CN109652380A

CN109652380A - 基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109652380A
Application number: CN201910075913.2A
Authority: CN
Inventors: 王丹; 尚小云; 徐凡丽; 蒋海娟; 赵丹; 辛雨
Original assignee: Suzhou Mao Hang Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Maximum Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-04-19
Anticipated expiration: 2039-01-25
Also published as: CN109652380B

Abstract

本发明属于免疫治疗领域，公开了一种PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞，并公开了通过BE‑Plus系统进行基因敲除的同时将表达LewisY‑CAR的质粒载体导入T细胞的制备方法，以及该CAR‑T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开的PD‑1基因敲除且靶向Lewis Y的CAR‑T细胞可以解除PD‑1/PD‑L1的抑制通路，有助于改良靶向LewisY的CAR‑T细胞的功效，且制备工艺简单，在肿瘤的细胞治疗中拥有较高的应用价值。

Description

基于碱基编辑靶向LewisY的CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体涉及免疫治疗领域，尤其涉及一种PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞及其制备方法和其应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。由于其卓越的疗效和创新型，在2013年被《科学》杂志评为年度最重要的科学突破。近年来肿瘤的免疫疗法已经成为当前肿瘤治疗的热点。其中嵌合抗原受体T细胞技术（Cheimetic Antigen Receptors-T cell，CAR-T）是一种新型的过继性细胞疗法（Adoptive cell transfer therapy，ACT），该疗法将患者的T细胞在体外修饰增殖后回输到患者体内，通过T细胞表达的特异性受体，靶向性的识别肿瘤细胞，且CAR-T细胞在体内能显示出较强的杀伤活性和持久性。

Lewis Y抗原是结合Ⅱ型血型寡糖链的四糖结构，Lewis Y抗原主要表达于胚胎发生期，在成人其表面表达则限于粒细胞和上皮表面。研究发现：在70-90%的上皮组织的癌细胞中发现了Lewis Y的过表达。Lewis Y作为靶结构的优点为表达抗Lewis Y嵌合受体的T细胞可能潜在的靶向表达Lewis Y的广泛恶性肿瘤。有研究表明以Lewis Y为靶点的LewisY-CAR转导的T细胞对RPMI 8226-13细胞和原代MM细胞表现出特异性的增殖杀伤活性。SPeinert （‎2010）的研究进一步证实了表达抗Lewis Y嵌合受体的T细胞在体外的特异性和其体内抗肿瘤活性，展现出CAR-T细胞靶向治疗肿瘤的另一个前景。

CAR-T细胞的组成包括抗原结合区、跨膜铰链区和胞内信号区三个部分。胞外区主要是单克隆抗体的单链可变区序列（scFv），可识别肿瘤特异性抗原；胞内区主要是T细胞受体CD3的ζ链或者是免疫球蛋白Fc受体的γ链（FcRγ），向细胞内转导胞外识别的信号。一般通过电穿孔或病毒转导，使嵌合抗原受体分子表达在T细胞表面形成CAR-T细胞，使其可以特异性识别和结合肿瘤细胞表面的抗原并裂解肿瘤细胞。

虽然CAR-T细胞在血液恶性肿瘤中显示出了很好的疗效，但是在实体瘤方向的应用仍然存在比较大的局限性，比如缺乏肿瘤特异性抗原，或者难以到达肿瘤部位，以及易受肿瘤微环境影响丧失功能或活性。肿瘤微环境的免疫逃逸机制主要是通过PD-1/PD-L1抑制通路，导致T细胞不能杀伤肿瘤细胞。通过靶向敲除PD-1基因，可以解除PD-1/PD-L1的抑制通路，有助于改良靶向Lewis Y的CAR-T细胞的功效。此外，将CAR-T细胞进行PD-1基因敲除，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。

中国专利CN201410077474.6提供了一种快速、简便、高效、特异性靶向敲除基因，通过提供精准特异性靶向PD-1基因的sgRNA，利用CRISPR-Cas9技术，达到特异性敲除PD-1基因的目的。但是，CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患。

为了解决CRISPR-Cas9所显示出的缺陷和局限性，本发明提供一种更加精确特异性更强的针对T细胞PD-1基因敲除的方法及其应用，并提供相应的技术方案，达到制备目的免疫细胞PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的技术方案。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，该CAR-T细胞能够免受肿瘤微环境的抑制，特别是PD-1通路介导的免疫抑制，且具有超越一般靶向Lewis Y的CAR-T细胞的杀伤能力。

本发明要解决的技术问题之二在于提供一种PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的制备方法，并提供相应的技术方案，该制备工艺简单，编辑效率高。

本发明要解决的技术问题之三在于提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。

为解决以上问题，本发明采用如下技术方案：

为了提高基因编辑效率以实现在体基因编辑，本发明采用基于CRISPR/Cas9技术的单碱基编辑器（base editor, BE）。BE-PlUS系统优势在于，第一，与CRISPR-Cas9相比，BE-PLUS具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率；第二，与Cas9核酸酶介导的基因编辑相比，BEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。BE-Plus双质粒系统（scfv-APOBEC-UGI，GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBEC N端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Work window由4-8扩为4-16，使效率更高。

BE-Plus双质粒系统基本原理为，BE Plus系统携带大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的Cas9，可将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂UDI抑制碱基切除修复机制，使UG配对得以保留，并在后续复制过程中，U替换成T，突变产物理论上可达50%。再通过dCas9和MMR机制，以UG中的U为模板，将UG替换修复成UA，后续复制变为TA，产率在15%~75%之间。使用的基因敲除方法为Istop，为在基因编码区内，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止。对CAR-T细胞进行PD-1基因的定点突变，使其免受肿瘤微环境的抑制，可能提高靶向杀伤能力。

本发明采用来源于鳞翅目昆虫的PiggyBac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。

本发明的第一方面，提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞。

作为本发明优选的技术方案，所述PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

作为本发明优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，BE-Plus系统中PD1-sgRNA寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：①明确待PD-1基因的编码区（CDs）20bp-NGG目标序列（PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG、CGA；②目标单碱基C位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；③目标单碱基T位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；④按照选定的特异性靶序列，分别合成正向具有5’- N₂₀-NGG-3’特征的寡核苷酸链及与其互补的反向寡核苷酸链，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；⑤对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化，并向反应体系中加入BsaⅠ内切酶进行酶切反应；⑥将步骤④和⑤中所获得双链sgRNA寡核苷酸与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行混合，并向体系中加入T4 DNA连接酶，进行连接；⑦将步骤⑥中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂Amp⁺平板（50μg/ml）,并挑取克隆测序。通过对人PD-1基因序列进行分析，选定待敲除PD-1的编码区，设计靶点序列sgRNA，共设计出3条靶点序列，具体序列如下所示：

sgRNA1-F：5’-GGGGTTCCAGGG CCTGTCTG-3’（SEQ ID NO.2）

sgRNA1-R：5’-CAG ACAGGCCCTGGA ACCCC-3’（SEQ ID NO.3）

sgRNA2-F：5’-CGACTGGCCAGGGCGCCTGT-3’（SEQ ID NO.4）

sgRNA2-R：5’-ACAGGCGCCCTGGCCAGTCG-3’（SEQ ID NO.5）

sgRNA3-F：5’- ACCGCCCAGACGACTGGCCA-3’（SEQ ID NO.6）

sgRNA3-R：5’- TGGCCAGTCGTCTGGGCGGT-3’（SEQ ID NO.7）

作为本发明优选的技术方案，靶点序列优选为sgRNA1，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

所获的核苷酸序列sgRNA可用于质粒载体上，慢病毒表达载体上，或用于逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、腺相关病毒表达载体或其他类型表达载体上。

在本发明中，术语LewisY-CAR指LewisY嵌合抗原受体，包含有靶向Lewis Y的scFv序列。

scFv：全称single-chain antibody fragment，即单链抗体片段。

在本发明中，术语LewisY-scFv指抗Lewis Y单链抗体片段，进行密码子优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

本发明的第二方面，提供一种PD-1基因敲除且表达LewisY -CAR的T细胞的制备方法，包括以下步骤：

（1）sgRNA设计、构建及其功能验证；

（2）从供者提供的外周血中分离外周血单个核细胞（perpheral blood mononuclearcell，PBMC）；

（3）密码子优化，准备Lewis Y嵌合抗原受体（CAR），即LewisY-CAR，对scFv片段送交公司进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

（4）分别准备或制备表达LewisY-CAR的质粒载体、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒；

（5）利用转染系统，将步骤（4）所得的表达LewisY-CAR的质粒载体、转座酶质粒、BEPlus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染导入PBMC细胞，获得转染后的细胞。

（6）将转染后的细胞进行体外培养并大量扩增；

（7）用CD3抗体刺激步骤（6）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞；

（8）收集PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，并对其进行检测。

作为本发明优选的技术方案，步骤（4）中表达LewisY-CAR的质粒载体优选为PB-LewisY CAR -BBZ-puro质粒，为PiggyBac-transposon载体依次串联人EF1α启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区、铰链区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

作为本发明优选的技术方案，其中所述胞膜外抗原结合区优选为经过密码子优化的，可结合Lewis Y蛋白的Lewis Y单链抗体，依次串联flag表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。

其中LewisY-ScFv序列为步骤（3）优化后的核苷酸序列：如SEQ ID NO.1所示。

作为本发明优选的技术方案，步骤（4）中靶向PD1的sgRNA质粒的制备为：将本发明第一方面内容中所述的sgRNA导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得pGL3-U6-PD1-sgR BE质粒。

作为本发明优选的技术方案，步骤（3）中表达LewisY-CAR的质粒载体中的胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合，优选为CD28-4-1BB；所述胞内信号传导区优选为CD28-4-1BB-CD3ζ。胞内信号传导区可介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达。

本发明中转染的方式可以通过电转和lipo2000，lipo3000脂质体转染。

作为本发明优选的技术方案，步骤（5）中所述转染优选为电转方式，即通过电转将准备好的质粒导入分选出的PBMC细胞中。

本发明的第三方面，提供PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞在制备抗肿瘤的细胞治疗药物中的应用。

相比于现有技术利用PD-1免疫检查点阻断治疗肿瘤，本发明的优点在于：

（1）本发明提供了一种利用基于单碱基突变制备PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞的方法。本发明中使用由CRISPR-Cas9基础上发展起来的碱基编辑技术，通过精准的CT或GA单碱基突变创造终止密码子，从而建立了比CRISPR-Cas9更高效，更加精确以及更少脱靶效应的基因敲除策略。

（2）本发明选用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率和减少时间，简化CAR-T的制备程序，增强了系统的负载量，相对于逆转录病毒系统更安全。

（3）本发明采用质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施案例或现有技术中的技术方案，以下将对实施列或现有技术描述中所需使用的附图作简要的介绍。

图1为本发明实施例1中pGL3-U6-PD1sgRNA BE表达载体的基因结构图；

图2为本发明中实施例4中pST1374-N-NLS-GCN4-D10A基因结构图；

图3为本发明中实施例4中pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1基因结构图；

图4 为本发明中实施例4中LewisY-scFv序列密码子优化后的质粒示意图；

图5 为本发明中使用的super piggybac transposase转座酶基因结构图；

图6 为本发明中实施例4中流式检测PD-1基因的敲除效率结果图；

图7为本发明中实施例5中制得的PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞体外杀伤实验。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则百分比按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

虽然在本发明的实施例中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的材料和方法。

实施例1 靶向PD-1的sgRNA质粒的制备

一、制备靶向PD-1的sgRNA质粒

（1）sgRNA设计和构建

明确T细胞PD-1基因目标DNA区域，依据选定的靶序列，合成了一对sgRNA，序列如下：

PD-1-sgRNA-F：5’- ggggttccagggcctgtctg-3’

PD-1-sgRNA-R：5’- cagacaggccctggaacccc-3’

（2）将（1）中sgRNA变性退火：

退火体系为：

2μl Up oligo (100μM)

2μl Down oligo (100μM)

2μl Vazyme T7EN1 reaction buffer

14μl DdH2O

在PCR仪中按照以下touch down 程序运行：95℃，5min；95-85℃ at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；hold at 4℃。

（3）pGL3-U6-sgRNA 质粒线性化。

酶切体系和条件如下：

8µg pGL3-U6-sgRNA（400 ng/µl）；

5µl CutSmart Buffer；

5µl BsaI (NEB，R0535L)；

补水至 50 µl，37℃孵育 3~4 小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切完成后用 AxyPrep PCR Clean up Kit（AP-PCR-250）纯化回收至 20~40 µl 灭菌水中。

（4）将变性、退火之后获得的双链 sgRNA 寡聚核苷酸与线性化的 pGL3-U6-sgRNA质粒相连，转化。

连接体系如下：

3µl 退火产物

1µl 线性化的 pGL3-U6-sgRNA 质粒（25 ng/µl）

1µl T4 ligation Buffer

0.5µl T4 DNA ligase (NEB，M0202S)

4.5µl 灭菌水

16 ℃连接 1 小时，将连接产物转化 DH5α 感受态细胞并涂 Amp+平板（50 µg/ml），并挑取克隆测序。测序鉴定引物：用 assembly For: cgattagtgaacggatctcgacg 测序鉴定获得阳性克隆。

（5）37℃摇床摇菌（250ml）过夜培养阳性克隆，并用 kit(Invitrogen, K210015)抽提质粒，质粒浓度控制在 1.5-2µg/µl。

二、sgRNA功能验证

（1）细胞培养与转染

①HEK293T细胞接种培养于DMEM高糖培养液中（HyClone, SH30022.01B），其中含 10%FBS，penicillin（100 U/ml）和 streptomycin（100 µg/ml）。

② 在转染前将 HEK293T 细胞接种于 12 孔板中，待细胞长到 70%~80%密度时，换成无抗生素培养基，准备转染

③ 按照电转操作说明，将2µg pGL3-U6-PD1sgRNA BE质粒（见图1所示）、2.0 µg 的pST1374-N-NLS-GCN4-D10A（见图2所示）、2 µg pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1（见图3所示）与电转液混匀，共转染至每孔细胞中，6~8小时后换液，并加入 Blasticidin（invitrigen,ant-bl-1）和 Puromycin（invitrigen,ant-pr-1）药筛，48 小时后收取细胞。

（2） T7EN1 酶切检测

① 将收集的细胞进行DNA提取，并在sgRNA位点上下游设计引物F、R，用F、R对所提取的DNA进行PCR扩增后并对PCR产物进行纯化回收。

② 取 200 ng 纯化回收产物统一稀释到 20 µl 进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃at −2℃/s；85–25℃at −0.1℃/s；hold at 4℃。

③ 在 20 µl 体系中加入 T7EN1 0.3 µl，混匀后 37℃酶切 30 分钟，加入 2 µl10× Loading Buffer ,用 3%的琼脂糖胶电泳检测。

（3）TA克隆测序

将 T7EN1 酶切检测步骤 c获得的 PCR 回收产物用 rTaq 进行加 A 反应。加 A 反应体系为：

700~800 ng PCR 回收产物

5 µl 10 ×Buffer (Mg²⁺ free)

3 µl Mg²⁺

4 µl dNTP

0.5 µl rTaq

补水至 50 µl 体系。

37°C温育 30 分钟后，取 1 µl 产物与 pMD19-T vector连接并转化 DH5α 感受态细胞，挑取单克隆，用通用引物 M13F 测序。

实施例2 PBMC的制备

用抗凝管采集健康人外周血，边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合；

将抗凝血缓慢加入装有等体积的淋巴细胞分离液（Ficoll）的50ml离心管中，450g，慢升慢降离心25min，中间不能停止离心；离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50ml离心管中，加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入PBS，160g，慢升慢降离心15min，弃上清；最后加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到PBMC。

实施例3 构建PB-LewisY-puro载体。

具体步骤如下：

（1）准备Lewis Y嵌合抗原受体（CAR），即LewisY-CAR，对scFv片段送交公司进行密码子优化，使之更易于在人体细胞内表达，密码子优化后地序列为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

（2）合成目的片段，使用In-Fusion技术将合成片段融合到PB-LewisYCAR-puro载体上，制作PB-LewisY-CAR-BBZ-puro质粒（如图4所示）。

合成引物Primer-F: CGGCGCCTACTCTAGAGCCACCGAAGTGAAGCTGG和Primer-R：GGGGACGAACAGATCTCTTGATCTCGAACTTGGTGCCG。使用PCR扩增合成的LewisY优化序列，回收LewisYPCR产物；

使用XbaІ和BglⅡ限制性内切酶双酶切原始PB-CD19CAR-puro载体，按照TaKaRa In-Fusion试剂盒的步骤，模板为酶切后的载体和LewisY PCR回收产物，进行连接实验。

连接产物转化DH5α感受态细胞，涂板挑单菌落测序，选择正确的连接产物菌进行大量扩增，并提取质粒DNA，获得PB-LewisY-CAR-BBZ-puro质粒。

实施例4 利用BE-Plus系统制备靶向Lewis Y且敲除PD-1基因的CAR-T细胞。

将PBMC用含10%FBS的AIM-V培养基（含IL-12细胞因子）进行培养。待细胞激活一段时间后细胞数目达到2-3×10⁶个。

将如图1所示特异性敲除人PD-1基因的载体、特异性靶向PD-1基因的sgRNA连接在线性的pGL3-U6-sgRNA质粒（优宝生物，Cat：VT8203）上，与 pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1、 pST1374-N-NLS-GCN4-D10A质粒、PB-LewisY-puro质粒、super piggybactransposase质粒（淼灵生物，Cat：P0179）一起成功转染CD3阳性T细胞即可实现PD-1基因的敲除。

具体步骤为：将上述5种质粒各4μg与Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该5种质粒的100μl电转混合液，其中原始质粒pGL3-U6-sgRNA、pST1374-scfv-APOBEC-UGI-GB1 和pST1374-N-NLS-GCN4-D10A 3个质粒作为对照；将所述两组电转混合液加入2-3×10⁶个PBMC细胞中利用Lonza AMAXA 2B电转仪进行电转；细胞转染2h后换液，采用偶联CD3/CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；转染5-6天后加入0.5μg/ml的 puromycin，筛选并培养扩增转染后的T细胞，而获得PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的CAR-T细胞。取部分细胞悬液，流式细胞仪检测PD-1基因的敲除效率达到80%以上（图6）。

实施例5制备PD-1基因敲除且表达LewisY的CAR-T细胞体外杀伤验证

分别培养Raji细胞和效应细胞PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的CAR-T细胞，和表达LewisY-CAR的CAR-T细胞。

收集靶细胞Raji4×10⁵ cells和效应细胞（CAR-T细胞）各3×10⁶ cells，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基（AIM-V培养基+10%FBS）重悬效应细胞，用2ml培养基（1640培养基+10%FBS）重悬靶细胞。

设置效靶比为1:1、5:1、10:1、20:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5% CO₂培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液（避光操作），室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度。结果如图5所示，PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的CAR-T细胞在Raji靶细胞中不同效靶比条件下杀伤效率明显强于表达LewisY-CAR的CAR-T细胞，当效靶比为20:1时，本发明PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的CAR-T细胞肿瘤杀伤能力为66%（见图7）。

序列表

<110> 苏州茂行生物科技有限公司

<120> 基于碱基编辑靶向Lewis Y的CAR-T细胞及其制备方法和应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 795

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggagttcg ggctgagatg ggtgtttctg gtggccatcc tgaaggacgt gcagtgcgag 60

gtgcagctgg tggagagcgg ggggggagtg gtgcagcctg gaaggagcct gagactgagc 120

tgtagcacaa gcggctttac cttttctgat tattacatgt actgggtgag gcaggccccc 180

ggaaagggcc tggagtgggt ggcttatatg tccaacgtgg gcgccattac agactacccc 240

gacacagtga agggcagatt caccattagc cgggacaaca gcaaaaacac actgttcctg 300

cagatggaca gcctgagacc cgaggacacc ggcgtgtact tctgcgccag aggcaccaga 360

gacggcagct ggttcgccta ctggggccag ggaacacccg tgaccgtgag cagcggcggc 420

ggaggaagcg gaggaggagg aagcggcgga ggaggcagcg acatccagat gacccagagc 480

cctagcagtc tgagtgccag cgtgggcgac agagtgacca tcacctgcag aagcagtcag 540

agaatcgtgc acagcaacgg aaatacatac ctggagtggt accagcagac acccggcaaa 600

gcccccaaac tgctgatcta caaggtgagc aatagattca gcggcgtgcc cagcagattc 660

agcggaagcg gaagcggcac cgacttcacc ttcactatca gcagcctgca gcccgaagat 720

atcgcaacct actactgctt ccaggggagc cacgtgccat tcaccttcgg ccagggaacc 780

aagctgcaga tcacc 795

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggggttccag ggcctgtctg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagacaggcc ctggaacccc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cgactggcca gggcgcctgt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acaggcgccc tggccagtcg 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

accgcccaga cgactggcca 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tggccagtcg tctgggcggt 20

<210> 8

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60

ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120

gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180

ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240

cacagaaat 249

<210> 9

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggagcaaac gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca 60

ggccccacta gaaagcatta ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg 120

agc 123

<210> 10

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cggttcagcg tcgtgaaaag ggggcgcaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt 60

atgcgcccag tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt cccagaggag 120

gaggaaggag gctgcgagct g 141

<210> 11

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agagtgaagt tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga 120

cgggaccccg aaatgggagg aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat 180

gaactgcaga aagacaagat ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc 240

cgacggggga agggacacga tgggctgtac cagggactgt caaccgccac taaagatacc 300

tacgacgcac tgcacatgca ggctctgccc ccaagatga 339

Claims

1.一种PD-1基因被敲除的CAR-T细胞，其特征在于，PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，采用的基因敲除是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

2.如权利要求1所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：

sgRNA1-F：如SEQ ID NO.2所示；

sgRNA1-R：如SEQ ID NO.3所示；

sgRNA2-F：如SEQ ID NO.4所示；

sgRNA2-R：如SEQ ID NO.5所示；

sgRNA3-F：如SEQ ID NO.6所示；

sgRNA3-R：如SEQ ID NO.7所示；

所述靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型的载体上。

3.如权利要求2所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述选出的靶点序列为如下序列：

sgRNA1-F：如SEQ ID NO.2所示；

sgRNA1-R：如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的LewisY-CAR包含LewisY-scFv，LewisY-scFv用于识别Lewis Y抗原，该LewisY-scFv序列为如SEQ ID NO.1所示。

5.如权利要求4所述的PD-1基因被敲除的表达LewisY-CAR的T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从供者提供的外周血中分离PBMC；

（2）在转染体系中，将表达LewisY-CAR的质粒、转座酶质粒、BE Plus双质粒、靶向PD-1的sgRNA质粒共同转染步骤（1）PBMC细胞，获得转染后的细胞，并进行体外培养、大量扩增；

（3）用CD3抗体刺激步骤（2）得到的细胞，以获得PD-1基因敲除且表达LewisY-CAR的T细胞，并对所获得T细胞进行后续检测。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，表达LewisY-CAR的质粒为PiggyBac-transposon载体依次串联启动子、信号肽、LewisY-scFv序列、铰链区、跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的，其中LewisY-scFv序列为优化后的核苷酸序列，如SEQ ID NO.1所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述启动子为人EF1α启动子，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，铰链区为CD8 Hinge嵌合受体铰链，跨膜区为CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区。

9.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中，所述的转染方法为电转转染方式，将构建好的多个质粒利用电转的方式转染入分选的细胞中。

10.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述靶向PD-1的sgRNA质粒是通过将靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。

11.如权利要求1-3任一项所述的PD-1基因被敲除的CAR-T细胞的用途，其特征在于，用于制备抗肿瘤的细胞治疗药物，特别是靶向Lewis Y阳性的肿瘤干细胞的细胞治疗药物。