
- 102100038080 B-cell receptor CD22 Human genes 0.000 description 2
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102100028972 HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 108010075704 HLA-A Antigens Proteins 0.000 description 2
- 101000884305 Homo sapiens B-cell receptor CD22 Proteins 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 2
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 2
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 101710089372 Programmed cell death protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 241000194007 Streptococcus canis Species 0.000 description 2
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000003682 fluorination reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 2
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 2
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 2
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 2
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 2-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-n-[3-[bis(4-chlorophenyl)methyl]-4-(dimethylamino)phenyl]-1-n,1-n-dimethylbenzene-1,4-diamine Chemical compound C1=C(C(C=2C=CC(Cl)=CC=2)C=2C=CC(Cl)=CC=2)C(N(C)C)=CC=C1NC(C=1)=CC=C(N(C)C)C=1C(C=1C=CC(Cl)=CC=1)C1=CC=C(Cl)C=C1 BGFTWECWAICPDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010008014 B-Cell Maturation Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102000006942 B-Cell Maturation Antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100021663 Baculoviral IAP repeat-containing protein 5 Human genes 0.000 description 1
- 108700012439 CA9 Proteins 0.000 description 1
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 description 1
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100025221 CD70 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 description 1
- 101150069031 CSN2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100025570 Cancer/testis antigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100024423 Carbonic anhydrase 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100025466 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100024965 Caspase recruitment domain-containing protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000218916 Cycas Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000018651 Epithelial Cell Adhesion Molecule Human genes 0.000 description 1
- 108010066687 Epithelial Cell Adhesion Molecule Proteins 0.000 description 1
- 101100343677 Escherichia coli (strain K12) lon gene Proteins 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029360 Hematopoietic cell signal transducer Human genes 0.000 description 1
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000868215 Homo sapiens CD40 ligand Proteins 0.000 description 1
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000934356 Homo sapiens CD70 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000856237 Homo sapiens Cancer/testis antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914337 Homo sapiens Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000761179 Homo sapiens Caspase recruitment domain-containing protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 1
- 101000920667 Homo sapiens Epithelial cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 101000990188 Homo sapiens Hematopoietic cell signal transducer Proteins 0.000 description 1
- 101000599852 Homo sapiens Intercellular adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000777628 Homo sapiens Leukocyte antigen CD37 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000952182 Homo sapiens Max-like protein X Proteins 0.000 description 1
- 101000934338 Homo sapiens Myeloid cell surface antigen CD33 Proteins 0.000 description 1
- 101001136592 Homo sapiens Prostate stem cell antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000880770 Homo sapiens Protein SSX2 Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914496 Homo sapiens T-cell antigen CD7 Proteins 0.000 description 1
- 101000934346 Homo sapiens T-cell surface antigen CD2 Proteins 0.000 description 1
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 1
- 101000934341 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD5 Proteins 0.000 description 1
- 101000763579 Homo sapiens Toll-like receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000763537 Homo sapiens Toll-like receptor 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000831567 Homo sapiens Toll-like receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000831496 Homo sapiens Toll-like receptor 3 Proteins 0.000 description 1
- 101000669447 Homo sapiens Toll-like receptor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000669460 Homo sapiens Toll-like receptor 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000669406 Homo sapiens Toll-like receptor 6 Proteins 0.000 description 1
- 101000669402 Homo sapiens Toll-like receptor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000800483 Homo sapiens Toll-like receptor 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 description 1
- 101000818543 Homo sapiens Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100020793 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710112634 Interleukin-13 receptor subunit alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100031586 Leukocyte antigen CD37 Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102100034709 Lymphocyte cytosolic protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710195102 Lymphocyte cytosolic protein 2 Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102100037423 Max-like protein X Human genes 0.000 description 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100025243 Myeloid cell surface antigen CD33 Human genes 0.000 description 1
- 108010069196 Neural Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100036735 Prostate stem cell antigen Human genes 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010002687 Survivin Proteins 0.000 description 1
- 102100027208 T-cell antigen CD7 Human genes 0.000 description 1
- 102100025237 T-cell surface antigen CD2 Human genes 0.000 description 1
- 102100025244 T-cell surface glycoprotein CD5 Human genes 0.000 description 1
- 108010060818 Toll-Like Receptor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100027010 Toll-like receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100027009 Toll-like receptor 10 Human genes 0.000 description 1
- 102100024333 Toll-like receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100024324 Toll-like receptor 3 Human genes 0.000 description 1
- 102100039360 Toll-like receptor 4 Human genes 0.000 description 1
- 102100039357 Toll-like receptor 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100039387 Toll-like receptor 6 Human genes 0.000 description 1
- 102100039390 Toll-like receptor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100033110 Toll-like receptor 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100033117 Toll-like receptor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000011408 Tripartite Motif Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010023649 Tripartite Motif Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 1
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 1
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 description 1
- 102100021125 Tyrosine-protein kinase ZAP-70 Human genes 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 101150055601 cops2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000034431 double-strand break repair via homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010087914 epidermal growth factor receptor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 108020005243 folate receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000006815 folate receptor Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010021309 integrin beta6 Proteins 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N n-[(2s)-3-methyl-1-oxo-1-pyrrolidin-1-ylbutan-2-yl]-3-phenylpropanamide Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCCC1)C(=O)CCC1=CC=CC=C1 DAZSWUUAFHBCGE-KRWDZBQOSA-N 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008263 repair mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/70521—CD28, CD152
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
- A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
- A61K39/4636—Immune checkpoint inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
- A61K39/464412—CD19 or B4
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- A61K39/464429—Molecules with a "CD" designation not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
- C12N15/867—Retroviral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了用于基因编辑的组合物及其应用，具体地，本发明公开了一种特异性结合gRNA的靶序列，以及含有该gRNA的基因编辑系统，并且本发明还提供了含有该基因编辑系统的组合物和药盒。本发明的该基因编辑系统可显著提高敲除率和重组率，并且本发明的组合物和药盒还可治疗疾病。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及用于基因编辑的组合物及其应用。
背景技术
CRISPR/Cas9系统是来源于古细菌和细菌的一种抵御质粒、噬菌体等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制。该系统主要由CRISPR序列和编码Cas蛋白的基因座发挥功能，目前最常用的是Ⅱ型家族的Cas9核酸酶，这一系统只需要单一的效应蛋白就可发挥作用。当外源DNA入侵细菌时,Ⅱ型CRISPR系统首先将入侵DNA整合到CRISPR重复序列之间。随后,包含入侵DNA序列的CRISPR RNA(crRNA)被转录和加工出来。此后，反式激活crRNA(transactivating CRISPR RNA,tracrRNA)与crRNA结合,并最终与Cas9蛋白形成复合物。最后，Cas9蛋白通过其HNH和RuvC样结构域发挥核酸内切酶作用引发DNA双链断裂。DNA的双链断裂会引发损伤修复机制，当有同源模板存在的情况下，细胞会发生精确的同源重组修复，从而可以实现外源序列的插入或替换。迄今，CRISPR/Cas9技术已经在很多领域得以成功应用，显示出广阔的前景。但是，利用同源重组方式进行精确的基因治疗依然面临很多困难，其中一个主要限制因素就是同源重组的效率非常低。虽然有不少研究报道了多种提高同源重组率的方法，但越来越多的证据表明这些方法并不适用于所有类型的细胞且效果也并不一致。因此，在特定细胞中找到有效提高同源重组的方法并筛选高效整合和切割的位点对基于细胞类型的细胞治疗尤为重要。
嵌合抗原受体T细胞技术(Chimeric Antigen Receptor T-Cell,CAR-T)是近年来兴起的一种新型过继免疫疗法。它将患者T细胞在体外进行基因改造，经过一定扩增后回输至患者体内，从而实现肿瘤的靶向杀伤。目前，已有三款CAR-T产品被美国食品药品监督管理局批准用于血液肿瘤的临床治疗，标志着CAR-T技术的巨大成功。但是，作为新兴的技术，CAR-T技术在各方面依然面临着很多挑战，有巨大的改进空间。首先，现在最常用的方法是利用病毒系统导入外源序列。但是，使用病毒系统存在制备成本高、有随机插入的安全隐患等问题。其次，包括病毒制备在内的传统技术无法实现外源序列在基因组中的精确插入，这样会造成细胞均一性差而影响疗效，也无法对T细胞进行更多的改造。另外，目前CAR-T疗法都是个性化治疗，存在生产成本高、周期长、效果有限等问题。因此，利用CRISPR/Cas9等技术实现CAR等人工改造元件在T细胞中的定点整合，对推动现有T细胞疗法的发展具有重要意义。一方面它可以避免外源序列随机插入带来的不确定性，提高细胞产品的均一性和稳定性。另一方面它可以实现T细胞的多样化改造，既可以一步构建通用型CAR-T细胞，通过调控内源基因构建增强型细胞产品，也可以实现人工元件的动态化表达，对拓展现有技术的应用有很大的帮助。但是，由于T细胞本身细胞类型的特殊性，通过同源重组实现外源序列定点整合的效率一直很低。因此，本领域迫切需要开发一种提高T细胞中同源重组效率的方法，同时也需要筛选高效整合和切割的位点。
发明内容
本发明的目的在于提供提高T细胞中同源重组效率的方法，并提供可特异性结合gRNA的源自PD1基因的靶序列，以及针对这段靶序列可实现高效整合和切割的gRNA位点。
在本发明的第一方面，提供了一种靶序列，所述靶序列选自下组：
(1)SEQ ID NO.:1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO.:1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列经过一个或多个(≤10个，如2-8个，优选为3-5个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的衍生核苷酸，并且所述靶序列特异性与gRNA结合。
在另一优选例中，所述靶序列选自下组：
(1)具有SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的多核苷酸；
(2)与SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％的多核苷酸；
(3)与上述(1)-(2)互补的多核苷酸。
在另一优选例中，所述靶序列包含如SEQ ID NO.:3-15中任一项所示的序列。
在另一优选例中，所述靶序列来源于PD1基因。
本发明第二方面提供了一种gRNA序列，所述gRNA序列与本发明第一方面所述的靶序列互补。
在另一优选例中，所述gRNA包括crRNA、tracrRNA、sgRNA。
在另一优选例中，所述gRNA包括未修饰和经修饰的gRNA。
在另一优选例中，所述经修饰的gRNA包括碱基的化学修饰。
在另一优选例中，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰。
在另一优选例中，所述gRNA的靶向序列包含SEQ ID NO.:16-28中任一所示的序列。
本发明第三方面提供了一种基因编辑系统，所述系统包括基因编辑酶和gRNA，所述gRNA与本发明第一方面所述的靶序列互补。
在另一优选例中，所述基因编辑酶选自下组：CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、TALEN酶、ZFN酶、或其组合。
在另一优选例中，所述基因编辑酶来源于微生物；优选地来源于细菌。
在另一优选例中，所述基因编辑酶的来源选自下组：酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)、葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、犬链球菌(Streptococcus canis)、或其组合。
在另一优选例中，所述基因编辑酶包括野生型或突变型的基因编辑酶。
在另一优选例中，所述基因编辑酶选自下组：Cas9、Cas12、Cas13、Cms1、MAD7、Cas3、Cas8a、Cas8b、Cas10d、Cse1、Csy1、Csn2、Cas4、Cas10、Csm2、Cmr5、Fok1、Cpf1、或其组合。
在另一优选例中，所述gRNA包括crRNA、tracrRNA、sgRNA。
在另一优选例中，所述gRNA包括未修饰和经修饰的gRNA。
在另一优选例中，所述经修饰的gRNA包括碱基的化学修饰。
在另一优选例中，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括体内基因编辑、体外基因编辑。
在另一优选例中，所述的基因编辑包括基于CRISPR的基因编辑或定点敲入供体DNA。
在另一优选例中，所述靶序列选自下组的靶位点：PD1。
在另一优选例中，所述gRNA的靶向序列包含SEQ ID NO.:16-28中任一项所示的序列。
在另一优选例中，所述组合物还包括供体DNA。
在另一优选例中，所述供体DNA为双链DNA。
在另一优选例中，所述的供体DNA包括第一同源臂和第二同源臂，其中所述第一同源臂和第二同源臂能够启动所述供体DNA在基因组的靶位点处由细胞介导的同源重组。
在另一优选例中，所述第一同源臂和第二同源臂的序列长度各自独立的为200-2000bp，较佳地，400-1000bp，更佳地，700-900bp。
在另一优选例中，所述的第一同源臂与基因组的靶位点的切割位点的上游侧(或左侧)序列是同源的，而所述的第二同源臂与基因组的靶位点的切割位点的下游侧(或右侧)序列是同源的。
在另一优选例中，所述靶位点包括PD1。
在另一优选例中，所述供体DNA还包括目的基因。
在另一优选例中，所述目的基因包含嵌合抗原受体或TCR的编码序列。
在另一优选例中，所述供体DNA的序列长度为50bp－5000bp，较佳地，80bp－4000bp。
在另一优选例中，所述目的基因的长度为50bp-3000bp，较佳地，1000bp-2200bp。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体或TCR的编码序列的长度为50bp-3000bp，较佳地，1000bp-2000bp。
在另一优选例中，所述第一同源臂的序列长度D1和第二同源臂的序列长度D2之比(D1/D2)为(0.8-1.2):(0.5-1.5)，较佳地(0.9-1.1):(0.7-1.3)，更佳地，1:1。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体含有靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域。
在另一优选例中，所述嵌合抗原受体包括靶向肿瘤细胞标志物的抗原结合结构域、任选的绞链区、跨膜结构域和细胞内信号传导结合域。
在另一优选例中，所述肿瘤细胞标志物选自下组：α叶酸受体、5T4、αvβ6整联蛋白、BCMA、B7-H3、B7-H6、CAIX、CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD70、CD79a、CD79b、CD123、CD138、CD171、CEA、CSPG4、EGFR、包含ErbB2(HER2)的EGFR家族、EGFRvIII、EGP2、EGP40、EPCAM、EphA2、EpCAM、FAP、胎儿AchR、FRα、GD2、GD3、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、HLA-A1+MAGE1、HLA-A2+MAGE1、HLA-A3+MAGE1、HLA-A1+NY-ESO-1、HLA-A2+NY-ESO-1、HLA-A3+NY-ESO-1、IL-11Rα、IL-13Rα2、Lambda、Lewis-Y、Kappa、间皮素、Muc1、Muc16、NCAM、NKG2D配体、NY-ESO-1、PRAME、PSCA、PSMA、ROR1、SSX、存活蛋白、TAG72、TEM、VEGFR2、WT-1、或其组合。
在另一优选例中，所述绞链区为选自下组的蛋白的铰链区：CD8、Ig(免疫球蛋白)铰链、CD28、或其组合。
在另一优选例中，所述跨膜结构域为选自下组的蛋白的跨膜区：CD8α、CD8β、CD28、CD33、CD37、CD5、CD16、ICOS、CD9、CD22、CD134、CD137、CD154、CD19、CD45、CD4、CD3ε、CD3γ、CD3ζ、或其组合。
在另一优选例中，所述细胞内信号传导结合域包括共刺激信号分子和/或初级信号传导结构域。
在另一优选例中，所述共刺激信号分子选自下组：OX40、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、LIGHT、DAP10、CDS、ICAM-1、CD278(ICOS)、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD27、CD54(ICAM)、CD83、LAT、NKD2C、SLP76、TRIM、ZAP70、或其组合。
在另一优选例中，所述初级信号传导结构域选自下组：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD22、CD79a、CD79b、CD66d、或其组合。
在另一优选例中，所述供体DNA的序列如SEQ ID NO.:29-31中任一项所示。
本发明第四方面提供了一种细胞，所述细胞经本发明第三方面所述的基因编辑系统进行编辑后获得。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。
在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，
在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。
本发明第五方面提供了一种组合物，包括：
本发明第三方面所述的系统或本发明第四方面所述的细胞；和
药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物还包括表达复合物，所述表达复合物包括编码外源蛋白质的核酸分子。
在另一优选例中，所述外源蛋白质是能够在细胞中表达的蛋白。
在另一优选例中，所述外源蛋白质是能够在细胞表面上表达的重组受体。
在另一优选例中，所述重组受体包括嵌合抗原受体(CAR)、TCR、嵌合表面受体。
在另一优选例中，所述组合物包括药物组合物。
在另一优选例中，所述药物组合物为液态。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型包括注射剂或针剂。
在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为静脉注射剂型或瘤内注射剂型。
在另一优选例中，所述的组合物中，本发明第三方面所述的系统或本发明第四方面所述的细胞占所述组合物总重量的1-99wt％，较佳地10-90wt％，更佳地30-70wt％。
本发明第六方面提供了一种药盒，包括：
第一容器，以及活性成分或含有所述活性成分的药物，所述活性成分或所述药物位于所述第一容器中，所述活性成分包含本发明第三方面所述的系统、或本发明第四方面所述的细胞、或本发明第五方面所述的组合物。
在另一优选例中，所述活性成分或所述药物为单方制剂。
在另一优选例中，所述活性成分或所述药物的剂型为注射剂型或针剂。
在另一优选例中，所述活性成分或所述药物的剂型为静脉注射剂型或瘤内注射剂型。在另一优选例中，所述药盒还含有说明书，所述说明书中记载了向施用对象给予所述活性成分或所述药物，从而预防和/或治疗疾病的说明。
在另一优选例中，所述施用对象为细胞。
在另一优选例中，所述施用对象为T细胞。
在另一优选例中，所述施用对象为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述施用为将所述活性成分或所述药物与T细胞接触，或者是将所述活性成分或所述药物通过注射方式注入人体内。
本发明第七方面提供了一种对细胞进行基因编辑的方法，包括将所述细胞接触本发明第三方面所述的基因编辑系统或本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述接触在体外进行。
在另一优选例中，所述细胞为体外培养的细胞。
在另一优选例中，所述的细胞包括原代细胞和传代的细胞。
在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，
在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。
本发明第八方面提供了一种用于基因编辑的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第三方面所述的基因编辑系统或本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括标签或说明书。
在另一优选例中，所述标签或所述说明书中记载了向编辑对象给予所述系统或所述组合物或所述药盒，从而进行基因编辑的说明。
在另一优选例中，所述编辑对象包括细胞。
在另一优选例中，所述细胞包括T细胞，
在另一优选例中，所述细胞包括CD3+T细胞、CD4+辅助T细胞、CD4+调节T细胞、CD8+T细胞、记忆性T细胞。
本发明第九方面提供了一种本发明第三方面所述的基因编辑系统、本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述药盒的用途，用于制备用于预防和/或治疗疾病的药物。
在另一优选例中，所述疾病包括癌症。
在另一优选例中，所述癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症包括PD-L1高表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、脑癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮素瘤、或其组合。
本发明第十方面提供了一种治疗疾病的方法，包括向受试者施用有效量的本发明第四方面所述的细胞、本发明第五方面所述的组合物或本发明第六方面所述的药盒。
在另一优选例中，所述疾病选包括癌症。
在另一优选例中，所述癌症包括实体肿瘤和血液肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症包括PD-L1高表达的肿瘤。
在另一优选例中，所述癌症选自下组：白血病、淋巴瘤、肝癌、肺癌、肾癌、乳腺癌、结直肠癌、胃癌、脑癌、黑色素瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、间皮素瘤、或其组合。
在另一优选例中，所述施用包括注射施用。
在另一优选例中，所述受试者为人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所述所述非人哺乳动物包括啮齿动物和灵长目动物，优选小鼠、大鼠、兔、猴。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
本申请的附图中，“Untreated T”表示未处理的T细胞，“Control”表示只电转了同源模板和Cas9的T细胞，“LV-19bbz”表示用慢病毒制备的CD19-CART细胞，“PD1-19bbz”表示非病毒PD1定点整合型CD19-CART细胞。
图1显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为CD19-CAR序列在PD1位点重组率。
图2显示了PD1基因CRISPR/Cas9高效切割sgRNA位点筛选，为通过ICE方法检测PD1位点敲除率。
图3显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为mTurquoise2荧光蛋白序列在PD1位点重组率。
图4显示了PD1基因高效整合sgRNA位点筛选，为CD19-CAR序列在PD1位点重组率。
图5显示了PD1基因CRISPR/Cas9高效切割sgRNA位点筛选，为通过ICE方法检测PD1位点敲除率。
图6显示了PD1定点整合CD19-CART细胞DNA测序结果。HA代表同源臂。
图7显示了PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率和敲除率。A图为不同健康供体T细胞制备的PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率；B图为五个代表性的不同健康供体T细胞制备的PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率和敲除率；C图为流式分析显示PD1定点整合CD19-CART细胞阳性率，对照组为只电转同源模板和Cas9；D图为PD1定点整合CD19-CART细胞与慢病毒制备CD19-CART细胞的PD1表达比较。
图8显示了PD1定点整合CD19-CART细胞与靶细胞共培养体外扩增。
图9显示了PD1定点整合CD19-CART细胞表面标志物表达。对照组为只电转同源模板和Cas9。
图10显示了PD1定点整合CD19-CART细胞分泌因子检测。对照组为只电转同源模板和Cas9。
图11显示了PD1定点整合CD19-CART细胞体外杀伤。对照组为只电转同源模板和Cas9。
图12显示了PD1定点整合CD19-CART细胞体内杀伤。肿瘤靶细胞为PD-L1过表达的Raji细胞。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选，首次意外的筛选到了可特异性结合gRNA的源自PD1基因的靶序列，并且针对该靶序列创造性地设计对PD1进行高效基因编辑的gRNA，本发明还首次发现含有该gRNA、基因编辑酶(在某些情况下还含有供体DNA)的基因编辑组合物具有很高的敲除率和重组率。在此基础上完成了本发明。
术语
CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法
CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPR RNAs(比如gRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。
此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(single-guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。
作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifying factor)，能够共定位RNA、DNA和蛋白。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，可靶定任何dsDNA序列，而gRNA的末端可连接到目标DNA，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA。这种技术被称为CRISPR/Cas9基因编辑系统。
靶向整合机制
在本发明的靶向整合策略中，提供了一种含有特定长度的同源臂的线性化供体(即供体DNA或外源核酸)，这种供体是通过PCR扩增或者精确酶切获得的含有一定长度(比如，700-900bp)同源臂的转基因供体；将供体DNA或外源核酸与Cas9蛋白以及guide RNA一起电转到细胞中。本发明提供的靶向整合策略相比于已有的基因靶向策略具有更高的整合效率。
基因编辑系统
本发明提供了一种基因编辑系统，所述系统包括基因编辑酶和gRNA，所述gRNA与来源于PD1基因的靶序列互补。
在一优选实施方式中，所述靶序列选自下组：
(1)SEQ ID NO.1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO.1所示的第40-130位(较佳地第50-122位)的核苷酸序列经过一个或多个(≤10个，如2-8个，优选为3-5个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的衍生核苷酸，并且所述靶序列特异性与gRNA结合。
在一优选实施方式中，所述靶序列选自下组：
(1)具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的多核苷酸；
(2)与SEQ ID NO:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％的多核苷酸；
(3)与上述(1)-(2)互补的多核苷酸。
在一优选实施方式中，所述靶序列如SEQ ID NO.:3-15所示。
在一优选实施方式中，本发明的基因编辑系统还含有供体DNA。
本发明的基因编辑系统可显著提高敲除率和重组率。
药物组合物和施用方法
另一方面，本发明还提供了一种药物组合物，它含有(a)安全有效量的本发明的基因编辑系统或本发明第四方面所述的细胞；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的基因编辑系统的剂量通常为10微克-100毫克/剂，较佳地为100-1000微克/剂。
在一优选实施方式中，所述药物组合物中所述细胞的浓度为1×103-1×108个细胞/Kg体重，更优地1×105-1×107个细胞/Kg体重。为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.01毫克/千克至50毫克/千克，较佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克体重的本发明的基因编辑系统。此外，本发明的基因编辑系统可以单用，也可与其他治疗剂一起使用(如配制在同一药物组合物中)。
在本发明中，本发明的药物组合物可以细胞治疗剂的形式施用，例如本发明的基因编辑系统可用于改造细胞，然后将改造好的细胞通过静脉或瘤内注射的方式施用于有需要的受试者。在某些实施方式中，本发明的基因编辑系统可用于改造体内的或分离的细胞。在某些实施方式中，所述细胞可以为T细胞，所述改造可以包括基因编辑。
药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐剂及其组合。
治疗性组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
通常，可将治疗性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液中、液体载体的固体形式。
一旦配成本发明的组合物，可将其通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。待预防或治疗的对象可以是动物；尤其是人。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，可根据使用情况而采用各种不同剂型的药物组合物。较佳地为静脉用药制剂或瘤内用药注射剂。
这些药物组合物可根据常规方法通过混合、稀释或溶解而进行配制，并且偶尔添加合适的药物添加剂，如赋形剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、缓冲剂、等渗剂(isotonicities)、防腐剂、润湿剂、乳化剂、分散剂、稳定剂和助溶剂，而且该配制过程可根据剂型用惯常方式进行。
本发明的药物组合物还可以缓释剂形式给药。例如，本发明的基因编辑系统可被掺入以缓释聚合物为载体的药丸或微囊中，然后将该药丸或微囊通过手术植入待治疗的组织。作为缓释聚合物的例子，可例举的有乙烯-乙烯基乙酸酯共聚物、聚羟基甲基丙烯酸酯(polyhydrometaacrylate)、聚丙烯酰胺、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、乳酸聚合物、乳酸-乙醇酸共聚物等，较佳地可例举的是可生物降解的聚合物如乳酸聚合物和乳酸-乙醇酸共聚物。
在一个实施方式中，所述药物组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的药物组合物优选配制用于静脉内施用。
当本发明的药物组合物被用于实际治疗时，作为活性成分的本发明的基因编辑系统的剂量，可根据待治疗的每个病人的体重、年龄、性别、症状程度而合理地加以确定。
本发明的主要优点包括：
(1)本发明的含有特定gRNA的基因编辑系统可显著提高敲除率和外源核酸的定点整合效率。
(2)通过筛选得到的外源序列高效整合的gRNA位点，本发明能提高外源序列在T细胞中定点整合效率
(3)通过筛选得到的CRISPR/Cas9高效切割的gRNA位点，本发明能提高T细胞基因敲除的效率
(4)使用本发明方法，使定点整合型T细胞产品的制备成为可能，也能更有效地制备基因敲除的T细胞产品
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和NatalieSherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。本专利涉及实验中使用的人供体细胞都获自上海赛笠生物科技有限公司。
如无特别说明，实施例所用的材料和试剂均为市售产品。
通用方法
I.电转T细胞
电转T细胞是实现T细胞基因编辑的技术方法，步骤参照Lonza公司P3PrimaryCell
X试剂盒
仪器与材料：
①Lonza 4D-NucleofectorTMSystem细胞核转仪
②试剂盒为P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit，(Lonza,V4XP-3024)
③CD3/CD28磁珠刺激后2-4天的T细胞
④商品化spCas9蛋白(5ug/ul)(TrueCutTMCas9 Protein v2，Thermofisher)
⑤合成的sgRNA(将合成的sgRNA溶解于TE缓冲液中，稀释成终浓度10ug/uL)
⑥含同源模板的线性化双链DNA
具体操作步骤：
适用于100μl规格的电转杯：
(1)按照82μl Solution+18μl supplement/每个电转杯，按电转总数，配置一个电转液混合液，混匀，放室温。
(2)将Cas9蛋白和sgRNA9进行共孵育，室温放置10min，形成RNP。
(3)RNP中加入线性化的同源模板双链DNA，室温孵育2min。
所述CD19-CART包括靶向CD19的胞外结构域，选自CD8α的跨膜区以及选自CD3ζ和CD137的胞内信号传导结构域；
(4)收集激活状态的T细胞，计数为5×106进行一个电转反应。
(5)将细胞与“RNP+同源模板”充分混合重悬，加入电转杯。
(6)打开电转仪，将电转杯放入槽孔，选择相应程序EO115进行电转。
(7)将细胞加入已预热的细胞培养基中，于细胞培养箱中培养。
II.外源序列重组率检测
1)取1×106细胞于无菌的1.5ml离心管中，离心后弃掉上清；
2)向细胞沉淀中加入流式缓冲液(含2％血清的PBS)清洗细胞；
3)置于室温离心机中，离心后尽量吸尽上清；
4)与检测抗体或蛋白进行共孵育，冰上孵育30分钟；
5)用流式缓冲液清洗细胞两次，离心后尽量吸尽上清；
6)用合适体积流式缓冲液重悬细胞，进行流式上机分析；
III.敲除率检测
(1)使用“血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒”(TIANGEN，DP304)提取未处理和电转后T细胞基因组DNA
(2)通过PCR扩增切割位点区域DNA
(3)使用“普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒”(TIANGEN，DP209)纯化PCR产物
(4)将纯化的PCR产物进行一代测序
(5)通过ICE工具(Synthego)分析敲除率
在某些实施方式中，本发明的靶序列可以如下所示，即SEQ ID NO.:1：
GCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCTGCTCCCGGGCCGCACGAGGGACAATAGGAGCCAGGCGCACCGGCCAGCCCCTGAAGGAGGACCCCTCAGCCGTGCCTGTGTTCTCTGTGGACTATGGGGAGCTGGATTTCCAGTGGCGAGAGAAGACCCCGGAGCCCCCCGTGCCCTGTGTCCCTGAGCAGACGGAGTATGCCACCATTGTCTTTCCTAGCGGAATGGGCACCTCATCCCCCGCCCGCAGGGGCTCAGCTGACGGCCCTCGGAGTGCCCAGCCACTGAGGCCTGAGGATGGACACTGCTCTTGGCCCCTCTGACCGGCTTCCTTGGCCACCAGTGTTCTGCAGACCCTCCACCATGAGCCCGGGTCAGCGCATTTCCTCAGGAGAAGCAGGCAGGGTGCAGGCCATTGCAGGCCGTCCAGGGGCTGAGCTGCCTGGGGGCGACCGGGGCTCCAGCCTGCACCTGCACCAGGCACAGCCCCACCACAGGACTCATGTCTCAATGCCCACAGTGAGCCCAGGCAGCAGGTGTCACCGTCCCCTACAGGGAGGGCCAGATGCAGTCACTGCTTCAGGTCCTGCCAGCACAGAGCTGCCTGCGTCCAGCTCCCTGAATCTCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCCTGCGGCCCGGGGCTGAAGGCGCCGTGGCCCTGCCTGACGCCCCGGAGCCTCCTGCCTGAACTTGGGGGCTGGTTGGAGATGGCCTTGGAGCAGCCAAGGTGCCCCTGGCAGTGGCATCCCGAAACGCCCTGGACGCAGGGCCCAAGACTGGGCACAGGAGTGGGAGGTACATGGGGCTGGGGACTCCCCAGGAGTTATCTGCTCCCTGCAGGCCTAGAGAAGTTTCAGGGAAGGTCAGAAGAGCTCCTGGCTGTGGTGGGCAGGGCAGGAAACCCCTCCACCTTTACACATGCCCAGGCAGCACCTCAGGCCCTTTGTGGGGCAGGGAAGCTGAGGCAGTAAGCGGGCAGGCAGAGCTGGAGGCCTTTCAGGCCCAGCCAGCACTCTGGCCTCCTGCCGCCGCATTCCACCCCAGCCCCTCACACCACTCGGGAGAGGGACATCCTACGGTCCCAAGGTCAGGAGGGCAGGGCTGGGGTTGACTCAGGCCCCTCCCAGCTGTGGCCACCTGGGTGTTGGGAGGGCAGAAGTGCAGGCACCTAGGGCCCCCCATGTGCCCACCCTGGGAGCTCTCCTTGGAACCCATTCCTGAAATTATTTAAAGGGGTTGGCCGGGCTCCCACCAGGGCCTGGGTGGGAAGGTACAGGCGTTCCCCCGGGGCCTAGTACCCCCGCCGTGGCCTATCCACTCCTCACATCCACACACTGCACCCCCACTCCTGGGGCAGGGCCACCAGCATCCAGGCGGCCAGCAGGCACCTGAGTGGCTGGGACAAGGGATCCCCCTTCCCTGTGGTTCTATTATATTATAATTATAATTAAATATGAGAGCATGCTAA。
在其他实施方式中，本发明的靶序列可以如下所示，即SEQ ID NO.:2：
TCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGA。
在另一些实施方式中，本发明的靶序列可以包含如SEQ ID NO.:3-15中任一项所示的序列：
DNA-sg1(即SEQ ID NO.:3)：ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG。
DNA-sg2(即SEQ ID NO.:4)：CAGGCGCCCTGGCCAGTCGT。
DNA-sg3(即SEQ ID NO.:5)：GGGCGCCTGTGGGATCTGCA。
DNA-sg4(即SEQ ID NO.:6)：TGGCCAGTCGTCTGGGCGGT。
DNA-sg5(即SEQ ID NO.:7)：GGCCAGTCGTCTGGGCGGTG。
DNA-sg6(即SEQ ID NO.:8)：GTGGGATCTGCATGCCTGGA。
DNA-sg7(即SEQ ID NO.:9)：GGCATGCAGATCCCACAGGC。
DNA-sg8(即SEQ ID NO.:10)：GCCCAGTTGTAGCACCGCCC。
DNA-sg9(即SEQ ID NO.:11)：CCAGCCCAGTTGTAGCACCG。
DNA-sg10(即SEQ ID NO.:12)：GGCCGCCAGCCCAGTTGTAG。
DNA-sg11(即SEQ ID NO.:13)：TCCTGGCCGCCAGCCCAGTT。
DNA-sg12(即SEQ ID NO.:14)：AGTTGTAGCACCGCCCAGAC。
DNA-sg13(即SEQ ID NO.:15)：GTTGTAGCACCGCCCAGACG。
在某些实施方式中，本发明的gRNA的靶向序列可以包含如SEQ ID NO.:16-28中任一项所示的序列：
PD1-sg1(即SEQ ID NO.:16)：CGACTGGCCAGGGCGCCTGT。
PD1-sg2(即SEQ ID NO.:17)：ACGACTGGCCAGGGCGCCTG。
PD1-sg3(即SEQ ID NO.:18)：TGCAGATCCCACAGGCGCCC。
PD1-sg4(即SEQ ID NO.:19)：ACCGCCCAGACGACTGGCCA。
PD1-sg5(即SEQ ID NO.:20)：CACCGCCCAGACGACTGGCC。
PD1-sg6(即SEQ ID NO.:21)：TCCAGGCATGCAGATCCCAC。
PD1-sg7(即SEQ ID NO.:22)：GCCTGTGGGATCTGCATGCC。
PD1-sg8(即SEQ ID NO.:23)：GGGCGGTGCTACAACTGGGC。
PD1-sg9(即SEQ ID NO.:24)：CGGTGCTACAACTGGGCTGG。
PD1-sg10(即SEQ ID NO.:25)：CTACAACTGGGCTGGCGGCC。
PD1-sg11(即SEQ ID NO.:26)：AACTGGGCTGGCGGCCAGGA。
PD1-sg12(即SEQ ID NO.:27)：GTCTGGGCGGTGCTACAACT。
PD1-sg13(即SEQ ID NO.:28)：CGTCTGGGCGGTGCTACAAC。
实施例1sgRNA的筛选实验
首先选择了一组PD1位点，在刺激后的T细胞中导入spCas9(TrueCutTMCas9Protein v2，Thermofisher)、sgRNA和CAR元件模板，其中CAR元件模板的序列如SEQ IDNO.:29所示。通过流式分析检测CAR阳性率，以确定外源序列高效整合的位点。结果显示，CAR元件在PD1多个位点均有不同程度的整合(图1)。同时，利用ICE方法检测这组位点的PD1敲除率。结果显示PD1部分位点有较高的敲除率(图2)。
之后，又选择了另一组PD1位点，在刺激后的T细胞中导入spCas9(TrueCutTMCas9Protein v2，Thermofisher)、sgRNA和含荧光蛋白mTurquoise2序列的模板,其中含荧光蛋白mTurquoise2序列的模板的序列如SEQ ID NO.:30所示。通过流式分析检测荧光蛋白的重组率，以确定外源序列高效整合的位点。结果显示，荧光蛋白序列在PD1多个位点均有不同程度的整合(图3)。在另一个实验中，在刺激后的T细胞中导入spCas9(TrueCutTMCas9Protein v2，Thermofisher)、sgRNA和CAR元件模板，其中CAR元件模板的序列如SEQ IDNO.:31所示。通过流式分析检测CAR阳性率，以确定外源序列高效整合的位点。与荧光蛋白重组检测结果相似，观察到CAR元件在PD1多个位点均有不同程度的整合(图4)。同时，利用ICE方法检测这组PD1位点的敲除率。结果显示PD1部分位点有较高的敲除率(图5)。
本实施例中提到的序列SEQ ID NO.:29-31中的任一项具体如下：
SEQ ID NO.:29，即PD1第一组位点(PD1-sg1到PD1-sg7)检测使用的含CAR序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2954-3753位的核苷酸为第二同源臂序列：
CCCTGCCACCGCCCCAGCCCCCCCGTCAGGCTGTTGCAGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGG。
SEQ ID NO.:30，即PD1第二组位点(PD1-sg8到PD1-sg13)检测使用的含mTurquoise2序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2213-3012位的核苷酸为第二同源臂序列：
AGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCCGGCGGCGGTCACGAACTCCAGCAGGACCATGTGATCGCGCTTCTCGTTGGGGTCTTTGCTCAGCTTGGACTGGGTGCTCAGGTAGTGGTTGTCGGGCAGCAGCACGGGGCCGTCGCCGATGGGGGTGTTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCTGCACGCCGCCGTCCTCGATGTTGTGGCGGATCTTGAAGTTGGCCTTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCGGCGGTGATATAGACGTTGTCGCTGAAGTAGTTGTACTCCAGCTTGTGCCCCAGGATGTTGCCGTCCTCCTTGAAGTCGATGCCCTTCAGCTCGATGCGGTTCACCAGGGTGTCGCCCTCGAACTTCACCTCGGCGCGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAAGAAGATGGTGCGCTCCTGGACGTAGCCTTCGGGCATGGCGGACTTGAAGAAGTCGTGCTGCTTCATGTGGTCGGGGTAGCGGGCGAAGCACTGCACGCCCCAGCTCAGGGTGGTCACGAGGGTGGGCCAGGGCACGGGCAGCTTGCCGGTGGTGCAGATGAACTTCAGGGTCAGCTTGCCGTAGGTGGCATCGCCCTCGCCCTCGCCGGACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTACGTCGCCGTCCAGCTCGACCAGGATGGGCACCACCCCGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGGGCTGCCCGTGACCCTGGGCCCTCTGTGTACACTGTGA。
SEQ ID NO.:31，即PD1第二组位点(PD1-sg8到PD1-sg13)检测使用的含CAR序列的供体DNA序列，在该序列中，第1-800位的核苷酸为第一同源臂序列，第2954-3753位的核苷酸为第二同源臂序列：
AGGCATCACACGGTGGAAAGATCTGGAACTGTGGCCATGGTGTGAGGCCATCCACAAGGTGGAAGCTTTGAGGGGGAGCCGATTAGCCATGGACAGTTGTCATTCAGTAGGGTCACCTGTGCCCCAGCGAAGGGGGATGGGCCGGGAAGGCAGAGGCCAGGCACCTGCCCCCAGCAGGGGCAGAGGCTGTGGGCAGCCGGGAGGCTCCCAGAGGCTCCGACAGAATGGGAGTGGGGTTGAGCCCACCCCTCACTGCAGCCCAGGAACCTGAGCCCAGAGGGGGCCACCCACCTTCCCCAGGCAGGGAGGCCCGGCCCCCAGGGAGATGGGGGGGATGGGGGAGGAGAAGGGCCTGCCCCCACCCGGCAGCCTCAGGAGGGGCAGCTCGGGCGGGATATGGAAAGAGGCCACAGCAGTGAGCAGAGACACAGAGGAGGAAGGGGCCCTGAGCTGGGGAGACCCCCACGGGGTAGGGCGTGGGGGCCACGGGCCCACCTCCTCCCCATCTCCTCTGTCTCCCTGTCTCTGTCTCTCTCTCCCTCCCCCACCCTCTCCCCAGTCCTACCCCCTCCTCACCCCTCCTCCCCCAGCACTGCCTCTGTCACTCTCGCCCACGTGGATGTGGAGGAAGAGGGGGCGGGAGCAAGGGGCGGGCACCCTCCCTTCAACCTGACCTGGGACAGTTTCCCTTCCGCTCACCTCCGCCTGAGCAGTGGAGAAGGCGGCACTCTGGTGGGGCTGCTCCAGGCATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGTAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTGTCGAGGCCGCGGATCCTTCGAATTCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCTGCATGTGAAGGGCGTCGTAGGTGTCCTTGGTGGCTGTACTGAGACCCTGGTAAAGGCCATCGTGCCCCTTGCCCCTCCGGCGCTCGCCTTTCATCCCAATCTCACTGTAGGCCTCCGCCATCTTATCTTTCTGCAGTTCATTGTACAGGCCTTCCTGAGGGTTCTTCCTTCTCGGCTTTCCCCCCATCTCAGGGTCCCGGCCACGTCTCTTGTCCAAAACATCGTACTCCTCTCTTCGTCCTAGATTGAGCTCGTTATAGAGCTGGTTCTGGCCCTGCTTGTACGCGGGGGCGTCTGCGCTCCTGCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTCTTCTGGAAATCGGCAGCTACAGCCATCTTCCTCTTGAGTAGTTTGTACTGGTCTCATAAATGGTTGTTTGAATATATACAGGAGTTTCTTTCTGCCCCGTTTGCAGTAAAGGGTGATAACCAGTGACAGGAGAAGGACCCCACAAGTCCCGGCCAAGGGCGCCCAGATGTAGATATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCTCGTGTGCACTGCGCCCCCCGCCGCTGGCCGGCACGCCTCTGGGCGCAGGGACAGGGGCTGCGACGCGATGGTGGGCGCCGGTGTTGGTGGTCGCGGCGCTGGCGTCGTGGTTGAGGAGACGGTGACTGAGGTTCCTTGGCCCCAGTAGTCCATAGCATAGCTACCACCGTAGTAATAATGTTTGGCACAGTAGTAAATGGCTGTGTCATCAGTTTGCAGACTGTTCATTTTTAAGAAAACTTGGCTCTTGGAGTTGTCCTTGATGATGGTCAGTCTGGATTTGAGAGCTGAATTATAGTATGTGGTTTCACTACCCCATATTACTCCCAGCCACTCCAGACCCTTTCGTGGAGGCTGGCGAATCCAGCTTACACCATAGTCGGGTAATGAGACCCCTGAGACAGTGCATGTGACGGACAGGCTCTGTGAGGGCGCCACCAGGCCAGGTCCTGACTCCTGCAGTTTCACCTCAGATCCGCCGCCACCCGACCCACCACCGCCCGAGCCACCGCCACCTGTGATCTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAACGTGTACGGAAGCGTATTACCCTGTTGGCAAAAGTAAGTGGCAATATCTTCTTGCTCCAGGTTGCTAATGGTGAGAGAATAATCTGTTCCAGACCCACTGCCACTGAACCTTGATGGGACTCCTGAGTGTAATCTTGATGTATGGTAGATCAGGAGTTTAACAGTTCCATCTGGTTTCTGCTGATACCAATTTAAATATTTACTAATGTCCTGACTTGCCCTGCAACTGATGGTGACTCTGTCTCCCAGAGAGGCAGACAGGGAGGATGTAGTCTGTGTCATCTGGATGTCCGGCCTGGCGGCGTGGAGCAGCAAGGCCAGCGGCAGGAGCAAGGCGGTCACTGGTAAGGCCATGGTGGCTCTAGAGTAGGCGCCGGTCACAGCTTGGATCTGTAACGGCGCAGAACAGAAAACGAAACAAAGACGTAGAGTTGAGCAAGCAGGGTCAGGCAAAGCGTGGAGAGCCGGCTGAGTCTAGGTAGGCTCCAAGGGAGCGCCGGACAAAGGCCCGGTCTCGACCTGAGCTTTAAACTTACCTAGACGGCGGACGCAGTTCAGGAGGCACCACAGGCGGGAGGCGGCAGAACGCGACTCAACCGGCGTGGATGGCGGCCTCAGGTAGGGCGGCGGGCGCGTGAAGGAGAGATGCGAGCCCCTCGAAGCTTCAGCTGTGTTCTGGCGGCAAACCCGTTGCGAAAAAGAACGTTCACGGCGACTACTGCACTTATATACGGTTCTCCCCCACCCTCGGGAAAAAGGCGGAGCCAGTACACGACATCACTTTCCCAGTTTACCCCGCGCCACCTTCTCTAGGCACCCGTTCAATTGCCGACCCCTCCCCCCAACTTCTCGGGGACTGTGGGCGATGTGCGCTCTGCCCACTGACGGGCACCGGAGCGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGGTAGGTGGGGTCGGCGGTCAGGTGTCCCAGAGCCAGGGGTCTGGAGGGACCTTCCACCCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGAGGCGGGCCTGGCCCTGGCAGCCCAGGGGTCCCGGAGCGAGGGGTCTGGAGGGACCTTTCACTCTCAGTCCCTGGCAGGTCGGGGGGTGCTGTGGCAGGCCCAGCCTTGGCCCCCAGCTCTGCCCCTTACCCTGAGCTGTGTGGCTTTGGGCAGCTCGAACTCCTGGGTTCCTCTCTGGGCCCCAACTCCTCCCCTGGCCCAAGTCCCCTCTTTGCTCCTGGGCAGGCAGGACCTCTGTCCCCTCTCAGCCGGTCCTTGGGGCTGCGTGTTTCTGTAGAATGACGGGTCAGGCTGGCCAGAACCCCAAACCTTGGCCGTGGGGAGTCTGCGTGGCGGCTCTGCCTTGCCCAGGCATCCTTGGTCCTCACTCGAGTTTTCCTAAGGATGGGATGAGCCCCATGTGGGACTAACCTTGGCTTTACGACGTCAAAGTTTAGATGAGCTGGTGATATTTTTCTCATTATATCCAAAGTGTACCTGTTCGAGTGAGGACAGTTCTTCTGTCTCCAGGATCCCTCCTGGGTGGGGATTGTGCCCGCCTGGGTCTCTGCCCAGATTCCAGGGCTCTCCCCGAGCCCTGTTCAGACCATCCGTGGGGGAGGCCTTGGCCTCACTCTCCCGGATCGAGGAGAGAGGGAGCCTCTTCCTGGGCTGCCCGTGACCCTGGGCCCTCTGTGTACACTGTGA。
实施例2使用本发明方法构建非病毒PD1定点整合型CD19-CART细胞，并对其功能进行检测
使用本发明PD1-sg1序列，使用不同健康供者的T细胞成功构建了PD1定点整合型CD19-CART细胞(其中用到的供体DNA序列如SEQ ID NO.:29所示)，并进行了测序验证(图6)，总阳性率大约在10％-30％(图7A、C)，敲除率大约在80％-95％(图7B)，PD1表达水平明显下降(图7D)，体现出了较好的制备稳定性。在此基础上，对PD1定点整合型CD19-CART的生物学功能进行了检测。实验结果显示，与PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)接触后，PD1定点整合型CD19-CART细胞具有比慢病毒制备的CAR-T细胞更强的扩增能力(图8)。与慢病毒制备的CD19-CART细胞相似，PD1定点整合型CD19-CART细胞能响应PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)的刺激而激活表面标志物CD69、CD137、CD25的表达(图9A-C)，其中CD137表达水平的上升更为明显。相一致地，PD1定点整合型CD19-CART细胞与PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)接触后能大量分泌细胞因子IL-2、TNF-α、IFN-γ(图10A-C)，其中IFN-γ分泌水平的上升更为显著。最后，通过体内外实验证明了与慢病毒制备的CD19-CART细胞相比，使用本发明构建的PD1定点整合型CD19-CART细胞具有对PD-L1高表达肿瘤靶细胞(本实施例以慢病毒感染的PD-L1稳定过表达Raji肿瘤靶细胞为例)更强的肿瘤杀伤能力(图11、12)。
综上，使用本发明序列并利用CRISPR/Cas9基因编辑工具可成功构建PD1定点整合型CAR-T细胞。本发明证明了与现有技术相比，使用本发明序列制备的定点整合型CAR-T细胞具有较高的阳性率，并可以有效地发挥功能。该技术方法与传统慢病毒制备方法相比，可减少CAR-T制备过程中使用病毒带来的高昂成本，并减少病毒随机插入带来的安全隐患，也提高了CAR-T产品的均一性。另外，该方法还可实现CAR-T细胞的多样化改造，增强CAR-T细胞的抗肿瘤能力。该举例证明了本发明提供的提高T细胞中外源序列定点整合的方法，以及保护的T细胞中高效整合、切割gRNA位点和DNA靶序列的重要性和价值，但不限于PD1定点整合CAR-T细胞的制备，可拓展到其他T细胞免疫疗法的开发。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 用于基因编辑的组合物及其应用
<130> P2021-0002
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2097
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gctcacctcc gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct ccaggcatgc 60
agatcccaca ggcgccctgg ccagtcgtct gggcggtgct acaactgggc tggcggccag 120
gatggttctt agactcccca gacaggccct ggaacccccc caccttctcc ccagccctgc 180
tcgtggtgac cgaaggggac aacgccacct tcacctgcag cttctccaac acatcggaga 240
gcttcgtgct aaactggtac cgcatgagcc ccagcaacca gacggacaag ctggccgcct 300
tccccgagga ccgcagccag cccggccagg actgccgctt ccgtgtcaca caactgccca 360
acgggcgtga cttccacatg agcgtggtca gggcccggcg caatgacagc ggcacctacc 420
tctgtggggc catctccctg gcccccaagg cgcagatcaa agagagcctg cgggcagagc 480
tcagggtgac agagagaagg gcagaagtgc ccacagccca ccccagcccc tcacccaggc 540
cagccggcca gttccaaacc ctggtggttg gtgtcgtggg cggcctgctg ggcagcctgg 600
tgctgctagt ctgggtcctg gccgtcatct gctcccgggc cgcacgaggg acaataggag 660
ccaggcgcac cggccagccc ctgaaggagg acccctcagc cgtgcctgtg ttctctgtgg 720
actatgggga gctggatttc cagtggcgag agaagacccc ggagcccccc gtgccctgtg 780
tccctgagca gacggagtat gccaccattg tctttcctag cggaatgggc acctcatccc 840
ccgcccgcag gggctcagct gacggccctc ggagtgccca gccactgagg cctgaggatg 900
gacactgctc ttggcccctc tgaccggctt ccttggccac cagtgttctg cagaccctcc 960
accatgagcc cgggtcagcg catttcctca ggagaagcag gcagggtgca ggccattgca 1020
ggccgtccag gggctgagct gcctgggggc gaccggggct ccagcctgca cctgcaccag 1080
gcacagcccc accacaggac tcatgtctca atgcccacag tgagcccagg cagcaggtgt 1140
caccgtcccc tacagggagg gccagatgca gtcactgctt caggtcctgc cagcacagag 1200
ctgcctgcgt ccagctccct gaatctctgc tgctgctgct gctgctgctg ctgctgcctg 1260
cggcccgggg ctgaaggcgc cgtggccctg cctgacgccc cggagcctcc tgcctgaact 1320
tgggggctgg ttggagatgg ccttggagca gccaaggtgc ccctggcagt ggcatcccga 1380
aacgccctgg acgcagggcc caagactggg cacaggagtg ggaggtacat ggggctgggg 1440
actccccagg agttatctgc tccctgcagg cctagagaag tttcagggaa ggtcagaaga 1500
gctcctggct gtggtgggca gggcaggaaa cccctccacc tttacacatg cccaggcagc 1560
acctcaggcc ctttgtgggg cagggaagct gaggcagtaa gcgggcaggc agagctggag 1620
gcctttcagg cccagccagc actctggcct cctgccgccg cattccaccc cagcccctca 1680
caccactcgg gagagggaca tcctacggtc ccaaggtcag gagggcaggg ctggggttga 1740
ctcaggcccc tcccagctgt ggccacctgg gtgttgggag ggcagaagtg caggcaccta 1800
gggcccccca tgtgcccacc ctgggagctc tccttggaac ccattcctga aattatttaa 1860
aggggttggc cgggctccca ccagggcctg ggtgggaagg tacaggcgtt cccccggggc 1920
ctagtacccc cgccgtggcc tatccactcc tcacatccac acactgcacc cccactcctg 1980
gggcagggcc accagcatcc aggcggccag caggcacctg agtggctggg acaagggatc 2040
ccccttccct gtggttctat tatattataa ttataattaa atatgagagc atgctaa 2097
<210> 2
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
tccaggcatg cagatcccac aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg 60
ctggcggcca gga 73
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
acaggcgccc tggccagtcg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
caggcgccct ggccagtcgt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 5
gggcgcctgt gggatctgca 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 6
tggccagtcg tctgggcggt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 7
ggccagtcgt ctgggcggtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 8
gtgggatctg catgcctgga 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 9
ggcatgcaga tcccacaggc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 10
gcccagttgt agcaccgccc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 11
ccagcccagt tgtagcaccg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 12
ggccgccagc ccagttgtag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 13
tcctggccgc cagcccagtt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 14
agttgtagca ccgcccagac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 15
gttgtagcac cgcccagacg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 16
cgactggcca gggcgcctgt 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 17
acgactggcc agggcgcctg 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 18
tgcagatccc acaggcgccc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 19
accgcccaga cgactggcca 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 20
caccgcccag acgactggcc 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 21
tccaggcatg cagatcccac 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 22
gcctgtggga tctgcatgcc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 23
gggcggtgct acaactgggc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 24
cggtgctaca actgggctgg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 25
ctacaactgg gctggcggcc 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 26
aactgggctg gcggccagga 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 27
gtctgggcgg tgctacaact 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 28
cgtctgggcg gtgctacaac 20
<210> 29
<211> 3753
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 29
ccctgccacc gccccagccc ccccgtcagg ctgttgcagg catcacacgg tggaaagatc 60
tggaactgtg gccatggtgt gaggccatcc acaaggtgga agctttgagg gggagccgat 120
tagccatgga cagttgtcat tcagtagggt cacctgtgcc ccagcgaagg gggatgggcc 180
gggaaggcag aggccaggca cctgccccca gcaggggcag aggctgtggg cagccgggag 240
gctcccagag gctccgacag aatgggagtg gggttgagcc cacccctcac tgcagcccag 300
gaacctgagc ccagaggggg ccacccacct tccccaggca gggaggcccg gcccccaggg 360
agatgggggg gatgggggag gagaagggcc tgcccccacc cggcagcctc aggaggggca 420
gctcgggcgg gatatggaaa gaggccacag cagtgagcag agacacagag gaggaagggg 480
ccctgagctg gggagacccc cacggggtag ggcgtggggg ccacgggccc acctcctccc 540
catctcctct gtctccctgt ctctgtctct ctctccctcc cccaccctct ccccagtcct 600
accccctcct cacccctcct cccccagcac tgcctctgtc actctcgccc acgtggatgt 660
ggaggaagag ggggcgggag caaggggcgg gcaccctccc ttcaacctga cctgggacag 720
tttcccttcc gctcacctcc gcctgagcag tggagaaggc ggcactctgg tggggctgct 780
ccaggcatgc agatcccaca taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 840
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 900
tataagctgc aataaacaag ttgtcgaggc cgcggatcct tcgaattctt agcgaggggg 960
cagggcctgc atgtgaaggg cgtcgtaggt gtccttggtg gctgtactga gaccctggta 1020
aaggccatcg tgccccttgc ccctccggcg ctcgcctttc atcccaatct cactgtaggc 1080
ctccgccatc ttatctttct gcagttcatt gtacaggcct tcctgagggt tcttccttct 1140
cggctttccc cccatctcag ggtcccggcc acgtctcttg tccaaaacat cgtactcctc 1200
tcttcgtcct agattgagct cgttatagag ctggttctgg ccctgcttgt acgcgggggc 1260
gtctgcgctc ctgctgaact tcactctcag ttcacatcct ccttcttctt cttctggaaa 1320
tcggcagcta cagccatctt cctcttgagt agtttgtact ggtctcataa atggttgttt 1380
gaatatatac aggagtttct ttctgccccg tttgcagtaa agggtgataa ccagtgacag 1440
gagaaggacc ccacaagtcc cggccaaggg cgcccagatg tagatatcac aggcgaagtc 1500
cagccccctc gtgtgcactg cgccccccgc cgctggccgg cacgcctctg ggcgcaggga 1560
caggggctgc gacgcgatgg tgggcgccgg tgttggtggt cgcggcgctg gcgtcgtggt 1620
tgaggagacg gtgactgagg ttccttggcc ccagtagtcc atagcatagc taccaccgta 1680
gtaataatgt ttggcacagt agtaaatggc tgtgtcatca gtttgcagac tgttcatttt 1740
taagaaaact tggctcttgg agttgtcctt gatgatggtc agtctggatt tgagagctga 1800
attatagtat gtggtttcac taccccatat tactcccagc cactccagac cctttcgtgg 1860
aggctggcga atccagctta caccatagtc gggtaatgag acccctgaga cagtgcatgt 1920
gacggacagg ctctgtgagg gcgccaccag gccaggtcct gactcctgca gtttcacctc 1980
agatccgccg ccacccgacc caccaccgcc cgagccaccg ccacctgtga tctccagctt 2040
ggtcccccct ccgaacgtgt acggaagcgt attaccctgt tggcaaaagt aagtggcaat 2100
atcttcttgc tccaggttgc taatggtgag agaataatct gttccagacc cactgccact 2160
gaaccttgat gggactcctg agtgtaatct tgatgtatgg tagatcagga gtttaacagt 2220
tccatctggt ttctgctgat accaatttaa atatttacta atgtcctgac ttgccctgca 2280
actgatggtg actctgtctc ccagagaggc agacagggag gatgtagtct gtgtcatctg 2340
gatgtccggc ctggcggcgt ggagcagcaa ggccagcggc aggagcaagg cggtcactgg 2400
taaggccatg gtggctctag agtaggcgcc ggtcacagct tggatctgta acggcgcaga 2460
acagaaaacg aaacaaagac gtagagttga gcaagcaggg tcaggcaaag cgtggagagc 2520
cggctgagtc taggtaggct ccaagggagc gccggacaaa ggcccggtct cgacctgagc 2580
tttaaactta cctagacggc ggacgcagtt caggaggcac cacaggcggg aggcggcaga 2640
acgcgactca accggcgtgg atggcggcct caggtagggc ggcgggcgcg tgaaggagag 2700
atgcgagccc ctcgaagctt cagctgtgtt ctggcggcaa acccgttgcg aaaaagaacg 2760
ttcacggcga ctactgcact tatatacggt tctcccccac cctcgggaaa aaggcggagc 2820
cagtacacga catcactttc ccagtttacc ccgcgccacc ttctctaggc acccgttcaa 2880
ttgccgaccc ctccccccaa cttctcgggg actgtgggcg atgtgcgctc tgcccactga 2940
cgggcaccgg agcggcgccc tggccagtcg tctgggcggt gctacaactg ggctggcggc 3000
caggatggtt cttaggtagg tggggtcggc ggtcaggtgt cccagagcca ggggtctgga 3060
gggaccttcc accctcagtc cctggcaggt cggggggtgc tgaggcgggc ctggccctgg 3120
cagcccaggg gtcccggagc gaggggtctg gagggacctt tcactctcag tccctggcag 3180
gtcggggggt gctgtggcag gcccagcctt ggcccccagc tctgcccctt accctgagct 3240
gtgtggcttt gggcagctcg aactcctggg ttcctctctg ggccccaact cctcccctgg 3300
cccaagtccc ctctttgctc ctgggcaggc aggacctctg tcccctctca gccggtcctt 3360
ggggctgcgt gtttctgtag aatgacgggt caggctggcc agaaccccaa accttggccg 3420
tggggagtct gcgtggcggc tctgccttgc ccaggcatcc ttggtcctca ctcgagtttt 3480
cctaaggatg ggatgagccc catgtgggac taaccttggc tttacgacgt caaagtttag 3540
atgagctggt gatatttttc tcattatatc caaagtgtac ctgttcgagt gaggacagtt 3600
cttctgtctc caggatccct cctgggtggg gattgtgccc gcctgggtct ctgcccagat 3660
tccagggctc tccccgagcc ctgttcagac catccgtggg ggaggccttg gcctcactct 3720
cccggatcga ggagagaggg agcctcttcc tgg 3753
<210> 30
<211> 3012
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 30
aggcatcaca cggtggaaag atctggaact gtggccatgg tgtgaggcca tccacaaggt 60
ggaagctttg agggggagcc gattagccat ggacagttgt cattcagtag ggtcacctgt 120
gccccagcga agggggatgg gccgggaagg cagaggccag gcacctgccc ccagcagggg 180
cagaggctgt gggcagccgg gaggctccca gaggctccga cagaatggga gtggggttga 240
gcccacccct cactgcagcc caggaacctg agcccagagg gggccaccca ccttccccag 300
gcagggaggc ccggccccca gggagatggg ggggatgggg gaggagaagg gcctgccccc 360
acccggcagc ctcaggaggg gcagctcggg cgggatatgg aaagaggcca cagcagtgag 420
cagagacaca gaggaggaag gggccctgag ctggggagac ccccacgggg tagggcgtgg 480
gggccacggg cccacctcct ccccatctcc tctgtctccc tgtctctgtc tctctctccc 540
tcccccaccc tctccccagt cctaccccct cctcacccct cctcccccag cactgcctct 600
gtcactctcg cccacgtgga tgtggaggaa gagggggcgg gagcaagggg cgggcaccct 660
cccttcaacc tgacctggga cagtttccct tccgctcacc tccgcctgag cagtggagaa 720
ggcggcactc tggtggggct gctccaggca tgcagatccc acaggcgccc tggccagtcg 780
tctgggcggt gctacaactg taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 840
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 900
tataagctgc aataaacaag ttgtcgaggc cgcggatcct tcgaattctc acttgtacag 960
ctcgtccatg ccgagagtga tcccggcggc ggtcacgaac tccagcagga ccatgtgatc 1020
gcgcttctcg ttggggtctt tgctcagctt ggactgggtg ctcaggtagt ggttgtcggg 1080
cagcagcacg gggccgtcgc cgatgggggt gttctgctgg tagtggtcgg cgagctgcac 1140
gccgccgtcc tcgatgttgt ggcggatctt gaagttggcc ttgatgccgt tcttctgctt 1200
gtcggcggtg atatagacgt tgtcgctgaa gtagttgtac tccagcttgt gccccaggat 1260
gttgccgtcc tccttgaagt cgatgccctt cagctcgatg cggttcacca gggtgtcgcc 1320
ctcgaacttc acctcggcgc gggtcttgta gttgccgtcg tccttgaaga agatggtgcg 1380
ctcctggacg tagccttcgg gcatggcgga cttgaagaag tcgtgctgct tcatgtggtc 1440
ggggtagcgg gcgaagcact gcacgcccca gctcagggtg gtcacgaggg tgggccaggg 1500
cacgggcagc ttgccggtgg tgcagatgaa cttcagggtc agcttgccgt aggtggcatc 1560
gccctcgccc tcgccggaca cgctgaactt gtggccgttt acgtcgccgt ccagctcgac 1620
caggatgggc accaccccgg tgaacagctc ctcgcccttg ctcaccatgg tggctctaga 1680
gtaggcgccg gtcacagctt ggatctgtaa cggcgcagaa cagaaaacga aacaaagacg 1740
tagagttgag caagcagggt caggcaaagc gtggagagcc ggctgagtct aggtaggctc 1800
caagggagcg ccggacaaag gcccggtctc gacctgagct ttaaacttac ctagacggcg 1860
gacgcagttc aggaggcacc acaggcggga ggcggcagaa cgcgactcaa ccggcgtgga 1920
tggcggcctc aggtagggcg gcgggcgcgt gaaggagaga tgcgagcccc tcgaagcttc 1980
agctgtgttc tggcggcaaa cccgttgcga aaaagaacgt tcacggcgac tactgcactt 2040
atatacggtt ctcccccacc ctcgggaaaa aggcggagcc agtacacgac atcactttcc 2100
cagtttaccc cgcgccacct tctctaggca cccgttcaat tgccgacccc tccccccaac 2160
ttctcgggga ctgtgggcga tgtgcgctct gcccactgac gggcaccgga gcggctggcg 2220
gccaggatgg ttcttaggta ggtggggtcg gcggtcaggt gtcccagagc caggggtctg 2280
gagggacctt ccaccctcag tccctggcag gtcggggggt gctgaggcgg gcctggccct 2340
ggcagcccag gggtcccgga gcgaggggtc tggagggacc tttcactctc agtccctggc 2400
aggtcggggg gtgctgtggc aggcccagcc ttggccccca gctctgcccc ttaccctgag 2460
ctgtgtggct ttgggcagct cgaactcctg ggttcctctc tgggccccaa ctcctcccct 2520
ggcccaagtc ccctctttgc tcctgggcag gcaggacctc tgtcccctct cagccggtcc 2580
ttggggctgc gtgtttctgt agaatgacgg gtcaggctgg ccagaacccc aaaccttggc 2640
cgtggggagt ctgcgtggcg gctctgcctt gcccaggcat ccttggtcct cactcgagtt 2700
ttcctaagga tgggatgagc cccatgtggg actaaccttg gctttacgac gtcaaagttt 2760
agatgagctg gtgatatttt tctcattata tccaaagtgt acctgttcga gtgaggacag 2820
ttcttctgtc tccaggatcc ctcctgggtg gggattgtgc ccgcctgggt ctctgcccag 2880
attccagggc tctccccgag ccctgttcag accatccgtg ggggaggcct tggcctcact 2940
ctcccggatc gaggagagag ggagcctctt cctgggctgc ccgtgaccct gggccctctg 3000
tgtacactgt ga 3012
<210> 31
<211> 3753
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 31
aggcatcaca cggtggaaag atctggaact gtggccatgg tgtgaggcca tccacaaggt 60
ggaagctttg agggggagcc gattagccat ggacagttgt cattcagtag ggtcacctgt 120
gccccagcga agggggatgg gccgggaagg cagaggccag gcacctgccc ccagcagggg 180
cagaggctgt gggcagccgg gaggctccca gaggctccga cagaatggga gtggggttga 240
gcccacccct cactgcagcc caggaacctg agcccagagg gggccaccca ccttccccag 300
gcagggaggc ccggccccca gggagatggg ggggatgggg gaggagaagg gcctgccccc 360
acccggcagc ctcaggaggg gcagctcggg cgggatatgg aaagaggcca cagcagtgag 420
cagagacaca gaggaggaag gggccctgag ctggggagac ccccacgggg tagggcgtgg 480
gggccacggg cccacctcct ccccatctcc tctgtctccc tgtctctgtc tctctctccc 540
tcccccaccc tctccccagt cctaccccct cctcacccct cctcccccag cactgcctct 600
gtcactctcg cccacgtgga tgtggaggaa gagggggcgg gagcaagggg cgggcaccct 660
cccttcaacc tgacctggga cagtttccct tccgctcacc tccgcctgag cagtggagaa 720
ggcggcactc tggtggggct gctccaggca tgcagatccc acaggcgccc tggccagtcg 780
tctgggcggt gctacaactg taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat 840
gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat 900
tataagctgc aataaacaag ttgtcgaggc cgcggatcct tcgaattctt agcgaggggg 960
cagggcctgc atgtgaaggg cgtcgtaggt gtccttggtg gctgtactga gaccctggta 1020
aaggccatcg tgccccttgc ccctccggcg ctcgcctttc atcccaatct cactgtaggc 1080
ctccgccatc ttatctttct gcagttcatt gtacaggcct tcctgagggt tcttccttct 1140
cggctttccc cccatctcag ggtcccggcc acgtctcttg tccaaaacat cgtactcctc 1200
tcttcgtcct agattgagct cgttatagag ctggttctgg ccctgcttgt acgcgggggc 1260
gtctgcgctc ctgctgaact tcactctcag ttcacatcct ccttcttctt cttctggaaa 1320
tcggcagcta cagccatctt cctcttgagt agtttgtact ggtctcataa atggttgttt 1380
gaatatatac aggagtttct ttctgccccg tttgcagtaa agggtgataa ccagtgacag 1440
gagaaggacc ccacaagtcc cggccaaggg cgcccagatg tagatatcac aggcgaagtc 1500
cagccccctc gtgtgcactg cgccccccgc cgctggccgg cacgcctctg ggcgcaggga 1560
caggggctgc gacgcgatgg tgggcgccgg tgttggtggt cgcggcgctg gcgtcgtggt 1620
tgaggagacg gtgactgagg ttccttggcc ccagtagtcc atagcatagc taccaccgta 1680
gtaataatgt ttggcacagt agtaaatggc tgtgtcatca gtttgcagac tgttcatttt 1740
taagaaaact tggctcttgg agttgtcctt gatgatggtc agtctggatt tgagagctga 1800
attatagtat gtggtttcac taccccatat tactcccagc cactccagac cctttcgtgg 1860
aggctggcga atccagctta caccatagtc gggtaatgag acccctgaga cagtgcatgt 1920
gacggacagg ctctgtgagg gcgccaccag gccaggtcct gactcctgca gtttcacctc 1980
agatccgccg ccacccgacc caccaccgcc cgagccaccg ccacctgtga tctccagctt 2040
ggtcccccct ccgaacgtgt acggaagcgt attaccctgt tggcaaaagt aagtggcaat 2100
atcttcttgc tccaggttgc taatggtgag agaataatct gttccagacc cactgccact 2160
gaaccttgat gggactcctg agtgtaatct tgatgtatgg tagatcagga gtttaacagt 2220
tccatctggt ttctgctgat accaatttaa atatttacta atgtcctgac ttgccctgca 2280
actgatggtg actctgtctc ccagagaggc agacagggag gatgtagtct gtgtcatctg 2340
gatgtccggc ctggcggcgt ggagcagcaa ggccagcggc aggagcaagg cggtcactgg 2400
taaggccatg gtggctctag agtaggcgcc ggtcacagct tggatctgta acggcgcaga 2460
acagaaaacg aaacaaagac gtagagttga gcaagcaggg tcaggcaaag cgtggagagc 2520
cggctgagtc taggtaggct ccaagggagc gccggacaaa ggcccggtct cgacctgagc 2580
tttaaactta cctagacggc ggacgcagtt caggaggcac cacaggcggg aggcggcaga 2640
acgcgactca accggcgtgg atggcggcct caggtagggc ggcgggcgcg tgaaggagag 2700
atgcgagccc ctcgaagctt cagctgtgtt ctggcggcaa acccgttgcg aaaaagaacg 2760
ttcacggcga ctactgcact tatatacggt tctcccccac cctcgggaaa aaggcggagc 2820
cagtacacga catcactttc ccagtttacc ccgcgccacc ttctctaggc acccgttcaa 2880
ttgccgaccc ctccccccaa cttctcgggg actgtgggcg atgtgcgctc tgcccactga 2940
cgggcaccgg agcggctggc ggccaggatg gttcttaggt aggtggggtc ggcggtcagg 3000
tgtcccagag ccaggggtct ggagggacct tccaccctca gtccctggca ggtcgggggg 3060
tgctgaggcg ggcctggccc tggcagccca ggggtcccgg agcgaggggt ctggagggac 3120
ctttcactct cagtccctgg caggtcgggg ggtgctgtgg caggcccagc cttggccccc 3180
agctctgccc cttaccctga gctgtgtggc tttgggcagc tcgaactcct gggttcctct 3240
ctgggcccca actcctcccc tggcccaagt cccctctttg ctcctgggca ggcaggacct 3300
ctgtcccctc tcagccggtc cttggggctg cgtgtttctg tagaatgacg ggtcaggctg 3360
gccagaaccc caaaccttgg ccgtggggag tctgcgtggc ggctctgcct tgcccaggca 3420
tccttggtcc tcactcgagt tttcctaagg atgggatgag ccccatgtgg gactaacctt 3480
ggctttacga cgtcaaagtt tagatgagct ggtgatattt ttctcattat atccaaagtg 3540
tacctgttcg agtgaggaca gttcttctgt ctccaggatc cctcctgggt ggggattgtg 3600
cccgcctggg tctctgccca gattccaggg ctctccccga gccctgttca gaccatccgt 3660
gggggaggcc ttggcctcac tctcccggat cgaggagaga gggagcctct tcctgggctg 3720
cccgtgaccc tgggccctct gtgtacactg tga 3753
Claims (10)
1.一种靶序列，其特征在于，所述靶序列选自下组：
(1)SEQ ID NO.:1所示的第40-130位的核苷酸序列；
(2)将SEQ ID NO.:1所示的第40-130位的核苷酸序列经过一个或多个(≤10个，如2-8个，优选为3-5个)核苷酸的取代、缺失或添加而形成的衍生核苷酸，并且所述靶序列特异性与gRNA结合。
2.如权利要求1所述的靶序列，其特征在于，所述靶序列选自下组：
(1)具有SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的多核苷酸；
(2)与SEQ ID NO.:2所示核苷酸序列的同源性≥95％，较佳地≥98％，更佳地≥99％的多核苷酸；
(3)与上述(1)-(2)互补的多核苷酸。
3.一种gRNA序列，其特征在于，所述gRNA序列与权利要求1所述的靶序列互补。
4.一种基因编辑系统，其特征在于，所述系统包括基因编辑酶和gRNA，所述gRNA与权利要求1所述的靶序列互补。
5.一种细胞，其特征在于，所述细胞经权利要求4所述的基因编辑系统进行编辑后获得。
6.一种组合物，其特征在于，包括：
权利要求4所述的系统或权利要求5所述的细胞；和
药学上可接受的载体。
7.一种药盒，其特征在于，包括：
第一容器，以及活性成分或含有所述活性成分的药物，所述活性成分或所述药物位于所述第一容器中，所述活性成分包含权利要求4所述的系统、或权利要求5所述的细胞、或权利要求6所述的组合物。
8.一种对细胞进行基因编辑的方法，其特征在于，包括将所述细胞接触权利要求4所述的基因编辑系统或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述的药盒。
9.一种用于基因编辑的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求4所述的基因编辑系统或权利要求6所述的组合物或权利要求7所述的药盒。
10.一种权利要求4所述的基因编辑系统、权利要求5所述的细胞、权利要求6所述的组合物或权利要求7所述药盒的用途，其特征在于，用于制备用于预防和/或治疗疾病的药物。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110064928.6A CN114807155A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 用于基因编辑的组合物及其应用 |
| PCT/CN2022/072130 WO2022152266A1 (zh) | 2021-01-18 | 2022-01-14 | 用于基因编辑的组合物及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110064928.6A CN114807155A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 用于基因编辑的组合物及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114807155A true CN114807155A (zh) | 2022-07-29 |
Family
ID=82446949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110064928.6A Pending CN114807155A (zh) | 2021-01-18 | 2021-01-18 | 用于基因编辑的组合物及其应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114807155A (zh) |
| WO (1) | WO2022152266A1 (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106480097A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-08 | 南京凯地生物科技有限公司 | 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用 |
| CN109517841A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-03-26 | 华东师范大学 | 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用 |
| CN109652380A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-19 | 苏州茂行生物科技有限公司 | 基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用 |
| CN109797171A (zh) * | 2017-05-08 | 2019-05-24 | 北京东方略细胞技术有限公司 | 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 |
| CN112239769A (zh) * | 2019-07-19 | 2021-01-19 | 华东师范大学 | 一种引导PD1基因切割实现外源序列高效整合的sgRNA |
| CN114164231A (zh) * | 2020-09-10 | 2022-03-11 | 华东师范大学 | 对细胞中的靶位点进行基因编辑的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109844125A (zh) * | 2016-08-31 | 2019-06-04 | 南京凯地生物科技有限公司 | 人pd-1基因敲除的cldn18．2特异性嵌合抗原受体t细胞的制备方法以及应用 |
| SG11201909814WA (en) * | 2017-04-21 | 2019-11-28 | Ospedale San Raffaele Srl | Gene therapy |
| CN107164377A (zh) * | 2017-06-12 | 2017-09-15 | 王小平 | 基于碱基编辑的基因敲除方法及其应用 |
| CN109722437B (zh) * | 2018-12-29 | 2020-01-07 | 广州百暨基因科技有限公司 | 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途 |
-
2021
- 2021-01-18 CN CN202110064928.6A patent/CN114807155A/zh active Pending
-
2022
- 2022-01-14 WO PCT/CN2022/072130 patent/WO2022152266A1/zh active Application Filing
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106480097A (zh) * | 2016-10-13 | 2017-03-08 | 南京凯地生物科技有限公司 | 利用CRISPR/Cas9技术敲除人PD‑1基因构建可靶向MSLN新型CAR‑T细胞的方法及其应用 |
| CN109797171A (zh) * | 2017-05-08 | 2019-05-24 | 北京东方略细胞技术有限公司 | 经修饰的t细胞、其制备方法及用途 |
| CN109517841A (zh) * | 2018-12-05 | 2019-03-26 | 华东师范大学 | 一种用于核苷酸序列修饰的组合物、方法与应用 |
| CN109652380A (zh) * | 2019-01-25 | 2019-04-19 | 苏州茂行生物科技有限公司 | 基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用 |
| CN112239769A (zh) * | 2019-07-19 | 2021-01-19 | 华东师范大学 | 一种引导PD1基因切割实现外源序列高效整合的sgRNA |
| CN114164231A (zh) * | 2020-09-10 | 2022-03-11 | 华东师范大学 | 对细胞中的靶位点进行基因编辑的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2022152266A1 (zh) | 2022-07-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA3022611A1 (en) | Genetically engineered cells and methods of making the same | |
| KR20230017783A (ko) | 시험관내 세포 전달 방법 | |
| CN116322716A (zh) | Regnase-1和/或TGFBRII被破坏的基因工程化T细胞具有改善的功能性和持久性 | |
| CA3081456A1 (en) | Methods, compositions and components for crispr-cas9 editing of tgfbr2 in t cells for immunotherapy | |
| KR102338993B1 (ko) | 인위적으로 조작된 조작면역세포 | |
| CN111909966B (zh) | 一种制备经修饰的免疫细胞的方法 | |
| CN111263808B (zh) | 一种靶向HPK1的gRNA和一种编辑HPK1基因的方法 | |
| WO2020123871A1 (en) | Compositions and methods for modifying a target nucleic acid | |
| WO2022052877A1 (zh) | 对细胞中的靶位点进行基因编辑的方法 | |
| CN113825834A (zh) | 使用rna引导的核酸内切酶进行dna构建体整合的改进工艺 | |
| WO2019200306A1 (en) | Modification of immune-related genomic loci using paired crispr nickase ribonucleoproteins | |
| JP2022531577A (ja) | 改変されたｃｄ２４７遺伝子座からキメラ受容体を発現する細胞、関連ポリヌクレオチド、および方法 | |
| JP2023547887A (ja) | セーフハーバー遺伝子座 | |
| TW202309034A (zh) | Dna依賴性蛋白質激酶抑制劑以及其組合物及用途 | |
| CA3175106A1 (en) | Compositions and methods for modifying a target nucleic acid | |
| WO2021170089A1 (en) | Engineering immune cells via simultaneous knock-in and gene disruption | |
| CN114807155A (zh) | 用于基因编辑的组合物及其应用 | |
| WO2022266538A2 (en) | Compositions and methods for targeting, editing or modifying human genes | |
| CN116669775A (zh) | 用修饰的核酸内切酶进行的基因编辑 | |
| WO2024073440A1 (en) | Inhibition of genotoxic stress to improve t cell engineering | |
| WO2024059618A2 (en) | Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas | |
| WO2024064683A2 (en) | Biallelic knockout of ciita | |
| WO2024064613A2 (en) | Biallelic knockout of hla-e | |
| WO2024064623A2 (en) | Biallelic knockout of cish | |
| WO2024064606A2 (en) | Biallelic knockout of ctla4 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20230324 Address after: 201109 Floor 1, Building 14, No. 3699, Yuanjiang Road, Minhang District, Shanghai Applicant after: BIORAY LABORATORIES Inc. Address before: 200241 No. 500, Dongchuan Road, Shanghai, Minhang District Applicant before: EAST CHINA NORMAL University Applicant before: BIORAY LABORATORIES Inc. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220729 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |