KR20220097984A - 키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 제조하기 위한 제조 방법 - Google Patents

키메라 항원 수용체를 발현하는 t 세포를 제조하기 위한 제조 방법 Download PDF

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KR20220097984A
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데메트리오스 칼라이치디스
시위앤 탄
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Abstract

본 개시의 양태는 종래의 제조 방법에 비하여 몇몇의 개선을 제공함으로써 임상적으로 유용한 CAR T-세포 요법의 강력한 공급을 야기하게 하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 제조하기 위한 제조 방법
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 이로써 그의 전체가 참조로 포함되는 2019년 11월 13일자 출원된 미국 특허 가출원 제62/934,991호에 대한 우선권의 이익을 주장한다.
키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법은 혈액암의 치료에서 유망한 치료 효과를 나타낸 바 있다. 전형적으로, CAR T 세포는 환자 면역 세포(자가) 또는 무관한 인간 공여자 유래의 면역 세포(동종이계) 중 어느 하나의 유전학적 조작(genetic engineering)에 의해 생성된다. 고품질의 임상 등급 CAR-T 세포의 생성은 이 기술의 광범위한 적용을 위한 전제 조건이다. 따라서 CAR-T 세포의 대규모 생성을 위한 효율적인 제조 방법을 개발하는 것에 큰 관심이 있다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 종래의 제조 방법에 비하여 몇몇의 개선을 제공하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 방법의 개발에 기초한다. 이러한 개선은 임상적으로 유용한 CAR T 세포 요법의 강건한 공급의 생성을 가능하게 하는 본원에 기재된 유전학적 변형의 일관성 및 효율의 개선을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
따라서, 본 개시의 일 양태는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법을 제공하며, 당해 방법은 (i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계; (ii) T 세포의 제1 집단을 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시켜, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제2 집단이 활성화된 T 세포를 포함하는 단계; (iii) 제1 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체, 및 제2 Cas9 효소 및 β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체를 활성화된 T 세포 내로 도입하여, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제3 집단이 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계; (iv) T 세포의 제3 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, T 세포의 제4 집단이 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하는 T 세포를 포함하며, AAV 벡터가 CAR을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, CAR-인코딩 핵산 서열은 제1 gRNA에 의해 표적화되는 TRAC 유전자좌에 대한 상동성 서열이 측접하는 단계; (v) T 세포의 제4 집단을 증량시키는(expanding) 단계; (vi) 증량된 T 세포로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 TRAC 유전자 및 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 단계; 및 (vii) 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 인간 혈액 세포로부터 농축된 동결보존된 T 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 하기를 포함하는 방법에 의해 제조된다: (a) 인간 공여자로부터 혈액 세포를 수득하는 단계; 및 (b) CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 농축시키는 단계. 일부 실시형태에서, (b)는 항-CD4 및/또는 항-CD8 항체와 컨쥬게이트된 자성 비드를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제1 집단은 적어도 80%의 세포 생존력 및/또는 적어도 80%의 순도의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 갖는다. 일부 실시형태에서, 방법은 (c) 단계 (b)에서 생성되는 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 동결보존하는 단계를 더 포함한다.
일부 실시형태에서, T 세포 활성화제는 나노매트릭스 입자에 부착된 CD3 효능제(agonist) 및 CD28 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 단계 (ii)는 T 세포의 제1 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x106개/㎠의 세포 씨딩 밀도 및 약 2x106개 세포/㎖의 세포 농도로 T 세포 활성화제와 혼합하고; 이에 따라 형성된 혼합물을 약 48시간 동안 인큐베이션시킴으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 혼합물 중 T 세포 활성화제 대 배지의 비는 약 1:12.5(v/v)이다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 단계 (ii) 이후에 T 세포의 제2 집단에서 T 세포 활성화제를 희석하여, 활성화를 감소시키고 세포가 단계 (iii) 이전에 회수되게 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단계 (iii)은 전기천공법에 의해 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)은 하나의 전기천공법 이벤트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 RNP 복합체 및 제2 RNP 복합체는 하나의 전기천공법 이벤트에서 활성화된 T 세포 내로 도입된다. 일부 실시형태에서, 제1 RNP 복합체 내의 제1 Cas9 효소의 양은 제2 RNA 복합체 내의 제2 Cas9 효소의 양과 같다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소의 농도는 약 0.15 ㎎/㎖이고, 제2 Cas9 효소의 농도는 약 0.15 ㎎/㎖이고, TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA의 농도는 약 0.08 ㎎/㎖이고, β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA의 농도는 약 0.2 ㎎/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)에서 세포 농도는 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖이다. 일부 실시형태에서, 단계 (iii)에서 세포 농도는 약 300 x 106개 세포/㎖이다. 다른 실시형태에서, 단계 (iii)(예를 들어, 전기천공법)에서 사용되는 각각의 용기 내의 총 세포 수는 약 5x108개 내지 약 1x109개의 세포, 예를 들어, 약 7x108개의 세포일 수 있다. 일부 예에서, 다수의 용기, 예를 들어, 약 5 내지 10개의 용기가 단계 (iii)(예를 들어, 전기천공법)에서 사용될 수 있다. 구체적인 예에서, 7개만큼 많은 용기가 단계 (iii)에서 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어, 전기천공법을 위하여 약 1.5x109개 내지 약 3x109개의 세포(예를 들어, 약 2.1x109개의 세포 또는 약 2.7x109개의 세포)를 함유할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 10,000 내지 약 80,000의 감염 다중도(MOI) 값을 갖는다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV 혈청형 6(AAV6) 벡터이다.
일부 실시형태에서, 단계 (v)는 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 6일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포의 제4 집단은 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 세포 배양 용기에 씨딩될 수 있다. 일부 실시형태에서, 단계 (v)는 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 7일 내지 약 9일 동안 배양함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 단계 (v)는 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 용기는 배지 교체 없이 약 10일 내지 약 12일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기(본원에서 상호 교환 가능하게 정적 배양 용기로도 지칭됨)이다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 용기는 배지 교체 없이 약 7일 내지 약 9일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기이다.
일부 실시형태에서, 단계 (vi)은 증량된 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정된 비드와 접촉시키고, 비결합 세포를 수집함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 또는 둘 모두는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 뉴클레아제(spCas9)이다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소 및 제2 Cas9 효소는 동일하다. 일부 실시형태에서, 제1 Cas9 효소는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 제2 Cas9 효소는 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA는 SEQ ID NO: 4의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA는 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA는 SEQ ID NO: 8의 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA는 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 gRNA, 제2 gRNA 또는 둘 모두는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR은 암 항원을 표적화하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 동시-자극 도메인 및 CD3z 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 도메인은 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고/하거나, 막횡단 도메인은 CD8a로부터 유래되고/되거나, 동시-자극 도메인은 CD28 및/또는 4-1BB로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 BCMA에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시의 양태는 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단을 제공한다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 상세사항은 하기 설명에 제시되어 있다. 본 발명의 다른 특징 또는 이점은 하기의 도면 및 몇몇의 실시형태의 상세한 설명, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
도 1a 및 도 1b는 다양한 조건 하에서의 T 세포의 활성화 및 증량을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 1a: CD25 및/또는 CD69를 발현하는 세포의 퍼센트로서 측정되는 T 세포 활성화를 보여주는 그래프. 도 1b: CD25의 발현 수준이 세포 증량 속도와 상호관련이 있는 것을 보여주는 그래프. CD25의 발현 수준을 CD25의 평균 형광 세기(MFI)로서 측정하였다.
도 2a 내지 도 2d는 T 세포가 본원에 기재된 최적화된 조건을 사용하여 정적 배양 용기에서 활성화되는 소규모 제조 방법에서 제조되는 T 세포에서의 편집 효율 및 CAR 발현을 보여주는 다이어그램을 포함한다. T 세포를 병행하여 대조군으로서 T-플라스크에서 제조하였다. UT: 미처리 T 세포; EP: 모의 전기천공된 T 세포; 플라스크: T-플라스크 내의 T 세포; 및 용기: 정적 배양 용기 내의 T 세포. 도 2a: T 세포에서의 TCRαβ 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 2b: T 세포에서의 β2M 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 2c: T 세포에서의 이중 낙아웃(DKO) 효율을 보여주는 그래프. 도 2d: T 세포에서의 CAR 발현 퍼센트(CAR%)를 보여주는 그래프.
도 3은 소규모 제조 방법에서 제조되는 T 세포의 편집 이후의 T 세포 증량을 보여주는 다이어그램이다. UT: 미처리 T 세포; EP: 모의 전기천공된 T 세포; 플라스크: T-플라스크 내의 T 세포; 및 용기: 정적 배양 용기 내의 T 세포.
도 4a 내지 도 4f는 상이한 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 편집 효율 및 CAR 발현을 보여주는 다이어그램을 포함한다. UT: 미처리 T 세포; D3: 제3일의 편집 효율; D6: 제6일의 편집 효율; D9: 제9일의 편집 효율; 및 D12: 제12일의 편집 효율. 도 4a: 100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 β2M 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 4b: 100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 TCRαβ 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 4c: 100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 CAR 발현 퍼센트(CAR%)를 보여주는 그래프. 도 4d: 200x106개 세포/㎖ 내지 400x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 β2M 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 4e: 200x106개 세포/㎖ 내지 400x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 TCRαβ 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 4f: 200x106개 세포/㎖ 내지 400x106개 세포/㎖의 세포 농도로 전기천공시킨 T 세포에서의 CAR 발현 퍼센트(CAR%)를 보여주는 그래프.
도 5a 및 도 5b는 다양한 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 5a: 1.25K 내지 80K 범위의 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 그래프. UT: 미처리 T 세포; D3: 형질도입 3일 후의 CAR+ 발현; D6: 형질도입 6일 후의 CAR+ 발현; D10: 형질도입 10일 후의 CAR+ 발현; 및 D13: 형질도입 13일 후의 CAR+ 발현. 도 5b: 0.12K 내지 23K 범위의 MOI로의 형질도입 11일 후에 측정되는 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 그래프. P.C.: 양성 대조군; EP: 전기천공법 단독 대조군; 및 Iso Type: 염소 IgG로 대체된 CAR 양성 아이소타입.
도 6a 내지 도 6c는 편집된 T 세포의 증량에 대한 세포 씨딩 밀도의 영향을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 6a: 증량 동안의 세포 수를 보여주는 그래프. 도 6b: 증량 동안의 세포 밀도를 보여주는 그래프. 도 6c: 증량 동안의 배수 증량을 보여주는 그래프.
도 7a 내지 도 7e는 항-CD19 유도된 키메라 T 세포 항원 수용체(CTX110)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조로부터의 데이터를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 7a는 본원에 기재된 기술의 일부 실시형태에 따른, 항-CD19 CAR을 발현하는 T 세포를 제조하기 위한 예시적인 제조 공정의 흐름도를 포함한다. 도 7b 및 도 7c는 다양한 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 7b: 0K 내지 80K 범위의 rAAV-138 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 그래프. 도 7c: 0K 내지 80K 범위의 rAAV-138 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 그래프. 20K의 rAAV-138 MOI로의 형질도입을 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 7d 및 도 7e는 상이한 농도의 TCR을 표적화하는 sgRNA(TA-1 sgRNA) 또는 B2M을 표적화하는 sgRNA(B2M-1 sgRNA)로부터 형성된 RNP 복합체로 전기천공된 T 세포에서의 편집 효율을 보여주는 다이어그램을 포함한다. TCRαβ-: TCRαβ 편집을 갖는 세포의 퍼센트; β2M-: β2M 편집을 갖는 세포의 퍼센트; 및 이중 낙아웃(DKO): TCRαβ 편집 및 β2M 편집을 갖는 세포의 퍼센트. 도 7d: 37.5 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖의 TA-1을 사용하여 형성된 RNP 복합체로 전기천공된 T 세포에서의 낙아웃 효율을 보여주는 그래프. 도 7e: 37.5 ㎍/㎖ 내지 300 ㎍/㎖의 B2M-1을 사용하여 형성된 RNP 복합체로 전기천공된 T 세포에서의 낙아웃 효율을 보여주는 그래프.
도 8a 내지 도 8g는 항-BCMA 유도된 키메라 T 세포 항원 수용체(CTX120)를 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조로부터의 데이터를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 8a는 본원에 기재된 기술의 일부 실시형태에 따른, 항-BCMA CAR을 발현하는 T 세포를 제조하기 위한, 예시적인 제조 공정의 흐름도를 포함한다. 도 8b: 증가하는 MOI로 형질도입된 T 세포에서의 CAR+ 발현을 보여주는 그래프. 도 8c: CTX120에서 검출된 소진 마커의 수준을 보여주는 그래프. 도 8d: CTX120의 CD8+ T 세포에서 검출되는 기억 마커의 수준을 보여주는 그래프. 도 8e: CTX120의 CD4+ T 세포에서 검출되는 기억 마커의 수준을 보여주는 그래프. 도 8f: BCMA+ 종양 세포와 CTX120의 동시-배양 시의 IFNγ의 생성을 보여주는 그래프. 도 8g: CTX120과 BCMA+ 종양 세포의 동시-배양 시의 종양 사멸을 보여주는 그래프.
도 9a 및 도 9b는 편집 이후 증량 일수의 함수로서 ㎖당 세포 농도의 그래프를 제공한다.
도 10a 및 도 10b는 편집 이후 증량 일수의 함수로서 계산된 세포 수의 그래프를 제공한다.
도 11a 및 도 11b는 편집 이후 증량 일수의 함수로서 세포 생존력 백분율의 그래프를 제공한다.
도 12a 내지 도 12c는 다양한 리플레이팅 및 저-플레이팅 군에서 평가되는 CAR+%(도 12a), TRAC-%(도 12b) 및 β2M-%(도 12c)를 포함하는 편집 효율을 도시한 그래프를 제공한다.
도 13a 및 도 13b는 다양한 리플레이팅된 세포 집단에서의 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비를 제공한다.
도 14a 내지 도 14f는 리플레이팅된 집단에서의 기억 세포 하위유형 마커의 평가를 도시한 막대 그래프를 제공한다. 리플레이팅된 집단 내의 세포를 나이브 T 세포, 중심 기억(CM) T 세포, 이펙터 기억(EM) T 세포 및 말단 이펙터(TE) T 세포로서 평가하였다.
도 15a 내지 도 15f는 CAR+, CD4+/CAR+ 및 CD8+/CAR+ 세포의 리플레이팅된 집단에서의 소진 마커의 평가를 도시한 막대 그래프를 제공한다. 검정된 3가지 소진 마커는 PD1, LAG3 및 TIM3이었다.
도 16a 내지 도 16c는 리플레이팅된 및 저-플레이팅 밀도 군에서 CAR-T 세포가 시험관 내에서 CD19 양성 Raji 표적 세포를 사멸하는 능력을 보여주는 그래프를 제공하며, 이를 유세포측정-기반의 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다.
도 17a 내지 도 17d는 생체 내에서 3가지 상이한 용량의 CAR 세포로의 접종 후 일수의 함수로서 종양 세포의 생존의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 18a 내지 도 18d는 생체 내에서 3가지 용량의 CAR 세포로의 접종 후 일수의 함수로서 마우스에서의 종양 질량을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 19는 본 개시의 하나의 실시형태를 예시한 흐름도를 보여준다.
도 20은 CAR T-세포 용해를 측정함에 의한 검정 대조군 FACS 분석을 보여준다. CAR T-세포는 CTX110 CAR T-세포였다. T-세포의 81%는 CAR+였다.
도 21a 내지 도 21c는 시험관 내에서 세포 용해 및 사이토카인 생성을 측정한 검정 대조군 실험의 결과를 보여준다. 검정은 동결된 원액으로부터 해동된 CTX110 CAR-T 세포를 사용하였다. T-세포는 HDR 후 6일에 80% CAR+였다.
도 22a 내지 도 22c는 3명의 각각의 공여자로부터 유래된 T-세포가 1x, 2x 및 4x 배양 조건에서 다양한 정도의 시험관 내 효능을 가졌음을 보여주는 시험관 내 효능 분석의 결과를 보여준다.
도 23a 내지 도 23c는 상이한 세포 농도에서의 세포 용해의 분석의 결과를 보여주며, 이는 공여자 1 및 2로부터 유래된 세포가 상이한 백분율의 CAR+ 세포에도 불구하고 유사한 반응을 보였음을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 CAR+ 세포에 대하여 정규화되는 경우 3명의 공여자로부터의 세포 용해의 분석의 결과를 보여준다. 공여자 2 및 3은 CAR 세포가 정규화되는 경우 검정에서 유사하게 거동하였다. 검정을 공여자 2에 대하여 동일한 E:T 비로 2x CAR-T 세포 수를 사용하여 반복하였다.
도 25a 내지 도 25c는 생체 내에서 모든 3명의 공여자 및 증량 조건에 대한 CAR 세포의 접종 후 일수의 함수로서 마우스의 생존의 백분율을 보여주는 생존 곡선을 제공한다.
본 개시는 적어도 부분적으로, 제조 방법의 하나 이상의 단계에 대한 개선된 조건을 포함하는, CAR-T 세포, 특히 동종이계 CAR-T 세포를 생성하기 위한 개선된 제조 방법의 개발에 기초한다. 본원에 개시된 개선된 제조 방법은 적어도 하기의 유리한 결과를 야기한다:
(a) 본원에 제공되는 개선된 T 세포 농축 조건으로부터 초래되는 T 세포 순도 개선 및 T 세포 생존력 개선.
(b) 본원에 제공되는 개선된 T 세포 형질도입 조건으로부터 초래되는 CAR-발현 T 세포를 생성하기 위한 일관성 개선 및 효율 개선.
(c) 본원에 제공되는 개선된 CRISPR-Cas9-매개의 유전자 편집 조건으로부터 초래되는 T 세포에서의 TRAC 유전자 및 β2M 유전자 파괴의 일관성 개선 및 효율 개선.
(d) 본원에 기재되는 개선된 제조 방법에 의해 제공되는 감소된 생성 시간 및 감소된 생성 비용으로부터 초래되는 CAR T-세포 요법의 공급 증가.
(e) 본원에 기재되는 개선된 제조 방법을 사용하여 균일한 고 품질 CAR T-요법의 생성으로부터 초래되는 제조된 약품의 가변성 감소.
(f) T 세포에서 높은 CAR 발현 수준을 유지하면서, 단순화된 AAV 형질도입 조건.
따라서, CAR 구축물, 예컨대 암 항원, 예를 들어, CD19 또는 BCMA를 표적화하는 CAR 구축물을 발현하는, TRAC 및 β2M 유전자가 낙아웃된, 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법이 본원에 제공된다. 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단 및 이의 치료적 용도는 또한, 본 개시의 범주 내에 있다.
I. 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조
본 개시의 양태는 파괴된 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 유전자 및 파괴된 T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역(TRAC) 유전자, 및 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 삽입된 핵산을 포함하는 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법을 제공한다.
β2M 유전자 및 TRAC 유전자의 파괴는 유전학적으로 조작된 T 세포를 비-동종반응성이 되게 하고, 동종이계 이식에 적합하게 한다. CAR을 인코딩하는 핵산의 삽입은 유전학적으로 조작된 T 세포가 그의 표면 상에 CAR을 발현하게 하며, 이는 유전학적으로 조작된 T 세포를 암 세포에 표적화한다.
따라서, 본원에 개시된 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법은 일부 실시형태에서, TRAC 및 β2M의 발현을 파괴하기 위한 CRISPR-Cas9 유전자 편집의 이용 및 CAR을 인코딩하는 핵산을 삽입하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 형질도입의 이용을 포함한다.
일반적으로, 본원에 개시된 CAR-T 세포의 제조 방법은 (i) 적합한 인간 면역 세포 공급원으로부터 CD4+/CD8+ T 세포를 농축하는 단계, (ii) 농축된 CD4+/CD8+ T 세포를 활성화시키는 단계, 및 (iii) 활성화된 T 세포를 유전학적으로 조작하여, 파괴된 TRAC 및 B2M 유전자를 갖는 CAR-T 세포를 생성하는 단계; 및 유전학적으로 조작된 T 세포를 치료적 이용을 위하여 수거하는 단계를 포함할 수 있다. 필요한 경우, 농축된 CD4+/CD8+ T 세포를 장래의 이용을 위하여 동결보존을 통해 보관할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 유전학적으로 조작된 T 세포는 수거 전에 시험관 내에서 증량될 수 있다. TCRαβ+ T 세포는 이에 따라 생성된 CAR-T 세포 집단으로부터 고갈될 수 있다.
(i) T 세포 농축
본원에 개시된 임의의 제조 방법은 출발 물질로서 인간 혈액 세포를 사용할 수 있다. 예를 들어, T 세포는 당업자에게 공지된 기법, 예컨대 침강, 예를 들어, FICOLL™ 분리를 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조에서 사용하기 위한 T 세포는 시험관 내 분화를 통해 줄기 세포(예를 들어, HSC 또는 iPSC)로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 혈액 세포는 개별 인간 공여자로부터 수득될 수 있다. 다른 실시형태에서, 혈액 세포는 다수의 인간 공여자(예를 들어, 2, 3, 4 또는 5명의 인간 공여자)로부터 수득될 수 있다.
일부 예에서, 적합한 인간 공여자 유래의 류코팩(leukopak) 샘플이 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 류코팩 샘플은 말초 혈액으로부터 수집되는 농축된 백혈구성분채집 생성물이다. 이는 전형적으로, 단핵구, 림프구, 혈소판, 혈장 및 적혈구를 포함하는 다양한 혈액 세포를 함유한다. 인간 공여자는 바람직하게는 건강한 인간 공여자이다. 예를 들어, 인간 공여자 후보는 HBV, HCV, HIV, HTLV, WNV, 트리파노소마 크루지(trypanosoma cruzi) 및/또는 CMV에 대한 스크리닝으로 처리될 수 있다. 스크리닝에서 음성 결과를 보이는 인간 대상체가 혈액 세포에 대한 공여자로서 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용되는 T-세포의 공급원은 특별히 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, T 세포 은행으로부터의 T 세포는 본원에 개시된 임의의 제조 방법에서 출발 물질로서 사용될 수 있다. T 세포 은행은 세포 배양물에서 T 세포 지속성을 개선시키기 위하여 특정 유전자(예를 들어, 세포 자가 재생, 아폽토시스 및/또는 T 세포 소진 또는 복제 노화에 관여하는 유전자)의 유전학적 편집을 갖는 T 세포를 포함할 수 있다. T 세포 은행은 보나파이드(bonafide) T 세포, 예를 들어, 비-형질전환된 T 세포, 최종 분화된 T 세포, 안정한 게놈을 갖는 T 세포 및/또는 증식 및 증량을 위해 사이토카인 및 성장 인자에 의존하는 T 세포로부터 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 T 세포 은행은 전구체 세포, 예컨대 조혈 줄기 세포(예를 들어, iPSC), 예를 들어, 시험관 내 배양물로부터 생성될 수 있다. 일부 예에서, T 세포 은행에서의 T 세포는 세포 자가-재생에 관여하는 하나 이상의 유전자, 아폽토시스에 관여하는 하나 이상의 유전자 및/또는 T 세포 소진에 관여하는 하나 이상의 유전자의 유전학적 편집을 포함하여, 이러한 유전자를 파괴하거나 이의 발현을 감소시켜, 배양물에서 지속성을 개선시킬 수 있다. T 세포 은행에서의 편집된 유전자의 예에는 Tet2, Fas, CD70, Regnase-1 또는 이의 조합이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 비-편집된 T 대응물과 비교하여, T 세포 은행에서의 T 세포는 배양 중 향상된 증량 능력, 향상된 증식 능력, 더 큰 T 세포 활성화 및/또는 감소된 아폽토시스 수준을 가질 수 있다.
적합한 T 세포는 종래의 방법 또는 본원에 개시된 방법을 사용하여 인간 혈액 세포로부터 농축될 수 있다. 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하는 데 사용하기 위한 T 세포는 CD4+, CD8+ 또는 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는 T 세포 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다. 일부 실시형태에서, CD4+ T 세포는 인간 혈액 세포로부터 농축될 수 있다. 다른 실시형태에서, CD8+ T 세포는 농축될 수 있다. 특정 예에서, CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두는 인간 혈액 세포로부터 정제된다.
CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포는 당업계에 알려져 있는 임의의 방법 또는 본원에 개시된 것들을 사용하여, 예를 들어, 표적 T 세포에 대한 특정 세포-표면 바이오마커에 결합할 수 있는 항체, 예를 들어, CD4에 특이적인 항체 및/또는 CD8에 특이적인 항체를 사용하여 적합한 혈액 세포 공급원, 예컨대 본원에 기재된 것들로부터 단리될 수 있다. 일부 실시형태에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 농축하는 단계는 자성 비드에 컨쥬게이트된 항-CD4 및 항-CD8 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 비드에 컨쥬게이트된 항체를 통해 자성 비드로의 표적 T 세포의 결합을 가능하게 하기에 적합한 조건 하에서 적합한 기간 동안 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 세포 집단을 이러한 자성 비드와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 비-결합 세포를 세척할 수 있고, 비드에 결합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 일상적인 방법을 사용하여 수집할 수 있다.
농축된 T 세포(예를 들어, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포)는 일상적인 관례에 따라 표적 T 세포의 세포 생존력 및/또는 순도와 같은 특징에 대하여 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 농축 단계로부터의 T 세포 집단은 적어도 약 80%(예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95% 이상)의 세포 생존력을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 농축된 T 세포 집단은 적어도 약 80%, 예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 약 98% 이상의 순도의 표적 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 농축된 T 세포 집단은 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97%, 약 98% 이상의 순도의 표적 T 세포(예를 들어, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포)를 가질 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해서 결정되는 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미하며, 이것은 그 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실시에 따라서, 허용 가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 보다 더 바람직하게는 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 방법과 관련하여, 이 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 출원서 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 암시적이며, 이 맥락에서 특정 값에 대한 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미한다.
농축된 T 세포 집단(이는 또한 본 개시의 범주 이내임)은 본원에 개시된 바와 같은 추가의 처리를 위해 바로 사용될 수 있다. 대안적으로, 농축된 T 세포 집단은 장래의 이용을 위하여 적합한 조건 하에, 예를 들어, 동결보존을 통해 보관될 수 있다. 추가의 처리 이전에, 동결보존된 T 세포는 일상적인 절차에 따라 해동될 수 있다. 해동된 세포의 세포 생존력을 평가하여 해동된 세포가 추가의 처리에 적합한지 여부를 결정할 수 있다.
(ii) T 세포 활성화
농축된 T 세포를 T 세포 활성화로 처리하여, 농축된 CD4+/CD8+ T 세포의 증식 및 증량을 가능하게 할 수 있다. 본원에 개시된 임의의 방법에서 사용되는 T 세포 활성화 단계는 높은 T 세포 활성화 효율을 제공하는 본원에 개시된 T 세포 활성화 조건을 포함할 수 있다. 추가로, 이로부터 수득되는 활성화된 T 세포는 높은 유전자 편집 효율과 편집 이후 큰 T 세포 증량 속도를 나타낼 것이다. 하기 실시예를 참조한다.
일부 실시형태에서, T 세포 활성화는 T 세포 활성화제 또는 T 세포 활성화제들, 예를 들어, CD3/TCR-매개된 신호전달 경로 및/또는 동시-자극 분자(예를 들어, CD28) 매개된 신호전달 경로를 자극하는 작용제를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 활성화제는 CD3 효능제(예를 들어, 효능작용 항-CD3 항체)일 수 있으며, CD3/TCR-매개된 세포 신호전달 경로를 활성화시킨다. 대안적으로 또는 추가적으로, T 세포 활성화제는 CD28 효능제(예를 들어, 항-CD28 항체)일 수 있으며, CD28에 의해 매개되는 동시-자극 신호전달 경로를 활성화시킨다. 본원에 개시된 방법에 이용하기 위한 임의의 T 세포 활성화제는 지지 부재, 예컨대 나노매트릭스 입자에 컨쥬게이트될 수 있다. 구체적인 예에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 T 세포 활성화제는 나노매트릭스 입자에 컨쥬게이트될 수 있는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, T 세포 활성화제는 나노매트릭스 입자에 부착된 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 포함한다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 동일한 나노매트릭스 입자에 부착된다. 일부 실시형태에서, CD3 효능제 및 CD28 효능제는 상이한 나노매트릭스 입자에 부착된다.
T 세포 활성화를 달성하기 위하여, 본원에 개시된 바와 같은 농축된 T 세포(예를 들어, CD4+/CD8+ T 세포)를 세포 배양 용기에서 적합한 세포 씨딩 밀도 및 적합한 세포 농도로 배치하고, T 세포 활성화를 유도하기에 적합한 기간 동안 본원에 개시된 임의의 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시킬 수 있다.
일부 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 세포 배양 배지의 비는 약 1:10(v/v) 내지 약 1:15(v/v)의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 세포 배양 배지의 비는 약 1:10(v/v), 약 1:10.5(v/v), 약 1:11(v/v), 약 1:11.5(v/v), 약 1:12(v/v), 약 1:12.5(v/v), 약 1:13(v/v), 약 1:13.5(v/v), 약 1:14(v/v), 약 1:14.5(v/v) 또는 약 1:15(v/v)일 수 있다. 구체적인 예에서, 세포 배양 용기 내의 T 세포 활성화제 대 배양 배지의 비는 약 1:12.5(v/v)이다.
대안적으로 또는 추가적으로, 적합한 세포 씨딩 밀도는 약 1.5 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎠)일 수 있으며, 적합한 세포 농도는 약 1.5 x 106개 내지 2.5 x 106개(예를 들어, 2x106개/㎖)일 수 있다. 세포를 약 42 내지 54시간, 예를 들어, 48시간 동안 T 세포 활성화제와 함께 인큐베이션시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 세포 배양 용기는 정적 배양 용기일 수 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포의 상대적으로 대규모의 생성을 가능하게 할 것이다. 종래의 세포 배양 플라스크에 비하여, 정적 세포 배양 용기는 혼합 또는 진탕 없이 T 세포에 산소 및 영양소를 공급하는 배지에 침지된 고 기체 투과성 막 상에 T 세포가 잔존하게 한다. 정적 배양 용기는 배지 교체 없이 T 세포 제조를 가능하게 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 방법에서 T 세포 활성화 방법은 배지 교체를 포함하지 않을 수 있다.
필요한 경우, 활성화제를 후속 유전자 편집 이벤트 이전에 세포 배양 용기로부터 제거하고, 희석하여, 유전자 편집 동안 활성화제가 부여할 수 있는 임의의 가능한 영향을 최소화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화제는 일상적인 방법, 예를 들어, 원심분리를 사용하여 세포 배양 용기로부터 제거될 수 있다. 대안적으로, 활성화제는 유전자 편집 이전에 세포 배양 용기에서 희석될 수 있으며, 예를 들어, 세포 배양 용기로의 배지의 첨가에 의해 희석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 임의의 T 세포 활성화 방법으로부터 유래되는 활성화된 T 세포를 하룻밤 배양하여(예를 들어, 약 16시간), T 세포가 유전자 편집 이전에 회복되게 할 수 있다. 일부 예에서, 활성화된 T 세포 배양물은 T 세포 활성화제를 여전히 함유할 수 있다. 다른 예에서, 활성화된 T 세포는 T 세포 활성화제의 존재를 거의 갖지 않거나, 전혀 갖지 않을 수 있다.
(iii) 활성화된 T 세포의 CRISPR-CAS9-매개된 유전자 편집
본원에 개시된 임의의 절차에 의해 제조되는 활성화된 T 세포를 유전자 편집으로 처리하여 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 통해 숙주 반응 관련 유전자, 예를 들어, TRAC 유전자 및/또는 β2M 유전자를 낙 아웃시킬 수 있다.
TRAC 유전자는 TCR 복합체의 구성성분을 인코딩한다. TRAC 유전자의 파괴는 TCR의 기능의 소실을 야기하며, 조작된 T 세포가 비-동종반응성이 되게 하고, 동종이계 이식에 적합하게 하여, 이식편대숙주병의 위험을 최소화시킨다. β2M 유전자는 주요 조직적합성 복합체(MHC) I 복합체의 공통(불변) 구성성분을 인코딩한다. β2M 유전자의 파괴에 의해, 숙주 대 치료적 동종이계 T 세포 반응을 방지할 수 있다. TRAC 유전자 및 β2M 유전자 둘 모두의 낙 아웃은 세포 요법에 사용하기 위한 동종이계 T 세포의 생성을 초래할 것이다.
CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집 시스템
CRISPR-Cas9 시스템은 유전자 편집에 사용되는 RNA-가이드 DNA-표적화 플랫폼으로 용도가 변경된 원핵생물의 자연 발생적 방어 메커니즘이다. 이는 DNA의 절단을 표적화하기 위해 DNA 뉴클레아제 Cas9, 및 두 개의 비코딩 RNA, crisprRNA(crRNA)와 트랜스-활성화 RNA(tracrRNA)에 의존한다. CRISPR은, 예를 들어 원핵생물을 감염시키거나 공격한 바이러스에 의해 세포에 이전에 노출된 외래 DNA와 유사성을 갖는 DNA의 단편(스페이서 DNA)을 함유하는 박테리아 및 고세균의 게놈에서 발견된 DNA 서열의 패밀리인 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부의 약어이다. 이들 DNA 단편은 후속하는 공격 동안 예를 들어 유사한 바이러스로부터의 재도입 시 유사한 외래 DNA를 검출하고 파괴시키도록 원핵생물에 의해 사용된다. CRISPR 유전자좌의 전사는 외래 외인성 DNA를 인식하고 절단할 수 있는 Cas(CRISPR 연관) 단백질과 회합하고 이를 표적화하는 스페이서 서열을 포함하는 RNA 분자의 형성을 야기한다. CRISPR/Cas 시스템의 많은 유형 및 클래스가 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Koonin et al, (2017) Curr Opin Microbiol 37:67-78] 참조).
crRNA는 전형적으로 표적 DNA에서 20개의 뉴클레오티드(nt) 서열과의 왓슨-클릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성을 통해 CRISPR-Cas9 복합체의 서열 인식 및 특이성을 유도한다. crRNA에서의 5' 20 nt의 서열의 변경은 특정 유전자좌로의 CRISPR-Cas9 복합체의 표적화를 허용한다. 표적 서열 뒤에 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)라 칭해지는 특이적인 짧은 DNA 모티프(서열 NGG를 가짐)가 있으면 CRISPR-Cas9 복합체는 crRNA의 처음 20 nt에 일치하는 서열을 함유하는 DNA 서열에만 결합한다.
TracrRNA는 crRNA의 3' 말단과 혼성화되어 RNA-듀플렉스 구조를 형성하고, 이는 Cas9 엔도뉴클레아제에 의해 결합되어, 이후 표적 DNA를 절단할 수 있는 촉매 활성 CRISPR-Cas9 복합체를 형성한다.
CRISPR-Cas9 복합체가 표적 부위에서 DNA에 결합되면, Cas9 효소 내의 두 개의 독립적인 뉴클레아제 도메인은 각각 PAM 부위의 상류에 DNA 가닥의 하나를 절단하여, 이중-가닥 파단(DSB)을 남기고, 여기서 DNA의 가닥 둘 모두는 염기 쌍으로 종료된다(블런트 말단).
특이적 표적 부위에서의 DNA로의 CRISPR-Cas9 복합체의 결합 및 부위-특이적 DSB의 형성 후, 다음의 핵심 단계는 DSB의 수선이다. 세포는 DSB를 수선하기 위한 두 개의 주요 DNA 수선 경로를 이용한다: 비상동성 말단 연결(NHEJ) 및 상동성-지정 수선(HDR).
NHEJ는 비분열 세포를 포함하는 대부분의 세포 유형에서 고도로 활성으로 보이는 강력한 수선 메커니즘이다. NHEJ는 오류 발생이 쉽고, 흔히 DSB의 부위에서 1 개의 뉴클레오티드 내지 수백 개의 뉴클레오티드의 제거 또는 부가를 발생시킬 수 있긴 하지만, 이러한 변형은 전형적으로 20 nt 미만이다. 생성된 삽입 및 결실(인델(indel))은 유전자의 코딩 또는 비코딩 영역을 파괴할 수 있다. 대안적으로, HDR은 고충실도로 DSB를 수선하기 위해 내인성으로 또는 외인성으로 제공된 상동성 공여자 DNA의 긴 스트레치를 이용한다. HDR은 분열 세포에서만 활성이고, 대부분의 세포 유형에서 비교적 낮은 빈도로 생긴다. 본 개시의 많은 실시형태에서, NHEJ는 수선 오페란트(operant)로서 이용된다.
(i) Cas9
일부 실시형태에서, Cas9(CRISPR 연관 단백질 9) 엔도뉴클레아제는 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 CRISPR 방법에 사용된다. 다른 Cas9 동족체가 또한 사용될 수 있지만, Cas9 효소는 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 유래의 것일 수 있다. 야생형 Cas9가 사용될 수 있거나, Cas9의 변형된 버전(예를 들어, Cas9의 진화된 버전, 또는 Cas9 오쏠로그 또는 변이체)이 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, Cas9는 C-말단 및 N-말단 SV40 대형 T 항원 핵 국소화 서열(NLS)을 포함하도록 조작된 스트렙토코커스 피오게네스-유래 Cas9 뉴클레아제 단백질을 포함한다. 생성된 Cas9 뉴클레아제(sNLS-spCas9-sNLS)는, 재조합 이. 콜라이(E. coli) 발효에 의해 생성되고 크로마토그래피에 의해 정제된 162 kDa 단백질이다. spCas9 아미노산 서열은 본원에서 SEQ ID NO: 1로 제공된 UniProt 수탁 번호 Q99ZW2로서 확인될 수 있다.
(ii) 가이드 RNA(gRNA)
본원에 기재된 바와 같은 CRISPR-Cas9-매개 유전자 편집은 가이드 RNA 또는 gRNA의 사용을 포함한다. 본원에서 사용되는 "gRNA"는 특정 표적 서열에서 유전자 편집을 위해 TRAC 유전자 또는 β2M 유전자 내의 특정 표적 서열로 Cas9를 유도할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 지칭한다. 가이드 RNA는 편집을 위한 표적 유전자 내의 표적 핵산 서열에 혼성화하는 적어도 하나의 스페이서 서열, 및 CRISPR 반복 서열을 포함한다.
TRAC 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 SEQ ID NO: 2에 제공된다. 또한, 본원에 언급된 주제 및 목적에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호로서 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 14(GRCh38: 염색체 14: 22,547,506-22,552,154; Ensembl; ENSG00000277734)에 위치한 TRAC 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역를 표적화하는 gRNA 및 Cas9는 TRAC 게놈 영역에서 파단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 파괴하는 TRAC 유전자 내의 인델을 생성시킨다.
일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 표 9의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TRAC 유전자 내에 인델을 생성한다. 일부 실시형태에서, TRAC 게놈 영역을 표적화하는 gRNA(SEQ ID NO: 2)는 표 9의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 TRAC 유전자 내에 인델을 생성한다.
β2M 유전자를 표적화하는 예시적인 gRNA는 SEQ ID NO: 6에 제공된다. 또한, 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 관련 개시가 본원에 참조로 포함되는 제WO 2019/097305A2호로서 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호를 참조한다. 다른 gRNA 서열은 염색체 15(GRCh38 좌표: 염색체 15: 44,711,477-44,718,877; Ensembl: ENSG00000166710)에 위치한 β2M 유전자 서열을 이용하여 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA 및 RNA-가이드 뉴클레아제는 β2M 게놈 영역에서 파단을 생성하여 mRNA 또는 단백질의 발현을 방해하는 β2M 유전자 내에 인델을 생성시킨다.
일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA는 표 10의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 β2M 유전자 내에 인델을 생성한다. 일부 실시형태에서, β2M 게놈 영역을 표적화하는 gRNA(SEQ ID NO: 6)는 표 10의 서열로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 β2M 유전자 내에 인델을 생성한다.
II형 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열로 불리는 제2 RNA를 포함한다. II형 gRNA에서, CRISPR 반복 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화되어 듀플렉스를 형성한다. V형 gRNA에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 두 시스템 모두에서, 듀플렉스는 부위-지정 폴리펩티드에 결합하고, 그에 따라 가이드 RNA와 부위-지정 폴리펩티드는 복합체를 형성한다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드와 이의 회합으로 인해 복합체에 표적 특이성을 제공한다. 따라서 게놈-표적화 핵산은 부위-지정 폴리펩티드의 활성을 유도한다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 각각의 가이드 RNA는 이의 게놈 표적 서열에 상보적인 스페이서 서열을 포함하도록 설계된다. 문헌[Jinek et al, Science, 337, 816-821 (2012)] 및 문헌[Deltcheva et al, Nature, 471, 602-607 (2011)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 실시형태에서, 게놈-표적화 핵산(예를 들어, gRNA)은 단일-분자 가이드 RNA이다.
이중-분자 가이드 RNA는 두 가닥의 RNA 분자를 포함한다. 제1 가닥은, 5'에서 3' 방향으로, 선택적인 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복 서열을 포함한다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열(최소 CRISPR 반복 서열에 상보적인), 3' tracrRNA 서열 및 선택적인 tracrRNA 연장 서열을 포함한다.
II형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA("sgRNA"로 지칭됨)는, 5'에서 3'방향으로, 선택적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 선택적 tracrRNA 연장 서열을 포함한다. 선택적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 추가 기능(예를 들어, 안정성)을 제공하는 요소를 포함할 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부와 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 선택적 tracrRNA 연장부는 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. V형 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA는, 5'에서 3' 방향으로, 최소 CRISPR 반복 서열 및 스페이서 서열을 포함한다.
"표적 서열"은 PAM 서열에 인접한 표적 유전자에 있으며, Cas9에 의해 변형될 서열이다. "표적 서열"은 PAM-가닥 및 상보적 비-PAM 가닥을 함유하는 이중-가닥 분자인 "표적 핵산"에서 소위 PAM-가닥에 있다. 당업자는 gRNA 스페이서 서열이 관심 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 위치한 상보적 서열에 혼성화된다는 것을 인식한다. 따라서, gRNA 스페이서 서열은 표적 서열의 RNA 등가물이다.
예를 들어, TRAC 표적 서열이 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3'(SEQ ID NO: 11)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'- AGAGCAACAGUGCUGUGGCC-3'(SEQ ID NO: 5)이다. 또 다른 예에서, β2M 표적 서열이 5'- GCTACTCTCTCTTTCTGGCC-3'(SEQ ID NO: 13)인 경우, gRNA 스페이서 서열은 5'- GCUACUCUCUCUUUCUGGCC-3'(SEQ ID NO: 9)이다. gRNA의 스페이서는 혼성화(즉, 염기 쌍형성)를 통해 서열-특이적 방식으로 관심 표적 핵산과 상호작용한다. 따라서, 스페이서의 뉴클레오티드 서열은 관심 표적 핵산의 표적 서열에 따라 달라진다.
본원의 CRISPR/Cas 시스템에서, 스페이서 서열은 시스템에 사용된 Cas9 효소에 의해 인식 가능한 PAM의 5'에 위치한 표적 핵산의 영역에 혼성화하도록 설계된다. 스페이서는 표적 서열과 완벽하게 일치하거나 불일치를 가질 수 있다. 각각의 Cas9 효소는 이것이 표적 DNA에서 인식하는 특정 PAM 서열을 갖는다. 예를 들어, 에스. 피오게네스는 표적 핵산에서, 서열 5'-NRG-3'을 포함하는 PAM을 인식하며, 여기서 R은 A 또는 G를 포함하고, N은 임의의 뉴클레오티드이고, N은 스페이서 서열에 의해 표적화된 표적 핵산 서열의 바로 3' 바로 옆에 있다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 20개 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 20개 미만의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 20개 초과의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 적어도 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 최대 5개, 10개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 30개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 PAM의 첫 번째 뉴클레오티드의 5' 바로 옆에 20개의 염기를 갖는다. 예를 들어, 5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3'을 포함하는 서열에서, 표적 핵산은 N에 대응하는 서열일 수 있으며, 여기서 N은 임의의 뉴클레오티드일 수 있고, 밑줄 표시된 NRG 서열은 에스. 피오게네스 PAM이다.
gRNA 내의 스페이서 서열은 관심 표적 유전자의 표적 서열(예를 들어, DNA 표적 서열, 예컨대 게놈 표적 서열)을 정의하는 서열(예를 들어, 20개 뉴클레오티드 서열)이다. TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 예시적인 스페이서 서열은 SEQ ID NO: 4에 제공된다. β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 예시적인 스페이서 서열은 SEQ ID NO: 8에 제공된다.
본원에 개시된 가이드 RNA는 crRNA 내의 스페이서 서열을 통해 임의의 관심 서열을 표적화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열 사이에 상보성 정도는 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 100% 상보성이다. 다른 실시형태에서, 표적 유전자 내의 표적 서열과 가이드 RNA의 스페이서 서열은 최대 10개의 불일치, 예를 들어, 최대 9개, 최대 8개, 최대 7개, 최대 6개, 최대 5개, 최대 4개, 최대 3개, 최대 2개, 또는 최대 1개의 불일치를 함유할 수 있다.
본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있는 gRNA의 비-제한적 예는 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호, 및 제WO/2019/215500호로 공개된 2019년 5월 10일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2019/000500호에 제공된다. 각각의 종래 출원의 관련 개시는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 본원에 제공된 임의의 gRNA 서열에 대하여, 명시적으로 변형을 나타내지 않는 것들은 비변형 서열과 임의의 적합한 변형을 갖는 서열 둘 모두를 포괄하는 것을 의미한다.
본원에 개시된 임의의 gRNA에서 스페이서 서열의 길이는, 또한 본원에 개시된 임의의 표적 유전자를 편집하는 데 사용되는 CRISPR/Cas9 시스템 및 구성성분에 좌우될 수 있다. 예를 들어, 상이한 박테리아 종으로부터의 상이한 Cas9 단백질은 다양한 최적의 스페이서 서열 길이를 갖는다. 따라서, 스페이서 서열은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 또는 50개 초과의 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 18개 내지 24개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 서열은 19개 내지 21개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 스페이서 서열은 20개 뉴클레오티드 길이를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, gRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있는 sgRNA일 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 미만의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 20개 초과의 뉴클레오티드 스페이서 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 5' 말단에 17개 내지 30개의 뉴클레오티드를 갖는 다양한 길이의 스페이서 서열을 포함한다. 예는 실시예 7에서 표 8에 제공된다.
일부 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 우라실을 포함하지 않는다. 다른 실시형태에서, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 하나 이상의 우라실을 포함할 수 있다. 예를 들어, sgRNA는 sgRNA 서열의 3' 말단에 1개 내지 8개의 우라실 잔기, 예를 들어, sgRNA 서열의 3' 말단에 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 또는 8개의 우라실 잔기를 포함할 수 있다.
임의의 sgRNA를 포함하는 본원에 개시된 임의의 gRNA는 변형되지 않을 수 있다. 대안적으로, 이는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 변형된 백본을 함유할 수 있다. 예를 들어, sgRNA와 같은 변형된 gRNA는, 5' 말단, 3' 말단, 또는 이 둘 모두에 위치할 수 있는 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시형태에서, 1개 초과의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 뉴클레아제 시스템과 함께 사용될 수 있다. 각각의 가이드 RNA는 CRISPR/Cas 시스템이 하나보다 많은 표적 핵산을 절단하도록 상이한 표적화 서열을 함유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA는 Cas9 RNP 복합체 내에서 동일하거나 상이한 성질, 예컨대 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA가 사용되는 경우, 각각의 가이드 RNA는 동일하거나 상이한 벡터에서 인코딩될 수 있다. 하나보다 많은 가이드 RNA의 발현을 구동하는 데 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이하다.
1개 초과의 적합한 Cas9 및 1개 초과의 적합한 gRNA가 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 일부 실시형태에서, 방법은 당업계에 공지된 Cas9 효소 및/또는 gRNA를 포함한다. 예는 예를 들어, 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2018/001619호 및 제WO/2019/215500호로 공개된 2019년 5월 10일자 출원된 국제 출원 제PCT/IB2019/000500호에서 찾을 수 있으며, 각각의 종래 출원의 관련 개시는 본원에 언급된 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다.
TRAC 및 B2M 유전자의 CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 바와 같은 활성화된 T 세포는 종래의 조건에 의해 제공되는 것들에 비하여 더 높고 더욱 일관적인 유전자 편집 효율을 초래할 본원에 개시된 조건 하에서 CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집을 통해 TRAC 유전자 및 β2M 유전자 둘 모두의 유전자 편집을 겪을 수 있다. 추가로, 본원에 개시된 유전자 편집 방법으로부터 수득되는 TRAC -/β2M - T 세포는 CAR 구축물을 코딩하는 바이러스 벡터가 TRAC -/β2M - T 세포 내로 전달되는 경우 키메라 항원 수용체(CAR)의 높은 발현 수준을 보였다.
Cas9 효소 및 TRAC 유전자 및 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA는 하나 이상의 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 본원에 개시된 바와 같은 활성화된 T 세포 내로 전달될 수 있다. RNP는 유전자 편집에 유용한데, 그 이유는 적어도 이들이 핵산-풍부 세포 환경에서 번잡한 상호작용의 위험을 최소화하고, RNA를 분해로부터 보호하기 때문이다. RNP의 형성 방법은 당업계에 공지되어 있다.
CRISPR-Cas9-매개된 유전자 편집 방법은 2개의 리보핵단백질 복합체를 포함할 수 있다. 제1 RNP 복합체는 제1 Cas9 효소 및 TRAC 유전자를 표적화하는 가이드 RNA(gRNA)를 포함한다. 제2 RNP 복합체는 제2 Cas9 효소 및 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA를 포함한다. 일부 예에서, 2가지 RNP 복합체는 상이한 Cas9 효소를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 2가지 RNP 복합체는 동일한 Cas9 효소를 포함한다. 구체적인 예에서, SEQ ID NO:1의 Cas9 효소는 제1 및 제2 RNP 둘 모두에서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 2가지 RNP 복합체는 동일한 양의 Cas9 효소를 함유할 수 있다. 예를 들어, 둘 모두의 RNP 복합체는 약 0.1 내지 0.3 ㎎/㎖(예를 들어, 약 0.1 내지 0.2 ㎎/㎖)의 Cas9 효소(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9 효소)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 각각의 RNP 복합체는 SEQ ID NO:1의 Cas9 효소일 수 있는 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9 효소를 포함할 수 있다.
다른 실시형태에서, 2가지 RNP 복합체는 상이한 양의 Cas9 효소를 함유할 수 있다. 일부 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 β2M 유전자를 표적화하는 RNP 복합체에 비하여 더 많은 양의 Cas9 효소를 포함할 수 있다. 대안적으로, β2M 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체에 비하여 더 많은 양의 Cas9 효소를 포함할 수 있다.
2가지 RNP 복합체는 동일한 양의 gRNA(하나는 TRAC를 표적화하고, 다른 하나는 β2M을 표적화함)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 2가지 RNP 복합체는 상이한 양의 gRNA를 포함할 수 있다. 예를 들어, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.035 ㎎/㎖ 내지 약 0.8 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 50 ㎍/㎖ 내지 약 80 ㎍/㎖의 범위일 수 있다. 구체적인 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.08 ㎎/㎖이다. 대안적으로 또는 추가적으로, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.075 ㎎/㎖ 내지 약 0.3 ㎎/㎖, 예를 들어, 약 0.1 ㎎/㎖ 내지 약 0.3 ㎎/㎖의 범위일 수 있다. 구체적인 예에서, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA의 양은 약 0.2 ㎎/㎖이다.
구체적인 예에서, TRAC 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9) 및 약 0.08 ㎎/㎖의 TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA(예를 들어, TA-1의 gRNA)를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, β2M 유전자를 표적화하는 RNP 복합체는 약 0.15 ㎎/㎖의 Cas9(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9) 및 약 0.2 ㎎/㎖의 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA(예를 들어, B2M-1의 gRNA)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 2가지 RNP가 전기천공법을 통해 순차적으로, 즉, 2개의 전기천공법 이벤트를 통해 활성화된 T 세포 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 2가지 RNP는 활성화된 T 세포 내로 동시에, 즉 1개의 전기천공법 이벤트를 통해 도입될 수 있다. 이 경우에, 2가지 RNP를 조합하여, 전기천공법 이벤트 이전에 혼합물을 형성할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 RNP는 RNP(들)를 적합한 양의 활성화된 T 세포와 혼합함으로써 활성화된 T 세포 내로 도입될 수 있으며, 이에 따라 형성된 혼합물은 세포 내로의 RNP의 전달을 허용하기에 적합한 조건 하에서 전기천공법으로 처리된다. 일부 예에서, 활성화된 T 세포의 적합한 양은 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 300x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 단계를 위한 T 세포의 적합한 양은 약 200x106개 세포/㎖ 내지 약 300x106개 세포/㎖의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 100x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 200x106개 세포/㎖일 수 있다. 일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 농도는 약 300x106개 세포/㎖일 수 있다.
일부 실시형태에서, 활성화된 T 세포의 적합한 양은 약 1x108개 내지 약 1x1010개의 세포, 예를 들어, 약 5x108개 내지 약 8x109개의 세포, 약 1x109개 내지 약 5x109개의 세포 또는 약 1x109개 내지 약 3x109개의 세포의 범위일 수 있다.
전기천공법에 사용하기 위한 T 세포는 사용되는 전기천공법 기기에 따라, 다중 셀 카세트(multiple cell cassette) 내에 배치될 수 있다. 적합한 전기천공법 기기는 당업자에게 공지되어 있으며, Lonza Nucleofector, Maxcyte GT 및 MaxCyte GTx를 포함하는 정적 및 유동 전기천공기를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 다중 셀 카세트가 전기천공법 방법에서 사용될 수 있다. 더욱 상세한 사항은 하기 실시예 10에 제공된다.
구체적인 예에서, 총 약 0.3 ㎎/㎖의 Cas9 효소(예를 들어, SEQ ID NO:1의 Cas9 효소), 약 0.08 ㎎/㎖의 TA-1의 gRNA 및 약 0.2 ㎎/㎖의 B2M-1의 gRNA를 포함하는 상기 개시된 2가지 RNP를 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 300x106개 세포/㎖(예를 들어, 약 300x106개 세포/㎖)의 양으로 활성화된 T 세포와 혼합할 수 있다. 이어서, 혼합물은 T 세포 내로의 RNP의 전달을 위하여 전기천공법으로 처리된다.
전기천공법 후에, 세포를 신선한 배지 또는 전기천공법 완충제 중에서 회복에 적합한 기간 동안 배양할 수 있다. 유전자 편집 효율을 일상적인 실시에 따라 수행할 수 있다. 이에 따라 생성된 유전학적으로 편집된 T 세포는 CAR 발현을 위해 구성된 핵산의 전달을 위하여 바이러스 벡터 형질도입으로 처리될 수 있다.
(iv) T 세포 형질도입
TRAC 및 β2M 유전자가 낙 아웃된 유전학적으로 편집된 T 세포를 바이러스 벡터, 예컨대 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로의 형질도입으로 처리하여, CAR을 발현하는 T 세포의 집단을 생성할 수 있다.
키메라 항원 수용체(CAR)
키메라 항원 수용체(CAR)는 원하지 않는 세포, 예를 들어, 암 세포와 같은 이환된 세포에 의해 발현되는 항원을 인식하고 이에 결합하도록 조작된 인공 면역 세포 수용체를 지칭한다. CAR 폴리펩티드를 발현하는 T 세포는 CAR T 세포로 지칭된다. CAR은 T-세포 특이성 및 반응성을 비-MHC-제한된 방식으로 선택된 표적에 대하여 재유도하는 능력을 갖는다. 비-MHC-제한된 항원 인식은 항원 가공과 관계없이 항원을 인식하여, 그에 의해 주요 종양 회피 메커니즘을 우회하는 능력을 CAR-T 세포에 제공한다. 더욱이, T-세포에서 발현되는 경우, CAR은 유리하게는 내인성 T-세포 수용체(TCR) 알파 및 베타 사슬과 이량체화하지 않는다.
다양한 세대의 CAR이 존재하며, 이의 각각은 상이한 성분을 함유한다. 제1 세대 CAR은 항체-유래 scFv를 힌지 및 막횡단 도메인을 통하여 T-세포 수용체의 CD3제타(ζ 또는 z) 세포내 신호전달 도메인에 연결시킨다. 제2 세대 CAR은 동시자극 신호를 제공하기 위해 추가의 동시-자극 도메인, 예를 들어, CD28, 4-1BB(41BB) 또는 ICOS를 혼입한다. 제3-세대 CAR은 TCR CD3ζ 쇄와 융합된 2개의 동시자극 도메인(예를 들어, CD27, CD28, 4-1BB, ICOS, 또는 OX40의 조합)을 함유한다(문헌[Maude et al, Blood. 2015; 125(26):4017-4023]; 문헌[Kakarla and Gottschalk, Cancer J. 2014; 20(2):151-155]). 임의의 다양한 세대의 CAR 구축물이 본 개시의 범위 내에 있다.
일반적으로, CAR은 표적 항원을 인식하는 세포외 도메인(예를 들어, 항체의 단일-쇄 가변 단편(scFv) 또는 다른 항체 단편) 및 T-세포 수용체(TCR) 복합체(예를 들어, CD3ζ)의 신호전달 도메인 및 대부분의 경우에 동시-자극 도메인을 포함하는 세포내 도메인을 포함하는 융합 폴리펩티드이다(문헌[Enblad et al, Human Gene Therapy. 2015; 26(8):498-505]). CAR 구축물은 세포외 도메인과 세포내 도메인 사이에 힌지 및 막횡단 도메인, 뿐만 아니라 표면 발현을 위한 N-말단에서의 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 신호 펩티드의 예는 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP(SEQ ID NO: 44) 및 MALPVTALLLPLALLLHAARP(SEQ ID NO: 75)를 포함한다. 다른 신호 펩티드가 사용될 수 있다.
(a) 항원 결합 세포외 도메인
항원-결합 세포외 도메인은 CAR이 세포 표면에서 발현될 때 세포외액에 노출되는 CAR 폴리펩티드의 영역이다. 일부 예에서, 신호 펩티드는 세포 표면 발현을 용이하게 하기 위해 N-말단에 위치할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 단일-쇄 가변 단편(scFv, 항체 중쇄 가변 영역(VH) 및 항체 경쇄 가변 영역(VL)(어느 한 배향)을 포함할 수 있음)일 수 있다. 일부 예에서, VH 및 VL 단편은 펩티드 링커를 통해 연결될 수 있다. 링커는, 일부 실시형태에서, 유연성을 위한 글리신 및 세린의 스트레치뿐만 아니라, 부가되는 가용성을 위한 글루탐산염 및 리신의 스트레치를 갖는 친수성 잔기를 포함한다. scFv 단편은 scFv 단편이 유래된 부모 항체의 항원-결합 특이성을 보유한다. 일부 실시형태에서, scFv는 인간화된 VH 및/또는 VL 도메인을 포함할 수 있다. 다른 실시형태에서, scFv의 VH 및/또는 VL 도메인은 완전 인간이다.
항원-결합 세포외 도메인은 관심 표적 항원, 예를 들어, 병리학적 항원, 예컨대 종양 항원에 특이적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 일반적으로 비종양 세포에서보다 종양 세포에서 더 높은 수준으로 발현되는 면역원성 분자, 예컨대 단백질을 언급하는 "종양 연관 항원"이고, 비종양 세포에서 이것은 전혀 발현되지 않거나, 낮은 수준으로만 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 종양 보유 숙주의 면역계에 의해 인식되는 종양 연관 구조는 종양 연관 항원으로 지칭된다. 일부 실시형태에서, 종양 연관 항원은 이것이 대부분의 유형의 종양에 의해 광범위하게 발현되는 경우, 공통 종양 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 연관 항원은 분화 항원, 돌연변이 항원, 과발현된 세포 항원, 또는 바이러스 항원이다. 일부 실시형태에서, 종양 항원은 종양 세포에 고유한 단백질과 같은 면역원성 분자로 언급되는 "종양 특이적 항원" 또는 "TSA"이다. 종양 특이적 항원은 배타적으로 종양 세포에서, 예를 들어, 특정 유형의 종양 세포에서 발현된다.
일부 예에서, 본원에 개시된 CAR 구축물은 CD19에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR 구축물은 BCMA에 결합할 수 있는 scFv 세포외 도메인을 포함한다. 항-CD19 CAR 및 항-BCMA CAR의 예는 하기 실시예에 제공된다.
(b) 막횡단 도메인
본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 막을 가로지르는 소수성 알파 나선일 수 있는 막횡단 도메인을 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 "막횡단 도메인"은 세포막, 바람직하게는 진핵 세포막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 막횡단 도메인은 이를 함유하는 CAR의 안정성을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에서 제공된 바와 같은 CAR의 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인일 수 있다. 다른 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD28 막횡단 도메인일 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, 막횡단 도메인은 CD8 및 CD28 막횡단 도메인의 키메라이다. 다른 막횡단 도메인은 본원에 제공된 바와 같이 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 막횡단 도메인은 하기의 서열을 함유하는 CD8a 막횡단 도메인이다:
Figure pct00001
다른 막횡단 도메인도 또한 사용될 수 있다.
(c) 힌지 도메인
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CAR의 세포외 도메인(항원 결합 도메인 포함)과 막횡단 도메인 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치할 수 있다. 힌지 도메인은 폴리펩티드 쇄에서 막횡단 도메인을 세포외 도메인 및/또는 세포질 도메인에 연결시키는 기능을 하는 임의의 올리고펩티드 또는 폴리펩티드일 수 있다. 힌지 도메인은 CAR, 또는 이의 도메인에 유연성을 제공하도록, 또는 CAR, 또는 이의 도메인의 입체 장애를 방지하도록 기능을 할 수 있다.
일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 최대 300개의 아미노산(예를 들어, 10개 내지 100개의 아미노산, 또는 5개 내지 20개의 아미노산)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 힌지 도메인(들)은 CAR의 다른 영역에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 힌지 도메인은 CD8 힌지 도메인일 수 있다. 다른 힌지 도메인이 사용될 수 있다.
(d) 세포내 신호전달 도메인
임의의 CAR 구축물은 수용체의 기능적 말단인 하나 이상의 세포내 신호전달 도메인(예를 들어, CD3ζ, 및 선택적으로 하나 이상의 동시-자극 도메인)을 함유한다. 항원 인식 후에, 수용체는 클러스터링되고, 신호는 세포로 전달된다.
CD3ζ는 T 세포 수용체 복합체의 세포질 신호전달 도메인이다. CD3ζ는 세 개(3)의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)를 함유하며, 이는 T 세포가 동족 항원과 결합된 후 활성화 신호를 T 세포로 전달한다. 많은 경우에, CD3ζ는 완전히 적격인 활성화 신호가 아니라 일차 T 세포 활성화 신호를 제공하고, 이는 동시-자극 신호전달을 필요로 한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 CAR 폴리펩티드는 하나 이상의 동시-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, CD28 및/또는 4-1BB의 동시-자극 도메인은 CD3ζ에 의해 매개되는 일차 신호전달과 함께 완전한 증식/생존 신호를 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 CAR은 CD28 동시-자극 분자를 포함한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 CAR은 4-1BB 동시-자극 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 CD28 동시-자극 도메인을 포함한다. 다른 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인 및 4-1BB 동시-자극 도메인을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CAR은 CD3ζ 신호전달 도메인, CD28 동시-자극 도메인 및 4-1BB 동시-자극 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 방법은, 예를 들어, 당업계에 공지되거나 본원에 개시된 CAR을 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포를 생성하는 데 사용될 수 있는 1가지 초과의 적합한 CAR을 포함하는 것을 이해해야 한다. 예는, 예를 들어, 제WO 2019/097305A2호로 공개된 2018년 5월 11일에 출원된 제PCT/IB2018/001619호에서 찾아볼 수 있으며, 이의 관련 개시는 본원에서 언급되는 목적 및 주제에 대하여 본원에 참조로 포함된다. 또 다른 예에서, CAR은 CD19("CD19 CAR" 또는 "항-CD19 CAR"로도 알려져 있음)에 결합한다. CD19에 결합하는 예시적인 CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 37에 제공된다(하기 실시예 7, 표 11 참조). 또 다른 예에서, CAR은 BCMA("BCMA CAR" 또는 "항-BCMA CAR"로도 알려져 있음)에 결합한다. BCMA에 결합하는 예시적인 CAR의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 61에 제공된다(하기 실시예 8, 표 16 및 표 17 참조).
T 세포로의 CAR 구축물의 전달을 위한 AAV 벡터
CAR 작제물을 인코딩하는 핵산은 아데노-연관 바이러스(AAV)를 사용하여 세포로 전달될 수 있다. AAV는 숙주 게놈에 부위 특이적으로 통합되어 CAR과 같은 전이유전자를 전달할 수 있는 작은 바이러스이다. 역위 말단 반복부(ITR)는 AAV 게놈 및/또는 관심 전이유전자에 측접하여 존재하고, 복제 원점으로서 작용한다. 또한 AAV 게놈에는, 전사될 때 표적 세포로의 전달을 위해 AAV 게놈을 캡슐화하는 캡시드를 형성하는 rep 및 cap 단백질이 존재한다. 이러한 캡시드의 표면 수용체는 AAV 혈청형을 부여하며, 이는 캡시드가 어느 표적 기관에 주로 결합할지를 결정하여 AAV에 의해 가장 효율적으로 감염될 세포를 결정한다. 현재 12개의 인간 AAV 혈청형이 알려져 있다. 일부 실시형태에서, CAR-코딩 핵산을 전달하는 데 사용되는 AAV는 AAV 혈청형 6(AAV6)이다.
아데노-연관 바이러스는 여러 이유로 유전자 요법에 가장 흔히 사용되는 바이러스 중 하나이다. 첫째, AAV는 인간을 비롯한 포유동물로의 투여 시 면역 반응을 유발하지 않는다. 둘째, AAV는 특히 적절한 AAV 혈청형 선택을 고려할 때, 표적 세포로 효과적으로 전달된다. 마지막으로, AAV는 게놈이 통합 없이 숙주 세포에서 지속할 수 있으므로 분열 세포와 비분열 세포 둘 모두를 감염시킬 수 있는 능력을 갖는다. 이러한 특성으로 인해 AAV는 유전자 요법에 이상적인 후보물질이다.
CAR을 인코딩하는 핵산은 숙주 T 세포에서 관심 게놈 부위로 삽입되도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 게놈 부위는 세이프 하버(safe harbor) 유전자좌에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR을 인코딩하는 핵산(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 의해 운반될 수 있는 공여자 주형을 통해)은 유전학적으로 조작된 T 세포에서 TRAC 유전자를 파괴하고 CAR 폴리펩티드를 발현하도록 TRAC 유전자 내의 위치에 삽입될 수 있도록 설계될 수 있다. TRAC의 파괴는 내인성 TCR의 기능 상실로 이어진다. 예를 들어, TRAC 유전자의 파괴는 본원에 기재된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다. TRAC 유전자 및 표적 영역에 특이적인 임의의 gRNA, 예를 들어, 본원에 개시된 것들이 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
일부 예에서, TRAC 유전자의 게놈 결실 및 CAR 코딩 세그먼트로의 치환은 상동성 지정 수선 또는 HDR에 의해 생성될 수 있다(예를 들어, 바이러스 벡터, 예컨대, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 일부일 수 있는 공여자 주형 사용). 일부 예에서, gRNA 표적 서열 또는 이의 부분은 결실된다(예를 들어, SEQ ID NO: 17). 일부 실시형태에서, TRAC 유전자에서의 파괴는 본원에 개시된 것들과 같은 엔도뉴클레아제 및 하나 이상의 TRAC 게놈 영역을 표적화하여 CAR 코딩 세그먼트를 TRAC 유전자로 삽입하는 하나 이상의 gRNA로 생성될 수 있다.
본원에 개시된 바와 같은 공여자 주형은 CAR에 대한 코딩 서열을 함유할 수 있다. 일부 예에서, CAR-코딩 서열은, 예를 들어, CRISPR-Cas9 유전자 편집 기술을 이용하여 TRAC 유전자에서 관심 게놈 위치에 효율적인 HDR이 가능하도록 두 개의 상동성 영역이 측접될 수 있다. 이 경우에, 표적 유전자좌에서 DNA의 두 가닥 모두 표적 유전자좌에 특이적인 gRNA에 의해 가이드된 CRISPR Cas9 효소로 절단될 수 있다. 이후, HDR이 발생하여 이중-가닥 파단(DSB)을 수선하고 CAR을 코딩하는 공여자 DNA를 삽입한다. 이것이 정확하게 발생하기 위해, 공여자 서열은 TRAC 유전자와 같은 표적 유전자에서 DSB 부위를 둘러싸는 서열에 상보적인 측접 잔기(이하, "상동성 아암")로 설계된다. 이들 상동성 아암은 DSB 복구를 위한 주형으로서 작용하여, 본질적으로 오류가 없는 메커니즘의 HDR을 가능하게 한다. 상동성 지정 수선(HDR)의 속도는 돌연변이와 절단 부위 사이의 거리의 함수이므로, 중복되거나 가까운 표적 부위를 선택하는 것이 중요하다. 주형은 상동성 영역이 측접된 추가 서열을 포함할 수 있거나, 게놈 서열과 상이한 서열을 함유할 수 있으므로, 서열 편집이 가능하다.
대안적으로, 공여자 주형은 DNA의 표적화된 위치에 대해 상동성 영역을 갖지 않을 수 있으며, 표적 부위에서의 절단 후 NHEJ-의존성 말단 연결에 의해 통합될 수 있다.
공여자 주형은 단일-가닥 및/또는 이중-가닥의 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 선형 또는 원형 형태로 세포에 도입될 수 있다. 선형 형태로 도입되는 경우, 공여자 서열의 말단은 당업자에게 알려진 방법에 의해 (예를 들어, 핵외 분해로부터) 보호될 수 있다. 예를 들어, 선형 분자의 3' 말단에 하나 이상의 디데옥시뉴클레오티드 잔기가 추가되고/되거나, 한쪽 또는 양쪽 말단에 자가-상보성 올리고뉴클레오티드가 라이게이션된다. 예를 들어, 문헌[Chang et al, (1987) Proc Natl Acad Sci USA 84:4959-4963]; 문헌[Nehls et al, (1996) Science 272:886-889]을 참조한다. 외인성 폴리뉴클레오티드를 분해로부터 보호하는 추가의 방법은 말단 아미노기(들)의 추가 및 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 O-메틸 리보스 또는 데옥시리보스 잔기와 같은 변형된 뉴클레오티드간 연결기의 사용을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
공여자 주형은, 예를 들어, 복제 원점, 프로모터, 및 항생제 내성을 인코딩하는 유전자와 같은 추가 서열을 갖는 벡터 분자의 일부로서 세포에 도입될 수 있다. 또한, 공여자 주형은 네이키드 핵산으로서 도입되거나, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체화된 핵산으로서 도입되거나, 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 및 인테그라제 결함 렌티바이러스(IDLV))에 의해 전달될 수 있다.
공여자 주형은, 일부 실시형태에서, 내인성 프로모터 부근(예를 들어, 하류 또는 상류)의 부위에 삽입될 수 있고, 이에 따라 이의 발현이 내인성 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 다른 실시형태에서, 공여자 주형은 CAR 유전자의 발현을 제어하기 위해 외인성 프로모터 및/또는 인핸서, 예를 들어 구성성 프로모터, 유도성 프로모터, 또는 조직 특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 외인성 프로모터는 EF1α 프로모터이다. 다른 프로모터가 사용될 수 있다.
게다가, 외인성 서열은 또한 전사 또는 번역 조절 서열, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 인슐레이터, 내부 리보솜 진입 부위, 2A 펩티드를 인코딩하는 서열, 및/또는 폴리아데닐화 신호를 포함할 수도 있다.
T 세포 형질도입
본원에 개시된 CAR 구축물(예를 들어, 항-CD19 CAR 또는 항-BCMA CAR)을 인코딩하는 적합한 양의 임의의 바이러스 벡터, 예컨대 AAV 벡터를 T 세포 내로의 바이러스 벡터의 유입을 허용하기에 적합한 기간 동안 적합한 양의 T 세포, 예컨대 본원에 개시된 유전학적으로 편집된 T 세포와 함께 인큐베이션시킬 수 있다. 예를 들어, 형질도입 방법은 CAR+ T 세포의 백분율을 증가시키는 최적화된 감염 다중도(MOI)의 범위의 이용을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000 내지 약 150,000, 예컨대 약 10,000 내지 약 80,000의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 사용되는 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000 내지 약 150,000, 약 5,000 내지 약 100,000, 약 10,000 내지 약 100,000, 약 10,000 내지 약 90,000, 약 10,000 내지 약 80,000, 약 10,000 내지 약 70,000, 약 10,000 내지 약 60,000, 약 10,000 내지 약 50,000, 약 10,000 내지 약 40,000, 약 10,000 내지 약 30,000, 약 10,000 내지 약 20,000, 약 20,000 내지 약 80,000, 약 30,000 내지 약 80,000, 약 40,000 내지 약 80,000, 약 50,000 내지 약 80,000, 약 60,000 내지 약 80,000, 또는 약 70,000 내지 약 80,000일 수 있다. 일부 예에서, 형질도입 방법에서 사용되는 AAV 벡터의 MOI는 약 1,000, 약 2,500, 약 5,000, 약 10,000, 약 15,000, 약 20,000, 약 25,000, 약 30,000, 약 31,000, 약 32,000, 약 33,000, 약 34000, 약 35,000, 약 40,000, 약 50,000, 약 60,000, 약 70,000, 약 80,000, 약 90,000, 약 100,000, 약 110,000, 약 120,000, 약 130,000, 약 140,000 또는 약 150,000일 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 항-CD19 CAR(예를 들어, 하기 실시예 7에 개시된 바와 같음)을 인코딩하며, 형질도입 방법에서 사용하기 위한 이러한 AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다. 다른 실시형태에서, AAV 벡터는 항-BCMA CAR(예를 들어, 하기 실시예 8에 개시된 바와 같음)을 인코딩하며, 형질도입 방법에서 사용하기 위한 이러한 AAV 벡터의 MOI는 약 20,000이다.
형질도입 후에, T 세포는 적합한 세포 배양 배지에서 회복에 적합한 기간 동안 배양될 수 있다. TRAC 및 B2M 유전자가 낙아웃된, CAR을 발현하는 유전학적으로 조작된 T 세포는 하기 개시된 바와 같이 시험관 내에서 증량될 수 있다.
(v) T 세포 증량
본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 임상적으로 유의미한 규모로 생성하기에 적합한 조건 하에서 시험관 내에서 증량될 수 있다. 이 증량 단계에서 사용되는 세포 배양 조건은 적어도 부분적으로, 더 짧은 인큐베이션 기간에 더 높은 최종 세포 밀도(이에 의한 제조 비용의 감소) 및 세포 요법에 사용하기 위한 더 강력한 T 세포를 달성하고자 한다. 효력은 다양한 T 세포 기능, 예를 들어, 증식, 표적 세포 사멸, 사이토카인 생성, 활성화, 이동 및 이의 조합에 의해 나타날 수 있다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 세포 배양 용기에서 T 세포의 집단(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포)을 세포 용기 내에 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 세포 용기에 약 300,000개 세포/㎠ 내지 약 500,000개 세포/㎠로 씨딩될 수 있다. 일부 양태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에 적어도 약 60,000개 세포/㎠, 적어도 약 62,500개 세포/㎠ 또는 적어도 약 83,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행된다. 일부 양태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에 적어도 약 150,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 250,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 300,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 400,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 500,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 600,000개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩함으로써 수행된다. 일부 양태에서, 씨딩 밀도는 약 250,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 씨딩 밀도는 약 500,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 씨딩 밀도는 약 600,000개 세포/㎠이다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 T 세포의 집단(예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 유전학적으로 조작된 T 세포)을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 6일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행될 수 있다. 일부 예에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠, 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠, 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 4x105개 세포/㎠, 2x105개 세포/㎠ 내지 약 3x105개 세포/㎠, 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠, 또는 4x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 6일 내지 약 12일, 약 6일 내지 약 11일, 약 6일 내지 약 10일, 약 6일 내지 약 9일, 약 6일 내지 약 8일, 약 6일 내지 약 7일, 약 7일 내지 약 12일, 약 7일 내지 약 11일, 약 7일 내지 약 10일, 약 7일 내지 약 9일, 약 7일 내지 약 8일, 약 8일 내지 약 12일, 약 8일 내지 약 9일, 약 9일 내지 약 12일, 약 10일 내지 약 12일, 또는 약 11일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행된다. 일부 실시형태에서, T 세포 증량은 T 세포의 집단을 세포 배양 용기에서 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 씨딩하고, 세포를 약 7일 내지 약 9일 동안 배양함으로써 수행된다.
일부 실시형태에서, T 세포 증량 단계는 세포 배양물을 리플레이팅하는 것(즉, 세포 배양물을 새로운 배양 용기 내로 분할하는 것)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물을 추가의 증량을 위하여 편집 후 제3일, 제4일, 제5일, 제6일 또는 7일에 1:4 비(4개의 새로운 용기 내로 1개의 용기 분할)로 리플레이팅할 수 있다.
T 세포 증량을 배지 교체 없이 T 세포의 증량을 가능하게 하는 정적 배양 용기에서 수행할 수 있다. 예를 들어, T 세포를 정적 배양 용기에서 배지 교체 없이 약 7일 내지 약 12일, 또는 약 7일 내지 약 9일 동안 증량시킬 수 있다.
(vi) TCRαβ + T 세포의 고갈
일부 실시형태에서, TCRαβ+ T 세포를 본원에 개시된 증량된 T 세포 집단으로부터 고갈시켜, 세포 요법에서 사용하기 위한 동종이계 T 세포의 집단을 생성할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "TCRαβ+ T 세포 고갈"은 TCRαβ+ T 세포를 포함하는 세포의 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 고갈시키는 것을 나타낸다. TCRαβ+ T 세포 고갈 후에, 생성된 T 세포 집단은 상당한 낮은 수준의 TCRαβ+ T 세포(예를 들어, 전체 세포 집단 중 3% 미만, 또는 전체 세포 집단 중 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만)를 가질 수 있다. 일부 예에서, 생성된 T 세포 집단에는 TCRαβ+ T 세포가 없을 수 있으며, 즉, TCRαβ+ T 세포의 존재는 통상적인 방법을 통해(예를 들어, TCRαβ+에 결합하는 항체를 사용하는 면역 검정에서 또는 유세포측정에 의해) 검출 가능하지 않다.
TCRαβ+ T 세포 고갈은 TCRαβ+ T 세포를 인식하는 작용제를 사용하여 TCRαβ+ T 세포를 포획함으로써, 이들을 TCRαβ+가 결여된 것들로부터 분리하여, 예를 들어, 자성 세포 분리를 수행함으로써 수행될 수 있다. 이러한 방법은 상기 개시된 증량된 T 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정화된 비드와 접촉시키고, 결합되지 않은 세포를 수집함으로써 수행될 수 있다. 이에 따라 수집된 비결합 세포(TCRαβ+가 결여된 것들)를 배양하여, 사전에 세포 회복을 가능하게 할 수 있으며, 예를 들어, 비결합 세포를 하룻밤 배양하여, 세포가 회복되게 할 수 있다.
(vii) 유전학적으로 조작된 T 세포의 수거
이어서, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포를 당업계에 공지된 통상적인 방법을 사용하여 치료적 이용을 위해 수거할 수 있다. 예를 들어, 유전학적으로 조작된 T 세포를 수거하는 것은 TCRαβ+가 고갈된 세포를 수집하는 것을 포함할 수 있다. 수거된 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 약물 물질로서 사용될 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, "약물 물질"은 환자에 투여될 수 있는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 나타낸다. 약물 물질을 치료적 이용을 위하여 제형화할 수 있으며, 예를 들어, 보관 배지(예를 들어, CryoStor CS5)에서 제형화하고 장래의 이용을 위해 동결보존할 수 있다.
약물 물질을 하나 이상의 오염물질, 예를 들어, 마이코플라스마, 인간 바이러스(예를 들어, HIV, HBV, HCV, CMV) 및 박테리아 내독소에 대하여 시험할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 약물 물질을 무균성에 대하여 시험할 수 있다. 오염물질 부재 약물 물질을 개별 환자 용량으로 분취할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 오염물질 부재 약물 물질을 치료적 이용을 위하여 보관할 수 있다.
따라서, 본 개시의 양태는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단(약물 물질)을 제공한다. 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 파괴된 TRAC 유전자, 파괴된 β2M 유전자 및 CAR을 인코딩하는 핵산, 예를 들어, 본원에 기재된 것들을 갖는다. 일부 실시형태에서, CAR은 병리학적 세포 상에 발현되는 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 CD19에 결합한다. 일부 실시형태에서, CAR은 BCMA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 CAR을 발현한다. 다른 양태에서, CAR을 발현하는 이들 세포는 추가로 검출 가능한 수준의 표면 TCR 및/또는 검출 가능한 수준의 표면 β2M을 발현하지 않는다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%가 CAR을 발현하는 경우, 해당 세포의 집단은 약 1.0% 이하, 약 0.5% 이하, 약 0.4% 이하, 또는 약 0.15% 이하의 표면 TCR을 발현하는 T 세포(예를 들어, TCRα/β+ 세포)를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단의 적어도 30%가 CAR을 발현하는 경우, 해당 세포의 집단은 약 50% 이하, 약 40% 이하 또는 약 30% 이하의 표면 β2M을 발현하는 T 세포를 포함한다.
또한, Cas9 효소, TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA, β2M 유전자를 표적화하는 gRNA, 및 CAR(예를 들어, CD19 CAR 또는 BCMA CAR)을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 AAV 벡터를 포함하는 본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단이 본 개시의 범주 이내이다.
II. 치료적 응용
본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단은 치료적 목적, 예를 들어, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단에 의해 발현되는 CAR 구축물에 의해 표적화된 암의 치료를 위하여 대상체에 투여될 수 있다.
대상체는 진단, 치료 또는 요법이 요망되는 임의의 대상체일 수 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 기재된 방법에 의해 생성되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단을 사용하여 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예는 다발성 골수종, 백혈병(예를 들어, T 세포 백혈병, B 세포 급성 림프아구성 백혈병(B-ALL), 및/또는 만성 림프구성 백혈병(C-CLL)), 림프종(예를 들어, B 세포 비호지킨 림프종(B-NHL), 호지킨 림프종, 및/또는 T 세포 림프종), 및/또는 투명 세포 신장 세포 암종(ccRCC), 췌장암, 위암, 난소암, 자궁경부암, 유방암, 신장암, 갑상선암, 비인두암, 비소세포 폐암(NSCLC), 교모세포종, 및/또는 흑색종을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
투여는 원하는 효과(들)가 생성될 수 있도록 원하는 부위, 예컨대 종양 부위에 유전학적으로 조작된 T 세포 집단이 적어도 부분적으로 국소화되게 하는 방법 또는 경로에 의한 대상체 내로의 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 배치(예를 들어, 이식)를 포함할 수 있다. 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 이식된 세포 또는 세포의 구성성분 중 적어도 일부가 생존 가능하게 남아 있는 대상체 내의 원하는 위치로의 전달을 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 대상체로의 투여 후의 세포의 생존 가능 기간은 몇시간, 예를 들어, 24시간 내지 며칠만큼 짧을 수 있고, 몇년 또는 심지어 대상체의 수명만큼 길 수 있고, 즉, 장기간 생착일 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 일부 양태에서, 유효량의 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 전신 투여 경로, 예컨대 복강내 또는 정맥내 경로를 통해 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 전신으로 투여되며, 이는 표적 부위, 조직 또는 기관으로 직접적으로 투여하는 것을 제외하고, 대신에, 이것이 대상체의 순환계에 유입됨에 따라, 대사 및 기타 유사 과정을 겪도록 세포의 집단을 투여하는 것을 나타낸다. 적합한 투여 방식은 주사, 주입, 설치 또는 섭취를 포함한다. 주사는 제한 없이 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 심실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지경, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척주관내, 뇌척수액내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 경로는 정맥내이다.
유효량은 의학적 질환(예를 들어, 암)의 적어도 하나 이상의 징후 또는 증상을 예방하거나 완화하는 데 필요한 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 양을 지칭하고, 원하는 효과를 제공하기에 충분한, 예를 들어, 의학적 질환을 갖는 대상체를 치료하기에 충분한 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 양과 관련된다. 유효량은 또한, 질병의 증상의 발생을 예방하거나 지연시키거나, 질병의 증상의 경과를 변경하거나(예를 들어, 비제한적으로, 질병의 증상의 진행을 늦춤), 질병의 증상을 역전시키기에 충분한 양을 포함한다. 임의의 주어진 경우에, 적절한 유효량은 일상적인 실험을 이용하여 당업자에 의해 결정될 수 있는 것으로 이해된다.
유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 유효량은 적어도 102개의 세포, 적어도 5x102개의 세포, 적어도 103개의 세포, 적어도 5x103개의 세포, 적어도 104개의 세포, 적어도 5x104개의 세포, 적어도 105개의 세포, 적어도 2x105개의 세포, 적어도 3x105개의 세포, 적어도 4x105개의 세포, 적어도 5x105개의 세포, 적어도 6x105개의 세포, 적어도 7x105개의 세포, 적어도 8x105개의 세포, 적어도 9x105개의 세포, 적어도 1x106개의 세포, 적어도 2x106개의 세포, 적어도 3x106개의 세포, 적어도 4x106개의 세포, 적어도 5x106개의 세포, 적어도 6x106개의 세포, 적어도 7x106개의 세포, 적어도 8x106개의 세포, 적어도 9x106개의 세포, 또는 이의 배수를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 유전학적으로 조작된 T 세포 집단을 사용한 치료의 효능은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료는 징후 또는 증상 중 어느 하나 또는 전부, 일례로서 기능 표적의 수준이 유리한 방식으로 변경(예를 들어, 적어도 10% 증가)되거나, 질병(예를 들어, 암)의 다른 임상적으로 허용되는 증상 또는 마커가 개선되거나 호전되는 경우, "유효한" 것으로 간주된다. 효능은 또한, 입원에 의해 평가되는 바와 같이 대상체가 악화되지 않거나 의료 개입이 필요하지 않은 것(예를 들어, 질병의 진행이 중단되거나 적어도 둔화됨)에 의해 측정될 수 있다. 이들 적응증을 측정하는 방법은 당업자에게 알려져 있고/있거나 본원에 기재되어 있다. 치료는 대상체에서의 질병의 임의의 치료를 포함하며, (1) 질병을 저해하는 것, 예를 들어 증상의 진행을 저지하거나 둔화시키는 것; 또는 (2) 질병을 완화시키는 것, 예를 들어 증상의 퇴행을 야기하는 것; 및 (3) 증상의 발생을 방지하거나 또는 이의 가능성을 낮추는 것을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같이 제조되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 또한 병용 요법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제조되는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단은 동일한 적응증을 치료하기 위하여 또는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 효능을 향상시키기 위하여 및/또는 유전학적으로 조작된 T 세포 집단의 부작용을 감소시키기 위하여 다른 치료제와 동시에 사용될 수 있다.
일반적인 기법
본 개시의 실시는 달리 나타내지 않는 한, 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학, 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌, 예컨대 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press]; 문헌[Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons]; 문헌[Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; 문헌[Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995)]; 문헌[DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985]; 문헌[Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984]; 문헌[Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986]; 문헌[Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986]; 및 문헌[B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 충분히 설명되어 있다.
추가 설명 없이, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 이의 가장 완전한 정도로 활용할 수 있는 것으로 사료된다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 어떤 식으로든 나머지 개시의 제한이 아니라 단지 예시적인 것으로 해석되어야 한다. 본원에 언급된 목적 또는 주제에 대하여 본원에 인용된 모든 간행물은 참조로 포함된다.
실시예
기재된 본 발명이 더욱 완전히 이해될 수 있도록, 하기의 실시예가 제시된다. 본 출원에 기재된 실시예는 본원에 제공되는 방법 및 조성물을 예시하기 위하여 제공되며, 어떠한 방식으로든 이들의 범주를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: T 세포 농축을 위한 최적화된 조건의 확인.
본 실시예에는 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 류코팩으로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 농축시키기 위한, T 세포 농축을 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다.
방법
류코팩 및 완충제 제조
인간 류코팩을 HemaCare 또는 Stem Express로부터 수집하고, T 세포 농축을 위해 처리하였다. PBS/EDTA 완충제(인산염 완충 염수, pH 7.2, 1 mM EDTA가 보충됨)에 0.5% 인간 혈청 알부민(HSA)을 보충하고, T 세포 선택 동안 처리, 프라이밍, 세척 및 용리를 위해 사용하였다.
류코팩 공여자를 하기에 대하여 스크리닝하였다:
· B형 간염 표면 항원(HBsAg EIA)
· C형 간염 바이러스 항체(항-HCV EIA)
· 인간 면역결핍 바이러스 항체(HIV 1/2 플러스(plus) O)
· 인간 T-림프친화 바이러스 항체(HTLV-I/II)
· HIV-1/HCV/HBV 핵산 시험
· WNV 핵산 시험
· 트리파노소마 크루지 항체(선택적 샤가스병 시험, 공여자마다 단일의 생애 시험)
· HIV/HBV/HCV
· CMV
상기 임의의 시험의 양성 결과를 보이는 공여자를 배제하였다. 본원에 개시된 실시예에서 사용되는 공여자의 인구통계 정보는 표 1에 나타나 있다.
Figure pct00002
Sysmex를 사용한 류코팩 혈액학 분석
들어오는 류코팩 유래의 샘플을 제조처의 설명에 따라 Sysmex XP300(Sysmex, 일련 번호: B0628)을 사용하여 혈액학 분석을 위하여 처리하였다. 백혈구(WBC) 계수를 사용하여, 자동화된 세포 처리 시스템 내에 로딩된 총 세포 질량을 계산하였다.
T 세포 농축
처리 완충제, 류코팩, CD4 마이크로비드 및 CD8 마이크로비드를 실행을 시작하기 전에 자동화된 세포 처리 시스템에 로딩하였다. 세포를 챔버에서 세척하고 표지하고, 분리를 위하여 자성 컬럼으로 지향시켰다. CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포획하고 처리 완충제에서 표적 백(bag) 내로 추가로 용리시켰다.
세포 계수 및 생존력
세포 계수 및 생존력 평가를 디폴트 프로파일을 사용하여 COUNTESS® II(Life Technologies, Cat: AMQAX1000)로 수행하였다. 세포(20 ㎕)를 버블(bubble)의 도입 없이 위 아래로 수회 피펫팅함으로써 트립판 블루(20 ㎕)와 혼합하였다. 세포/트립판 블루 혼합물(10 ㎕)을 COUNTESS® II 세포 계수 챔버 슬라이드 내에 로딩하였다.
유세포측정
약 1x106개의 전핵 세포를 실온(RT)에서 10분 동안 95 ㎕의 염색 완충제(0.5% 소 혈청 알부민(BSA)/DPBS)) 중 5 ㎕의 인간 TruStain FcX™를 사용하여 블로킹하였다. 세포를 4℃에서 30분 동안 Pacific blue-컨쥬게이트된 항-인간 CD45 항체(1:50), BV510-컨쥬게이트된 항-인간 CD3 항체(1:50), APC-Cy7-컨쥬게이트된 항-인간 CD4 항체(1:50), PE-Cy7-컨쥬게이트된 항-인간 CD8 항체(1:50), APC-컨쥬게이트된 항-인간 CD19 항체(1:50), FITC-컨쥬게이트된 항-인간 CD56 항체(1:50) 및 PE-컨쥬게이트된 항-인간 CD33 항체(1:50)와 추가로 인큐베이션시켰다. 이어서, 5 ㎕의 7-아미노-악티노마이신 D(7-AAD) 생존력 염색 용액을 함유하는 1 ㎖의 암모늄-클로라이드-칼륨(ACK) 용해 완충제를 각각의 샘플에 제공하였다. ACK 용해 완충제를 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후에, 세포를 NovoCyte-3000 유세포측정기를 사용하여 획득하였다.
결과
류코팩 샘플 내의 백혈구(WBC)
시험된 류코팩 내의 WBC는 8.14x109개 내지 21.36x109개 세포의 범위였으며, 림프구 개수는 5.77x109개 내지 17.32x109개의 범위였다.
CD4 및 CD8 농축 - 순도, 생존력, 세포 회수 및 수율
시험된 9개의 뱃치 중에, 4개를 프로그램 A로 평가하고, 5개를 프로그램 B로 평가하였다. 모든 뱃치는 90% 초과의 순도 및 90% 초과의 생존력을 갖는 T 세포를 제공하였다(표 2). 프로그램 A로부터의 세포 회수는 31%였던 한편, 프로그램 B로부터의 세포 회수는 55.69%였다.
Figure pct00003
종합하여, 이들 결과는 건강한 공여자(HD) 류코팩으로부터의 T 세포가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에 대하여 높은 순도(90% 초과) 및 높은 생존력(90% 초과)으로 농축되었음을 보여준다.
실시예 2: T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건의 확인.
본 실시예에는 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 사용한 T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다.
정적 배양 용기 내의 T 세포 활성화를 위한 최적화된 조건의 확인
요약하여, 건강한 공여자 류코팩으로부터의 동결보존된 T 세포를 해동시키고, 대조군으로서 T-플라스크 또는 정적 배양 용기에서 폴리머 나노매트릭스에 컨쥬게이트된 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제를 사용하여 48시간 동안 활성화시켰다. 세포 활성화 마커 CD25 및 CD69의 표면 발현을 모니터링함으로써, 그리고 세포 증식을 모니터링함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. 세포 씨딩 밀도, 배지 부피, 및 폴리머 나노매트릭스에 컨쥬게이트된 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제("CD3/CD28 효능제") 농도를 포함하는 정적 배양 용기에서의 활성화를 위한 다양한 T 세포 활성화 조건을 시험하였다(표 3). 세포 활성화 마커 CD25 및 CD69의 표면 발현을 모니터링함으로써, 그리고 세포 증식을 모니터링함으로써 T 세포 활성화를 평가하였다. T-플라스크에서의 T 세포 활성화를 양성 대조군(PC)으로 사용하였다(표 3).
Figure pct00004
도 1a에 나타낸 바와 같이, CD25 및 CD69를 발현하는 세포의 백분율은 시험된 조건 간에 유사하였다. 조건 3에서 약간 더 높은(약 10% 더 높은) CD69+ 세포 및 CD25+CD69+ 세포의 집단이 관찰되었다(도 1a).
그러나, 세포 증량 속도는 CD69의 발현 수준과 상관관계가 없었으며, 오히려, 이는 CD25의 평균 형광 세기(MFI)에 의해 측정되는 바와 같은 CD25의 발현 수준과 상관관계가 있었다(도 1b). 시험되는 조건 중에, 조건 7은 양성 대조군의 것과 비교하는 경우 CD25 MFI와 세포 증량 간에 가장 유사한 상관관계를 가졌다(도 1b). CD25 및 CD69는 T-세포 활성화 마커이며, 여기서, 조기 상향조절 및 후기 상향조절은 활성화 상태와 상관관계가 있다.
요약하여, 이들 결과는 표 3에서 조건 7이 정적 배양 용기에서 뛰어난 T 세포 활성화 효과를 야기하였음을 나타낸다(조건 7: 2.00x106개 세포/㎠; 2.00x106개 세포/㎖; 40 ㎕의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스/1x106개 세포; 및 1:12.5의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 대 배지 비).
소규모 제조 공정에서의 선택적인 T 세포 활성화 조건의 입증
다음으로, 확인된 T 세포 활성화 조건(조건 7: 2.00x106개 세포/㎠; 2.00x106개 세포/㎖; 40 ㎕의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스/1x106개 세포; 및 1:12.5의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 대 배지 비)을 소규모 제조 공정에서(정적 배양 용기에서) 시험하였으며, 활성화된 T 세포를 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현, T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역(TRAC) 낙-아웃 및/또는 베타-2-마이크로글로불린(β2M) 낙-아웃에 관한 이들의 유전자 편집 효능에 대하여 조사하였다. T-플라스크(플라스크) 내의 T 세포의 활성화 및 편집을 정적 세포 배양 용기(용기)에서의 것과 비교하였다. TRAC 및 β2M 전기천공된 T 세포(EP) 및 미처리 T 세포(UT)를 대조군으로서 사용하였다.
소규모 제조 공정
냉동바이얼(cryovial)을 액체 질소 보관으로부터 회수하고, 소량의 동결된 물질이 유지될 때까지 수조에서 해동시켰다. 이어서, 세포를 10X 부피의 완전 성장 배지(X-VIVO™ 15(Lonza), 5% 인간 AB 혈청, 100U/㎖ IL2, 100U/㎖ IL7)에 적가하고, 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리에 의해 펠렛화시켰다. 세포를 1x106개 세포/㎖의 농도로 재현탁화시키고, 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스-매개된 활성화로 처리하였으며, 이는 하류 변형을 개선시켰다. 요약하여, 단리된 T 세포를 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스에 공유적으로 부착된 재조합 CD3 및 CD28로 활성화시켰다. 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 비처리된 플라스크에서 1:25 비 또는 1x106개의 세포당 40 ㎕로 세포에 적용하였다. 세포를 48시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이터 내에서의 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스에서 2일 동안 유지하였다. 인큐베이션 후에, 세포를 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리한다. 이어서, 세포 펠렛을 완전 성장 배지에서 재현탁화시키고, 유전자 변형 이전에 1x106개 세포/㎖의 농도로 하룻밤 배양하였다.
재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 없이 완전 배지에서의 하룻밤 배양 후에, 총 세포 수 및 세포 생존력을 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기에서의 계수에 의해 정량화하였다. 이어서, 세포를 실온에서 10분 동안 300g에서 원심분리하였다. 세포 펠렛을 10 ㎖의 전기천공법 완충제 중에서 세척하고, 다시 원심분리하였다. 세포를 원심분리하는 동안, 리보핵단백질(RNP) 복합체를 제조하였다. 2가지 개별 RNP 복합체를 형성하였다. B2M sgRNA 및 Cas9를 각각 150 ㎍/㎖ 및 150 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 하나의 RNP를 형성하였다. TCR sgRNA 및 Cas9를 각각 150 ㎍/㎖ 및 150 ㎍/㎖의 농도로 함유하는 다른 RNP를 형성하였다. sgRNA 및 Cas9를 함유하는 RNP 복합체를 실온에서 10분 동안의 인큐베이션에 의해 형성하였다. Cas9(Cas9; SEQ ID NO: 1) 및 β2M 유전자를 표적화하는 gRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6)를 함유하는 하나의 RNP 복합체를 형성하였으며, Cas9(Cas9; SEQ ID NO: 1) 및 TCR 유전자를 표적화하는 gRNA(TA-1; SEQ ID NO: 2)를 함유하는 다른 RNP 복합체를 형성하였다. 원심분리 후에, 세포 펠렛을 전기천공법 완충제 중에 400x106개 세포/㎖의 농도로 재현탁화시켰다. 생성된 세포 현탁액을 사용하여, 300x106개 세포/㎖, 200x106개 세포/㎖, 150x106개 세포/㎖ 및 100x106개 세포/㎖의 최종 세포 농도를 갖는 추가의 희석액을 생성하였다. 개별 RNP 복합체를 조합하고, 전기천공법 큐벳 내에서 피펫팅하였다. 다양한 농도의 세포를 RNP 복합체에 첨가하고, 위 아래로 5회 피펫팅하였다.
세포를 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 전기천공시켰다. 일단 각각의 개별 큐벳을 전기천공시킨 후에, 세포 및 RNP 용액을 비-처리된 12-웰 플레이트 내로 분취하였으며, 각각의 웰은 500 ㎕의 X-VIVO™ 15 배지(인간 AB 혈청, IL2 및 IL7 부재)를 함유한다. 세포를 인큐베이터에서 20분 동안 휴지되게 하였다. 총 세포 수 및 세포 생존력을 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기 또는 NC-200에서의 계수에 의해 정량화하였다.
휴지 이후 총 세포 수에 기초하여, 세포를 원하는 농도에 도달하도록 X-VIVO™ 15(인간 AB 혈청, IL2 또는 IL7 부재)로 추가로 희석할 필요가 있을 수 있다. 형질도입을 수행하기 위하여 필요한 AAV의 부피를 계산하기 위하여 총 세포 수가 필요하다.
Figure pct00005
AAV 및 세포 현탁액을 혼합하고, 37℃ 및 5% CO2에서 1시간 동안 비-처리된 플라스크에서 인큐베이션되게 하였다. AAV를 포함하는 전체 부피를 100 ㎖의 완전 배지를 함유하는 정적 배양 용기에 첨가하였다. 정적 배양 용기를 3일 동안 인큐베이션시켜, 세포 증량을 가능하게 하였다.
전기천공법 후에, 정적 배양 용기의 각각의 웰을 100 ㎖의 완전 성장 배지로 채웠다. 유전자 변형된 세포를 완전 성장 배지에서 5x105개 세포/㎖ 내지 1x106개 세포/㎖의 농도로 씨딩하였다. IL2 또는 IL7을 100U/㎖의 최종 작업 농도로 3일 내지 4일마다 보충하였다. 총 세포 수를 트립판 블루의 첨가 및 COUNTESS® 세포계수기에서의 계수에 의해 3일 내지 4일마다 정량화하였다. 세포를 전기천공법 이후 9일 내지 12일 동안 배양 중에 유지하여, 30x106개 세포/㎖의 포화 농도에 기초하여 최대 총 세포 수를 달성하였다. 세포가 이 임계값에 도달하면, TCR 알파 또는 베타를 발현하는 임의의 남아 있는 비편집된 세포의 고갈을 수행하여, 이들 세포 불순물을 제거하였다.
정적 배양 용기에서의 증량 단계 동안, 세포는 정체기에 도달하여, 정적 배양 용기에서 최대 수의 세포를 유지할 수 있다. 이 단계에서, 총 세포 집단은 6% 이하의 TCR 알파 및 베타 양성 발현 세포를 포함하였다. TCR 알파 및 베타 양성 세포를 집단으로부터 고갈시킬 수 있는데, 그 이유는 이들이 이식편 대 숙주 반응에 기여할 수 있기 때문이다. 부피 감소를 정적 배양 용기에서 수행하여, 부피의 90%를 제거하였으며, 부피의 나머지 10%는 세포를 함유하였다. 고갈을 수행하는 데 사용되는 튜빙 세트(tubing set)에 멸균 용접된 전달 백에 세포를 로딩하였다. TCR 알파 및 베타 양성 세포를 항-비오틴 비드에 의해 포획될 수 있는 비오틴 항-TCR 알파 베타를 포함하는 TCR 알파 베타 고갈 키트를 사용하여 주요 집단으로부터 제거하였다. TCR 알파 베타 양성이 고갈된 세포를 표적 백 내로 용리시키고, 정적 배양 용기 내로 다시 전달하고, 하루 더 배양하였다. 이어서, 세포를 CS5에서 동결건조시키고, -145℃에서 보관하였다.
배양물로부터의 신선한, 또는 냉동바이얼로부터 해동된 세포를 염색 완충제 중에서 세척하고, 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 음성 대조군으로서, 1x106개의 세포를 Fab-비오틴 또는 IgG-비오틴 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 염색 완충제로 세척하고, 마우스 항-IgG와 함께 인큐베이션시켜, 과잉의 일차 항체를 포획하였다. 세포를 다시 세척하고, 전체 패널의 이차 항체(CD45, CD5, CD4, CD8, B2M, TCR, 스트렙트아비딘-APC) 및 생존력 염료와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 염색 완충제로 마지막으로 세척하고, 다양한 염색된 집단을 포획하도록 유세포측정기에서 실행하였다.
유세포측정기를 사용하여 공정 중 샘플 및 동결보존된 생성물에 존재하는 다양한 집단을 정량화하였다. 본원에 기재된 게이팅(gating) 전략을 사용하여, 하위집단을 구별하였다. 요약하여, 사용되는 전략은 초기에 림프구 집단을 게이팅하고, 단일항 세포 집단을 선택하고, CD45+ 또는 CD5+ 집단을 게이팅하는 것에 기초한다. B2M- 및 TRAC - 염색된 세포를 부모 CD45+ 또는 CD5+ 집단의 비로서 가시화시킴으로써 편집 효율을 결정하였다. 유사하게, CD4 대 CD8 하위집단의 비를 CD45+ 또는 CD5+ 집단의 비로서 플롯팅하였다. 아이소타입 대조군을 사용하여, APC 채널에서 CAR+ 발현에 대한 게이트를 설정하였다.
결과
본원에 개시된 소규모 제조 공정에서, T 세포를 동일한 활성화 조건(조건 7) 하에 정적 배양 용기에서, 그리고 T-플라스크에서 활성화시킨 다음, 생성된 활성화된 T 세포를 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 2개의 리보핵단백질(RNP) 복합체의 존재 하에 전기천공시켰다. 전기천공법 후에, 세포를 20,000의 감염 다중도(MOI)로 항-CD19 CAR(항-CD19 CAR; SEQ ID NO: 53)을 발현하기 위한 rAAV 벡터로 형질도입하고, 증량시켰다. TCRαβ 및 β2M의 낙아웃 효율, 항-CD19 CAR 발현 및 세포 증량을 세포 증량 동안 평가하였다. TCRαβ 고갈을 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 수행하였다. 공정 완충제, 세포 생성물, 및 비오틴에 컨쥬게이트된 항-TCRα/β 모노클로널 항체를 포함하는 TCRαβ 키트를 실행 이전에 자동화 세포 처리 시스템에 로딩하였다. 세포를 세척하고, 챔버에서 표지하고, 분리를 위하여 자성 컬럼에 지향시켰다. 비결합 세포(TCRαβ-)를 처리 완충제 중 표적 백 내로 수집하였다.
이에 따라 수득되는 세포를 유세포측정법에 의해 분석하여, T 세포 활성화 효율(CD25+%, CD69+% 및 형광 세기 또는 MFI에 의해 표시되는 바와 같음), 유전자 편집 효율(αβ% 및 β2M%), TCDαβ 고갈 효율 및 CAR 발현 효율을 시험하였다. 하기 표 4를 참조한다.
Figure pct00006
요약하여, 총 0.5x106개 내지 1x106개의 세포를 CAR 전체 패널 및 CAR 감소 패널에 대하여 일차 비-컨쥬게이트된 항체에서 4℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 1 ㎖의 염색 완충제(DPBS/0.5% BSA)로 세척함으로써 비결합 항체를 제거한 다음, 세포를 실온(RT)에서 10분 동안 100 ㎕의 염색 완충제 중 1 ㎍의 대조군 마우스 IgG와 함께 인큐베이션시켰다. 그 다음, 세포를 LIVE/DEAD™ 고정 가능한 데드(Dead) 세포 염료(Thermo Fisher)(T 세포 활성화 패널 제외)를 포함하는 컨쥬게이트된 항체(모든 패널)를 사용하여 4℃에서 30분 동안 광으로부터 보호하여 염색하였다. 인큐베이션 후에, 7-AAD를 함유하는 염색 완충제 중에 재현탁화시킨 T 세포 활성화 패널을 제외하고, 세포를 염색 완충제로 세척하고, 염색 완충제 중에 재현탁화시켰다.
정적 배양 용기에서 활성화된 T 세포는 T-플라스크에서 활성화된 T 세포와 비교하여 비슷하거나 더 높은 TCRαβ 및 β2M 낙아웃 효율 및 CAR% 발현을 보였다(도 2a 내지 도 2d). 편집은 편집 효율을 모니터링한 12일 기간에 걸쳐 지속하여 유지되었다(도 2a 내지 도 2d). 제9일의 미처리 T 세포(UT)에서의 상승된 수준의 CAR% 발현은 유세포측정 동안 기술적인 문제로부터 초래되었으며, 제3일, 제6일 및 제12일에 측정된 CAR% 발현과 불일치하였다(도 2d).
정적 배양 용기에서 활성화된 T 세포는 T-플라스크에서 활성화된 T 세포에 비하여 상당히 더 높은 편집 후 배수 증량을 보였다(58.46배에 비하여 98.66배; 도 3). 미처리 T 세포(84.61배) 및 모의 전기천공된 T 세포(71.77배)의 편집 후 배수 증량은 T-플라스크에서 활성화된 T 세포에 대하여 관찰되는 것(58.46배)보다 더 높았지만, 정적 배양 용기에서 활성화된 T 세포에 대하여 관찰되는 것(98.66배)보다 더 낮았다(도 3).
종합하여, 이들 결과는 T 세포 활성화를 위한 확인된 최적의 조건이 대조군 T-플라스크와 비교하여, 소규모 제조 공정(정적 배양 용기로 나타냄)에서 유사한 높은 T 세포 활성화 효율을 보였음을 보여준다. 또한, 정적 배양 용기에서 생성되는 생성된 활성화된 T 세포는 T-플라스크에서 제조되는 활성화된 T 세포에 비하여, 유사하거나 더 높은 편집 효율, CAR 발현 효율 및 더 큰 편집 후 세포 증량을 보였다.
실시예 3 : T 세포 전기천공법을 위한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 TRAC 및 β2M 유전자좌에서 최적의 CRISPR-Cas9-의존적 유전자 편집을 위한 T 세포 농도의 범위를 포함하는, 전기천공법을 통한 T 세포의 유전자 편집을 위한 최적화된 조건의 확인이 보고된다. 본 실시예에서, 고정된 농도의 gsRNA 및 Cas9를 전기천공법에 의해 증가하는 농도의 T 세포 내로 도입하고, 편집 효율을 유세포측정법에 의해 결정하였다.
100x10 6 개 세포/㎖ 내지 300x10 6 개 세포/㎖의 세포 농도는 효율적인 편집을 가능하게 한다
각각 150 ㎍/㎖, 150 ㎍/㎖ 및 300 ㎍/㎖의 고정된 농도의 B2M sgRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6), TRAC sgRNA(TA-1, SEQ ID NO: 2) 및 CAS9(SEQ ID NO: 1)를 사용하여, 전기천공법을 증가하는 농도의 세포(100x106개 세포/㎖ 내지 400x106개 세포/㎖)를 사용하여 수행하였다. 편집 효율을 유세포측정법을 사용하여 유전자 편집 후에 3일마다 모니터링하였다. 각각의 샘플 내의 농도는 표 5에 요약되어 있다.
Figure pct00007
100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖ 범위의 세포 농도에서, 편집된 세포에서 B2M(-) 및 TCR(-) 하위집단은 각각 80% 초과 및 98% 초과였다(도 4a 및 도 4b). 세포를 100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖ 범위의 농도로 전기천공시킨 경우 CAR+ 발현은 40% 초과였다(도 4c). 400x106개 세포/㎖의 세포 농도에 대하여, B2M(-) 및 TCR(-) 하위집단은 각각 80% 미만 및 87% 미만이었다(도 4d 및 도 4e). CAR+ 발현은 또한 400x106개 세포/㎖의 밀도로 전기천공된 세포에서 약간 감소하였다(도 4f).
요약하여, 이들 결과는 100x106개 세포/㎖ 내지 300x106개 세포/㎖ 범위의 세포 농도가 내인성 β2M 및 TCR 유전자좌에서 효율적인 편집을 가능하게 하는 것을 보여준다.
실시예 4: T 세포 형질도입을 위한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 T 세포에서 CAR+ 발현을 야기하는 키메라 항원 수용체를 코딩하는 rAAV 벡터의 최적의 T 세포 형질도입을 위한 MOI의 범위의 확인이 보고된다. 본 실시예에서, T 세포를 증가하는 MOI를 사용하여 rAAV 벡터로 형질도입하였으며, CAR+ 발현을 유세포측정법에 의해 정량화하였다.
요약하여, 건강한 공여자 류코팩으로부터의 동결보존된 T 세포를 해동시키고, 48시간 동안 활성화시켰다. 세포를 Cas9 및 TCR을 표적화하는 sgRNA(TA-1; SEQ ID NO: 2/Cas9; SEQ ID NO: 1), 및 Cas9 및 β2M을 표적화하는 sgRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6/Cas9; SEQ ID NO: 1)를 포함하는 RNP 복합체의 존재 하에 1x106개의 세포 농도로 대량으로 전기천공시켰으며, 각각의 복합체에서 150 ㎍/㎖의 sgRNA 및 150 ㎍/㎖을 사용하였다(표 6). 또한, 상기 실시예 1 내지 3을 참조한다.
전기천공법 후에, 세포를 재현탁화시키고, 인큐베이터에서 20분 동안 휴지되게 하였다. 이어서, 전기천공된 세포를 다양한 분취액으로 분리하고, 37℃에서 1시간 동안 증가하는 MOI의 rAAV로 형질도입하였다(표 6). CAR+ 발현을 제3일, 제6일, 제10일 및 제13일에 전기천공법 및 형질도입 후에 유세포측정에 의해 결정하였다.
Figure pct00008
도 5a에 나타낸 바와 같이, 20K의 MOI는 시험된 기간에 걸쳐 적어도 50%의 CAR+ 발현을 달성하기에 충분하였다. CAR+ 발현을 10K, 20K, 40K 및 80K의 MOI로 포화시켰다(도 5a). 다양한 MOI는 세포 생존력 및 세포 증량에 대하여 영향을 갖지 않았다(데이터 미도시). 대량의 전기천공법을 수행하였고, B2M 및 TRAC 낙다운이 미처리 세포를 제외하고 모든 샘플에 걸쳐 일관적이었기 때문에(데이터 미도시), CAR+ 발현의 차이는 유전자 편집의 비효율성으로 인한 것이 아니었다. 1.25K 내지 10K의 MOI는 감소된 CAR+ 발현과 선형의 상호관련이 있는 것으로 보였다(도 5a). T 세포를 0K 내지 23K의 MOI로 증분식으로 형질도입한 추가의 실험은 CAR+ 발현과 0.12K 내지 4.7K의 범위의 MOI 간에 선형의 상관관계를 보였다(도 5b).
종합하여, 이들 결과는 CAR+ 발현이 10K 내지 80K의 MOI로 형질도입된 T 세포에서 포화되었으며, CAR+ 발현이 0.12K 내지 4.7K의 MOI로 형질도입된 T 세포에서 MOI와 선형의 상관관계가 있었음을 보여준다.
실시예 5 : T 세포 증량을 위한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 뛰어난 T 세포 증량을 위한 최적의 세포 씨딩 밀도의 확인이 보고된다. 본 실시예에서, T 세포를 증가하는 밀도로 씨딩하고, 세포 증량을 시간이 지남에 따라 모니터링하였다.
요약하여, 건강한 공여자 류코팩으로부터의 동결보존된 T 세포를 해동시키고, 48시간 동안 활성화시켰다. 이어서, 세포를 Cas9 및 TCR을 표적화하는 sgRNA(TA-1; SEQ ID NO: 2/Cas9; SEQ ID NO: 1), 및 Cas9 및 β2M을 표적화하는 sgRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6/Cas9; SEQ ID NO: 1)를 포함하는 RNP 복합체의 존재 하에 전기천공시켰으며, 각각의 복합체에서 150 ㎍/㎖의 sgRNA 및 150 ㎍/㎖를 사용하였다. 전기천공법 후에, 세포를 20,000의 MOI로 rAAV로 형질도입한 다음, 정적 배양 용기에서 증량시켰다. 상세사항에 대해서는 상기 실시예 1 내지 4를 참조한다.
편집 후에, 세포를 최대 12일의 증량을 위하여 정적 배양 용기에서 5x104개 세포/㎠(50,000개), 1x105개 세포/㎠(100,000개), 2x105개 세포/㎠(200,000개), 3x105개 세포/㎠(300,000개) 및 5x105개 세포/㎠(500,000개)로 씨딩하였다. 세포 계수 및 생존력을 3일마다 평가하였다. 배수 증량을 최종 세포 수 대 출발 세포 수의 비로 계산하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 5x105개 세포/㎠의 밀도로 씨딩된 세포는 9일에 성장 정체기에 도달하였다. 12일까지, 3x105개 세포/㎠의 밀도로 씨딩된 세포는 제9일에 5x105개 세포/㎠로 씨딩된 세포에 의해 도달되는 것과 유사한 세포 수에 도달하였다(도 6a 및 도 6b). 2x105개 세포/㎠ 및 1x105개 세포/㎠의 밀도로 씨딩된 세포는 12일까지 성장 정체기에 도달하지 않고, 중등의 증량을 보였다(도 6a 및 도 6b). 시험된 씨딩 밀도 중에, 가장 낮은 수준의 증식이 5x104개 세포/㎠의 밀도의 세포로 씨딩된 세포에 대하여 관찰되었다(도 6a 및 도 6b). 1x105개 세포/㎠의 밀도로 씨딩된 세포는 이들이 더 적은 총 세포를 초래하였지만, 2x105개 세포/㎠(185.5배) 및 3x105개 세포/㎠(164.6배)의 밀도로 씨딩된 세포에 비하여 더욱 강력한 배수 증량 속도(223.4배)를 보였다(도 6c). 5x105개 세포/㎠ 및 5x104개 세포/㎠로 씨딩된 세포에 대한 배수 증량 속도는 대략 100배였다(도 6c).
요약하여, 이들 결과는 3x105개 세포/㎠ 내지 5x105개 세포/㎠의 세포 씨딩 밀도의 범위가 편집 후 효율적인 T 세포 증량을 제공하였음을 보여준다.
실시예 6 : TCRαβ 고갈을 위한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 편집 후에 남아 있는 TCRαβ+ 세포의 최적의 고갈을 위한 조건의 확인이 보고된다. CRISPR-Cas9-매개된 유전자-편집은 전형적으로 90% 초과의 T 세포에서 TCRαβ 발현의 제거를 야기한다. 이식편대숙주병(GvHD)의 가능성을 최소화시키기 위하여, 남아 있는 TCRαβ+ T 세포를 TCRαβ+ 고갈 공정을 통해 추가로 감소시킬 수 있다.
요약하여, 세포를 비오틴 컨쥬게이트된 TCRαβ 항체 및 항-비오틴 마이크로비드와 함께 인큐베이션시켰다. 과잉의 비결합 항체 및 마이크로비드의 제거 후에, 세포를 자성 컬럼을 통과시키고, 표지된 TCRαβ+ 세포를 컬럼 상에 포획하였다. 비결합 TCRαβ- 세포를 PBS/EDTA 완충제 중 0.5% HSA를 갖는 표적 백으로 용리시킨다. 세포 회복을 가능하게 하도록 용리된 세포를 하룻밤 배양한 다음, 약품 제형을 위해 수거하였다.
CAR-발현 T 세포 생성물의 4개의 뱃치를 TCRαβ 고갈을 위하여 처리하였다. 3개의 뱃치를 전체 규모 공정으로부터 생성하였으며, 1개의 뱃치(CTX110-18-01)를 중간 크기 공정으로부터 생성하였다. 투입 세포 수는 공여자 변화 및 증량 규모로 인하여 7.4x109개 세포 내지 32.0x109개의 세포로 달라졌다(표 7). 고갈 후 세포 수 회수는 75% 내지 113.33%의 범위였다(표 7). 100% 또는 113%의 세포 수 회수는 투입 세포 수의 과소 평가에 의해 야기될 수 있었다(표 7). CTX110-18-01 뱃치로부터의 투입 세포(84.5%)를 제외하고, 투입 및 산출 세포의 생존력은 90% 초과였다(표 7). 투입 세포 및 산출 세포에서의 TCRαβ+의 평균 퍼센트는 각각 2.06% 및 0%였다.
Figure pct00009
요약하여, 이들 결과는 TRAC 유전자 및 β2M 유전자가 유전학적으로 파괴된 CAR-발현 T 세포로부터의 TCRαβ의 효율적인 고갈을 보여준다.
실시예 7: 항-CD19 CAR을 발현하는, TRAC 유전자 및 β2M 유전자가 유전학적으로 파괴된, 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조를 위한 제조 공정 개발(CTX110)
개요
CTX110은 CRISPR-Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부/CRISPR 연관 단백질 9) 유전자 편집 구성성분(sgRNA 및 Cas9 뉴클레아제)을 사용하여 생체외에서 유전자 변형된 동종이계 T 세포를 포함하는 CD19-유도된 T 세포 면역요법이다.
변형은 TRAC 및 β2M 유전자의 표적화된 파괴를 포함한다. TRAC 유전자좌의 파괴는 T 세포 수용체(TCR)의 발현의 소실을 초래하며, 이식편대숙주병(GvHD)의 가능성을 감소시키고자 하며, β2M 유전자좌의 파괴는 주요 조직적합성 복합체 I형(MHC I) 단백질의 발현의 결여를 초래하며, 숙주 거부의 가능성을 감소시킴으로써 지속성을 개선시키고자 한다. 항-CD19 CAR의 부가는 변형된 T 세포를 CD19-발현 종양 세포를 향해 지향시킨다.
CAR은 항-CD19 scFv, CD8 막횡단 도메인, CD28 동시-자극 도메인 및 CD3ζ 신호전달 도메인으로 구성된다. CTX110 CAR의 발현은 EF-1α 프로모터에 의해 유도된다.
CTX110에 대한 예시적인 제조 공정은 도 7a에 도시되어 있다.
제조 공정의 진화
CTX110 제조 공정을 연구 규모, 개발 규모 및 임상 규모를 포함하는 3가지 생성 규모로 수행하였다. 연구 규모 공정은 소규모로 수행하였으며, 연구 규모 공정은 개발 규모 공정 및 임상 규모 공정을 위해 규모 확대하여 전달하였다. 초기 개발 활동(4개 롯트)을 운영 파라미터의 실행 가능성 및 조정을 위하여 약물 물질에 대한 실험실-등급 출발 물질을 사용하여 행하였다. 이후에, 개발 규모 공정과 운영상 동일한 임상 규모 공정을 위하여, GMP-공급 출발 물질(sgRNA, Cas9 및 rAAV-138)의 이용 및 정량적 허용 기준을 구현하였다.
출발 물질의 선택
CTX110의 생성을 위한 출발 물질은 하기를 포함한다:
- 건강한 공여자로부터 수집되는 류코팩,
- 박테리아 유래 Cas9 뉴클레아제,
- 2개의 단일 가이드 RNA(sgRNA), TRAC 유전자좌를 표적화하는 TA-1 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 β2M-1, 및
- 항-CD19 CAR 유전자를 인코딩하는 재조합 AAV-6 벡터(rAAV-138).
편집된 TRAC 및 β2M 유전자좌, 및 CTX110의 유전학적 변형을 만드는 데 사용되는 구성성분에 대한 구조적 정보는 하기에 제공되어 있다:
Cas9 뉴클레아제의 아미노산 서열(SEQ ID NO:1):
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
(i) 건강한 공여자에 걸친 세포 편집 성능
건강한 공여자(남성, n = 10) 유래의 T 세포를 류코팩으로부터 단리하였으며, 냉동튜브(cryotube)에 동결시켰다. 편집 효율을 하기의 농도의 유전자-편집 구성성분을 사용하여 각각의 공여자의 해동된 세포에서 평가하였다: Cas9(300 ㎍/㎖), TA-1(75 ㎍/㎖) 및 Β2M-1(150 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖).
모든 공여자 유래의 40% 초과의 편집된 세포가 CAR을 발현하였다. β2M 및 TRAC 낙아웃 비율은 각각 총 세포 집단의 80% 및 95% 초과였다(표 12). 공여자에 걸친 모든 T 세포 단리는 CTX110 제조를 위해 허용 가능한 것으로 여겨졌으며, 이는 강력한 생성 공정을 나타낸다.
Figure pct00023
(ii) Cas9 뉴클레아제
SEQ ID NO:1의 Cas9 뉴클레아제를 본 실시예에서 사용하였다. 하기 표 14에 요약된 결과는 유사한 수준의 TCRαβ- 및 Β2M- 세포, 및 이중-음성 세포가 존재하였음을 나타낸다.
(iii) rAAV-138 벡터
상기 개시된 바와 같은 rAAV-138 벡터를 원하는 CAR+ 발현을 달성하기 위한 MOI의 영향의 평가를 위해 사용하였다. 세포를 증가하는 MOI로 형질도입하고, CAR+ 발현을 정량화하였다. 상기 실시예 4를 참조한다. 도 7b에 제시된 데이터는 20,000의 MOI의 선택을 뒷받침한다.
규모 확대 개발을 위하여, 상기 언급된 출발 물질을 사용하여 선택된 MOI의 적합성을 입증하기 위한 연구를 행하였다. 세포를 0 내지 23,000 범위의 MOI로 형질도입하였다. 전기천공법 및 바이러스 감염에 이어서 11일의 증량 후에, CAR+ 발현을 유세포측정에 의해 정량화하였다. 결과는 도 7c에 제시되어 있다. AAV 용량-의존적인 CAR+ 발현은 0의 MOI에서의 2.1% CAR+로부터 23,000의 MOI에서의 56.2% CAR+까지의 범위였다. CAR+ 발현은 4,700의 MOI에서 포화되었다.
GMP rAAV-138(23,000의 MOI)로 감염된 세포에 대한 CAR 발현은 비-GMP 벡터(20,000의 MOI)로 수득되는 것과 유사하였으며, 각각 56.2% 및 55.4%였다. 20,000의 MOI를 규모 확대 제조를 위해 선택하였다.
(iv) 리보핵단백질 복합체(RNP)의 원위치 형성
고정된 농도의 세포를 사용하여, Cas9(SEQ ID NO: 1)와 TCR을 표적화하는 sgRNA(TA-1, SEQ ID NO: 2) 및 β2M을 표적화하는 sgRNA(Β2M-1; SEQ ID NO 6)의 인큐베이션에 의해 형성되는 증가하는 농도의 RNP 복합체를 사용해 전기천공법을 수행하였다. TA-1/Cas9 및 β2M/Cas9 복합체의 원위치 형성을 300 ㎍/㎖의 최종 조합된 농도의 Cas9 뉴클레아제(각각의 가이드와 조합된 150 ㎍/㎖의 최종 농도의 Cas9 뉴클레아제와 등가)를 사용하여 평가하였다. TA-1 및 Β2M-1의 최종 농도는 37.5 ㎍/㎖에서 300 ㎍/㎖까지 달라졌다.
도 7d에 나타낸 바와 같이, 37.5 ㎍/㎖ 내지 75 ㎍/㎖의 TA-1 sgRNA 농도는 더 높은 TCRαβ의 편집을 초래하였다. 150 ㎍/㎖ 또는 300 ㎍/㎖의 TA-1 sgRNA 농도는 TCRαβ의 추가의 편집을 제공하지 않았으며, B2M의 편집을 감소시켰다. 시험되는 농도 중에, 75 ㎍/㎖의 TA-1 sgRNA는 TCRαβ, β2M의 편집, 및 TCRαβ 및 β2M 이중 낙아웃(DKO)에 대하여 가장 높은 효율을 제공하였다. 도 7e에 나타낸 바와 같이, 75 ㎍/㎖ 내지 150 ㎍/㎖의 B2M-1 sgRNA 농도는 더 높은 β2M의 편집을 초래하였으며, 이는 효율적인 편집이 TA-1 sgRNA의 농도보다 더 높은 B2M-1 sgRNA의 농도를 사용하여 달성될 수 있다는 것을 뒷받침한다.
요약하여, 이들 결과는 각각 0.3 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖ 및 0.2 ㎎/㎖의 최종 농도의 Cas9, TA-1 sgRNA 및 B2M-1 sgRNA를 사용한 T 세포의 효율적인 편집을 보여준다. 이들 농도를 달성하기 위하여, TA-1 sgRNA/Cas9 및 B2M-1 sgRNA/Cas9 혼합물을 각각 2.7:1 및 6.7:1의 몰비로 제조하였다.
RNP 복합체에서 검출되는 유리 Cas9의 퍼센트를 결정하기 위하여, TA-1 sgRNA(TA-1; SEQ ID NO: 2) 및 Cas9(Cas9; SEQ ID NO: 1), 및 B2M-1 sgRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6) 및 Cas9(Cas9; SEQ ID NO: 1) 혼합물을 각각 2.7:1 및 6.7:1의 몰비로 제조하였다. 혼합물을 10분 동안 인큐베이션시킨 다음, CEX HPLC에 의해 분석하여, 유리 Cas9의 양을 정량화하였다. 표 13에 나타낸 바와 같이, 혼합물에서 검출되는 유리 Cas9의 낮은 퍼센트는 RNP 복합체가 효율적으로 형성되었음을 뒷받침한다.
Figure pct00024
이들 결과는 Cas9와 sgRNA의 인큐베이션은 대다수의 Cas9가 RNP 복합체 내에 포함되게 한다는 것을 보여준다.
제조 공정의 개발
(i) 연구 공정
총 22개의 연구 롯트를 17명의 건강한 자원자 유래의 T 세포를 사용하여 연구 규모 공정에 의해 생성하였다. 연구 규모 공정에 대해 확인된 조건을 입증하고, 규모 확대를 위해 조정하여, 개발 규모 공정을 수행하였다. 마지막으로, GMP-공급된 중요한 출발 물질을 임상 규모 공정에서 임상 물질의 제조를 위하여 평가하였다. 사실상, 개발 규모 공정 및 임상 규모 공정은 운영상 동일하다.
연구 규모 공정은 도 7a에 예시된 공정과 동일한 단계를 따랐다. 요약하여, PBMC의 동결된 바이얼(롯트 1-14, 16, 21, 22) 또는 백혈구성분채집술 생성물로부터 농축된 동결된 T 세포(롯트 12-15, 17-20)로부터의 T 세포를 CD3/CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 나노매트릭스 입자를 사용하여 젠타마이신 또는 페놀 레드 부재의 X-VIVO™ 15, 5% 인간 AB 혈청, rhIL-2 및 rhIL-7로 이루어진 "T-세포 배지"에서 2일 내지 3일 동안 활성화시켰다. 제2일 또는 제3일에, 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스를 신선한 배지로 희석하거나, 세포의 세척 및 원심분리에 의해 제거하였다. 다음날, T 세포를 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 포함하는 전기천공법-기반의 트랜스펙션 시스템을 사용하여 Cas9 및 sgRNA로 전기천공시켰다.
전기천공법 이후 대략 20분 내지 60분에, 세포를 처리하지 않고 두거나, 세포당 20,000 또는 50,000 지노카피(genocopy)의 MOI로 AAV6 rAAV-138로 감염시켰다. 대략 1시간의 감염 후에, 세포를 세척하고, T-세포 배지에 플레이팅하였다.
게놈 편집 이후 대략 1주에, 세포를 유세포측정에 의해 TCRαβ/β2M 낙아웃 및 CAR 발현에 대하여 평가하였다. TCRαβ-, B2M-, CD4+, CD8+ 및 CAR+였던 세포의 백분율을 이후에 계산하였다.
유전자 편집 후에 TCRαβ 및 B2M의 표면 발현을 소실하고, 세포-표면 검출 가능한 CAR을 발현한 세포의 백분율을 각각의 공정에 대하여 유세포측정에 의해 평가하였다(표 14). 연구 롯트(n = 22)에 걸쳐, 43 ± 16%(18 내지 72%)의 세포가 원하는 항-CD19 CAR의 표면 발현을 달성하는 한편, TCRαβ(98 ± 0.66%, 97 내지 99%) 및 B2M(79 ± 9.6%, 54 내지 86%)의 표면 소실도 또한 나타내었다(표 14). 유사한 결과가 개발 규모 공정 및 임상 규모 공정에 대하여 수득되었다(표 14). 연구 롯트에서 완전히 편집된(TCRαβ-B2M-CAR+) 세포의 백분율은 평균하여 31 ± 13%(15 내지 59%)였다.
CD3ζ 표면 발현은 TCR과의 복합체의 형성에 의존적이다. 이와 같이, 이는 TCRαβ의 소실에 더하여 TCR의 소실에 대한 기능적 생화학 마커로서 기능한다. CD3ζ 표면 발현의 소실은 연구 롯트에서 평균 96 ± 3.5%(85 내지 99%)였다.
하위집단에 대한 CD4/CD8 빈도는 유전자-편집 구성성분 없이 전기천공법에 의해 처리된 대조군 T 세포와 유사하였다. 연구 롯트에 있어서, 편집된 세포(TCRαβ-B2M-CAR+, 롯트 1 내지 11, 16 내지 22)는 평균하여, 50 ± 12%의 CD4 세포 및 45 ± 14%의 CD8 세포를 함유하였다. 전기천공된 및 대조군 T 세포(롯트 1 내지 11, 16 내지 21)는 57 ± 12%의 CD4 세포 및 40 ± 12%의 CD8 세포를 함유하였다. 편집된 T 세포를 대조군 T 세포와 비교하는 경우 CD4 또는 CD8 빈도 간에는 통계적으로 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(비대응 양측 스튜던츠 t-검정).
(ii) 개발 및 임상 공정
연구 공정을 규모 확대 및 임상 물질의 제조를 위하여 GMP 시설로 옮겼다. 연구 공정에 대하여 확인된 조건을 입증하고, 규모 확대를 위해 조정하였다(개발 공정). 마지막으로, GMP-공급된 중요한 출발 물질을 임상 물질의 제조를 위하여 평가하였다(임상 공정). 사실상, 개발 및 임상 공정은 운영상 동일하다. 결과는 하기 표 14에 제시되어 있다.
(iii) 제조 공정에 걸친 유전자 편집의 비교 가능성
임상 롯트로부터의 결과와, 연구 공정 및 초기 규모 확대 및 비-임상 롯트의 비교는 표 14에 제시되어 있다.
Figure pct00025
공정 파라미터의 평가
제조 운영 파라미터를 일련의 소규모 및 전체 규모 실험에서 평가하였으며, 이는 표 15에 요약되어 있다.
Figure pct00026
Figure pct00027
실시예 8 : 항-BCMA CAR을 발현하는, TRAC 및 β2M 유전자가 유전학적으로 파괴된 유전학적으로 조작된 T 세포(CTX120)를 제조하기 위한 방법
CTX120은 CRISPR-Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부/CRISPR 연관 단백질 9) 유전자 편집 구성성분(sgRNA(단일 가이드 RNA) 및 Cas9 뉴클레아제)을 사용하여 생체외에서 유전학적으로 변형된 인간 동종이계 T 세포를 포함하는 BCMA-유도된 T 세포 면역요법이다.
변형은 TRAC 및 B2M 유전자좌의 표적화된 파괴, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터(rAAV166, 항-BCMA 유도된 키메라 T 세포 항원 수용체를 인코딩하는 혈청형 6 rAAV)를 사용한 TRAC 유전자좌 내로의 항-BCMA 키메라 항원 수용체(CAR) 전이유전자의 삽입을 포함한다.
CAR은 BCMA에 특이적인 인간화된 단일-쇄 가변 단편(scFv)에 이어서 CD8 힌지 및 CD137(4-1BB) 및 CD3ζ에 대한 세포내 신호전달 도메인에 융합된 막횡단 영역으로 구성된다. CTX120 CAR의 발현은 신장 인자 1 알파(EF-1α) 프로모터에 의해 유도된다.
CTX120의 제조 공정은 도 8a에 예시되어 있다. 박테리아 유래 Cas9 뉴클레아제; 2개의 단일 가이드 RNA(sgRNA), TRAC 유전자좌를 표적화하는 TA-1 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 B2M-1을 포함하는 출발 물질의 구조적 정보는 상기 실시예 7에 제공되어 있다. rAAV 벡터 내의 항-BCMA CAR의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 하기에 제공된다(표 16 및 표 17):
Figure pct00028
Figure pct00029
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Figure pct00034
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Figure pct00038
CTX120 약물 물질의 제조는 농축된 T 세포를 해동한 후 활성화 및 전기천공법/형질도입을 포함하였으며, 이 때 세포를 증량하였다. 증량 후에, TCRαβ+ 세포를 고갈시켰다. 세포를 하룻밤 배양하고, 수거하고, 약물 물질 시험을 위하여 샘플링하였다. 도 8a를 참조한다. 재처리를 CTX120 제조의 어떠한 단계에서도 수행하지 않았다.
T 세포 농축
T 세포를 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 항-CD8 및 항-CD4 항체-코팅된 자성 비드의 혼합물을 사용하여 자성 분리를 통해 백혈구성분채집술 물질(류코팩)로부터 농축시켰다. 농축 전에, 류코팩을 세포 계수 및 생존력(80% 이상)을 위하여 샘플링하였다. 농축된 세포를 HSA가 존재하는 PBS/EDTA 완충제에서 단리한 다음, 세포 계수, 생존력(80% 이상), T 세포 순도(70% 이상 CD3) 및 무균성을 위하여 샘플링하였다. 이어서, 세포를 4 ± 1℃에서 원심분리하고, 50×106개의 생존 가능한 세포/㎖의 표적 농도로 CryoStor CS5 중에 재현탁화시켰다.
T 세포 동결보존
세포를 세포 계수, 생존력(80% 이상)을 위해 샘플링한 다음, 2,500×106개 세포/백(30 내지 70 ㎖의 세포 현탁액)의 표적 세포 수로 에틸 비닐 아세테이트 냉동백 내로 분취하였다. 1 내지 2개의 백의 T 세포를 생성하는 데 하나의 류코팩이 충분하였다. 각각의 백을 열-밀봉하고, 표지하고, 제어-속도 냉동기로 옮길 때까지 2 내지 8℃에서 보관한 다음, 보관을 위하여 증기상 액체 질소로 옮겼다.
T 세포 해동 및 활성화
하나의 동결된 백의 농축된 T 세포를 해동시키고, 3ℓ 백으로 옮기고, 보충된 X-VIVO™ 15 배지(X-VIVO™ 15, 5% 인간 혈청, 100 IU/㎖ rhIL2, 100 IU/㎖ rhIL7) 내로 희석하였다. 세포를 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위하여 샘플링하였다. 세포를 540 g에서 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지 중에 재현탁화시키고, 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위해 샘플링하였다. 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 가용성 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 용액을 1:12.5(v/v)의 비로 첨가하여, 세포를 활성화시켰다.
세포를 2개의 정적 세포 배양 용기 내에, 각각 대략 500 ㎖의 총 부피의 보충된 X-VIVO™ 15 배지/재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스로, 2×106개의 생존 가능한 세포/㎖의 표적 밀도로 씨딩하였다. 정적 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 48 ± 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 공정 내내 정적 배양 용기를 취급할 때는 언제나, 이들을 구멍 및 누수, 및 투명한 황색 배지의 존재에 대하여 검사하였다.
희석
이틀(2일) 후에, 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 각각의 정적 배양 용기에 5 ℓ까지 첨가하였다. 세포를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 추가로 인큐베이션시켰다.
전기천공법 및 형질도입
보충된 X-VIVO™ 15 배지의 부피를 정적 배양 용기 내의 딥-튜브(dip-tube)에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰으며, 배지 내로의 세포의 재현탁화를 가능하게 하도록 온건하게 와류시켰다. 세포를 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위해 샘플링하였다. 세포를 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮기고, 540 g에서, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시키고, 동일한 조건 하에 다시 원심분리하였다. 세포를 두번째로 300×106개 세포/㎖의 표적 농도로 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시켰다.
Cas9 뉴클레아제를 개별 마이크로원심분리용 튜브에서 TA-1 sgRNA(TCR 표적화) 및 B2M-1 sgRNA(β2M 표적화)와 혼합하였다. 각각의 용액을 10분 이상 실온에서 인큐베이션시켜, 각각의 리보핵단백질 복합체를 형성하였다. 2가지 Cas9/gRNA 혼합물을 조합하고, 세포와 혼합하여, Cas9, TA-1 및 B2M-1이 각각 0.3 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖ 및 0.2 ㎎/㎖의 최종 농도가 되게 하였다. 혼합물을 피펫팅에 의해 분취하고, 전기천공법 카세트 내로 로딩하였다. 카세트를 캡핑하고, 순차적으로 유동 전기천공법에 기초한 트랜스펙션 시스템을 사용하여 전기천공시켰다. 전기천공법 후에, 세포를 125 ㎖ 삼각 플라스크에서 각각의 카세트로부터 풀링하고, 37℃에서 20분 이상 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하였다. 세포를 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 107개 세포/㎖로 희석하고, 신선하게 해동된 rAAV-166b를 20,000 vg/세포의 MOI로 첨가하였다. 세포를 37℃, 5% CO2에서 60분 이상 동안 인큐베이션시켰다.
원하는 CAR+ 발현을 달성하기 위한 MOI의 영향을 개발 롯트의 벡터(rAAV-166b)를 사용하여 평가하였다. 세포를 증가하는 MOI로 형질도입하고, %CAR+를 정량화하였다. 도 8b에 나타낸 바와 같이, AAV 용량-의존적 CAR 발현이 관찰되었다. CAR의 발현은 10,000의 MOI 근처에서 포화되었으며, 이는 20,000의 MOI의 선택을 뒷받침한다.
원위치에서의 2가지 리보핵단백질 복합체(RNP)의 형성을 상기 실시예 7의 설명에 따라 수행하였다. 또한, 상기 표 13에 제공된 결과도 참조한다.
상동성 지정-수선(HDR)은 DNA 이중 가닥 파단부에 대한 고충실도 세포 수선 메커니즘이다. HDR은 CAR 유전자의 각각의 말단 상의 상동성 서열을 사용함으로써 AAV 주형으로부터의 CAR 유전자를 원하는 TRAC 유전자좌 내로 도입하기 위해 사용된다.
TRAC 유전자좌에서 항-BCMA CAR을 평가하기 위하여, ddPCR 검정을 개발하였다. 통합된 항-BCMA CAR 서열을 증폭시키고, CAR 유전자 삽입을 갖는 세포의 퍼센트를 결정하기 위하여 TRAC 부위 특이적 PCR 프라이머 세트를 설계하였다. CTX120의 3개의 롯트를 ddPCR에 의해 평가하였으며, %HDR은 표 18에 나타나 있다. 이들 결과에 의해, TRAC 유전자좌에서의 항-BCMA CAR의 삽입이 확인된다.
Figure pct00039
세포 증량
세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 희석하고, 세포 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하고, 2개의 정적 배양 용기 및 하나의 추가의 정적 배양 용기(세포 모니터링을 위한 위성(satellite) 배양물) 내로 0.2-0.5 × 106개의 생존 가능한 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다. 정적 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포 배양물을 최대 9일 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 동안 배양물에, 배양 부피 ㎖당 100 IU의 rhIL2 및 rhIL7를 3일 내지 4일마다 보충하였다. 위성 정적 세포 배양 용기를 증량 내내 세포 계수, 생존력 및 T 세포 순도에 대하여 시험하였다. 위성 배양 용기 내의 세포 밀도가 대략 30×106개/㎠에 도달하는 때, TCRαβ 고갈을 수행하였다. 위성 배양 용기에서 세포 밀도가 30×106개/㎠에 도달하지 않았다면, 주요 배양물에서 TCRαβ 고갈을 제9일에 수행하였다.
TCRαβ 고갈
각각의 정적 세포 배양 용기의 배지를 정적 배양 용기 내의 딥-튜브에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰다. 대량의 배지를 제거한 후에, 정적 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포를 배지 중에 재현탁화시켰다.
세포를 정적 배양 용기에 연결하는 딥-튜브와 핏팅된 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮겼다. 세포를 생존력(70% 이상), 계수 및 %CAR+ 세포를 위하여 샘플링하였다. 그 다음, 세포를 540 x g에서, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 재현탁화시키고, 0.5% HSA를 함유하는 650 ㎖ 미만의 PBS/EDTA 중에 풀링하였다. 세포 현탁액을 멸균 백으로 옮겼으며, 이는 자동화 세포 처리 시스템에 연결된다. 자동화 세포 처리 시스템에서, 세포를 비오틴-컨쥬게이트된 항-TCRαβ 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 항-비오틴 자성 비드와 함께 인큐베이션시켜, 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 TCRαβ+ 세포의 고갈을 가능하게 하였다. 세포를 세포 계수, 생존력(70% 이상) 및 %CAR+ 세포에 대하여 시험하였다.
세포 회복
고갈된 세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지 중에 재현탁화시키고, 3ℓ 백(들)으로 옮기고, 정적 세포 배양 용기(들) 내로 씨딩하고, 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다.
세포 수거(약물 물질)
세포를 수거하기 위하여, 정적 배양 용기를 인큐베이터로부터 제거하고, 세포의 침강을 위하여 휴지되게 하였다. 성장 배지를 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피까지 각각의 정적 배양 용기로부터 제거하였다. 제거된 배지를 무균성을 위해 샘플링하였다. 정적 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포가 배지 중에 재현탁화되게 하였다. 각각의 정적 배양 용기의 내용물을 펌프를 사용하여 3 ℓ 전달 백으로 옮기고, 중력에 의해 40 ㎛ 수혈 필터를 통해 개별 무균 3 ℓ 백 내로 여과하였다. 세포를 농도 및 생존력을 위하여 샘플링하였다.
본원에 개시된 제조 공정에 의해 생성되는 CTX120의 세포 표현형
CTX120 약품 개발 롯트를 T 세포 집단에 대하여 분석하였다. 유동 패널은 표 19에 나타나 있다.
Figure pct00040
소진 마커
CD57, Lag3 및 PD1은 T 세포 소진과 연관된 마커이다. CTX120 약품의 소진 상태를 표 19에 정의된 마커를 사용하여 평가하였다. 도 8c 및 표 20에 나타낸 바와 같이, 낮은 수준의 소진 마커가 CAR+ CTX120 약품 세포에서 관찰되었다.
Figure pct00041
CTX120 약품을 기억 세포 마커에 대하여 평가하였다. CD45RO 게이트에서, CD62L, CCR7 및 CD27은 중심 기억과 연관된 마커였다. CD45RA 게이트에서, CD62L은 줄기 세포 기억에 대한 마커였다. CD62L 및 CCR7+였던 세포는 중심 기억 및 줄기 세포 기억에 대한 마커였다. CD8+ T 세포에 대한 결과는 도 8d 및 표 21에 나타나 있다. CD4+ T 세포에 대한 결과는 도 8e 및 표 22에 나타나 있다.
Figure pct00042
Figure pct00043
CTX120의 생물학적 활성
BCMA 항원으로의 자극 시의 CAR T 세포 약품의 생물학적 활성을 측정하는 2가지 검정을 개발하였다. 먼저, T 세포 활성화 시의 IFNγ 분비를 결정하였다. 요약하여, CAR T 세포를 재조합 인간 BCMA와 함께 인큐베이션시켰다. CAR T 세포 활성화 시에, 분비된 IFNγ의 수준을 MSD(Meso-Scale Delivery)에 의해 측정하였다. 결과는 도 8f에 나타나 있다.
다음으로, BCMA 양성 MM.1S 표적 세포를 사멸시키는 CTX120 CAR-T 세포의 능력을 유세포측정-기반의 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다. 요약하여, 표적 세포를 eFluor670으로 표지하고, 다양한 비로 CTX120 세포와 함께 인큐베이션시켰다. CTX120 세포독성을 표지된 세포를 대조군 샘플과 비교하여 라이브(live) 게이트에서 평가함으로써 4시간에 분석하였다. 결과는 도 8g에 나타나 있다. CTX120의 모든 3개의 개발 롯트는 용량 의존적 표적 세포 세포독성을 보였다.
종합하여, 이들 결과는 항-BCMA CAR 발현 T 세포의 생성을 보여주었다. 본원에 기재된 바와 같이 제조된 항-BCMA CAR 발현 T 세포는 TCR 및 β2M의 낮은 발현 수준을 나타냄으로써, 숙주 거부의 가능성을 감소시켰다. 추가로, 항-BCMA CAR 발현 T 세포는 T 세포 활성화 시에 BCMA 양성 세포의 표적화된 세포 사멸을 나타내었다.
실시예 9: 규모 확대를 위한 T 세포 증량에 대한 최적화된 조건의 확인
본 실시예에는 뛰어난 T 세포 증량 및 수율 증가를 위한 최적의 플레이팅 또는 리플레이팅 조건의 확인이 보고된다. 본 실시예에서, T 세포를 편집 후 같은 날에 500 K/㎠보다 더 낮은 밀도로 플레이팅하거나, 500 K/㎠ 밀도로 씨딩하고, 편집 후 다른 날에 리플레이팅하였다. 세포 증량을 시간이 지남에 따라 모니터링하였다.
요약하여, 건강한 공여자 류코팩으로부터의 동결보존된 T 세포를 해동시키고, 48시간 동안 활성화시켰다. 그 다음, 세포를 Cas9(150 ㎍/㎖) 및 TCR을 표적화하는 sgRNA(TA-1; SEQ ID NO: 2/Cas9; SEQ ID NO: 1)(80 ㎍/㎖), 및 Cas9(150 ㎍/㎖) 및 β2M을 표적화하는 sgRNA(B2M-1; SEQ ID NO: 6/Cas9; SEQ ID NO: 1)(200 ㎍/㎖)를 포함하는 RNP 복합체의 존재 하에 전기천공시켰다. 전기천공법 후에, 세포를 20,000의 MOI로 rAAV로 형질도입한 다음, 정적 배양 용기에서 증량시켰다. 상세사항에 대해서는 상기 실시예 1 내지 4를 참조한다.
편집 후에, 세포를 증량을 위하여 정적 배양 용기에 166 K/㎠, 125 K/㎠, 또는 83 K/㎠로 씨딩하였다. 또 다른 세트의 세포를 편집 후 500 K/㎠로 씨딩하고, 추가의 증량을 위하여 편집 후 제3일, 제4일, 제5일, 제6일, 또는 제7일에 1:4 비(4개의 새로운 용기로 1개의 용기 분할)로 리플레이팅하였다. 리플레이팅 없이 500 K/㎠로 리플레이팅된 세포를 CTX110 참조물질 군으로서 사용하였다. 세포 밀도가 3-4x106개/㎖에 도달할 때까지 모든 군을 증량시켰으며, 이 때 세포를 수거하였다(표 23). 세포 계수 및 생존력을 1일 내지 3일마다 평가하였다.
Figure pct00044
대조군 CTX110 참조물질(리플레이팅되지 않았음)은 7일 내에 3-4x106개/㎖의 농도에 도달하였다(도 9a 및 도 9b). 제3일, 제4일 및 제5일("D3, D4, D5")에 리플레이팅된 세포는 10일 내에 약 3-4x106개/㎖ 세포 농도에 도달하였다(도 9a 및 도 9b). 제6일("D6") 및 제7일("D7")에 리플레이팅된 세포는 약 14일 내지 18일에 3-4x106개/㎖ 세포 농도에 도달하였다(도 9a 및 도 9b). D3, D4 및 D5는 D6 및 D7보다 약 4일 내지 8일 더 일찍 3.0-4.0x106개/㎖의 표적 세포 농도에 도달하였다. 166 K/㎠, 125 K/㎠, 또는 83 K/㎠로 플레이팅된 세포는 수거 점에 도달하는 데 10일, 11일 및 14일이 걸렸으며, 이는 참조물질 군보다 3일, 4일 및 7일 더 길었다.
도 10a 및 도 10b는 총 4.-4.5e8개의 세포가 제7일에 CTX110 참조물질로부터 수거된 한편, 제3일, 제4일, 제5일, 제6일 및 제7일 리플레이팅 군으로부터 수거된 총 세포 수는 1.3e9개 내지 2e9개였음을 보여주며, 이는 CTX110 대조군 참조물질보다 3배 내지 5배 더 많은 세포였다.
총 1.2e9개, 1.64e9개 및 2.32e9개의 세포가 166 K/㎠, 125 K/㎠, 또는 83 K/㎠ 플레이팅된 군으로부터 수거되었으며, 이는 CTX110 대조군 참조물질과 비교하여 3배 내지 6배 더 많은 세포였다.
모든 리플레이팅된 군 및 저밀도 플레이팅 군으로부터의 세포 생존력은 CTX110 참조물질과 유사하였다(도 11a 및 도 11b).
D3, D4 및 D5 리플레이팅, 166 K/㎠ 플레이팅 및 125 K/㎠ 플레이팅이 가장 적은 일수에 예상되는 수의 세포를 제공하는 것이 결정되었다.
CAR+%, TRAC-% 및 B2M-%를 포함하는 편집 효율을 모든 리플레이팅 및 저-플레이팅 군으로부터 평가하였다. (도 12a 내지 도 12c) CTX110 참조물질에서 CAR+%는 55.9%였다. D3, D4 및 D5 리플레이팅 군은 CAR+%를 57.9%, 56% 및 52.62%로 유지하는 한편, D6 및 D7은 38.65% 및 35.45%의 감소된 CAR+%를 초래하였다. 166 K/㎠, 125 K/㎠, 또는 83 K/㎠로부터의 CAR+%는 CTX110 참조물질로부터의 유의미한 변화 없이 59.3%, 54.9% 및 52.9%였다. CTX110 참조물질 군에서 TRAC-%는 94.24%였다. D3, D4 및 D5 리플레이팅 군 및 166 K/㎠ 플레이팅 군은 93.5%, 93.6%, 93.15% 및 93.9%로서 비슷한 TRAC-%를 유지하였다. TRAC-%의 약간의 감소는 125 K/㎠ 및 83 K/㎠에서 91.5% 및 91.2%로 관찰되었다. TRAC-%의 더 큰 감소는 D6 및 D7 리플레이팅 군에서 88% 및 87.2%로 관찰되었다. B2M-%에서도 유사한 경향이 입증되었다. CTX110 참조물질 군의 B2M-%는 77.93%였다. D3, D4 및 D5 리플레이팅 군 및 166 K/㎠ 플레이팅 군은 75.51%, 75.39%, 76.77% 및 76.31%로서 비슷한 TRAC-%를 유지하였다. B2M-%의 약간의 감소가 125 K/㎠ 및 83 K/㎠에서 71.74% 및 69.19%로 관찰되었다. B2M-%의 더 큰 감소가 D6 및 D7 리플레이팅 군에서 60.37% 및 58.29%로서 관찰되었다.
D3, D4 및 D5 리플레이팅, 166 K/㎠ 플레이팅 및 125 K/㎠ 플레이팅이 CTX110 참조물질과 가장 비슷한 편집 효율을 제공하는 것이 결정되었다.
리플레이팅된 집단의 세포 표현형을 실시예 8 및 표 19에 기재된 바와 같이, CD95, CD45RO, CD57, CD27 및 CCR7을 제외하고, Tim3을 포함하는 유동 패널을 사용하여 결정하였다. 도 13a 및 도 13b는 리플레이팅 집단 및 CTX110 참조물질에서의 CD4+ 대 CD8+ 세포의 비를 보여준다. CD4 대 CD8의 비는 D3, D4 및 D5 리플레이팅 군 및 166k 및 125k 저 밀도 플레이팅 군에서 잘 유지되었다. 증가된 CD8+ 세포가 D6 및 D7 리플레이팅 군 및 83K 저 밀도 플레이팅 군에서 관찰되었다.
리플레이팅된 집단을 기억 세포 마커에 대하여 평가하였다. CAR+, CD4+CAR+, 및 CD8+CAR+ 집단 내에서, CD45RA+CD62L+ 세포, CD45RA-CD62L+ 세포, CD45RA-CD62L- 세포 및 CD45RA+CD62L- 세포는 각각 나이브 T 세포, 중심 기억(CM) T 세포, 이펙터 기억(EM) T 세포 및 말단 이펙터(TE) T 세포로 정의되었다. CTX110 생성물 내의 이들 집단을 하위세트로 정의하였다. 도 14a 내지 도 14f는 리플레이팅 집단 및 저 밀도 플레이팅 군에서 관찰되는 하위세트 조성물을 보여준다. CAR+, CD4+CAR+ 및 CD8+CAR+ 집단 내에서, 대부분의 리플레이팅 및 저 밀도 플레이팅 군은 감소된 나이브 T 세포를 보였다. 감소된 중심 기억 T 세포가 D6 및 D7 리플레이팅 군에서 검출되었지만, D3, D4, 및 D5 리플레이팅 군에서는 유의미하지 않았다. 대부분의 군은 증가된 이펙터 기억 T 세포를 보였다. 증가된 최종 분화 세포는 CAR+ 및 CD8+CAR+ 세포에서 관찰되었지만, 대부분의 CD4+CAR+ 세포에서는 그렇지 않았다.
도 15a 내지 도 15f에 나타낸 바와 같이, 낮은 수준의 소진 마커가 CAR+, CD4+/CAR+ 및 CD8+/CAR+ 리플레이팅 집단에서 관찰되었다. 실험 중 하나에서, CTX110 참조물질과 비교하여, D6 및 D7 리플레이팅 세포에서 증가된 LAG3 발현이 존재하였다(도 15a 및 도 15c). 종합적으로, 모든 3개의 소진 마커(PD1, LAG3 및 TIM3)에서 증가된 발현이 존재하지 않았다. 모든 군에서 PD1 발현이 존재하지 않거나, 매우 낮은 PD1 발현이 존재하였다.
시험관 내 세포 사멸 검정
다음으로, CD19 양성 Raji 표적 세포를 사멸시키는 리플레이팅 및 저-플레이팅 밀도 군에서의 CAR-T 세포의 능력을 유세포측정-기반의 세포독성 검정을 사용하여 평가하였다. 요약하여, 표적 세포를 eFluor670으로 표지하고, 다양한 비로 CAR-T 세포와 함께 인큐베이션시켰다. 대조군 샘플과 비교하여 표지된 세포를 라이브 게이트에서 평가함으로써 CTX110 세포독성을 24시간에 분석하였다. 결과는 도 16a 내지 도 16c에 나타나 있다. CTX110의 모든 리플레이팅 및 저-밀도 플레이팅 군은 CTX110 참조물질과 유사한 수준으로 용량 의존적인 표적 세포 세포독성을 보였다.
요약하여, 이들 시험관 내 결과는 D3, D4 및 D5 리플레이팅, 및 166 K/㎠ 및 125 K/㎠의 씨딩 밀도가 CTX110 참조물질과 같이 충분한 증량, 편집 효율 및 세포독성을 제공하였음을 보여준다.
생체 내 연구
다음으로, 마우스에서 종양을 사멸시키는 리플레이팅 및 저-밀도 플레이팅 군에서의 CAR-T 세포의 능력을 2개의 독립적인 연구에서 생체 내에서 연구하였다(표 24 및 표 25). Nalm6-Fluc-GFP 종양 세포를 CAR-T 투여 4일 전에 CIEA NOG 마우스 내로 접종하였다. 주별 생물발광(BLI, 광자/s) 평가는 마우스에서의 종양 버든의 평가를 가능하게 한다. 생체 내 연구 #1에서, D5, D6 및 D7 리플레이팅, 및 CTX110 참조물질을 마우스당 2e6개, 4e6개 및 10e6개의 CAR+ 세포의 용량으로 투여하였다. 군마다 그리고 용량마다 6마리의 마우스가 포함되었다. 미처리 마우스를 음성 대조군으로 사용하였다. 생체 내 연구 #2에서, 저-밀도 플레이팅 군(166 K/㎠, 125 K/㎠ 및 83 K/㎠) 및 리플레이팅 군(D3, D4 및 D6 리플레이팅)을 마우스당 4e6개의 CAR+ 세포의 용량으로 투여하였다. 군마다 4마리의 수여자가 포함되었다.
Figure pct00045
Figure pct00046
생체 내 연구 #1은 모든 3가지 용량에서 D5 리플레이팅 군 및 CTX110 참조물질 간에 유사한 생존을 나타내었다. (도 17a 내지 도 17c) 83 K/㎠ 및 166 K/㎠ 플레이팅 군 및 D4 리플레이팅 군은 다른 시험 군 및 CTX110 참조물질과 비교하여 손상된 생존을 가졌다. (도 17d) 생존 중간값이 표 26 및 표 27에 열거되어 있다.
Figure pct00047
Figure pct00048
둘 모두의 연구에서 미처리 마우스로부터의 BLI는 주변-이환(peri-morbidity) 조건에 도달하였으며, 이는 제25일 및 제18일의 높은 종양 버든을 나타낸다. 연구 #1에서, D6 및 D7 리플레이팅 군은 모든 3가지 용량(각각 마우스당 2e6개, 4e6개 및 10e6개의 CAR+ 세포; 도 18a 내지 도 18c)에서 D5 및 CTX110 참조물질과 비교하여 BLI의 더욱 조기의 증가를 보였다. D5 및 CTX110 참조물질은 유사한 종양 성장 역학을 보였다. 연구 #2에서, 83 K/㎠ 플레이팅 군은 CTX110 참조물질보다 더욱 신속한 종양 성장을 보였다. 모든 다른 시험군은 CTX110 참조물질과 비교하여 유사하거나 또는 심지어 지연된 종양 성장을 보였다(도 18d).
생존 중간값 및 BLI에 따라, D5 리플레이팅 군은 CTX110 참조물질과 같은 생체 내 효능을 유지하였으나, D6 및 D7 리플레이팅 군은 그렇지 않았다.
증량 기간, 수율, 편집, 소진/하위세트 마커, 시험관 내 및 생체 내 효력을 사용하여 최적의 씨딩 밀도 및/또는 리플레이팅 조건을 결정하였다. 분석의 요약은 표 28에 나타나 있다. 제5일에 1:4 비의 리플레이팅은 유리한 증량 및 편집 효율을 제공하였다.
Figure pct00049
실시예 10: 개선된 세포 증량
(A) 증가된 CTX110 및 CTX 120 세포 증량 산출을 위한 최적화된 전기천공법
본 개시에 기재된 바와 같은 방법은 전기천공법을 사용하여, 예를 들어, Cas9 및 가이드 RNA 복합체를 포함하는 다양한 리보핵단백질(RNP) 복합체를 포함하는 다양한 핵산 및 폴리펩티드를 수여자 T 세포에 전달한다. 다양한 제조처로부터의 임의의 적합한 전기천공법 기기가 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있기 때문에, 전기천공법 공정에 사용되는 기기는 특별히 제한되지 않는다. 전기천공법에 사용되는 세포 씨딩 밀도는 특별히 제한되지 않는다.
본 실시예는 효율적인 편집을 유지하면서, 더 큰 부피를 유지할 수 있는 카세트에서 증가된 수의 세포를 전기천공시킬 수 있는 전기천공법 기기를 사용한다. 더 큰 전기천공법 용량은 형질도입 및 증량을 위하여 더 많은 수의 편집된 세포를 제공함으로써, 임의의 제공된 조작된 T-세포, 예를 들어, CTX110 또는 CTX120 조작된 T-세포 생성물의 산출을 예를 들어, 2배만큼 증가시킨다. 이 증가된 용량이 세포 배가 및 또는 공정 기간을 연장할 필요 없이 제공되기 때문에, 이는 제조에서 유리하다.
예를 들어, 추가의 세포가 추가의 T-세포 배양 용기(5000 ㎖ 배지 용량을 갖는 500 ㎠ 기체 투과성 막 표면적), 예컨대 2개 이상의 추가의 배양 용기를 씨딩하는 데 이용 가능하다. 예를 들어, 증가된 수의 세포를 사용하여, 최대 4x 배양 용기가 씨딩될 수 있으며, 여기서, 300e6 ≤ x ≤ 600e6개의 세포가 2x 배양 용기에 씨딩될 수 있거나, 600e6 ≤ x ≤ 800e6개의 세포가 3x 배양 용기에 씨딩될 수 있거나, 800e6개 이하의 세포가 4x 배양 용기에 씨딩될 수 있다.
일부 양태에서, 배양 용기당 약 400,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠를 씨딩한다. 대안적으로, 배양 용기당 약 250,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 300,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 250,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 500,000개 세포/㎠가 씨딩되거나, 배양 용기당 약 150,000개 세포/㎠ 내지 600,000개 세포/㎠가 씨딩된다.
일부 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 적어도 약 150,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 250,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 300,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 400,000개 세포/㎠, 또는 적어도 약 500,000개 세포/㎠이다.
일부 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 약 250,000개 세포/㎠이다. 다른 양태에서, 표적 씨딩 밀도는 약 500,000개 세포/㎠이다.
최대 1 ㎖의 부피를 유지할 수 있는 전기천공법 카세트가 사용될 수 있다. 이 시스템을 사용하여, 2.7 x 109개의 세포를 최대 7개의 G1000 카세트에서 전기천공시킬 수 있다. 3 ㎖ 주사기에 부착된 일회용 블런트 팁 니들을 사용한 카세트로부터의 세포의 회수는 삼각 플라스크 내로의 마이크로피펫 팁의 방출의 위험을 없앨 것이다.
더 큰 용량을 갖는 시스템의 이용도 또한 세포 형질도입 단계를 용이하게 한다. 형질도입을 위한 현재의 최대 7e8개의 세포에서 1.4e9개의 세포로의 배가는 증량을 위하여 최대 4개의 세포 배양 용기를 씨딩하기에 충분한 물질을 생성한다. 따라서, 고정된 제9일 고갈을 유지하여, 효율적으로 동일한 양의 처리 시간에 실행당 산출량을 최대 배가시킬 수 있다.
실시예에서 다른 단계는 상기로부터 변경시키지 않았다.
(B) 약품 수율을 증가시키기 위한 3개의 T-세포 공여자 롯트를 사용한 방법 최적화 및 비교
이 섹션에는 증가된 증량 방법의 강건성을 입증하고, 현재의 약품(DP) 유사 물질과 선택된 세포 배양 조건 간의 비교가능성 분석을 위한 물질을 생성하기 위한 1x, 2x, 4x 및 제4일 분할과 함께 4x의 CAR T 세포의 생성이 기재된다.
이 뱃치를 위한 출발 물질은 3개의 건강한 공여자 성분채집술 롯트로부터의 CD4/CD8 T 세포 선택이었다. 선택된 증량 조건의 CTX110 CAR T 세포를 G-Rex 500M-CS 챔버에 씨딩하였다.
G-Rex500M-CS에서의 이전의 CTX110 CAR T 증량 씨딩 및 수거 세포 밀도는 각각 500,000개/㎠ 및 30 x 106개/㎠였으며, 이는 30x109개 이하의 CAR T 세포를 생성하였다. G-Rex500M-CS 배양 용기에서 CAR T 세포의 DP 수율을 증가시키기 위하여, 본 실시예를 개발하였다. 하기 표 29에 기재된 3개의 선택 조건을 선택하여, 3명의 상이한 공여자를 사용하여 CTX110 DP-유사 비교 가능성을 평가하고, 다수의 하류 분석 검정을 위하여 충분한 샘플 세포를 생성하였다.
Figure pct00050
상세한 프로토콜은 하기에 제공되어 있다.
a. 전체 CTX110 DS 공정을 위하여 모든 배양 배지, GMP IL-2 및 GMP IL-7을 제조하며, 여기서:
1. T 세포를 전체 대규모(3x G-Rex500M-CS)에 따라 활성화시켰다
2. CAR T 세포를 1x G-Rex500M-CS 및 1x웰을 갖는 소규모(1x 웰 GRex6M)에서 증량을 위해 선택된 씨딩 밀도로 씨딩하였다
3. CAR T 세포를 조건마다 1/2 대규모, 1x G-Rex500M-CS에 따라 고갈 후 씨딩하였다
b. 적절한 수의 T 세포를 해동시켜, 전체 대규모(3x G-Rex500M-CS)를 수행한다.
c. 적절한 수의 T 세포를 활성화시켜, 전체 대규모(3x G-Rex500M-CS)를 수행한다.
d. 활성화제를 희석한다.
e. 전체 대규모(3x G-Rex500M-CS)에서 전기천공법(EP)을 위하여 세포를 수거한다.
f. 2,040x106개 내지 2,160x106개의 T 세포의 전기천공법(17 내지 18개의 OC400 카세트).
g. 6 웰 Falcon 플레이트의 2 x 웰 간에 동일하게 세포를 전달하고, 20분 동안 인큐베이션시킨다.
h. 시험관 내 효능 +EP -AAV 대조군을 위하여 EP T 세포를 희석하고, 소규모(1x 웰 G-Rex6M)에서 5.0x106개의 총 세포를 씨딩한다.
i. 1,000x106개의 T 세포를 형질도입한다.
j. 적절한 수의 T 세포를 증량을 위하여 적절한 배양 용기에 씨딩한다:
1. S1: G-Rex500M-CS 내에 씨딩된 250x106개의 총 세포, 소규모(1x 웰 G-Rex6M)에서 5.0x106개의 총 세포.
2. S2: G-Rex500M-CS 내에 씨딩된 125x106개의 총 세포, 소규모(1x 웰 G-Rex6M)에서 2.5x106개의 총 세포.
3. S3: G-Rex500M-CS 내에 씨딩된 62.5x106개의 총 세포, 소규모(1x 웰 G-Rex6M)에서 1.25x106개의 총 세포.
4. S4: G-Rex500M-CS 내에 씨딩된 250x106개의 총 세포, 소규모(1x 웰 G-Rex6M)에서 5.0x106개의 총 세포.
k. 각각의 조건 사양에 따라 CAR T 증량을 수행한다:
1. S1: 100IU/㎖의 IL-2 및 100IU/㎖의 IL-7을 G-Rex500M-CS 및 G-Rex6M 웰에 3일마다 1회 보충한다. TCRab 유동 패널을 위하여 G-Rex6M으로부터 샘플을 빼내고, 증량 제7일에 TCRab 고갈 처리한다.
2. S2: 100IU/㎖의 IL-2 및 100IU/㎖의 IL-7를 G-Rex500M-CS 및 G-Rex6M 웰에 3일마다 1회 보충한다. TCRab 유동 패널을 위하여 G-Rex6M으로부터 샘플을 빼내고, 증량 제8일에 TCRab 고갈 처리한다.
3. S3: 100IU/㎖의 IL-2 및 100IU/㎖의 IL-7를 G-Rex500M-CS 및 G-Rex6M 웰에 3일마다 1회 보충한다. TCRab 유동 패널을 위하여 G-Rex6M으로부터 샘플을 빼내고, 증량 제9일에 TCRab 고갈 처리한다.
4. S4:
a. 증량 제4일:
a. GathRex 펌프를 사용하여 G-Rex500M-CS로부터 상청액을 제거하고 세포를 수거하고, 세포의 부피를 기록한다.
b. 중력에 의해, 새로운 G-Rex500M-CS에 5000 ㎖의 배양 배지를 채우고 수거된 세포 부피의 1/4을 채워진 배양 용기에 씨딩한다. 배양 용기를 인큐베이터로 복귀시킨다.
c. 혈청학적 피펫을 사용하여, G-Rex6M의 새로운 단일 웰을 75 ㎖의 배양 배지로 채웠다. 혈청학적 피펫을 사용하여, G-Rex6M 웰에서 세포를 균질화하고 25 ㎖의 세포를 채워진 배양 용기로 전달한다. 배양 용기를 인큐베이터로 복귀시킨다.
b. 100IU/㎖의 IL-2 및 100IU/㎖의 IL-7를 G-Rex500M-CS 및 G-Rex6M 웰에 3일마다 1회 보충한다. TCRab 유동 패널을 위하여 G-Rex6M으로부터 샘플을 빼내고, 형질도입 후 증량 제9일에 TCRab 고갈 처리한다.
l. 1/2 대규모(1x G-Rex500M-CS)에서 TCRab 고갈을 수행한다. 적절한 유동 분석을 위하여 고갈-전 샘플을 수득한다.
m. 적절한 유동 분석을 위하여 고갈-후 샘플을 수득하고, 고갈-후 표적 T 세포를 씨딩하여, 1/2 대규모(1x G-Rex500M-CS)를 수행한다.
n. 1/2 대규모(1x G-Rex500M-CS)에서 수거를 수행한다. 수거 세포 계수 및 고갈-후 수득된 %CAR+에 기초하여:
1. DP 제형 생존 가능 세포 농도를 계산한다:
Figure pct00051
2. 수거된 총 생존 가능 세포 수를 DP 제형 농도로 나누어, 표적 세포 농도에 도달하는 데 필요한 부피를 계산한다:
Figure pct00052
3. 세포를 0.5x 표적 부피로 재현탁화시킨다.
4. 재현탁화된 세포 펠렛에서 두번째 세포 계수를 수행한다.
5. 표적 생존 가능 세포 농도에 도달하도록 세포를 재현탁화시키기 위한 나머지 부피를 계산한다.
6. 수거 세포 계수 계산에 기초하여 표적 세포 농도로 희석한다.
o. 추가의 유동 특성화 및 비교 가능성 분석을 위하여 적절한 수의 세포를 동결보존한다.
(C) 세포 독성 검정에 의해 평가되는 세포 증량 최적화의 시험관 내 효능
본 실시예에는 상기 실시예 (B)에서 제조된 세포의 시험관 내 효능 세포 독성 검정이 기재된다. 검정에서는 동시-배양 검정에서 생존 가능 세포의 절대적인 양을 측정한다.
Raji 표적 암 세포(CD19+)를 eFluor 670(APC 채널) 증식 염료로 표지하고, 웰당 50K개 세포로 플레이팅하였다. 다양한 비의 비표지된 이펙터 CAR T 세포를 시험된 각각의 조건에 대하여 첨가하였다. 이펙터 CAR T 세포에 의한 표적 세포의 세포 사멸을 DAPI 생/사 염색(Pacific Blue 채널)에 의해 24시간의 배양 후에 측정하였다. 계수 비드를 유동 분석 동안 첨가하여, 샘플 간에 정규화시켰다. 시험 샘플 내의 생존 가능 세포(DAPI 음성)의 수를 나열하고, 표적 세포를 단독으로 함유하는 웰에서의 생존 가능 세포의 수에 대하여 정규화시켜, 세포 용해의 백분율을 계산하였다. CAR-T에 의한 배양 배지 내로의 사이토카인 방출을 멀티플렉스 ELISA 검정(Luminex)에서 분석하였다.
이들 실험은 2x 및 4x CTX110 제조 조건에 대하여 1x를 평가하였다. 3명의 상이한 공여자로부터의 T-세포를 병렬로 분석하였다. 시험관 내 효능을 2가지 메트릭스에 의해 확인하였으며, 이는 24시간 세포 독성 검정 및 사이토카인 생성에 의한 것이었다.
Figure pct00053
도 20은 CAR T-세포 용해의 측정에 의한 검정 대조군 FACS 분석을 보여준다. CAR T-세포는 CTX110 CAR T-세포였다. T-세포의 81%는 CAR+였다.
도 21a 내지 도 21c는 시험관 내에서 세포 용해 및 사이토카인 생성을 측정하는 검정 대조군 실험의 결과를 보여준다. 검정은 동결된 원액으로부터 해동된 CTX110 CAR-T 세포를 사용하였다. T-세포는 HDR 후 제6일에 80% CAR+였다.
도 22a 내지 도 22c는 3명의 공여자의 각각으로부터 유래된 T-세포가 1x, 2x 및 4x 배양 조건에서 다양한 정도의 시험관 내 효능을 가졌음을 보여주는 시험관 내 효능 분석의 결과를 보여준다.
도 23a 내지 도 23c는 상이한 세포 농도에서의 세포 용해의 분석의 결과를 보여주며, 이는 공여자 1 및 2로부터 유래된 세포가 상이한 백분율의 CAR+ 세포에도 불구하고, 유사한 반응을 보였음을 나타낸다.
도 24a 및 도 24b는 CAR+ 세포에 대하여 정규화되는 경우, 3명의 공여자로부터의 세포 용해의 분석의 결과를 보여준다. 공여자 2 및 3은 CAR 세포를 정규화시킨 경우 검정에서 유사하게 거동하였다. 검정을 공여자 2에 대하여 동일한 E:T 비로 2x CAR-T 세포 수를 사용하여 반복하였다.
IFNγ 생성을 또한 ELISA에 의해 상청액에서 측정하였다. IFNγ 사이토카인 분석은 E:T 비와 관련된 용량 반응에 관한 세포 사멸 결과를 반영하였으며, 공여자 반응 간에는 일부 가변성이 있었다. IL2 측정치는 공여자들 간에 더욱 가변적이었다. 유의미하게 더 낮은 IL2 생성이 공여자 2 세포에 대한 배지에서 관찰되었다.
요약하여, 평가된 각각의 공여자에 대하여, 2x 및 4x 배양 조건 둘 모두는 1x 제조 프로토콜과 유사한 시험관 내 효능을 보인다.
(D) 세포 증량 최적화의 생체 내 효능(생체 내 생존 분석)
CTX110 세포를 상기 실시예 (C)에 따라 제조하고, 하기 표 31에 나타낸 바와 같이, Nalm6 이종이식편 종양 모델에서 4e6개의 용량의 CAR+ T 세포를 마우스에 투여하였다. Nalm6-Fluc-GFP 종양 세포를 CAR-T 투여 4일 전에 CIEA NOG 마우스 내로 접종하였다. 주별 생물발광(BLI, 광자/s) 평가는 마우스에서의 종양 버든의 평가를 가능하게 한다.
Figure pct00054
모든 3명의 공여자 및 증량 조건에 있어서, CAR+ 세포를 투여한 동물은 미처리 대조군 세포를 투여한 동물과 달리, 제38일에 계속 생존한다.
Figure pct00055
실시예 11 : 키메라 항원 수용체를 발현하는, TRAC 및 β2M 유전자가 유전학적으로 파괴된, 유전학적으로 조작된 T 세포를 제조하기 위한 방법
하기에는 CRISPR-Cas9(클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부/CRISPR 연관 단백질 9) 유전자 편집 구성성분(sgRNA(단일 가이드 RNA) 및 Cas9 뉴클레아제)을 사용하여 생체 외에서 유전학적으로 변형된 인간 동종이계 T 세포로 구성된 T 세포 면역요법의 제조를 위한 예시적인 공정이 기재된다.
변형은 TRAC 및 β2M 유전자좌의 표적화된 파괴, 및 재조합 아데노-연관 바이러스 벡터(예를 들어, 항원 유도된 키메라 T 세포 항원 수용체를 인코딩하는 혈청형 6 rAAV)를 사용한 TRAC 유전자좌 내로의 키메라 항원 수용체(CAR) 전이유전자의 삽입을 포함한다.
제조 공정은 도 19에 예시되어 있다. 박테리아 유래 Cas9 뉴클레아제; 2개의 단일 가이드 RNA(sgRNA), TRAC 유전자좌를 표적화하는 하나의 sgRNA(예를 들어, TA-1) 및 β2M 유전자좌를 표적화하는 제2 sgRNA(예를 들어, B2M-1)를 포함하는 출발 물질의 구조적 정보는 본원에 제공되어 있다. rAAV 벡터 내의 CAR의 예시적인 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열도 또한 제공된다.
T 세포 농축
T 세포를 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 항-CD8 및 항-CD4 항체-코팅된 자성 비드의 혼합물을 사용하여 자성 분리를 통해 백혈구성분채집술 물질(류코팩)로부터 농축시켰다. 농축 전에, 류코팩을 세포 계수 및 생존력(80% 이상)을 위하여 샘플링하였다. 농축된 세포를 HSA가 존재하는 PBS/EDTA 완충제에서 단리한 다음, 세포 계수, 생존력(80% 이상), T 세포 순도(70% 이상 CD3) 및 무균성을 위하여 샘플링하였다.
T 세포 동결보존
이어서, 세포를 4 ± 1℃에서 원심분리하고, 50×106개의 생존 가능 세포/㎖의 표적 농도로 CryoStor CS5 중에 재현탁화시켰다. 세포를 세포 계수, 생존력(80% 이상)을 위해 샘플링한 다음, 2,500×106개 세포/백(30 내지 70 ㎖의 세포 현탁액)의 표적 세포 수로 에틸 비닐 아세테이트 냉동백 내로 분취하였다. 1 내지 2개의 백의 T 세포를 생성하는 데 하나의 류코팩이 충분하였다. 각각의 백을 열-밀봉하고, 표지하고, 제어-속도 냉동기로 옮길 때까지 2 내지 8℃에서 보관한 다음, 보관을 위하여 증기상 액체 질소로 옮겼다.
T 세포 해동 및 활성화
하나의 동결된 백의 농축된 T 세포를 해동시키고, 3ℓ 백으로 옮기고, 보충된 X-VIVO™ 15 배지(X-VIVO™ 15, 5% 인간 혈청, 100 IU/㎖ rhIL2, 100 IU/㎖ rhIL7) 내로 희석하였다. 세포를 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위하여 샘플링하였다. 세포를 540 g에서 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 그 다음, 세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지 중에 재현탁화시키고, 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위해 샘플링하였다. 재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 가용성 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스 용액을 1:12.5(v/v)의 비로 첨가하여, 세포를 활성화시켰다.
세포를 2개의 정적 세포 배양 용기 내에, 각각 대략 500 ㎖의 총 부피의 보충된 X-VIVO™ 15 배지/재조합 인간화된 CD3 및 CD28 효능제에 컨쥬게이트된 콜로이드성 폴리머 나노매트릭스로, 2×106개의 생존 가능한 세포/㎖의 표적 밀도로 씨딩하였다. 정적 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 48 ± 4시간 동안 인큐베이션시켰다. 공정 내내 정적 배양 용기를 취급할 때는 언제나, 이들을 구멍 및 누수, 및 투명한 황색 배지의 존재에 대하여 검사하였다.
희석
이틀(2일) 후에, 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 각각의 정적 배양 용기에 5 ℓ까지 첨가하였다. 세포를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 추가로 인큐베이션시켰다.
전기천공법 및 형질도입
전기천공법을 위한 제제에서, 보충된 X-VIVO™ 15 배지의 부피를 정적 배양 용기 내의 딥-튜브에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰으며, 배지 내로의 세포의 재현탁화를 가능하게 하도록 온건하게 와류시켰다. 세포를 세포 계수 및 생존력(70% 이상)을 위해 샘플링하였다. 세포를 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮기고, 540 g에서, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시키고, 동일한 조건 하에 다시 원심분리하였다. 세포를 두번째로 300×106개 세포/㎖의 표적 농도로 전기천공법 완충제 중에 재현탁화시켰다.
개별 마이크로원심분리용 튜브에서 Cas9 뉴클레아제를 TRAC를 표적화하는 sgRNA와 혼합하거나, Cas9 뉴클레아제를 β2M을 표적화하는 sgRNA와 혼합하였다. 각각의 용액을 10분 이상 동안 실온에서 인큐베이션시켜, 각각의 리보핵단백질 복합체(RNP)를 형성하였다. 2가지 Cas9/gRNA 혼합물을 조합하고, 세포와 혼합하여, Cas9, TRAC sgRNA 및 B2M sgRNA가 각각 0.3 ㎎/㎖, 0.08 ㎎/㎖ 및 0.2 ㎎/㎖의 최종 농도가 되게 하였다. 혼합물을 피펫팅에 의해 분취하고, 전기천공법 카세트 내로 로딩하였다. 카세트를 캡핑하고, 순차적으로 트랜스펙션 시스템을 사용하여 정적 전기천공법에 의해 전기천공시켰다. 전기천공법 후에, 세포를 125 ㎖ 삼각 플라스크에서 각각의 카세트로부터 풀링하고, 37℃에서 20분 이상 동안 인큐베이션시켰다. 세포를 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하였다.
형질도입을 하기와 같이 수행하였다. 세포를 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 107개 세포/㎖로 희석하고, 신선하게 해동된 rAAV를 20,000 vg/세포의 MOI로 첨가하였다. 세포를 37℃ 5% CO2에서 60분 이상 동안 인큐베이션시켰다.
상동성 지정-수선(HDR)은 DNA 이중 가닥 파단부에 대한 고충실도 세포 수선 메커니즘이다. HDR은 CAR 유전자의 각각의 말단 상의 상동성 서열을 사용함으로써 AAV 주형으로부터의 CAR 유전자를 원하는 TRAC 유전자좌 내로 도입하기 위해 사용된다.
세포 증량
세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지를 사용하여 희석하고, 세포 생존력(70% 이상) 및 계수를 위하여 샘플링하고, 2개의 정적 배양 용기 및 하나의 추가의 정적 배양 용기 내로 0.2-0.5 × 106개의 생존 가능 세포/㎠의 밀도로 씨딩하였다(세포 모니터링을 위한 위성 배양물). 정적 배양 용기를 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 인큐베이션시켰다. 세포 배양물을 최대 9일 동안 인큐베이션시켰다. 이 시간 동안 배양물에, 배양 부피 ㎖당 100 IU의 rhIL2 및 rhIL7를 3일 내지 4일마다 보충하였다. 위성 정적 세포 배양 용기를 증량 내내 세포 계수, 생존력 및 T 세포 순도에 대하여 시험하였다. 위성 배양 용기 내의 세포 밀도가 대략 30×106개/㎠에 도달하는 때, TCRαβ 고갈을 수행하였다. 위성 배양 용기에서 세포 밀도가 30×106개/㎠에 도달하지 않았다면, 주요 배양물에서 TCRαβ 고갈을 제9일에 수행하였다.
TCRαβ 고갈
각각의 정적 세포 배양 용기의 배지를 정적 배양 용기 내의 딥-튜브에 연결된 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피로 감소시켰다. 대량의 배지를 제거한 후에, 정적 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포를 배지 중에 재현탁화시켰다.
세포를 정적 배양 용기에 연결하는 딥-튜브와 핏팅된 500 ㎖ 원심분리용 튜브로 옮겼다. 세포를 생존력(70% 이상), 계수 및 %CAR+ 세포를 위하여 샘플링하였다. 그 다음, 세포를 540 x g에서, 20 ± 1℃에서 15분 동안 원심분리하였다. 세포 펠렛을 재현탁화시키고, 0.5% HSA를 함유하는 650 ㎖ 미만의 PBS/EDTA 중에 풀링하였다. 세포 현탁액을 멸균 백으로 옮겼으며, 이는 자동화 세포 처리 시스템에 연결된다. 자동화 세포 처리 시스템에서, 세포를 비오틴-컨쥬게이트된 항-TCRαβ 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 세척하고, 항-비오틴 자성 비드와 함께 인큐베이션시켜, 자동화 세포 처리 시스템을 사용하여 TCRαβ+ 세포의 고갈을 가능하게 하였다. 세포를 세포 계수, 생존력(70% 이상) 및 %CAR+ 세포(30 내지 40% 이상)에 대하여 시험하였다.
세포 회복
고갈된 세포를 보충된 X-VIVO™ 15 배지 중에 재현탁화시키고, 3ℓ 백(들)으로 옮기고, 정적 세포 배양 용기(들) 내로 씨딩하고, 37 ± 1℃ 및 5 ± 1% CO2에서 하룻밤 인큐베이션시켰다.
세포 수거(약물 물질)
세포를 수거하기 위하여, 정적 배양 용기를 인큐베이터로부터 제거하고, 세포의 침강을 위하여 휴지되게 하였다. 성장 배지를 펌프를 사용하여 대략 500 ㎖의 최종 부피까지 각각의 정적 배양 용기로부터 제거하였다. 제거된 배지를 무균성을 위해 샘플링하였다. 정적 배양 용기를 온건하게 와류시켜, 세포가 배지 중에 재현탁화되게 하였다. 각각의 정적 배양 용기의 내용물을 펌프를 사용하여 3 ℓ 전달 백으로 옮기고, 중력에 의해 40 ㎛ 수혈 필터를 통해 개별 무균 3 ℓ 백 내로 여과하였다. 세포를 농도 및 생존력을 위하여 샘플링하였다.
균등물
본 발명의 여러 실시형태가 본원에 기재되고 예시되었지만, 당업자는 기능을 수행하고/수행하거나 본원에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 용이하게 구상할 것이고, 이러한 각각의 변화 및/또는 수정은 본원에 기재된 본 발명의 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 여겨진다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기재된 모든 파라미터, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것을 의미하고, 실제 파라미터, 치수, 재료 및/또는 구성이 본 발명의 교시(들)가 이용되는 특정 적용 또는 적용들에 좌우될 것임을 용이하게 인지할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 이용하여 본원에 기재된 구체적인 본 발명의 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 알아낼 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 이에 대한 균등물의 범위 내에서 본 발명의 실시형태는 구체적으로 기재되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시의 발명의 실시형태는 본원에 기재된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 둘 이상의 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트, 및/또는 방법이 서로 일치하지 않는 경우, 둘 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합은 본 개시의 발명의 범위 내에 포함된다.
본원에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전 정의, 참조로 포함된 문서의 정의, 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미보다 우선되는 것으로 이해되어야 한다.
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본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 단수형 부정 관사는 달리 상반되게 명백히 표시되지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 문구 "및/또는"은 이와 같이 결합된 요소, 즉, 일부 경우에 결합적으로 존재하고 다른 경우에 별개로 존재하는 요소 중 "어느 하나 또는 둘 모두"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 다수의 요소들은 동일한 방식으로, 즉, 이와 같이 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 확인된 요소와 관련이 있는지 여부와 관계없이 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 확인된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및/또는 B"에 대한 언급은 "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때, 일 실시형태에서, A만(선택적으로 B 이외의 요소 포함); 또 다른 실시형태에서, B만(선택적으로 A 이외의 요소 포함); 추가의 또 다른 실시형태에서, A와 B 둘 모두(선택적으로 다른 요소 포함) 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는 "또는"은 상기 정의된 바와 같은 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인, 즉, 다수의 요소들 또는 요소들의 목록, 및, 선택적으로 추가의 나열되지 않은 항목 중 하나 초과를 포함하여 적어도 하나를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같이 상반되게 분명히 지시되는 용어, 또는 청구범위에서 사용되는 경우, "~로 이루어진"이 다수 요소들 또는 요소들의 목록 중 정확히 하나의 요소의 포함을 지칭할 것이다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 용어 "또는"은 "~ 중 어느 하나", "~ 중 하나", "~ 중 하나만", 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배제적인 용어가 선행하는 경우에 배제적인 대안(즉, "둘 모두가 아니라 하나 또는 다른 하나")을 지시하는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어진"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에서 본원에 사용되는, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 문구 "적어도 하나"는, 요소의 목록의 임의의 조합의 요소를 배제하지 않고, 반드시 요소의 목록 내에 구체적으로 나열되는 각각의 및 모든 요소 중 적어도 하나를 포함하지는 않는, 요소의 목록에서 어느 하나 이상의 요소로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이러한 정의는 또한, 구체적으로 확인된 요소들과 관련이 있든 아니든 간에, 문구 "적어도 하나"가 지칭하는 요소들의 목록 내에서 구체적으로 확인된 요소들 이외의 요소들이 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 허용한다. 따라서, 비-제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는, 동등하게, "A 또는 B 중 적어도 하나", 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서, B가 존재하지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A(및 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A가 존재하지 않으면서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 추가의 또 다른 실시형태에서, 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하여 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소를 포함함) 등을 지칭할 수 있다.
또한, 달리 상반되게 분명히 지시되지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 조치를 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 조치의 순서는 반드시 방법의 단계 또는 조치가 언급되는 순서로 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CRISPR Therapeutics AG <120> MANUFACTURING PROCESS FOR MAKING T CELLS EXPRESSING CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS <130> 095136-0144-002WO1 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/934,991 <151> 2019-11-13 <160> 76 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1368 <212> PRT <213> Streptococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val 1 5 10 15 Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe 20 25 30 Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile 35 40 45 Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu 50 55 60 Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser 85 90 95 Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys 100 105 110 His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr 115 120 125 His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val 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Phe 340 345 350 Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser 355 360 365 Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp 370 375 380 Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg 385 390 395 400 Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu 405 410 415 Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe 420 425 430 Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile 435 440 445 Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp 450 455 460 Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu 465 470 475 480 Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr 485 490 495 Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser 500 505 510 Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys 515 520 525 Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln 530 535 540 Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr 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Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 76 <211> 4364 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 76 gagatgtaag gagctgctgt gacttgctca aggccttata tcgagtaaac ggtagtgctg 60 gggcttagac gcaggtgttc tgatttatag ttcaaaacct ctatcaatga gagagcaatc 120 tcctggtaat gtgatagatt tcccaactta atgccaacat accataaacc tcccattctg 180 ctaatgccca gcctaagttg gggagaccac tccagattcc aagatgtaca gtttgctttg 240 ctgggccttt ttcccatgcc tgcctttact ctgccagagt tatattgctg gggttttgaa 300 gaagatccta ttaaataaaa gaataagcag tattattaag tagccctgca tttcaggttt 360 ccttgagtgg caggccaggc ctggccgtga acgttcactg aaatcatggc ctcttggcca 420 agattgatag cttgtgcctg tccctgagtc ccagtccatc acgagcagct ggtttctaag 480 atgctatttc ccgtataaag catgagaccg tgacttgcca gccccacaga gccccgccct 540 tgtccatcac tggcatctgg actccagcct gggttggggc aaagagggaa atgagatcat 600 gtcctaaccc tgatcctctt gtcccacaga tatccagaac cctgaccctg ccgtgtacca 660 gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta ttcaccgatt ttgattctca 720 aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc acagacaaaa ctgtgctaga 780 catgaggtct atggacttca ggctccggtg cccgtcagtg ggcagagcgc acatcgccca 840 cagtccccga gaagttgggg ggaggggtcg gcaattgaac cggtgcctag agaaggtggc 900 gcggggtaaa ctgggaaagt gatgtcgtgt actggctccg cctttttccc gagggtgggg 960 gagaaccgta tataagtgca gtagtcgccg tgaacgttct ttttcgcaac gggtttgccg 1020 ccagaacaca ggtaagtgcc gtgtgtggtt cccgcgggcc tggcctcttt acgggttatg 1080 gcccttgcgt gccttgaatt acttccactg gctgcagtac gtgattcttg atcccgagct 1140 tcgggttgga agtgggtggg agagttcgag gccttgcgct taaggagccc cttcgcctcg 1200 tgcttgagtt gaggcctggc ctgggcgctg gggccgccgc gtgcgaatct ggtggcacct 1260 tcgcgcctgt ctcgctgctt tcgataagtc tctagccatt taaaattttt gatgacctgc 1320 tgcgacgctt tttttctggc aagatagtct tgtaaatgcg ggccaagatc tgcacactgg 1380 tatttcggtt tttggggccg cgggcggcga cggggcccgt gcgtcccagc gcacatgttc 1440 ggcgaggcgg ggcctgcgag cgcggccacc gagaatcgga cgggggtagt ctcaagctgg 1500 ccggcctgct ctggtgcctg gcctcgcgcc gccgtgtatc gccccgccct gggcggcaag 1560 gctggcccgg tcggcaccag ttgcgtgagc ggaaagatgg ccgcttcccg gccctgctgc 1620 agggagctca aaatggagga cgcggcgctc gggagagcgg gcgggtgagt cacccacaca 1680 aaggaaaagg gcctttccgt cctcagccgt cgcttcatgt gactccacgg agtaccgggc 1740 gccgtccagg cacctcgatt agttctcgag cttttggagt acgtcgtctt taggttgggg 1800 ggaggggttt tatgcgatgg agtttcccca cactgagtgg gtggagactg aagttaggcc 1860 agcttggcac ttgatgtaat tctccttgga atttgccctt tttgagtttg gatcttggtt 1920 cattctcaag cctcagacag tggttcaaag tttttttctt ccatttcagg tgtcgtgacc 1980 accatggcgc ttccggtgac agcactgctc ctccccttgg cgctgttgct ccacgcagca 2040 aggccgcagg tgcagctggt gcagagcgga gccgagctca agaagcccgg agcctccgtg 2100 aaggtgagct gcaaggccag cggcaacacc ctgaccaact acgtgatcca ctgggtgaga 2160 caagcccccg gccaaaggct ggagtggatg ggctacatcc tgccctacaa cgacctgacc 2220 aagtacagcc agaagttcca gggcagggtg accatcacca gggataagag cgcctccacc 2280 gcctatatgg agctgagcag cctgaggagc gaggacaccg ctgtgtacta ctgtacaagg 2340 tgggactggg acggcttctt tgacccctgg ggccagggca caacagtgac cgtcagcagc 2400 ggcggcggag gcagcggcgg cggcggcagc ggcggaggcg gaagcgaaat cgtgatgacc 2460 cagagccccg ccacactgag cgtgagccct ggcgagaggg ccagcatctc ctgcagggct 2520 agccaaagcc tggtgcacag caacggcaac acccacctgc actggtacca gcagagaccc 2580 ggacaggctc ccaggctgct gatctacagc gtgagcaaca ggttctccga ggtgcctgcc 2640 aggtttagcg gcagcggaag cggcaccgac tttaccctga ccatcagcag cgtggagtcc 2700 gaggacttcg ccgtgtatta ctgcagccag accagccaca tcccttacac cttcggcggc 2760 ggcaccaagc tggagatcaa aagtgctgct gcctttgtcc cggtatttct cccagccaaa 2820 ccgaccacga ctcccgcccc gcgccctccg acacccgctc ccaccatcgc ctctcaacct 2880 cttagtcttc gccccgaggc atgccgaccc gccgccgggg gtgctgttca tacgaggggc 2940 ttggacttcg cttgtgatat ttacatttgg gctccgttgg cgggtacgtg cggcgtcctt 3000 ttgttgtcac tcgttattac tttgtattgt aatcacagga atcgcaaacg gggcagaaag 3060 aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 3120 gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gcgagtgaag 3180 ttttcccgaa gcgcagacgc tccggcatat cagcaaggac agaatcagct gtataacgaa 3240 ctgaatttgg gacgccgcga ggagtatgac gtgcttgata 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agtcagatga ggggtgtgcc 4140 cagaggaagc accattctag ttgggggagc ccatctgtca gctgggaaaa gtccaaataa 4200 cttcagattg gaatgtgttt taactcaggg ttgagaaaac agctaccttc aggacaaaag 4260 tcagggaagg gctctctgaa gaaatgctac ttgaagatac cagccctacc aagggcaggg 4320 agaggaccct atagaggcct gggacaggag ctcaatgaga aagg 4364

Claims (43)

  1. 유전학적으로 조작된 T 세포의 제조 방법으로서, 상기 방법이 하기를 포함하는 방법:
    (i) T 세포의 제1 집단을 제공하는 단계;
    (ii) 상기 T 세포의 제1 집단을 세포 배양 용기에서 T 세포 활성화제의 존재 하에 인큐베이션시켜, T 세포의 제2 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제2 집단이 활성화된 T 세포를 포함하는 단계;
    (iii) 제1 Cas9 효소 및 T 세포 수용체 알파 쇄 불변 영역(TRAC) 유전자를 표적화하는 제1 가이드 RNA(gRNA)를 포함하는 제1 리보핵단백질(RNP) 복합체, 및 제2 Cas9 효소 및 베타-2 마이크로글로불린(β2M) 유전자를 표적화하는 제2 gRNA를 포함하는 제2 RNP 복합체를 상기 T 세포의 제2 집단 내로 도입하여, T 세포의 제3 집단을 생성하는 단계로서, 상기 T 세포의 제3 집단이 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는 T 세포를 포함하는 단계;
    (iv) 상기 T 세포의 제3 집단을 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터와 함께 인큐베이션시켜, T 세포의 제4 집단을 생성하는 단계로서, 상기 AAV 벡터가 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 상기 핵산 서열은 TRAC 유전자좌에 대한 상동성 서열이 측접하며, 상기 T 세포의 제4 집단이 파괴된 TRAC 유전자 및 파괴된 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 활성화된 T 세포를 포함하는 단계;
    (v) 상기 T 세포의 제4 집단을 증량(expanding)시킴으로써, 증량된 T 세포 집단을 생성하는 단계;
    (vi) 상기 증량된 T 세포 집단으로부터 TCRαβ+ T 세포를 제거하여, 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 생성하는 단계로서, 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단이 파괴된 TRAC 유전자 및 β2M 유전자를 갖는, CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 단계; 및
    (vii) 상기 유전학적으로 조작된 T 세포의 집단을 수거하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 인간 혈액 세포로부터 농축된 동결보존된 T 세포로부터 유래되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 하기를 포함하는 공정에 의해 제조되는, 방법: (a) 혈액 세포를 인간 공여자로부터 수득하는 단계; 및 (b) CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포를 상기 혈액 세포로부터 농축시키는 단계.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (b)가 항-CD4 및/또는 항-CD8 항체와 컨쥬게이트된 자성 비드를 사용하여 수행되는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포의 제1 집단이 적어도 약 80%의 세포 생존력 및/또는 적어도 약 80%의 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 순도를 갖는, 방법.
  6. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (c) 단계 (b)에서 생성되는 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 동결보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 T 세포 활성화제가 CD3 효능제 및 CD28 효능제를 포함하며, 상기 CD3 효능제 및 CD28 효능제가 나노매트릭스 입자에 부착되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii)가 상기 T 세포의 제1 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x106개/㎠의 세포 씨딩 밀도 및 약 2x106개 세포/㎖의 세포 농도로 T 세포 활성화제와 함께 약 48시간 동안 인큐베이션시킴으로써 수행되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 혼합물 중 T 세포 활성화제 대 배지의 비가 약 1:12.5(v/v)인, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ii) 이후에 T 세포의 제2 집단에서 T 세포 활성화제를 희석하여, 활성화를 감소시키고, 단계 (iii) 이전에 세포가 회복되게 하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)이 전기천공법에 의해 수행되는, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (iii)이 하나의 전기천공법 이벤트를 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 제1 RNP 복합체 및 상기 제2 RNP 복합체가 하나의 전기천공법 이벤트에서 상기 활성화된 T 세포 내로 도입되는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 RNP 복합체 내의 제1 Cas9 효소의 양이 상기 제2 RNA 복합체 내의 제2 Cas9 효소의 양과 같은, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소의 농도가 약 0.15 ㎎/㎖이고, 상기 제2 Cas9 효소의 농도가 약 0.15 ㎎/㎖이고, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA의 농도가 약 0.08 ㎎/㎖이고, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA의 농도가 약 0.2 ㎎/㎖인, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)에서 세포 농도가 약 100x106개 세포/㎖ 내지 약 400x106개 세포/㎖, 선택적으로 약 300x106개 세포/㎖인, 방법.
  17. 제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (iii)에서 각각의 용기에서 세포 수가 약 3 x 108개 세포/㎖인, 방법.
  18. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 약 10,000 내지 약 80,000의 감염 다중도(MOI) 값을 갖는, 방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 AAV 벡터의 MOI가 약 20,000인, 방법.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 AAV 벡터가 AAV 혈청형 6(AAV6) 벡터인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)가 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 7x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 6일 내지 약 12일 동안 배양함으로써 수행되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (v)가 T 세포의 제4 집단을 세포 배양 용기에서 약 2x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 약 7일 내지 약 9일 동안 배양함으로써 수행되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 T 세포의 제4 집단이 약 3x105개 세포/㎠ 내지 약 5x105개 세포/㎠의 씨딩 밀도로 배양되는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 세포 배양 용기가 배지 교체 없이 약 10일 내지 약 12일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기인, 방법.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양 용기가 배지 교체 없이 약 7일 내지 약 9일 동안 세포 증량을 가능하게 하는 정적 세포 배양 용기인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (vi)이 증량된 세포를 항-TCRαβ 항체가 고정된 비드와 접촉시키고, 결합되지 않은 세포를 수집함으로써 수행되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 증량 단계가 세포 용기에서 T 세포를 약 150,000개 세포/㎠ 내지 약 500,000개 세포/㎠, 선택적으로 약 300,000개 세포/㎠ 내지 약 500,000개 세포/㎠의 밀도로 씨딩하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 Cas9 효소, 제2 Cas9 효소 또는 둘 모두가 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) Cas9 뉴클레아제(spCas9)인, 방법.
  29. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소 및 상기 제2 Cas9 효소가 동일한, 방법.
  30. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 Cas9 효소가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하고/하거나 상기 제2 Cas9 효소가 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA가 SEQ ID NO: 4의 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  32. 제32항에 있어서, 상기 TRAC 유전자를 표적화하는 제1 gRNA가 SEQ ID NO: 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA가 SEQ ID NO: 8의 스페이서 서열을 포함하는, 방법.
  34. 제34항에 있어서, 상기 β2M 유전자를 표적화하는 제2 gRNA가 SEQ ID NO: 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  35. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, 또는 둘 모두가 하나 이상의 2'-O-메틸 포스포로티오에이트 변형을 포함하는, 방법.
  36. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 암 항원을 표적화하는 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 동시-자극 도메인 및 CD3z 세포질 신호전달 도메인을 포함하는, 방법.
  37. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 CD19에 결합하는, 방법.
  38. 제38항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 단일 쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고/하거나, 상기 막횡단 도메인이 CD8a로부터 유래되고/되거나, 동시-자극 도메인이 CD28로부터 유래되는, 방법.
  39. 제39항에 있어서, 상기 CAR이 SEQ ID NO: 37의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CAR이 BCMA에 결합하는, 방법.
  41. 제41항에 있어서, 상기 세포외 도메인이 단일-쇄 가변 단편(scFv)을 포함하고/하거나, 상기 막횡단 도메인이 CD8a로부터 유래되고/되거나 상기 동시-자극 도메인이 4-1BB로부터 유래되는, 방법.
  42. 제42항에 있어서, 상기 CAR이 SEQ ID NO: 61의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  43. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생성되는, 유전학적으로 조작된 T 세포 집단.
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