JP2023501580A - キメラ抗原受容体を発現するｔ細胞を作製するための製造プロセス - Google Patents

キメラ抗原受容体を発現するｔ細胞を作製するための製造プロセス Download PDF

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Abstract

本開示の態様は、従来の製造方法を上回るいくつかの改善を提供し、それにより臨床的に有用なＣＡＲ Ｔ細胞療法の強力な供給の生成を可能にする、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／９３４，９９１号明細書に対する優先権の利益を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法は、血液癌の治療において有望な治療効果を示している。典型的には、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、患者の免疫細胞（自己）又は無関係のヒトドナーからの免疫細胞（同種異系）のいずれかの遺伝子操作によって生成される。高品質の臨床用ＣＡＲ－Ｔ細胞の生成は、この技術を幅広く適用するための必要条件である。従って、ＣＡＲ－Ｔ細胞の大規模生産のための効率的な製造プロセスを開発することは、非常に興味深いことである。
本開示は、少なくとも部分的に、従来の製造方法を上回るいくつかの改善を提供する、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法の開発に基づく。このような改善としては、本明細書に記載の遺伝子改変の一貫性及び効率の改善が挙げられるが、これらに限定されず、それにより臨床的に有用なＣＡＲ－Ｔ細胞療法の強力な供給の生成が可能になる。
従って、本開示の一態様は、遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法であって、（ｉ）Ｔ細胞の第１の集団を提供する工程と；（ｉｉ）細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下でＴ細胞の第１の集団をインキュベートして、Ｔ細胞の第２の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第２の集団は、活性化Ｔ細胞を含む、工程と；（ｉｉｉ）活性化Ｔ細胞に、第１のＣａｓ９酵素及びＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体並びに第２のＣａｓ９酵素及びβ２Ｍ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体を導入して、Ｔ細胞の第３の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第３の集団は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及び破壊されたβ２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；（ｉｖ）Ｔ細胞の第３の集団をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとインキュベートして、Ｔ細胞の第４の集団を生成する工程であって、Ｔ細胞の第４の集団は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞を含み、ＡＡＶベクターは、ＣＡＲをコードする核酸配列を含み、ＣＡＲをコードする核酸配列は、第１のｇＲＮＡによって標的化されるＴＲＡＣ遺伝子座と相同な配列に隣接している、工程と；（ｖ）Ｔ細胞の第４の集団を増殖させる工程と；（ｖｉ）増殖されたＴ細胞からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去して、遺伝子操作されたＴ細胞集団を生成する工程であって、遺伝子操作されたＴ細胞集団は、ＣＡＲを発現し、且つ破壊されたＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を有するＴ細胞を含む、工程と；（ｖｉｉ）遺伝子操作されたＴ細胞集団を収集する工程とを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、ヒト血液細胞から濃縮された凍結保存Ｔ細胞から誘導される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、（ａ）ヒトドナーから血液細胞を得る工程と；（ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程とを含むプロセスによって調製される。いくつかの実施形態では、（ｂ）は、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８抗体と結合された磁気ビーズを使用して実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第１の集団は、少なくとも８０％の細胞生存率並びに／又は少なくとも８０％のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を有する。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）工程（ｂ）で生成された濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を凍結保存する工程を更に含む。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤は、ナノマトリックス粒子に結合されたＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）は、約２×１０６／ｃｍ２の細胞播種密度及び約２×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度において、細胞培養容器でＴ細胞の第１の集団をＴ細胞活性化剤と混合し、且つこのようにして形成された混合物を約４８時間にわたってインキュベートすることによって実施される。いくつかの実施形態では、混合物中のＴ細胞活性化剤対培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、活性化を減少させ、且つ工程（ｉｉｉ）前に細胞を回復させるために、工程（ｉｉ）後、Ｔ細胞の第２の集団中でＴ細胞活性化剤を希釈する工程を更に含み得る。
いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）は、１つのエレクトロポレーションイベントを伴う。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＰ複合体及び第２のＲＮＰ複合体は、１つのエレクトロポレーションイベントで活性化Ｔ細胞に導入される。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＰ複合体中の第１のＣａｓ９酵素の量は、第２のＲＮＡ複合体中の第２のＣａｓ９酵素の量と同じである。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、第２のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡの濃度は、約０．０８ｍｇ／ｍＬであり、及びβ２Ｍ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡの濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬである。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の細胞濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬである。他の実施形態では、工程（ｉｉｉ）（例えば、エレクトロポレーション）で使用される各容器の総細胞数は、約５×１０８～約１×１０９細胞、例えば約７×１０８細胞であり得る。いくつかの例では、複数の容器、例えば約５～１０個の容器が工程（ｉｉｉ）（例えば、エレクトロポレーション）で使用され得る。具体例では、７個もの容器が工程（ｉｉｉ）で使用され得、これは、例えば、エレクトロポレーションのために約１．５×１０９～約３×１０９細胞（例えば、約２．１×１０９細胞又は約２．７×１０９細胞）を含み得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、約１０，０００～約８０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）値を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）ベクターである。
いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、細胞培養容器でＴ細胞の第４の集団を播種し、且つ約６日～約１２日にわたって細胞を培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞の第４の集団は、約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で細胞培養容器に播種され得る。いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約７日～約９日にわたって細胞培養容器でＴ細胞の第４の集団を培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、工程（ｖ）は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、細胞培養容器でＴ細胞の第４の集団を播種することによって実施される。いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、培地交換なしで約１０日～約１２日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器（本明細書では静置培養容器とも交換可能に呼ばれる）である。いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、培地交換なしで約７日～約９日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器である。
いくつかの実施形態では、工程（ｖｉ）は、増殖された細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されているビーズに接触させ、且つ結合されていない細胞を収集することによって実施される。
いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素、第２のＣａｓ９酵素又は両方は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｓｐＣａｓ９）である。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素及び第２のＣａｓ９酵素は、同じである。いくつかの実施形態では、第１のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は第２のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡは、配列番号４のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する第１のｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡは、配列番号８のスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、β２Ｍ遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第１のｇＲＮＡ、第２のｇＲＮＡ又は両方は、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、癌抗原を標的化する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａから誘導され、且つ／又は共刺激ドメインは、ＣＤ２８及び／若しくは４－１ＢＢから誘導される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。
本開示の態様は、本明細書に記載の方法によって生成される、遺伝子操作されたＴ細胞集団を提供する。
本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明に記載する。本発明の他の特徴又は利点は、以下の図面及びいくつかの実施形態の詳細な説明並びに添付の特許請求の範囲からも明らかになるであろう。
様々な条件下のＴ細胞の活性化及び増殖を示す図である。図１Ａ：ＣＤ２５及び／又はＣＤ６９を発現する細胞のパーセントとして測定されるＴ細胞活性化を示すグラフ。図１Ｂ：ＣＤ２５の発現レベルが細胞増殖速度と関連していることを示すグラフ。ＣＤ２５の発現レベルは、ＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定された。 本明細書に記載の最適化された条件を使用して、静置培養容器内でＴ細胞が活性化される小規模製造プロセスで調製されたＴ細胞における編集効率及びＣＡＲ発現を示す図を含む。Ｔ細胞は、対照としてＴフラスコで並行して生成された。ＵＴ：未処理Ｔ細胞；ＥＰ：模擬エレクトロポレーションＴ細胞；フラスコ：Ｔフラスコ内のＴ細胞；及び容器：静置培養容器内のＴ細胞。図２Ａ：Ｔ細胞におけるＴＣＲαβノックアウト効率を示すグラフ。図２Ｂ：Ｔ細胞におけるβ２Ｍノックアウト効率を示すグラフ。図２Ｃ：Ｔ細胞におけるダブルノックアウト（ＤＫＯ）効率を示すグラフ。図２Ｄ：Ｔ細胞におけるＣＡＲパーセント（ＣＡＲ％）発現を示すグラフ。 小規模製造プロセスで調製されたＴ細胞の編集後のＴ細胞増殖を示す図である。ＵＴ：未処理Ｔ細胞；ＥＰ：模擬エレクトロポレーションＴ細胞；フラスコ：Ｔフラスコ内のＴ細胞；及び容器：静置培養容器内のＴ細胞。 異なる細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞における編集効率及びＣＡＲ発現を示す図を含む。ＵＴ：未処理Ｔ細胞；Ｄ３：３日目の編集効率；Ｄ６：６日目の編集効率；Ｄ９：９日目の編集効率；及びＤ１２：１２日目の編集効率。図４Ａ：１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるβ２Ｍノックアウト効率を示すグラフ。図４Ｂ：１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるＴＣＲαβノックアウト効率を示すグラフ。図４Ｃ：１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるＣＡＲパーセント（ＣＡＲ％）発現を示すグラフ。図４Ｄ：２００×１０６細胞／ｍＬ～４００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるβ２Ｍノックアウト効率を示すグラフ。図４Ｅ：２００×１０６細胞／ｍＬ～４００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるＴＣＲαβノックアウト効率を示すグラフ。図４Ｆ：２００×１０６細胞／ｍＬ～４００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度でエレクトロポレーションされたＴ細胞におけるＣＡＲパーセント（ＣＡＲ％）発現を示すグラフ。 様々なＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示す図を含む。図５Ａ：１．２５Ｋ～８０Ｋの範囲のＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示すグラフ。ＵＴ：未処理Ｔ細胞；Ｄ３：形質導入の３日後のＣＡＲ＋発現；Ｄ６：形質導入の６日後のＣＡＲ＋発現；Ｄ１０：形質導入の１０日後のＣＡＲ＋発現；及びＤ１３：形質導入の１３日後のＣＡＲ＋発現。図５Ｂ：０．１２Ｋ～２３Ｋの範囲のＭＯＩで形質導入された１１日後に測定されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示すグラフ。Ｐ．Ｃ．：陽性対照；ＥＰ：エレクトロポレーションのみの対照；及びアイソタイプ：ＣＡＲ陽性アイソタイプはヤギＩｇＧに置き換えられた。 編集されたＴ細胞の増殖に対する細胞播種密度の影響を示す図を含む。図６Ａ：増殖中の細胞数を示すグラフ。図６Ｂ：増殖中の細胞密度を示すグラフ。図６Ｃ：増殖中の増殖倍数を示すグラフ。 抗ＣＤ１９指向性キメラＴ細胞抗原受容体（ＣＴＸ１１０）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の製造からのデータを示す図を含む。図７Ａは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＣＤ１９ ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。図７Ｂ～７Ｃは、様々なＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示す図を含む。図７Ｂ：０Ｋ～８０Ｋの範囲のｒＡＡＶ－１３８ＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示すグラフ。図７Ｃ：０Ｋ～８０Ｋの範囲のｒＡＡＶ－１３８ＭＯＩで形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示すグラフ。２０ＫのｒＡＡＶ－１３８ＭＯＩによる形質導入を陽性対照として使用した。図７Ｄ～７Ｅは、ＴＣＲを標的化するｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ）又はＢ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ）の異なる濃度から形成されたＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションされたＴ細胞における編集効率を示す図を含む。ＴＣＲαβ－：ＴＣＲαβの編集を有する細胞のパーセント；β２Ｍ－：β２Ｍの編集を有する細胞のパーセント；及びダブルノックアウト（ＤＫＯ）：ＴＣＲαβ及びβ２Ｍの編集を有する細胞のパーセント。図７Ｄ：３７．５μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬのＴＡ－１を使用して形成されたＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションされたＴ細胞のノックアウト効率を示すグラフ。図７Ｅ：３７．５μｇ／ｍＬ～３００μｇ／ｍＬのＢ２Ｍ－１を使用して形成されたＲＮＰ複合体でエレクトロポレーションされたＴ細胞のノックアウト効率を示すグラフ。 抗ＢＣＭＡ指向性キメラＴ細胞抗原受容体（ＣＴＸ１２０）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞の製造からのデータを示す図を含む。図８Ａは、本明細書に記載の技術のいくつかの実施形態による、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製するための例示的な製造プロセスのフローチャートを含む。図８Ｂ：ＭＯＩの増加に伴って形質導入されたＴ細胞におけるＣＡＲ＋発現を示すグラフ。図８Ｃ：ＣＴＸ１２０で検出された疲弊マーカーのレベルを示すグラフ。図８Ｄ：ＣＴＸ１２０のＣＤ８＋Ｔ細胞で検出されたメモリーマーカーのレベルを示すグラフ。図８Ｅ：ＣＴＸ１２０のＣＤ４＋Ｔ細胞で検出されたメモリーマーカーのレベルを示すグラフ。図８Ｆ：ＣＴＸ１２０とＢＣＭＡ＋腫瘍細胞の共培養によるＩＦＮγの産生を示すグラフ。図８Ｇ：ＣＴＸ１２０とＢＣＭＡ＋腫瘍細胞の共培養による腫瘍殺傷を示すグラフ。 編集後の増殖の日数の関数としての１ｍＬ当たりの細胞濃度のグラフを提供する。 編集後の増殖の日数の関数として計算された細胞数のグラフを提供する。 編集後の増殖の日数の関数としての細胞生存率のパーセンテージのグラフを提供する。 様々な再プレーティング及び低プレーティング群で評価されたＣＡＲ＋％（図１２Ａ）、ＴＲＡＣ－％（図１２Ｂ）及びβ２Ｍ－％（図１２Ｃ）を含む編集効率を示すグラフを提供する。 様々な再プレーティングされた細胞集団におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の比率を提供する。 再プレーティングされた集団におけるメモリー細胞サブタイプマーカーの評価を示す棒グラフを提供する。再プレーティングされた集団の細胞は、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリー（ＣＭ）Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ）Ｔ細胞及び末端エフェクター（ＴＥ）Ｔ細胞として評価された。 ＣＡＲ＋、ＣＤ４＋／ＣＡＲ＋及びＣＤ８＋／ＣＡＲ＋細胞の再プレーティングされた集団における疲弊マーカーの評価を示す棒グラフを提供する。分析された３つの疲弊マーカーはＰＤ１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３であった。 フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイを使用して評価された、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ標的細胞を殺す、再プレーティング及び低プレーティング密度群のＣＡＲ－Ｔ細胞の能力を示すグラフを提供する。 ｉｎ ｖｉｖｏでの３つの異なる用量のＣＡＲ細胞での接種後の日数の関数としての腫瘍細胞の生存率を示すグラフを提供する。 ｉｎ ｖｉｖｏでの３つの用量のＣＡＲ細胞での接種後の日数の関数としてのマウスの腫瘍量を示すグラフを提供する。 本開示の一実施形態を示すフローチャートを示す。 ＣＡＲ Ｔ細胞溶解を測定することによるアッセイ対照ＦＡＣＳ分析を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＴＸ１１０ ＣＡＲ Ｔ細胞であった。Ｔ細胞の８１％は、ＣＡＲ＋であった。 ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞溶解及びサイトカイン産生を測定するアッセイ対照実験の結果を示す。本アッセイでは、凍結ストックから解凍したＣＴＸ１１０ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。Ｔ細胞は、ＨＤＲ後６日目で８０％ＣＡＲ＋であった。 ３人のドナーの各々から誘導されるＴ細胞が、１倍、２倍及び４倍の培養条件の間で様々な程度のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有することを示すｉｎ ｖｉｔｒｏ効力分析の結果を示す。 異なる細胞濃度での細胞溶解の分析の結果を示し、ドナー１及び２から誘導される細胞が、異なるパーセンテージのＣＡＲ＋細胞にもかかわらず同様の応答を示したことを示す。 ＣＡＲ＋細胞について正規化した場合の３人のドナーからの細胞溶解の分析の結果を示す。ドナー２及び３は、ＣＡＲ細胞が正規化されたときのアッセイで同様に挙動した。同じＥ：Ｔの比率でドナー２の２倍のＣＡＲ－Ｔ細胞数でアッセイを繰り返した。 ３人のドナー全てについてのＣＡＲ細胞の接種後の日数及びｉｎ ｖｉｖｏでの増殖条件の関数としてのマウスの生存率を示す生存曲線を提供する。
本開示は、少なくとも部分的に、ＣＡＲ－Ｔ細胞、特に同種異系ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成するための、製造プロセスの１つ以上の工程について改善された条件を含む改善された製造プロセスの開発に基づく。本明細書では、少なくとも以下の有利な結果につながる改善された製造プロセスが開示される：
（ａ）本明細書で提供されるＴ細胞濃縮条件の改善から生じるＴ細胞純度の改善及びＴ細胞生存率の改善。
（ｂ）本明細書で提供されるＴ細胞形質導入条件の改善から生じる、ＣＡＲ発現Ｔ細胞を産生するための一貫性の改善及び効率の改善。
（ｃ）本明細書で提供されるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集条件の改善から生じるＴ細胞におけるＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子破壊の一貫性の改善及び効率の改善。
（ｄ）本明細書に記載の改善された製造プロセスによって提供される生産時間の短縮及び生産コストの減少から生じるＣＡＲ Ｔ細胞療法の供給の増加。
（ｅ）本明細書に記載の改善された製造プロセスを使用した均一で高品質のＣＡＲ Ｔ療法の生成から生じる生成された製剤の変動性の低減。
（ｆ）Ｔ細胞で高いＣＡＲ発現レベルを維持しながらのＡＡＶ形質導入条件の単純化。
従って、本明細書では、癌抗原、例えばＣＤ１９又はＢＣＭＡを標的化し、ノックアウトされたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲコンストラクトなどのＣＡＲコンストラクトを発現する遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法が提供される。本明細書に記載される方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団及びその治療的使用も本開示の範囲内である。
Ｉ．遺伝子操作されたＴ細胞の製造
本開示の態様は、破壊されたβ２－マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子及び破壊されたＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子並びにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする挿入された核酸を含む遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法が提供される。
β２Ｍ遺伝子及びＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、遺伝子操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、同種異系間移植に適したものにする。ＣＡＲをコードする核酸の挿入は、遺伝子操作されたＴ細胞がその表面にＣＡＲを発現することを可能にし、そこで遺伝子操作されたＴ細胞を癌細胞に標的化する。
従って、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法は、いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集を使用してＴＲＡＣとβ２Ｍの発現を妨害し、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）形質導入を使用してＣＡＲをコードする核酸を挿入することを伴う。
一般に、本明細書で開示されるＣＡＲ－Ｔ細胞を製造する方法は、（ｉ）好適なヒト免疫細胞源からＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程と、（ｉｉ）濃縮されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化する工程と、（ｉｉｉ）活性化Ｔ細胞を遺伝子操作して破壊されたＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子を有するＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する工程と、治療的使用のために遺伝子操作されたＴ細胞を採取する工程とを含み得る。必要に応じて、濃縮されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞は、将来の使用のために凍結保存を介して保存され得る。代わりに又は加えて、遺伝子操作されたＴ細胞は、収集前にｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ得る。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、このようにして生成されたＣＡＲ－Ｔ細胞集団から枯渇させ得る。
（ｉ）Ｔ細胞の濃縮
本明細書に開示される製造方法のいずれも出発物質としてヒト血液細胞を使用し得る。例えば、Ｔ細胞を、遠心沈降（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離）などの当業者に公知の技術を使用して、対象から回収される血液の単位から得ることができる。代わりに、遺伝子操作されたＴ細胞の作製に使用するためのＴ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの分化を介して幹細胞（例えば、ＨＳＣ又はｉＰＳＣ）から誘導され得る。いくつかの実施形態では、血液細胞は個々のヒトドナーから得ることができる。他の実施形態では、血液細胞は、複数のヒトドナー（例えば、２、３、４又は５人のヒトドナー）から得ることができる。
いくつかの例では、好適なヒトドナーからのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｋ）サンプルを使用し得る。当技術分野において公知のとおり、ロイコパックサンプルは、末梢血から収集される濃縮された白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋａｐｈｅｒｅｓｉｓ）製品である。ロイコパックサンプルには、典型的には、単球、リンパ球、血小板、血漿及び赤血球などの様々な血液細胞が含まれている。ヒトドナーは、好ましくは、健康なヒトドナーである。例えば、ヒトドナー候補は、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、ＷＮＶ、クルーズトリパノソーマ及び／又はＣＭＶのスクリーニングの対象となり得る。スクリーニングで陰性の結果を示したヒト対象は、血液細胞のドナーとして使用され得る。
本方法での使用が見出されるＴ細胞の供給源は特に限定されない。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞バンクからのＴ細胞は、本明細書に開示される製造方法のいずれかにおける出発物質として使用することができる。Ｔ細胞バンクは、細胞培養におけるＴ細胞の持続性を改善するために、特定の遺伝子（例えば、細胞の自己再生、アポトーシス及び／又はＴ細胞の疲弊又は複製老化に関与する遺伝子）の遺伝子編集を伴うＴ細胞を含み得る。Ｔ細胞バンクは、真正Ｔ細胞、例えば、非形質転換Ｔ細胞、最終分化Ｔ細胞、安定したゲノムを有するＴ細胞並びに／又は増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のためにサイトカイン及び成長因子に依存するＴ細胞から生成し得る。代わりに、このようなＴ細胞バンクは、造血幹細胞（例えば、ｉＰＳＣ）などの前駆細胞、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養物から生成し得る。いくつかの例では、Ｔ細胞バンク内のＴ細胞は、細胞の自己複製に関与する１つ以上の遺伝子、アポトーシスに関与する１つ以上の遺伝子及び／又はＴ細胞の疲弊に関与する１つ以上の遺伝子の遺伝子編集を含み得、そのような遺伝子の発現を破壊又は低減し、培養の持続性の改善をもたらす。Ｔ細胞バンクで編集された遺伝子の例としては、Ｔｅｔ２、Ｆａｓ、ＣＤ７０、Ｒｅｇｎａｓｅ－１又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。編集されていないＴ細胞と比較して、Ｔ細胞バンクのＴ細胞は、培養における増殖能力（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）の増強、増殖能力（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｃａｐａｃｉｔｙ）の増強、Ｔ細胞の活性化の増大及び／又はアポトーシスレベルの低下を有し得る。
好適なＴ細胞は、従来の方法又は本明細書に開示される方法を使用して、ヒト血液細胞から濃縮することができる。遺伝子操作されたＴ細胞の作製に使用するためのＴ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はこれらの組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない１つ以上のＴ細胞マーカーを発現し得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ヒト血液細胞から濃縮することができる。他の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮することができる。具体例では、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれもヒト血液細胞から精製される。
ＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、当技術分野で公知の任意の方法又は本明細書に開示されている方法を使用して、例えば、標的Ｔ細胞の特定の細胞表面バイオマーカーに結合することができる抗体、例えば、ＣＤ４に特異的な抗体及び／又はＣＤ８に特異的な抗体を使用して、本明細書に記載されているものなどの好適な血液細胞源から単離することができる。いくつかの実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の濃縮は、磁気ビーズに結合した抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８抗体を使用して実施することができる。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む細胞集団は、好適な条件下で好適な期間、そのような磁気ビーズと共にインキュベートすることができ、ビーズに結合した抗体を介して標的Ｔ細胞を磁気ビーズに結合させることができる。非結合細胞は洗浄でき、ビーズに結合したＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は通常の方法で収集できる。
濃縮されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）は、日常的な慣行に従って、細胞生存率及び／又は標的Ｔ細胞の純度などの特徴について評価され得る。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される濃縮工程からのＴ細胞集団は、少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又はそれを超える）の細胞生存率を有し得る。代わりに又は加えて、濃縮されたＴ細胞集団は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、約９８％又はそれを超える標的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）の純度を有し得る。代わりに又は加えて、濃縮されたＴ細胞集団は、少なくとも約７０％、例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、約９８％又はそれを超える標的Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞）の純度を有し得る。
「約」又は「およそ」という用語は、当技術分野の通常の技能の１つによって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差の範囲内を意味し得る。代わりに、「約」とは、所定の値の最大±２０％、好ましくは最大±１０％、より好ましくは最大±５％、更に好ましくは最大±１％の範囲を意味し得る。代わりに、特に生物学的システム又はプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が出願及び特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、「約」という用語は暗黙的であり、これに関連して特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する。
濃縮されたＴ細胞集団（これも本開示の範囲内である）は、本明細書に開示されるように、更なる処理のために直ちに使用され得る。代わりに、濃縮されたＴ細胞集団は、例えば凍結保存を介して、将来の使用に好適な条件下で保存され得る。更なる処理前に凍結保存Ｔ細胞を通常の手順に従って解凍することができる。解凍した細胞の細胞生存率を評価して、解凍した細胞が更なる処理に好適であるかどうかを判断することができる。
（ｉｉ）Ｔ細胞活性化
濃縮されたＴ細胞はＴ細胞活性化を受けて、濃縮されたＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）及び増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）を可能にし得る。本明細書に開示される方法のいずれかで使用されるＴ細胞活性化工程は、高いＴ細胞活性化効率を提供する本明細書に開示されるＴ細胞活性化条件を含み得る。更に、そこから得られた活性化Ｔ細胞は、高い遺伝子編集効率及び編集後の高いＴ細胞増殖率を示す。以下の例を参照されたい。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性は、Ｔ細胞活性化剤又は薬剤、例えば、ＣＤ３／ＴＣＲ媒介性シグナル伝達経路及び／又は共刺激分子（例えば、ＣＤ２８）媒介性シグナル伝達経路を刺激する薬剤を使用して達成することができる。例えば、Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト（例えば、アゴニスト抗ＣＤ３抗体）であり得、ＣＤ３／ＴＣＲ－媒介性細胞シグナル伝達経路を活性化する。代わりに又は加えて、Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ２８アゴニスト（例えば、抗ＣＤ２８抗体）であり得、ＣＤ２８によって媒介される共刺激シグナル伝達経路を活性化する。本明細書に開示される方法で使用するためのＴ細胞活性化剤のいずれも、ナノマトリックス粒子などの支持部材に結合し得る。具体例では、本明細書に開示される方法で使用するためのＴ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体を含み得、これらは、ナノマトリックス粒子に結合し得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化剤は、ナノマトリックス粒子に結合したＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、同じナノマトリックス粒子に結合している。いくつかの実施形態では、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、異なるナノマトリックス粒子に結合している。
Ｔ細胞活性化を達成するために、本明細書で開示される濃縮されたＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞）は、好適な細胞播種密度及び好適な細胞濃度で細胞培養容器に入れ、本明細書に開示されるＴ細胞活性化剤のいずれかの存在下で好適な期間インキュベートして、Ｔ細胞活性化を誘導し得る。
場合により、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対細胞培養培地の比は、約１：１０（ｖ／ｖ）～約１：１５（ｖ／ｖ）の範囲でであり得る。いくつかの例では、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対細胞培養培地の比は、約１：１０（ｖ／ｖ）、約１：１０．５（ｖ／ｖ）、約１：１１（ｖ／ｖ）、約１：１１．５（ｖ／ｖ）、約１：１２（ｖ／ｖ）、約１：１２．５（ｖ／ｖ）、約１：１３（ｖ／ｖ）、約１：１３．５（ｖ／ｖ）、約１：１４（ｖ／ｖ）、約１：１４．５（ｖ／ｖ）又は約１：１５（ｖ／ｖ）でであり得る。具体例では、細胞培養容器中のＴ細胞活性化剤対培養培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である。
代わりに又は加えて、好適な細胞播種密度は、約１．５×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｃｍ２）であり得、好適な細胞濃度は、約１．５×１０６～２．５×１０６（例えば、２×１０６／ｍＬ）であり得る。細胞は、Ｔ細胞活性化剤と、約４２～５４時間、例えば、約４８時間インキュベートされ得る。
いくつかの実施形態では、細胞培養容器は、静置培養容器であり得、これは、本明細書に開示されるように、遺伝子操作されたＴ細胞の比較的大規模な生産を可能にするであろう。従来の細胞培養フラスコと比較して、静置細胞培養容器は、混合又は振盪することなくＴ細胞に酸素と栄養素を供給する培地の下に沈められた高ガス透過性膜上にＴ細胞が存在することを可能にする。静置培養容器は、培地を交換することなくＴ細胞の製造を可能にする。従って、いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法のいずれかにおけるＴ細胞活性化プロセスは、培地交換を伴わなくてもよい。
必要に応じて、活性化剤を細胞培養容器から除去するか、又は後続の遺伝子編集イベント前に希釈し、活性化剤が遺伝子編集中に与える可能性のある潜在的な影響を最小限に抑え得る。いくつかの実施形態では、活性化剤は、通常の方法、例えば遠心分離などを使用して細胞培養容器から除去することができる。代わりに、活性化剤は、遺伝子編集前に細胞培養容器で希釈、例えば細胞培養容器に培地を添加することによって希釈され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＴ細胞活性化プロセスのいずれかから誘導される活性化Ｔ細胞は、遺伝子編集前にＴ細胞を回復させるために一晩（例えば、約１６時間）培養され得る。場合により、活性化Ｔ細胞の培養物は、依然としてＴ活性化剤が含まれている場合がある。他の場合、活性化Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化剤がほとんど又は全く存在しない場合がある。
（ｉｉｉ）活性化Ｔ細胞のＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９媒介遺伝子編集
本明細書で開示される手順のいずれかによって調製される活性化Ｔ細胞は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を介して、宿主応答関連遺伝子、例えば、ＴＲＡＣ遺伝子及び／又はβ２Ｍ遺伝子をノックアウトするための遺伝子編集を受け得る。
ＴＲＡＣ遺伝子は、ＴＣＲ複合体の構成要素をコードする。ＴＲＡＣ遺伝子の破壊は、ＴＣＲの機能喪失をもたらし、この操作されたＴ細胞を非同種異系反応性にし、且つ同種異系間移植に好適なものにし、移植片対宿主疾患のリスクを最小化する。β２Ｍ遺伝子は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）Ｉ複合体の共通（不変）構成要素をコードする。β２Ｍ遺伝子を破壊すると、宿主対治療的同種Ｔ細胞応答を防ぐことができる。ＴＲＡＣ遺伝子とβ２Ｍ遺伝子の両方をノックアウトすると、細胞治療に使用する同種異系Ｔ細胞の産生がもたらされる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を媒介した遺伝子編集システム
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、遺伝子編集のために使用されるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ標的化プラットフォームとして転用されている、原核生物に天然に存在する防御機構である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムは、ＤＮＡヌクレアーゼであるＣａｓ９と、２つの非コードＲＮＡであるｃｒｉｓｐｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とに依拠するものであり、ＤＮＡを切断することを目的としている。ＣＲＩＳＰＲは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートの頭字語であり、例えば原核生物を感染又は攻撃したウイルスによって細胞に以前暴露された外来ＤＮＡと類似性を有するＤＮＡの断片（スペーサーＤＮＡ）を含有する細菌及び古細菌のゲノムに見られるＤＮＡ配列のファミリーである。例えば、同様のウイルスがその後の攻撃時に再導入すると、類似した外来ＤＮＡを検出及び破壊するために、これらのＤＮＡの断片が原核生物によって使用される。ＣＲＩＳＰＲ座位の転写によってスペーサー配列を含むＲＮＡ分子の形成がもたらされるが、このＲＮＡ分子は、外来の外来性ＤＮＡを認識して切断することができるＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質と結合し、標的となる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのいくつかの種類及びクラスが記載されている（例えば、Ｋｏｏｎｉｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ３７：６７－７８を参照されたい）。
ｃｒＲＮＡは、典型的には、標的ＤＮＡ内の２０個のヌクレオチド（ｎｔ）の配列とのワトソン－クリック塩基対形成を介して、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の配列認識及び特異性を促進する。ｃｒＲＮＡ中の５’２０ｎｔの配列の変化は、特定の座位へのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体の標的化を可能にする。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体は、標的配列がプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる特定の短いＤＮＡモチーフ（配列ＮＧＧを有する）の後にある場合、ｃｒＲＮＡの最初の２０ｎｔと一致する配列を含むＤＮＡ配列のみに結合する。
ＴｒａｃｒＲＮＡは、ｃｒＲＮＡの３’末端とハイブリダイズしてＲＮＡ二重鎖構造を形成し、このＲＮＡ二重鎖構造にＣａｓ９エンドヌクレアーゼが結合して、触媒活性のあるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が形成され、次いでこのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体によって標的ＤＮＡを切断することができる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が標的部位でＤＮＡに結合すると、Ｃａｓ９酵素内の２つの独立したヌクレアーゼドメインがそれぞれＰＡＭ部位の上流でＤＮＡ鎖の一方を切断し、ＤＮＡの両鎖が塩基対で終端する（平滑末端）二本鎖切断（ＤＳＢ）を残す。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９複合体が特定の標的部位でＤＮＡに結合し、部位特異的なＤＳＢが形成された後、以下の重要な工程は、ＤＳＢの修復である。細胞は、ＤＳＢを修復するために、２つの主要なＤＮＡ修復経路、非相同末端連結（ＮＨＥＪ）及び相同組換え修復（ＨＤＲ）を使用する。
ＮＨＥＪは、非分裂細胞を含む大部分の細胞型において高度に活性であるように見える堅固な修復機構である。ＮＨＥＪは、誤りがちであり、多くの場合、ＤＳＢの部位において１～数百のヌクレオチド間で除去又は付加をもたらす可能性があるが、そのような改変は、典型的には＜２０ｎｔである。得られた挿入及び欠失（インデル）は、遺伝子のコード領域又は非コード領域を破壊する可能性がある。代わりに、ＨＤＲは、内因的又は外因的に提供される長い一続きの相同性ドナーＤＮＡを使用して、高い忠実度でＤＳＢを修復する。ＨＤＲは、分裂細胞においてのみ活性であり、大部分の細胞型において相対的に低い頻度で生じる。本開示の多くの実施形態では、修復オペラントとしてＮＨＥＪを利用する。
（ｉ）Ｃａｓ９
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）エンドヌクレアーゼは、本明細書で開示されるような遺伝子操作されたＴ細胞を作製するためのＣＲＩＳＰＲ法において使用される。Ｃａｓ９酵素は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来するものであり得るが、他のＣａｓ９相同体も使用することができる。本明細書に記載されているように、野生型Ｃａｓ９が使用され得るか、又はＣａｓ９の修飾されたバージョンが使用され得る（例えば、Ｃａｓ９の発展させたバージョン又はＣａｓ９オルソログ若しくはバリアント）ことを理解すべきである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃ末端及びＮ末端にＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原の核局在配列（ＮＬＳ）を含むように改変されているストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含む。得られたＣａｓ９ヌクレアーゼ（ｓＮＬＳ－ｓｐＣａｓ９－ｓＮＬＳ）は、組み換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発酵によって生成され、クロマトグラフィーによって精製された１６２ｋＤａのタンパク質である。ｓｐＣａｓ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９９ＺＷ２として見出すことができ、本明細書では配列番号１として示される。
（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本明細書で記載されるようなＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集は、ガイドＲＮＡ、すなわちｇＲＮＡを使用することを含む。本明細書で使用する場合、「ｇＲＮＡ」とは、特定の標的配列で遺伝子を編集するために、Ｃａｓ９をＴＲＡＣ遺伝子又はβ２Ｍ遺伝子内の特定の標的配列に誘導することができるゲノム標的化核酸を意味する。ガイドＲＮＡは、編集のための標的遺伝子内の標的核酸配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列とにハイブリダイズする、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。
ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する代表的なｇＲＮＡは、配列番号２に示される。国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号も参照され、その関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１４番染色体上に位置するＴＲＡＣ遺伝子配列を使用して設計され得る（ＧＲＣｈ３８：１４番染色体：２２，５４７，５０６－２２，５５２，１５４；．Ｅｎｓｅｍｂｌ；ＥＮＳＧ０００００２７７７３４）。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＣａｓ９は、ＴＲＡＣゲノム領域に切断を生じさせてＴＲＡＣ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。
いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的とするｇＲＮＡにより、表９の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、ＴＲＡＣゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（配列番号２）により、表９の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、ＴＲＡＣ遺伝子におけるインデルが生じる。
β２Ｍ遺伝子を標的化する例示的なｇＲＮＡは、配列番号６に示される。国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された２０１８年５月１１日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号も参照され、その関連する開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により本明細書に組み込まれる。他のｇＲＮＡ配列は、１５番染色体上に位置するβ２Ｍ遺伝子配列を使用して設計することができる（ＧＲＣｈ３８の座標：１５番染色体：４４，７１１，４７７－４４，７１８，８７７；Ｅｎｓｅｍｂｌ：ＥＮＳＧ０００００１６６７１０）。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ及びＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、β２Ｍゲノム領域に切断を生じさせてβ２Ｍ遺伝子にインデルをもたらし、ｍＲＮＡ又はタンパク質の発現を阻害する。
いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡにより、表１０の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、β２Ｍ遺伝子におけるインデルが生じる。いくつかの実施形態では、β２Ｍゲノム領域を標的化するｇＲＮＡ（配列番号６）により、表１０の配列から選択される少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む、β２Ｍ遺伝子におけるインデルが生じる。
ＩＩ型システムでは、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と呼ばれる第２のＲＮＡも含む。ＩＩ型のｇＲＮＡでは、ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、互いにハイブリダイズして二重鎖を形成する。Ｖ型のｇＲＮＡでは、ｃｒＲＮＡが二重鎖を形成する。両方のシステムにおいて、二重鎖は部位特異的ポリペプチドに結合し、その結果、ガイドＲＮＡと部位特異的ポリペプチドとで複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸は、この部位特異的ポリペプチドとの会合による複合体に標的特異性をもたらす。そのため、ゲノム標的化核酸は、部位特異的ポリペプチドの活性を誘導する。
当業者に理解されているように、各ガイドＲＮＡは、そのゲノム標的配列に相補的なスペーサー配列を含むように設計されている。Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３７，８１６－８２１（２０１２）及びＤｅｌｔｃｈｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４７１，６０２－６０７（２０１１）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、二重分子ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、ゲノム標的化核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、単一分子ガイドＲＮＡである。
二重分子ガイドＲＮＡは、２つの鎖のＲＮＡ分子を含む。第１の鎖は、５’から３’の方向に、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列及び最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。第２の鎖は、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列（最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列に相補的）、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。
ＩＩ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる）は、５’から３’方向において、任意選択的なスペーサー延長配列、スペーサー配列、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列、単一分子ガイドリンカー、最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、３’ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及び任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長配列を含む。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、ガイドＲＮＡに追加の機能性（例えば、安定性）を付与する要素を含み得る。単一分子ガイドリンカーは、最小ＣＲＩＳＰＲ反復と最小ｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結して、ヘアピン構造を形成する。任意選択的なｔｒａｃｒＲＮＡ延長は、１つ以上のヘアピンを含む。Ｖ型システムにおける単一分子ガイドＲＮＡは、５’から３’方向において、最小ＣＲＩＳＰＲ反復配列及びスペーサー配列を含む。
「標的配列」とは、ＰＡＭ配列に隣接している標的遺伝子のことであり、Ｃａｓ９によって改変される配列のことである。「標的配列」は、「標的核酸」内のいわゆるＰＡＭ鎖上にあり、ＰＡＭ鎖及び相補的な非ＰＡＭ鎖を含む二本鎖分子である。当業者は、ｇＲＮＡスペーサー配列が、目的の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に位置する相補的配列にハイブリダイズすることを認識している。そのため、ｇＲＮＡスペーサー配列は、標的配列のＲＮＡ均等物である。
例えば、ＴＲＡＣ標的配列が５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＣＣ－３’（配列番号１１）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＵＧＣＵＧＵＧＧＣＣ－３’（配列番号５）である。別の例では、β２Ｍ標的配列が５’－ＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣ－３’（配列番号：１３）である場合、ｇＲＮＡスペーサー配列は、５’－ＧＣＵＡＣＵＣＵＣＵＣＵＵＵＣＵＧＧＣＣ－３’である（配列番号：９）。ｇＲＮＡのスペーサーは、ハイブリダイゼーション（すなわち塩基対形成）を介して配列特異的な様式で目的の標的核酸と相互作用する。そのため、スペーサーのヌクレオチド配列は、目的の標的核酸の標的配列に依存して変化する。
本明細書のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサー配列は、このシステムで使用されるＣａｓ９酵素によって認識可能なＰＡＭの５’に位置する標的核酸の領域にハイブリダイズするように設計されている。スペーサーは、標的配列と完全に一致し得るか、又はミスマッチを有し得る。各Ｃａｓ９酵素は、標的ＤＮＡにおいて認識する特定のＰＡＭ配列を有する。例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）は、標的核酸において、配列５’－ＮＲＧ－３’（ここで、Ｒは、Ａ又はＧのいずれかを含み、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、Ｎは、スペーサー配列により標的化される標的核酸配列の３’の直近にある）を含むＰＡＭを認識する。
いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個未満の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、２０個超の長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、最大で５、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０個又はそれを超える長さのヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸配列は、ＰＡＭの最初のヌクレオチドの５’の直近に２０個の塩基を有する。例えば、５’－ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＲＧ－３’を含む配列では、標的核酸は、Ｎ（ここで、Ｎは、任意のヌクレオチドであり得、下線が引かれたＮＲＧ配列は、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＰＡＭである）に対応する配列であり得る。
ｇＲＮＡのスペーサー配列は、目的の標的遺伝子の標的配列（例えば、ゲノム標的配列などのＤＮＡ標的配列）を定義する配列（例えば、２０個のヌクレオチド配列）である。ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号４に示される。β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの例示的なスペーサー配列は、配列番号８に示される。
本明細書で開示されるガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ内のスペーサー配列によって目的の任意の配列を標的化することができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的遺伝子内の標的配列との間の相補性の程度は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列及び標的配列内の標的配列は、１００％相補的である。他の実施形態では、ガイドＲＮＡのスペーサー配列と標的配列内の標的配列は、最大で１０個のミスマッチ、例えば最大で９個、最大で８個、最大で７個、最大で６個、最大で５個、最大で４個、最大で３個、最大で２個又は最大で１個のミスマッチを含有し得る。
本明細書で提供される使用し得るｇＲＮＡの非限定的な例は、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開される、２０１８年５月１１日に出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットとして公開される、２０１９年５月１０日に出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号に提供されており、先の出願の各々の関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で提供されるｇＲＮＡ配列のいずれかに関して、改変を明確に示していないものは、未改変の配列と、任意の好適な改変を有する配列との両方を包含することを意味する。
本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれかにおけるスペーサー配列の長さは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム及び更に本明細書で開示される標的遺伝子のいずれかを編集するために使用される構成要素に依存し得る。例えば、異なる細菌種に由来する異なるＣａｓ９タンパク質は、様々な最適なスペーサー配列長を有する。従って、スペーサー配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０又は５０個超の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１８～２４個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、標的化配列は、１９～２１個の長さのヌクレオチドを有し得る。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、２０個の長さのヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡであり得、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０個未満のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に２０超のヌクレオチドのスペーサー配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の５’末端に１７～３０個のヌクレオチドを有する可変長のスペーサー配列を含む。例を実施例７の表８に示す。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端にウラシルを含まない。他の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１つ以上のウラシルを含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡは、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１～８個のウラシル残基、例えば、ｓｇＲＮＡ配列の３’末端に１、２、３、４、５、６、７又は８個のウラシル残基を含むことができる。
ｓｇＲＮＡのいずれかを含む、本明細書で開示されるｇＲＮＡのいずれも未改変でであり得る。代わりに、１つ以上の修飾ヌクレオチド及び／又は修飾主鎖を含み得る。例えば、ｓｇＲＮＡなどの改変ｇＲＮＡは、５’末端、３’末端のいずれか又は両方に位置し得る１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエートヌクレオチドを含むことができる。
特定の実施形態では、２つ以上のガイドＲＮＡをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムと共に使用することができる。各ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが２つ以上の標的核酸を切断するように、異なる標的化配列を含有し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上のガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰ複合体内での活性又は安定性などの同じ又は異なる特性を有し得る。２つ以上のガイドＲＮＡが使用される場合、各ガイドＲＮＡは、同じ又は異なるベクター上にコードされ得る。２つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同じであるか又は異なる。
２つ以上の好適なＣａｓ９及び２つ以上の好適なｇＲＮＡを本明細書に記載される方法、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される方法に使用することができることが理解されるであろう。いくつかの実施形態では、方法は、当技術分野において公知のＣａｓ９酵素及び／又はｇＲＮＡを含む。例は、例えば、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された、２０１８年５月１１日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号及び国際公開第２０１９／２１５５００号パンフレットとして公開された、２０１９年５月１０日出願の国際出願番号ＰＣＴ／ＩＢ２０１９／０００５００号に見出すことができ、各先行出願の関連する開示は、本明細書で言及される目的及び主題に対して本明細書に参照として組み込まれる。
ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される活性化Ｔ細胞は、本明細書に開示される条件下において、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集を介してＴＲＡＣ遺伝子とβ２Ｍ遺伝子の両方の遺伝子編集を受け得、これにより、従来の条件によって提供されるものと比較してより高く、より一貫した遺伝子編集効率がもたらされる。更に、本明細書で開示される遺伝子編集プロセスから得られるＴＲＡＣ－／β２Ｍ－Ｔ細胞は、ＣＡＲコンストラクトをコードするウイルスベクターがＴＲＡＣ－／２Ｍ－Ｔ細胞に送達されると、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の高い発現レベルを示した。
Ｃａｓ９酵素並びにＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡは、１つ以上のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成することができ、これは、本明細書に開示されるように、活性化Ｔ細胞に送達され得る。ＲＮＰは、少なくともそれらが、核酸が豊富な細胞環境中での乱雑な相互作用のリスクを最小化し、且つＲＮＡを分解から保護するため、遺伝子編集に有用である。ＲＮＰを形成する方法は、当技術分野において知られている。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介遺伝子編集プロセスには、２つのリボ核タンパク質複合体が関与する場合がある。第１のＲＮＰ複合体は、第１のＣａｓ９酵素及びＴＲＡＣ遺伝子を標的化するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。第２のＲＮＰ複合体は、第２のＣａｓ９酵素及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡを含む。いくつかの例では、２つのＲＮＰ複合体は、異なるＣａｓ９酵素を含む。他の例では、２つのＲＮＰ複合体は、同じＣａｓ９酵素を含む。具体例では、配列番号１のＣａｓ９酵素は、第１及び第２のＲＮＰの両方で使用可能である。
いくつかの実施形態では、２つのＲＮＰ複合体は、同じ量のＣａｓ９酵素を含有し得る。例えば、ＲＮＰ複合体のいずれも、約０．１～０．３ｍｇ／ｍＬ（例えば、約０．１～０．２ｍｇ／ｍＬ）のＣａｓ９酵素（例えば、配列番号１のＣａｓ９酵素）を含み得る。いくつかの例では、ＲＮＰ複合体の各々は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９酵素（これは、配列番号１のＣａｓ９酵素でであり得る）を含み得る。
他の実施形態では、２つのＲＮＰ複合体は、異なる量のＣａｓ９酵素を含有し得る。いくつかの例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、β２Ｍ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体と比較してより多量のＣａｓ９酵素を含み得る。代わりに、β２Ｍ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体と比較してより多量のＣａｓ９酵素を含み得る。
２つのＲＮＰ複合体は、同じ量のｇＲＮＡ（一方はＴＲＡＣを標的化し、他方はβ２Ｍを標的化する）を含み得る。代わりに、２つのＲＮＰ複合体は、異なる量のｇＲＮＡを含み得る。例えば、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０３５ｍｇ／ｍＬ～約０．８ｍｇ／ｍＬ、例えば、約５０μｇ／ｍＬ～約８０μｇ／ｍＬの範囲でであり得る。具体例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０８ｍｇ／ｍＬである。代わりに又は加えて、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．０７５ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬ、例えば、約０．１ｍｇ／ｍＬ～約０．３ｍｇ／ｍＬの範囲でであり得る。具体例では、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡの量は、約０．２ｍｇ／ｍＬである。
具体例では、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９（例えば、配列番号１のＣａｓ９）及び約０．０８ｍｇ／ｍＬのＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（例えば、ＴＡ－１のｇＲＮＡ）を含み得る。代わりに又は加えて、β２Ｍ遺伝子を標的化するＲＮＰ複合体は、約０．１５ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９（例えば、配列番号１のＣａｓ９）及び約０．２ｍｇ／ｍＬのβ２Ｍ伝子を標的化するｇＲＮＡ（例えば、Ｂ２Ｍ－１のｇＲＮＡ）を含み得る。
いくつかの実施形態では、２つのＲＮＰは、エレクトロポレーションを介して連続的に、すなわち２つのエレクトロポレーションイベントを介して、活性化Ｔ細胞に導入され得る。代わりに、２つのＲＮＰは、同時に、すなわち１つのエレクトロポレーションイベントを介して活性化Ｔ細胞に導入され得る。この場合、エレクトロポレーションイベント前に２つのＲＮＰを組み合わせて混合物を形成し得る。
本明細書に開示されるＲＮＰのいずれかは、ＲＮＰを好適な量の活性化Ｔ細胞と混合することによって活性化Ｔ細胞に導入することができ、こうして形成された混合物は、ＲＮＰの細胞への送達を可能にする好適な条件下でエレクトロポレーションに供される。場合により、活性化Ｔ細胞の好適な量は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約３００×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。例えば、エレクトロポレーション工程用のＴ細胞の好適な量は、約２００×１０６細胞／ｍＬ～約３００×１０６細胞／ｍＬの範囲であり得る。いくつかの例では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約２００×１０６細胞／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の濃度は、約３００×１０６細胞／ｍＬであり得る。
いくつかの実施形態では、活性化Ｔ細胞の好適な量は、約１×１０８～約１×１０１０細胞、例えば、約５×１０８～約８×１０９細胞、約１×１０９～約５×１０９細胞又は約１×１０９～約３×１０９細胞の範囲であり得る。
エレクトロポレーションにおいて使用するためのＴ細胞は、使用するエレクトロポレーション機器によっては、複数のセルカセットに入れ得る。好適なエレクトロポレーション機器は、当業者に公知であり、静的及び流動エレクトロポレーターを挙げることができ、Ｌｏｎｚａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ、Ｍａｘｃｙｔｅ ＧＴ及びＭａｘＣｙｔｅ ＧＴｘが含まれる。場合により、複数のセルカセットを、エレクトロポレーションプロセスで使用し得る。更なる詳細は、以下の実施例１０で提供される。
具体例では、合計で約０．３ｍｇ／ｍＬのＣａｓ９酵素（例えば、配列番号１のＣａｓ９酵素）、約０．０８ｍｇ／ｍＬのＴＡ－１のｇＲＮＡ及び約０．２ｍｇ／ｍＬＢ２Ｍ－１のｇＲＮＡを含む上記で開示される２つのＲＮＰは、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約３００×１０６細胞／ｍＬ（例えば、約３００×１０６細胞／ｍＬ）の量の活性化Ｔ細胞と混合し得る。次に、混合物をエレクトロポレーションに供して、ＲＮＰをＴ細胞に送達する。
エレクトロポレーション後、細胞は、回復に好適な期間、新鮮な培地又はエレクトロポレーションバッファーで培養され得る。遺伝子編集効率は、日常的な慣行に従って実施し得る。このように生成される遺伝子編集されたＴ細胞は、ＣＡＲ発現のために構成された核酸の送達のためにウイルスベクター形質導入を受け得る。
（ｉｖ）Ｔ細胞の形質導入
ノックアウトされたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子編集されたＴ細胞は、ＣＡＲを発現するＴ細胞の集団を生成するためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによる形質導入を受け得る。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、望ましくない細胞、例えば癌細胞などの疾患細胞で発現した抗原を認識して結合するように改変されている人工の免疫細胞受容体を指す。ＣＡＲポリペプチドを発現するＴ細胞は、ＣＡＲ Ｔ細胞と呼ばれる。ＣＡＲは、ＭＨＣに制限されない様式において、選択された標的に対するＴ細胞の特異性及び反応性を再誘導する能力を有する。ＭＨＣに制限されない抗原認識は、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力をＣＡＲ－Ｔ細胞に与え、それにより腫瘍エスケープの主要な機構をバイパスする。更に、ＣＡＲは、Ｔ細胞に発現する場合、有利には、内在性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のアルファ鎖及びベータ鎖と二量体化しない。
様々な世代のＣＡＲが存在し、その各々は、異なる構成要素を含む。第一世代のＣＡＲは、ヒンジ及び膜貫通ドメインを介して抗体に由来するｓｃＦｖをＴ細胞受容体のＣＤ３ゼータ（ζ又はｚ）細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。第二世代のＣＡＲは、共刺激シグナルを供給するための追加の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８、４－１ＢＢ（４１ＢＢ）又はＩＣＯＳを組み込んでいる。第三世代のＣＡＲは、ＴＣＲのＣＤ３ζ鎖と融合した２つの共刺激ドメイン（例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＩＣＯＳ又はＯＸ４０の組み合わせ）を含む。Ｍａｕｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２５（２６）：４０１７－４０２３；Ｋａｋａｒｌａ ａｎｄ Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１４；２０（２）：１５１－１５５）。様々な世代のＣＡＲコンストラクトは、いずれも本開示の範囲内である。
一般に、ＣＡＲは、標的抗原（例えば、抗体の単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）又は別の抗体断片）を認識する細胞外ドメインを含む融合ポリペプチドであり、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体（例えば、ＣＤ３ζ）のシグナル伝達ドメインを含み、そのほとんどの場合に共刺激ドメインである。（Ｅｎｂｌａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ．２０１５；２６（８）：４９８－５０５）。ＣＡＲコンストラクトは、細胞外ドメインと細胞内ドメインとの間にヒンジ及び膜貫通ドメインを更に含み得、且つ表面に発現するためにＮ末端にシグナルペプチドを含み得る。シグナルペプチドの例としては、ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰ（配列番号４４）及びＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号７５）が挙げられる。他のシグナルペプチドを使用し得る。
（ａ）抗原結合細胞外ドメイン
抗原結合細胞外ドメインとは、ＣＡＲが細胞表面に発現すると、細胞外液にさらされるＣＡＲポリペプチドの領域のことである。場合により、細胞表面発現を促進するために、シグナルペプチドがＮ末端に位置し得る。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖであり、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）とを（いずれかの方向に）含み得る）であり得る。場合により、ＶＨ断片及びＶＬ断片は、ペプチドリンカーを介して連結され得る。リンカーは、いくつかの実施形態では、可動性のために一続きのグリシン及びセリン並びに可溶性を付与するために一続きのグルタミン酸塩及びリシンを含んだ親水性残基を含む。ｓｃＦｖ断片は、親抗体の抗原結合特異性を保持しており、そこからｓｃＦｖ断片が誘導される。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインを含み得る。他の実施形態では、ｓｃＦｖのＶＨドメイン及び／又はＶＬドメインは、完全ヒト型である。
抗原結合細胞外ドメインは、目的の標的抗原、例えば、腫瘍抗原などの病態抗原に特異的であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、通常、全く発現されない場合があるか、又は低レベルでのみ発現される場合がある非腫瘍細胞より腫瘍細胞においてより高レベルで発現されるタンパク質などの免疫原性分子を参照する「腫瘍関連抗原」である。いくつかの実施形態では、腫瘍を内部に持つ宿主の免疫系によって認識される腫瘍関連構造は、腫瘍関連抗原と呼ばれる。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、大部分のタイプの腫瘍によって広範に発現される場合、普遍的な腫瘍抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原は、分化抗原、変異性抗原、過剰発現された細胞抗原又はウイルス抗原である。いくつかの実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞に固有のタンパク質などの免疫原性分子を指す「腫瘍特異抗原」又は「ＴＳＡ」である。腫瘍特異抗原は、腫瘍細胞、例えば、特定のタイプの腫瘍細胞でのみ発現する。
いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＣＤ１９に結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲコンストラクトは、ＢＣＭＡに結合可能なｓｃＦｖ細胞外ドメインを含む。抗ＣＤ１９ ＣＡＲ及び抗ＢＣＭＡ ＣＡＲの例は、以下の実施例で提供される。
（ｂ）膜貫通ドメイン
本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、膜をまたがる疎水性のαヘリックスであり得る膜貫通ドメインを含み得る。本明細書で使用する場合、「膜貫通ドメイン」とは、好ましくは、真核細胞の細胞膜である細胞膜内で熱力学的に安定な任意のタンパク質構造体を意味する。膜貫通ドメインは、それ自体を含有するＣＡＲの安定性をもたらす。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるように、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメインであり得る。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインであり得る。更に他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８膜貫通ドメイン及びＣＤ２８膜貫通ドメインのキメラである。本明細書に記載されているような他の膜貫通ドメインを使用し得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、
ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣＮＨＲＮＲ（配列番号４９）；又は
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹ（配列番号３１）
の配列を含むＣＤ８ａ膜貫通ドメインである。
他の膜貫通ドメインを使用し得る。
（ｃ）ヒンジドメイン
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＡＲの細胞外ドメイン（抗原結合ドメインを含む）と膜貫通ドメインとの間に位置し得るか、又はＣＡＲの細胞質ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置し得る。ヒンジドメインは、ポリペプチド鎖において膜貫通ドメインを細胞外ドメイン及び／又は細胞質ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチド又はポリペプチドであり得る。ヒンジドメインは、ＣＡＲ若しくはそのドメインに可動性をもたらすか、又はＣＡＲ若しくはそのドメインの立体障害を防ぐように機能し得る。
いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、最大で３００個のアミノ酸（例えば、１０～１００個のアミノ酸又は５～２０個のアミノ酸）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの他の領域に１つ以上のヒンジドメインが含まれ得る。いくつかの実施形態では、ヒンジドメインは、ＣＤ８ヒンジドメインであり得る。他のヒンジドメインを使用し得る。
（ｄ）細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲコンストラクトのいずれかは、受容体の機能的末端である１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメイン（例えばＣＤ３ζ及び任意選択的に１つ以上の共刺激ドメイン）を含む。抗原認識後、受容体クラスター及びシグナルは、細胞に伝達される。
ＣＤ３ζは、Ｔ細胞受容体複合体の細胞質シグナル伝達ドメインである。ＣＤ３ζは、Ｔ細胞が同種抗原と会合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達する３つの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。多くの場合、ＣＤ３ζは、一次Ｔ細胞の活性化シグナルを提供するが、十分に適格な活性化シグナルではなく、共刺激シグナル伝達を必要とする。
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるＣＡＲポリペプチドは、１つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを更に含み得る。例えば、ＣＤ３ζによって媒介される一次シグナル伝達と共に、ＣＤ２８及び／又は４－１ＢＢの共刺激ドメインを使用して、十分な増殖シグナル／生存シグナルを伝達し得る。いくつかの例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、ＣＤ２８共刺激分子を含む。他の例では、本明細書で開示されるＣＡＲは、４－１ＢＢ共刺激分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインを含む。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。更に他の実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及び４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
本明細書に記載される方法は、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞、例えば当技術分野において公知の又は本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞を生成するために使用することができる２つ以上の好適なＣＡＲを包含することが理解されるであろう。例は、例えば、国際公開第２０１９／０９７３０５Ａ２号パンフレットとして公開された２０１８年５月１１日に出願されたＰＣＴ／ＩＢ２０１８／００１６１９号に見出すことができ、その関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。別の例では、ＣＡＲはＣＤ１９に結合する（「ＣＤ１９ ＣＡＲ」又は「抗ＣＤ１９ ＣＡＲ」とも呼ばれる）。ＣＤ１９に結合する例示的なＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号３７に提供されている（以下の実施例７、表１１を参照されたい）。更に別の例では、ＣＡＲはＢＣＭＡに結合する（「ＢＣＭＡ ＣＡＲ」又は「抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ」とも呼ばれる）。ＢＣＭＡに結合する例示的なＣＡＲのアミノ酸配列は、配列番号６１に提供されている（以下の実施例８、表１６及び１７を参照されたい）。
ＣＡＲコンストラクトをＴ細胞に送達するためのＡＡＶベクター
ＣＡＲコンストラクトをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して細胞に送達され得る。ＡＡＶは、宿主ゲノムに部位特異的に組み込み、従ってＣＡＲなどの導入遺伝子を送達し得る小型のウイルスである。逆位末端配列（ＩＴＲ）は、ＡＡＶゲノム及び／又は目的の導入遺伝子に隣接して存在し、複製開始点として機能する。また、ＡＡＶゲノムには、転写された場合にＡＡＶゲノムをカプセル化して標的細胞に送達するためのカプシドを形成するｒｅｐタンパク質及びｃａｐタンパク質も存在する。これらのカプシド上の表面受容体によってＡＡＶの血清型が付与され、カプシドがどの標的臓器に最初に結合するのか、従っていずれの細胞にＡＡＶが最も効率的に感染するのかが決定される。現在知られているヒトＡＡＶの血清型は、１２種類である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸を送達するのに使用されるＡＡＶは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）である。
アデノ随伴ウイルスは、いくつかの理由のために遺伝子療法に最も頻繁に使用されるウイルスの１つである。第一に、ＡＡＶは、ヒトを含む哺乳動物への投与時に免疫応答を誘発しない。第二に、ＡＡＶは、特に適切なＡＡＶ血清型の選択を考慮に入れる場合、標的細胞に効率的に送達される。最後に、ＡＡＶは、ゲノムが組み込みを伴わずに宿主細胞において存続し得ることから、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する能力を有する。この特質により、ＡＡＶは、遺伝子療法の理想的な候補となる。
ＣＡＲをコードする核酸は、宿主Ｔ細胞内の目的のゲノム部位に挿入するように設計することができる。いくつかの実施形態では、標的ゲノム部位は、セーフハーバー座位内に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする核酸は、（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターによって運ぶことが可能なドナー鋳型を介して）遺伝子操作されたＴ細胞内のＴＲＡＣ遺伝子を破壊してＣＡＲポリペプチドを発現させるために、ＴＲＡＣ遺伝子内の位置に挿入することができるように設計することができる。ＴＲＡＣの破壊は、内因性ＴＣＲの機能喪失をもたらす。例えば、本明細書に記載されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。この目的のために、ＴＲＡＣ遺伝子及び標的部位に特異的なｇＲＮＡのいずれか、例えば本明細書で開示されるものを使用することができる。
いくつかの実施例では、相同組換え修復、すなわちＨＤＲ（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターの一部であり得るドナー鋳型を使用した）により、ＴＲＡＣ遺伝子内のゲノム欠失と、ＣＡＲをコードするセグメントによる置換とを生じさせることができる。いくつかの例では、ｇＲＮＡ標的配列又はその一部が削除される（例えば、配列番号１７）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるようなエンドヌクレアーゼ及び１つ以上のＴＲＡＣゲノム領域を標的化する１つ以上のｇＲＮＡにより、且つＣＡＲをコードするセグメントをＴＲＡＣ遺伝子に挿入することにより、ＴＲＡＣ遺伝子の破壊を生じさせることができる。
本明細書で開示されるようなドナー鋳型は、ＣＡＲのコード配列を含有し得る。いくつかの実施例では、ＣＡＲをコードする配列は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９遺伝子編集技術を使用して、目的の遺伝子位置、例えばＴＲＡＣ遺伝子で効率的なＨＤＲを行うことができるように、２つの相同性領域に隣接し得る。この場合、標的座位に特異的なｇＲＮＡによって誘導されたＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素により、ＤＮＡの両方の鎖を標的座位で切断することができる。次いで、ＨＤＲが発生して二重鎖切断（ＤＳＢ）を修復し、ＣＡＲをコードするドナーＤＮＡを挿入する。これを正しく発生させるために、ドナー配列は、ＴＲＡＣ遺伝子などの標的遺伝子のＤＳＢ部位を取り囲む配列に相補的な隣接残基（以下では「相同性アーム」）を有するように設計されている。これらの相同性アームは、ＤＳＢ修復のための鋳型として機能し、ＨＤＲを本質的に誤りのない機構とすることを可能にする。相同組換え修復（ＨＤＲ）の割合は、変異部位と切断部位との間の距離の関数であり、そのため、重複しているか又は近傍の標的部位を選択することが重要である。鋳型は、相同領域に隣接した余分な配列を含むことができるか、又はゲノム配列と異なる配列を含むことができ、これによって配列編集が可能になる。
代わりに、ドナー鋳型は、ＤＮＡの標的化された位置と相同性のある領域がなくてもよく、標的部位で切断された後にＮＨＥＪ依存的末端連結により組み込まれ得る。
ドナー鋳型は、一本鎖及び／又は二重鎖のＤＮＡ又はＲＮＡであり得、直鎖状又は環状の形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法により（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）保護することができる。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基を直鎖状分子の３’末端に付加し、且つ／又は自己相補的オリゴヌクレオチドを一方又は両方の末端に連結する。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３；Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外来性のポリヌクレオチドを分解から保護するための更なる方法として、末端アミノ基の付加並びに例えばホスホロチオエート、ホスホロアミデート及びＯ－メチルリボース又はデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間結合の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
ドナー鋳型は、例えば、複製開始点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。更に、ドナー鋳型は、裸の核酸として、リポソーム若しくはポロキサマーなどの薬剤と複合体を形成した核酸として細胞に導入することができるか、又はウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス及びインテグラーゼ欠損レンチウイルス（ＩＤＬＶ））により送達することができる。
いくつかの実施形態では、ドナー鋳型は、その発現が内在性プロモーターによって駆動することができるように、内在性プロモーターの近傍の部位（例えば、下流又は上流）に挿入することができる。他の実施形態では、ドナー鋳型は、ＣＡＲ遺伝子の発現を制御するために、外来性プロモーター及び／又はエンハンサー、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含み得る。いくつかの実施形態では、外来性プロモーターは、ＥＦ１αプロモーターである。他のプロモーターを使用し得る。
更に、外来性配列は、転写又は翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列及び／又はポリアデニル化シグナルも含み得る。
Ｔ細胞の形質導入
本明細書に開示されるＣＡＲコンストラクト（例えば、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ又は抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ）をコードするＡＡＶベクターなどの任意の好適な量のウイルスベクターは、好適な量のＴ細胞、例えば、本明細書に開示される遺伝子編集されたＴ細胞と、ウイルスベクターのＴ細胞への侵入を可能にするために好適な期間インキュベートし得る。例えば、形質導入プロセスは、ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を増加させる一連の最適化された感染多重度（ＭＯＩ）の使用を伴い得る。場合により、形質導入プロセスにおけるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、例えば約１０，０００～約８０，０００などの範囲であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００～約１５０，０００、約５，０００～約１００，０００、約１０，０００～約１００，０００、約１０，０００～約９０，０００、約１０，０００～約８０，０００、約１０，０００～約７０，０００、約１０，０００～約６０，０００、約１０，０００～約５０，０００、約１０，０００～約４０，０００、約１０，０００～約３０，０００、約１０，０００～約２０，０００、約２０，０００～約８０，０００、約３０，０００～約８０，０００、約４０，０００～約８０，０００、約５０，０００～約８０，０００、約６０，０００～約８０，０００又は約７０，０００～約８０，０００であり得る。いくつかの例では、形質導入プロセスで使用されるＡＡＶベクターのＭＯＩは、約１，０００、約２，５００、約５，０００、約１０，０００、約１５，０００、約２０，０００、約２５，０００、約３０，０００、約３１，０００、約３２，０００、約３３，０００、約３４０００、約３５，０００、約４０，０００、約５０，０００、約６０，０００、約７０，０００、約８０，０００、約９０，０００、約１００，０００、約１１０，０００、約１２０，０００、約１３０，０００、約１４０，０００又は約１５０，０００であり得る。
いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは抗ＣＤ１９ ＣＡＲをコードし（例えば、以下の実施例７で開示される）、形質導入プロセスで使用するためのこのようなＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。他の実施形態では、ＡＡＶベクターは抗ＢＣＭＡ ＣＡＲをコードし（例えば、以下の実施例８で開示される）、形質導入プロセスで使用するためのこのようなＡＡＶベクターのＭＯＩは、約２０，０００である。
形質導入後、Ｔ細胞は、回復のために好適な期間、好適な細胞培養培地で培養され得る。ノックアウトされたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有し、ＣＡＲを発現する遺伝子操作されたＴ細胞は、以下に開示されるとおり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ得る。
（ｖ）Ｔ細胞の増殖
本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞は、好適な条件下でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させて、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を臨床的に適切な規模で生成し得る。この増殖工程で使用される細胞培養条件は、少なくとも部分的に、より短いインキュベーション期間でより高い最終細胞密度を達成し（それにより製造コストを削減し）、細胞治療で使用するためのより強力なＴ細胞を達成することを意図している。効力は、様々なＴ細胞機能、例えば、増殖、標的細胞殺傷、サイトカイン産生、活性化、遊走及びそれらの組み合わせによって示され得る。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、細胞容器中約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団（例えば、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞）を、細胞培養容器に播種することによって実施され得る。例えば、Ｔ細胞は、細胞容器中約３００，０００細胞／ｃｍ２～約５００，０００細胞／ｃｍ２で播種され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞増殖は、少なくとも約６０，０００細胞／ｃｍ２、少なくとも約６２，５００細胞／ｃｍ２又は少なくとも約８３，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種することによって実施される。いくつかの態様では、Ｔ細胞増殖は、少なくとも約１５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約２５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約３００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約４００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約５００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約６００，０００細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種することによって実施される。いくつかの態様では、播種密度は、約２５０，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、播種密度は、約５００，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、播種密度は、約６００，０００細胞／ｃｍ２である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団（例えば、本明細書で開示される遺伝子操作されたＴ細胞）を、細胞培養容器に播種し、約６日～約１２日にわたって細胞を培養することによって実施され得る。いくつかの例では、Ｔ細胞増殖は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約４×１０５細胞／ｃｍ２、２×１０５細胞／ｃｍ２～約３×１０５細胞／ｃｍ２、３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２又は４×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度で、Ｔ細胞集団を細胞培養容器に播種し、約６日～約１２日、約６日～約１１日、約６日～約１０日、約６日～約９日、約６日～約８日、約６日～約７日、約７日～約１２日、約７日～約１１日、約７日～約１０日、約７日～約９日、約７日～約８日、約８日～約１２日、約８日～約９日、約９日～約１２日、約１０日～約１２日又は約１１日～約１２日にわたって細胞を培養することによって実施される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、細胞培養容器でＴ細胞集団を播種し、約７日～約９日にわたって細胞を培養することによって実施される。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞増殖工程は、細胞培養物を再プレーティングすること（すなわち細胞培養物を新しい培養容器に分割すること）を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、編集後３、４、５、６又は７日目に１：４の比率（１つの容器を４つの新しい容器に分割）で再プレーティングして、更に増殖させることができる。
Ｔ細胞増殖は静置培養容器で行うことができ、これは、培地を交換することなくＴ細胞を増殖させることができる。例えば、Ｔ細胞は、静置培養容器内で、培地を交換せずに、約７日～約１２日又は約７日～約９日にわたって増殖させることができる。
（ｖｉ）ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇
いくつかの実施形態では、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、本明細書に開示される増殖されたＴ細胞集団から枯渇して、細胞治療で使用するための同種異系Ｔ細胞の集団を生成し得る。本明細書で使用する場合、「ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇」は、そのようなものを含む細胞の集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を枯渇させることを指す。ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇に続いて、得られたＴ細胞集団は、実質的に低レベルのＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を有し得る（例えば、全細胞集団の３％未満又は２％未満、１％未満又は全細胞集団の０．５％未満）。いくつかの例では、得られたＴ細胞集団はＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を含まなくてもよく、すなわち、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の存在は、従来の方法（例えば、ＴＣＲαβ＋に結合する抗体を使用するイムノアッセイ又はフローサイトメトリー）では日付が与えられない。
ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞の枯渇は、ＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を認識してＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を捕捉する薬剤を使用して実施し、それにより、例えば、磁気細胞分離を実施することにより、ＴＣＲαβ＋を欠くものからそれらを分離し得る。このような方法は、上記で開示された増殖されたＴ細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されているビーズに接触させ、且つ結合されていない細胞を収集することによって実施され得る。このように収集された非結合細胞（ＴＣＲαβ＋を欠くもの）は、事前に細胞を回復させるために培養することができ、例えば非結合細胞を一晩培養して細胞を回復させ得る。
（ｖｉｉ）遺伝子操作されたＴ細胞の採取
次いで、本明細書で開示される方法のいずれかによって生成される遺伝子操作されたＴ細胞は、当技術分野で公知の従来の方法を使用して治療的使用のために採取することができる。例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の採取は、ＴＣＲαβ＋が枯渇した細胞の収集を含み得る。採取した遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、原薬として使用し得る。本明細書で使用する場合、「原薬」は、患者に投与され得る遺伝子操作されたＴ細胞の集団を指す。原薬は、治療的使用のために製剤化、例えば、保存培地（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５）中で製剤化され、将来の使用のために凍結保存され得る。
原薬は、１つ以上の汚染物質、例えばマイコプラズマ、ヒトウイルス（例えば、ＨＩＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＣＭＶ）及び細菌内毒素について試験される場合がある。代わりに又は加えて、原薬は、滅菌について試験される場合がある。汚染のない原薬は、個々の患者の用量に分取され得る。代わりに又は加えて、汚染のない原薬は、治療的使用のために保存され得る。
従って、本開示の態様は、遺伝子操作されたＴ細胞の集団（原薬）を提供する。遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、破壊されたＴＲＡＣ遺伝子、破壊されたβ２Ｍ遺伝子及びＣＡＲをコードする核酸、例えば、本明細書に記載されるものを有する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、病的な細胞上で発現される抗原に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％は、ＣＡＲを発現する。他の態様では、ＣＡＲを発現するこれらの細胞は、検出可能なレベルの表面ＴＣＲ及び／又は検出可能なレベルの表面β２Ｍを更に発現しない。
他の実施形態では、本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％がＣＡＲを発現する場合、細胞の集団は、約１．０％以下、約０．５％以下、約０．４％以下又は約０．１５％以下の表面ＴＣＲを発現するＴ細胞（例えば、ＴＣＲα／β＋細胞）を含む。
他の実施形態では、本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団の少なくとも３０％がＣＡＲを発現する場合、細胞の集団は、約５０％以下、約４０％以下又は約３０％以下の表面β２Ｍを発現するＴ細胞を含む。
Ｃａｓ９酵素、ＴＲＡＣ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ、β２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ及びＣＡＲをコードする核酸配列を含むＡＡＶベクター（例えば、ＣＤ１９ ＣＡＲ又はＢＣＭＡ ＣＡＲ）を含む、本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団も本発明の範囲内である。
ＩＩ．治療用途
本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、治療目的、例えば、遺伝子操作されたＴ細胞の集団によって発現されるＣＡＲコンストラクトによって標的化される癌の治療のために対象に投与され得る。
対象は、診断、処置又は治療が望まれている任意の対象であり得る。いくつかの実施形態では、この対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、この対象は、ヒトである。
本明細書に記載された方法によって生成される遺伝子操作されたＴ細胞の集団を使用して治療され得る癌の非限定的な例としては、多発性骨髄腫、白血病（例えば、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ－ＡＬＬ）及び／又は慢性リンパ性白血病（Ｃ－ＣＬＬ））、リンパ腫（例えば、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫及び／又はＴ細胞リンパ腫）及び／又は明細胞腎細胞癌（ｃｃＲＣＣ）、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸癌、乳癌、腎臓癌、甲状腺癌、上咽頭癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬＣ）、神経膠芽腫及び／又は黒色腫が挙げられるがこれらに限定されない。
投与は、望ましい効果を生じさせることができるように、腫瘍部位などの所望の部位に遺伝子操作されたＴ細胞集団の少なくとも部分的な局在化をもたらす方法又は経路により、遺伝子操作されたＴ細胞集団を、対象に配置する（例えば、移植する）ことを含み得る。対象の所望の位置に送達をもたらす任意の適切な経路によって遺伝子操作されたＴ細胞集団を投与することができるが、この場合、移植された細胞又はこの細胞の構成要素の少なくとも一部は、生存したままである。対象への投与後の細胞の生存期間は、数時間（例えば、２４時間）の短い期間から数日、数年又は更に対象の寿命（すなわち長期の生着）までであり得る。例えば、本明細書に記載されるいくつかの態様では、有効量の遺伝子操作されたＴ細胞集団を、腹腔内又は静脈内経路などの全身性の投与経路を介して投与することができる。
いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＴ細胞集団を全身に投与し、これは、細胞の集団を標的部位、組織又は臓器に直接投与するのではなく、代わりに対象の循環系に入り、それにより代謝及び他の同様のプロセスを受けるように投与することを意味する。好適な投与の様式としては、注射、注入、点滴又は経口摂取が挙げられる。注射としては、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節腔内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内及び胸骨内注射並びに注入が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、経路は、静脈内である。
有効量とは、医学的状態（例えば、癌）の少なくとも１つ以上の徴候又は症状を予防又は軽減するのに必要な遺伝子操作されたＴ細胞集団の量を意味し、所望の効果をもたらす、例えば医学的状態を有する対象を治療するのに十分な量の遺伝子操作されたＴ細胞集団を意味する。有効量としては、疾患の症状の発症を予防するか若しくは遅らせるか、疾患の症状の経過を変える（例えば、限定されないが、疾患の症状の進行を遅らせる）か、又は疾患の症状を逆転させるのに十分な量も挙げられる。任意の所与の場合に関して、適切な有効量は、通常の実験により当業者によって決定することができることが理解される。
有効量の遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、少なくとも１０２細胞、少なくとも５×１０２細胞、少なくとも１０３細胞、少なくとも５×１０３細胞、少なくとも１０４細胞、少なくとも５×１０４細胞、少なくとも１０５細胞、少なくとも２×１０５細胞、少なくとも３×１０５細胞、少なくとも４×１０５細胞、少なくとも５×１０５細胞、少なくとも６×１０５細胞、少なくとも７×１０５細胞、少なくとも８×１０５細胞、少なくとも９×１０５細胞、少なくとも１×１０６細胞、少なくとも２×１０６細胞、少なくとも３×１０６細胞、少なくとも４×１０６細胞、少なくとも５×１０６細胞、少なくとも６×１０６細胞、少なくとも７×１０６細胞、少なくとも８×１０６細胞、少なくとも９×１０６細胞又はその複合を含み得る。
本明細書に記載されるように生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団を用いた治療の有効性は、当業者によって決定することができる。治療は、一例ではあるが、任意の１つ又は全ての徴候又は症状の機能的標的のレベルが有利な様式で変えられる（例えば、少なくとも１０％増加する）か、又は疾患（例えば、癌）の他の臨床的に認められている症状又はマーカーが改善されるか又は緩和される場合、「有効」とみなされる。有効性は、入院又は医学的介入の必要性により評価された場合、対象が悪化しないことによっても測定され得る（例えば、疾患の進行が止まるか又は少なくとも遅くなる）。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、且つ／又は本明細書に記載されている。治療は、対象における疾患の任意の治療を含み、且つ（１）疾患を阻害すること、例えば症状の進行を止めるか若しくは遅くすること、又は（２）疾患を軽減すること、例えば症状の退行をもたらすこと、及び（３）症状の発症の可能性を予防するか若しくは減少させることを含む。
本明細書に記載されるように生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団は、組み合わせ療法でも使用され得る。例えば、本明細書に記載されるように生成される遺伝子操作されたＴ細胞集団は、同じ適応症を治療するか若しくは遺伝子操作されたＴ細胞集団の有効性を高め、且つ／又は遺伝子操作されたＴ細胞集団の副作用を低減させるために他の治療薬と併用され得る。
一般的技術
本開示の実施では、別段の指摘がない限り、当技術分野の範囲内にある分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の従来技術が用いられる。こうした技術は、例えば下記の文献で詳細に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６；ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）。
当業者であれば、更に詳細に述べることなく上記説明に基づいて本発明を最大限利用することができると考えられる。従って、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈すべきであり、決して以下の本開示を限定するものではない。本明細書で引用する全ての刊行物は、本明細書で言及される目的のために又は主題に対して参考として組み入れられる。
記載されている本発明をより詳細に理解できるように、以下の実施例が説明される。本出願で記載される実施例は、本明細書で提供される方法及び組成物を説明するために提供されており、それらの範囲を限定するものとしていかなる方法でも解釈されるべきではない。
実施例１：Ｔ細胞濃縮のための最適化条件の特定。
本実施例では、自動細胞処理システムを使用してロイコパックからＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮するための、Ｔ細胞濃縮のための最適化条件の特定について報告する。
方法
ロイコパック及びバッファー調製
ヒトロイコパックはＨｅｍａＣａｒｅ又はＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓから収集され、Ｔ細胞濃縮のために処理された。ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２、１ｍＭ ＥＤＴＡを添加）に０．５％ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を添加し、Ｔ細胞選択中の処理、プライム化、洗浄及び溶出に使用した。
ロイコパックドナーは、以下についてスクリーニングされた。
・Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ ＥＩＡ）
・Ｃ型肝炎ウイルス抗体（抗ＨＣＶ ＥＩＡ）
・ヒト免疫不全ウイルス抗体（ＨＩＶ １／２ ｐｌｕｓ Ｏ）
・ヒトＴ－リンパ球向性ウイルス抗体（ＨＴＬＶ－Ｉ／ＩＩ）
・ＨＩＶ－１／ＨＣＶ／ＨＢＶ核酸試験
・ＷＮＶ核酸試験
・クルーズトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ Ｃｒｕｚｉ）抗体（選択的シャーガス病検査、ドナーごとに１回の生涯検査）
・ＨＩＶ／ＨＢＶ／ＨＣＶ
・ＣＭＶ
上記のテストのいずれかで陽性の結果を示したドナーは除外された。本明細書に開示される実施例で使用されるドナーの個体群統計情報を表１に示す。
Figure 2023501580000002
Ｓｙｓｍｅｘによるロイコパック血液学分析
入ってくるロイコパックからのサンプルは、製造元の指示に従って、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＰ３００（Ｓｙｓｍｅｘ、シリアル番号Ｂ０６２８）を使用して血液学的分析のために処理された。白血球（ＷＢＣ）カウントを使用して、自動化細胞処理システムにロードされた総細胞量を計算した。
Ｔ細胞の濃縮
処理バッファー、ロイコパック、ＣＤ４マイクロビーズ及びＣＤ８マイクロビーズを、実行を開始する前に自動化細胞処理システムにロードした。細胞を洗浄し、分離のためにチャンバー内でマグネットカラムに向けて標識した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を捕捉し、処理バッファー中のターゲットバッグに更に溶出した。
細胞数及び生存率
細胞数及び生存率の評価は、デフォルトのプロファイルを使用してＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ：ＡＭＱＡＸ１０００）で実施した。細胞（２０μＬ）を、気泡を導入せずに数回上下にピペッティングすることにより、トリパンブルー（２０μＬ）と混合した。細胞／トリパンブルー混合物（１０μＬ）をＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）ＩＩ細胞計数チャンバースライドにロードした。
フローサイトメトリー
約１×１０６の全核細胞を、９５μＬの染色バッファー（０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）／ＤＰＢＳ）中の５μＬのヒトＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（商標）で室温（ＲＴ）において１０分間ブロックした。細胞を、Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ結合抗ヒトＣＤ４５抗体（１：５０）、ＢＶ５１０結合抗ヒトＣＤ３抗体（１：５０）、ＡＰＣ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ４抗体（１：５０）、ＰＥ－Ｃｙ７結合抗ヒトＣＤ８抗体（１：５０）、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ１９抗体（１：５０）、ＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ５６抗体（１：５０）及びＰＥ結合抗ヒトＣＤ３３抗体（１：５０）で、４℃において３０分間更にインキュベートした。次いで、５μＬの７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）生存率染色液を含む１ｍＬの塩化アンモニウム－カリウム（ＡＣＫ）溶解バッファーを各サンプルに適用した。ＡＣＫ溶解バッファーをＲＴで１０分間インキュベートした後、ＮｏｖｏＣｙｔｅ－３０００フローサイトメーターで細胞を取得した。
結果
ロイコパックサンプル中の白血球（ＷＢＣ）
試験したロイコパックのＷＢＣは、８．１４×１０９～２１．３６×１０９細胞の範囲であり、５．７７×１０９～１７．３２×１０９の範囲のリンパ球数を有した。
ＣＤ４及びＣＤ８の濃縮－純度、生存率、細胞回復率及び収率
試験された９つのバッチのうち、４つはプログラムＡで評価され、５つはプログラムＢで評価された。全てのバッチで、純度が＞９０％、生存率が＞９０％のＴ細胞が得られた（表２）。プログラムＡからの細胞回復率は３１％であったが、プログラムＢからの細胞回復率は５５．６９％であった。
Figure 2023501580000003
まとめると、これらの結果は、健康なドナー（ＨＤ）ロイコパックからのＴ細胞が、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対して高純度（＞９０％）及び高生存率（＞９０％）で濃縮されたことを示している。
実施例２：Ｔ細胞活性化のための最適化条件の特定
本実施例では、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを使用して、Ｔ細胞活性化のための最適化条件の特定について報告する。
静置培養容器におけるＴ細胞活性化のための最適化条件の特定
簡単に説明すると、健康なドナーロイコパックからの凍結保存Ｔ細胞を解凍し、ポリマーナノマトリックスに結合した組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストで、対照又は静置培養容器としてＴフラスコ内で４８時間活性化した。Ｔ細胞の活性化は、細胞活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の表面発現をモニタリングし、細胞増殖をモニタリングすることによって評価された。細胞播種密度、培地量及びポリマーナノマトリックスに結合した組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニスト（「ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニスト」）濃度を含む静置培養容器での活性化のための様々なＴ細胞活性化条件を試験した（表３）。Ｔ細胞の活性化は、細胞活性化マーカーＣＤ２５及びＣＤ６９の表面発現をモニタリングし、細胞増殖をモニタリングすることによって評価された。ＴフラスコでのＴ細胞活性化を陽性対照（ＰＣ）として使用した（表３）。
Figure 2023501580000004
図１Ａに示すように、ＣＤ２５及びＣＤ６９を発現する細胞の割合は、試験した条件間で類似していた。条件３では、ＣＤ６９＋細胞及びＣＤ２５＋ＣＤ６９＋細胞のわずかに高い（約１０％高い）集団が観察された（図１Ａ）。
しかし、細胞増殖率は、ＣＤ６９の発現レベルとは相関しておらず、むしろＣＤ２５の平均蛍光強度（ＭＦＩ）で測定した場合、ＣＤ２５の発現レベルと相関していた（図１Ｂ）。試験された条件の中では、陽性対照と比較した場合、条件７がＣＤ２５ＭＦＩと細胞増殖の間に最も類似した相関関係があった（図１Ｂ）。ＣＤ２５及びＣＤ６９はＴ細胞活性化マーカーであり、初期の上方制御と後期の上方制御が活性化状態と相関している。
要するに、これらの結果は、表３の条件７が、静置培養容器において優れたＴ細胞活性化効果をもたらしたことを示している（条件７：２．００×１０６細胞／ｃｍ２；２．００×１０６細胞／ｍＬ；４０μＬの組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックス／１×１０６細胞；及び１：１２．５の組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックス対培地の比）。
小規模製造プロセスにおける任意選択的なＴ細胞活性化条件の検証
次に、特定されたＴ細胞活性化条件（条件７：２．００×１０６細胞／ｃｍ２；２．００×１０６細胞／ｍＬ；４０μＬの組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックス／１×１０６細胞；及び１：１２．５の組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックス対培地の比）を、小規模製造プロセスにおいて（静置培養容器において）試験し、活性化Ｔ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）ノックアウト及び／又はβ－２－ミクログロブリン（β２Ｍ）ノックアウトの発現に関する遺伝子編集効率について調査した。Ｔフラスコ（フラスコ）におけるＴ細胞の活性化及び編集を、静置細胞培養容器（容器）におけるものと比較した。ＴＲＡＣ及びβ２ＭのエレクトロポレーションされたＴ細胞（ＥＰ）並びに未処理Ｔ細胞（ＵＴ）を対照として使用した。
小規模製造プロセス
クライオバイアルを液体窒素保存から回収し、少量の凍結物質が残るまで水浴で解凍した。次いで、細胞を１０倍量の完全増殖培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（Ｌｏｎｚａ）、５％のヒトＡＢ血清、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ２、１００Ｕ／ｍＬのＩＬ７）に滴下し、３００ｇで室温において１０分間遠心分離してペレット化した。細胞を１×１０６細胞／ｍＬの濃度に再懸濁し、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストを介した活性化に結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスに供し、下流の修飾を改善した。簡単に言えば、単離されたＴ細胞は、コロイド状ポリマーナノマトリックスに共有結合した組換えＣＤ３及びＣＤ２８で活性化された。組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを、未処理のフラスコ内の１：２５の比率又は１×１０６細胞当たり４０μＬで細胞に適用した。細胞は、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックス中で、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで２日間（４８時間）維持した。インキュベーション後、細胞を３００ｇで１０分間室温において遠心分離する。次いで、細胞ペレットを完全増殖培地に再懸濁し、遺伝子改変前に１×１０６細胞／ｍＬの濃度で一晩培養した。
組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを含まない完全培地で一晩培養した後、トリパンブルーを添加してＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーターでカウントすることにより、総細胞数及び細胞生存率を定量した。次いで、細胞を３００ｇで１０分間室温において遠心分離した。細胞ペレットを１０ｍＬのエレクトロポレーションバッファーで洗浄し、再度遠心分離した。細胞を遠心分離する間に、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を調製した。２つの分離したＲＮＰ複合体が形成された。Ｂ２Ｍ ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をそれぞれ１５０μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬの濃度で含む１つのＲＮＰが形成された。ＴＣＲ ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９をそれぞれ１５０μｇ／ｍＬ及び１５０μｇ／ｍＬの濃度で含む別のＲＮＰが形成された。ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９を含むＲＮＰ複合体は、室温で１０分間のインキュベーションによって形成された。一方のＲＮＰ複合体はＣａｓ９（Ｃａｓ９；配列番号１）及びβ２Ｍ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６）を含んで形成され、他方のＲＮＰ複合体はＣａｓ９（Ｃａｓ９；配列番号１）及びＴＣＲ遺伝子を標的化するｇＲＮＡ（ＴＡ－１；配列番号２）を含んで形成された。遠心分離後、細胞ペレットをエレクトロポレーションバッファーに再懸濁して４００×１０６細胞／ｍＬの濃度にした。得られた細胞懸濁液を使用して、３００×１０６細胞／ｍＬ、２００×１０６細胞／ｍＬ、１５０×１０６細胞／ｍＬ及び１００×１０６細胞／ｍＬの最終細胞濃度を有する更なる希釈液を生成した。分離したＲＮＰ複合体を合わせて、エレクトロポレーションキュベットにピペットで移した。様々な濃度の細胞をＲＮＰ複合体に添加し、上下に５回ピペッティングした。
フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用して、細胞をエレクトロポレーションした。各個々のキュベットをエレクトロポレーションしたら、細胞及びＲＮＰ溶液を未処理の１２ウェルプレートに分注し、各ウェルに５００μＬのＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（ヒトＡＢ血清、ＩＬ２及びＩＬ７を含まない）を入れた。細胞をインキュベーター内で２０分間休止させた。トリパンブルーを添加し、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーター又はＮＣ－２００でカウントすることにより、総細胞数及び細胞生存率を定量した。
休止後の総細胞数に基づいて、細胞を、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５（ヒトＡＢ血清、ＩＬ２又はＩＬ７を含まない）で更に希釈し、所望の濃度に到達させる必要がある場合がある。形質導入を行うために必要なＡＡＶの量を計算するには、総細胞数が必要である。
必要なＡＡＶのμＬ＝（総細胞数）（所望のＭＯＩ（すなわち２０，０００））／（ウイルスｖｇｃ／ｍＬ（すなわち１．５×１０１３））
ＡＡＶ及び細胞懸濁液を混合し、未処理のフラスコ内で３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。ＡＡＶを含む全量を、１００ｍＬの完全培地を含む静置培養容器に添加した。静置培養容器を３日間インキュベートして細胞増殖させた。
エレクトロポレーション後、静置培養容器の各ウェルに１００ｍＬの完全増殖培地を充填した。遺伝子改変細胞は、完全増殖培地に５×１０５細胞／ｍＬ～１×１０６細胞／ｍＬの濃度で播種された。ＩＬ２又はＩＬ７は、３～４日ごとに１００Ｕ／ｍＬの最終作業濃度まで補充された。総細胞数は、トリパンブルーを添加し、ＣＯＵＮＴＥＳＳ（登録商標）サイトメーターでカウントすることにより、３～４日ごとに定量された。エレクトロポレーション後、細胞を培養で９～１２日間維持し、３０×１０６細胞／ｍＬの飽和濃度に基づいて最大の総細胞数を達成した。細胞がこの閾値に達すると、ＴＣＲα又はβを発現した任意の残存する未編集細胞の枯渇を実施して、これらの細胞不純物を除去した。
静置培養容器での増殖期の間に、細胞はプラトー期に達する可能性があり、それにより、静置培養容器内で最大数の細胞に到達する。この段階では、総細胞集団はＴＣＲα及びβ陽性発現細胞の６％以下で構成されていた。ＴＣＲα及びβ陽性細胞は、移植片対宿主反応に寄与する可能性があるため、集団から枯渇し得る。静置培養容器で体積減少を行い、体積の９０％を除去し、体積の残りの１０％は細胞を含んでいた。細胞を、枯渇を実施するために使用されるチューブセットに滅菌溶接されたトランスファーバッグにロードした。ＴＣＲα及びβ陽性細胞を、抗ビオチンビーズによって捕捉される場合があるビオチン抗ＴＣＲαβを含むＴＣＲαβ枯渇キットを使用して主要な集団から除去した。ＴＣＲαβ陽性が枯渇した細胞はターゲットバッグに溶出され、静置培養容器に戻され、更に１日間培養した。次いで、細胞をＣＳ５で凍結保存し、－１４５℃で保存した。
培養物からの新鮮な細胞又はクライオバイアルから解凍した細胞を染色バッファーで洗浄し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。陰性対照として、１×１０６個の細胞を、Ｆａｂ－ビオチン又はＩｇＧ－ビオチン抗体とインキュベートした。細胞を染色用バッファーで洗浄し、過剰な一次抗体を捕捉するためにマウス抗ＩｇＧと共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、二次抗体（ＣＤ４５、ＣＤ５、ＣＤ４、ＣＤ８、Ｂ２Ｍ、ＴＣＲ、ストレプトアビジン－ＡＰＣ）及び生存率色素のフルパネルとインキュベートした。最後に細胞を染色用緩衝液で洗浄し、フローサイトメーターにかけて様々に染色された集団を捕捉した。
フローサイトメトリーを使用して、インプロセスサンプル並びに凍結保存された製品に存在する多様な集団を定量化した。本明細書に記載されているゲーティング戦略は、亜集団を区別するために使用した。要約すると、使用される戦略は、最初にリンパ球集団をゲーティングし、一重項細胞集団を選択し、ＣＤ４５＋又はＣＤ５＋集団をゲーティングすることに基づく。編集効率は、Ｂ２Ｍ－及びＴＲＡＣ－染色された細胞を親のＣＤ４５＋又はＣＤ５＋集団の割合として視覚化することによって決定した。同様に、ＣＤ４及びＣＤ８亜集団の比率は、ＣＤ４５＋又はＣＤ５＋集団の比率としてプロットした。アイソタイプコントロールを使用して、ＡＰＣチャネルでのＣＡＲ＋発現のゲートを設定した。
結果
本明細書で開示される小規模製造プロセスにおいて、Ｔ細胞を静置培養容器及び同じ活性化条件下のＴフラスコで活性化し（条件７）、次いで得られた活性化Ｔ細胞を２つのリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の存在下でフローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用してエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞に、感染多重度（ＭＯＩ）２０，０００で抗ＣＤ１９ ＣＡＲ（抗ＣＤ１９ ＣＡＲ；配列番号５３）を発現させるためのｒＡＡＶベクターを形質導入し、増殖させた。ＴＣＲαβ及びβ２Ｍのノックアウト効率、抗ＣＤ１９ ＣＡＲ発現並びに細胞増殖を細胞増殖中に評価した。ＴＣＲαβの枯渇は、自動化細胞処理システムを使用して実施した。処理バッファー、細胞産物及びビオチンに結合した抗ＴＣＲα／βモノクローナル抗体を含むＴＣＲαβキットを、実行前に自動化細胞処理システムにロードした。細胞を洗浄し、分離のためにチャンバー内でマグネットカラムに向けて標識した。非結合細胞（ＴＣＲαβ－）を処理バッファー中のターゲットバッグに収集した。
このようにして得られた細胞をフローサイトメトリーで分析し、Ｔ細胞活性化効率（ＣＤ２５＋％、ＣＤ６９＋％及び蛍光強度又はＭＦＩで表される）、遺伝子編集効率（αβ％及びβ２Ｍ％）、ＴＣＤαβ枯渇効率及びＣＡＲ発現効率を調べた。下記の表４を参照されたい。
Figure 2023501580000005
要約すると、合計０．５×１０６～１×１０６の細胞を、ＣＡＲフルパネル及びＣＡＲ減少パネル用の一次非結合抗体で４℃において２０分間インキュベートした。非結合の抗体を１ｍＬの染色バッファー（ＤＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ）で洗浄して除去し、次いで細胞を１００μＬの染色バッファー中の１μｇの対照マウスＩｇＧと室温（ＲＴ）で１０分間インキュベートした。次いで、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含むコンジュゲート抗体（すべてのパネル）（Ｔ細胞活性化パネルを除く）で、細胞を、光から保護された４℃において３０分間染色した。インキュベーション後、細胞を染色バッファーで洗浄し、Ｔ細胞活性化パネルを除いて、染色バッファーに再懸濁させ、これを７－ＡＡＤを含む染色バッファーに再懸濁させた。
静置培養容器で活性化されたＴ細胞は、Ｔフラスコで活性化されたＴ細胞と比較して、同等以上のＴＣＲαβ及びβ２Ｍノックアウト効率並びにＣＡＲ％発現を示した（図２Ａ～２Ｄ）。編集は、編集効率が監視される１２日間にわたって持続したままであった（図２Ａ～２Ｄ）。９日目の未処理Ｔ細胞（ＵＴ）におけるＣＡＲ％発現のレベルの上昇は、フローサイトメトリー中の技術的問題に起因し、３、６及び１２日目に測定されたＣＡＲ％発現と一致しなかった（図２Ｄ）。
静置培養容器で活性化されたＴ細胞は、Ｔフラスコで活性化されたＴ細胞と比較して、編集後に有意に高い増殖倍数を示した（５８．４６倍と比較して９８．６６倍；図３）。未処理Ｔ細胞の編集後の増殖倍数（８４．６１倍）及び模擬エレクトロポレーションＴ細胞の編集後の増殖倍数（７１．７７倍）は、Ｔフラスコで活性化されたＴ細胞で観察されたもの（５８．４６倍）よりも高かったが、静置培養容器で活性化されたＴ細胞で観察されたもの（９８．６６倍）よりも低かった（図３）。
まとめると、これらの結果は、Ｔ細胞活性化の特定された最適条件が、対照Ｔフラスコと比較して、小規模製造プロセス（静置培養容器で表される）で同様の高いＴ細胞活性化効率を示したことを示している。更に、静置培養容器で生成された結果として得られた活性化Ｔ細胞は、Ｔフラスコで生成された活性化Ｔ細胞と比較して、同等以上の編集効率、ＣＡＲ発現効率及び編集後のより大きい細胞増殖を示した。
実施例３：Ｔ細胞のエレクトロポレーションのための最適化条件の特定
本実施例では、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座での最適なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９依存性遺伝子編集のためのＴ細胞濃度の範囲を含む、エレクトロポレーションによるＴ細胞の遺伝子編集のための最適化された条件の特定を報告する。本実施例において、固定濃度のｇｓＲＮＡ及びＣａｓ９は、エレクトロポレーションによって増加するＴ細胞濃度に導入され、編集効率はフローサイトメトリーによって決定された。
１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度で効率的な編集が可能
固定濃度のＢ２ＭｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６）、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１、配列番号２）及びＣＡＳ９（配列番号１）を使用して、それぞれ、１５０μｇ／ｍＬ、１５０μｇ／ｍＬ及び３００μｇ／ｍＬで、細胞濃度を上げながら（１００×１０６細胞／ｍＬ～４００×１０６細胞／ｍＬ）エレクトロポレーションを行った。フローサイトメトリーを使用して遺伝子編集後、編集効率を３日ごとに監視した。各サンプルの濃度を表５にまとめる。
Figure 2023501580000006
１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの範囲の細胞濃度で、編集された細胞のＢ２Ｍ（－）及びＴＣＲ（－）亜集団は、それぞれ、＞８０％及び＞９８％であった（図４Ａ～４Ｂ）。細胞を１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの範囲の濃度でエレクトロポレーションした場合、ＣＡＲ＋発現は＞４０％であった（図４Ｃ）。４００×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度の場合、Ｂ２Ｍ（－）及びＴＣＲ（－）亜集団は、それぞれ、＜８０％及び＜８７％であった（図４Ｄ～４Ｅ）。ＣＡＲ＋発現は、４００×１０６細胞／ｍＬの密度でエレクトロポレーションされた細胞でもわずかに減少した（図４Ｆ）。
要するに、これらの結果は、１００×１０６細胞／ｍＬ～３００×１０６細胞／ｍＬの範囲の細胞濃度が内因性β２Ｍ及びＴＣＲ遺伝子座での効率的な編集を可能にすることを示している。
実施例４：Ｔ細胞形質導入のための最適化条件の特定
本実施例では、Ｔ細胞におけるＣＡＲ＋発現をもたらす、キメラ抗原受容体をコードするｒＡＡＶベクターの最適なＴ細胞形質導入のためのＭＯＩの範囲の特定を報告する。本実施例において、Ｔ細胞はＭＯＩの増加と共にｒＡＡＶベクターによって形質導入され、ＣＡＲ＋発現はフローサイトメトリーによって定量化された。
要約すると、健康なドナーロイコパックからの凍結保存されたＴ細胞を解凍し、４８時間活性化した。Ｃａｓ９及びＴＣＲを標的化するｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１；配列番号２／Ｃａｓ９；配列番号１）並びにＣａｓ９及びβ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６／Ｃａｓ９；配列番号１）を含むＲＮＰ複合体の存在下で、１×１０６の細胞濃度で、細胞を、大量にエレクトロポレーションし、各複合体には１５０μｇ／ｍＬのｓｇＲＮＡ及び１５０μｇ／ｍＬが含まれていた（表６）。上記の実施例１～３も参照されたい。
エレクトロポレーション後、細胞を再懸濁し、インキュベーター内で２０分間静置した。次いで、エレクトロポレーションした細胞を様々なアリコートに分離し、３７℃で１時間ｒＡＡＶのＭＯＩを増加させて形質導入した（表６）。ＣＡＲ＋発現は、３、６、１０及び１３日目のエレクトロポレーション及び形質導入後のフローサイトメトリーによって決定された。
Figure 2023501580000007
図５Ａに示すように、２０ＫのＭＯＩは、試験される期間にわたって少なくとも５０％のＣＡＲ＋発現を達成するのに十分であった。ＣＡＲ＋発現は、ＭＯＩが１０Ｋ、２０Ｋ、４０Ｋ及び８０Ｋで飽和していた（図５Ａ）。ＭＯＩを変化させても、細胞の生存率及び細胞の増殖には影響しなかった（データは示さず）。大量のエレクトロポレーションが実施され、Ｂ２Ｍ及びＴＲＡＣのノックダウンは未処理の細胞を除いて全てのサンプルで一貫していたため、ＣＡＲ＋発現の差異は、遺伝子編集の非効率性によるものではなかった（データは示さず）。１．２５Ｋ～１０Ｋの間のＭＯＩは、ＣＡＲ＋発現の減少と線形相関しているように見えた（図５Ａ）。０Ｋ～２３ＫのＭＯＩでＴ細胞が漸進的に形質導入された更なる実験は、ＣＡＲ＋発現と０．１２Ｋ～４．７Ｋの範囲のＭＯＩとの間に線形相関を示した（図５Ｂ）。
まとめると、これらの結果は、ＣＡＲ＋発現が１０Ｋ～８０ＫのＭＯＩで形質導入されたＴ細胞で飽和し、ＣＡＲ＋発現が０．１２Ｋ～４．７ＫのＭＯＩで形質導入されたＴ細胞のＭＯＩと線形相関したことを示している。
実施例５：Ｔ細胞増殖のための最適化条件の特定
本実施例では、優れたＴ細胞増殖のための任意選択的な細胞播種密度の特定を報告する。本実施例において、Ｔ細胞を増加する密度で播種し、細胞増殖を経時的に監視した。
要約すると、健康なドナーロイコパックからの凍結保存されたＴ細胞を解凍し、４８時間活性化した。次いで、Ｃａｓ９及びＴＣＲを標的化するｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１；配列番号２／Ｃａｓ９；配列番号１）並びにＣａｓ９及びβ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６／Ｃａｓ９；配列番号１）を含むＲＮＰ複合体の存在下で、細胞をエレクトロポレーションし、各複合体には１５０μｇ／ｍＬのｓｇＲＮＡ及び１５０μｇ／ｍＬが含まれていた。エレクトロポレーション後、細胞を２０，０００のＭＯＩのｒＡＡＶで形質導入し、次いで静置培養容器で増殖させた。詳細については上記の実施例１～４を参照されたい。
編集後、細胞を、最大１２日の増殖のために、５×１０４細胞／ｃｍ２（５０，０００）、１×１０５細胞／ｃｍ２（１００，０００）、２×１０５細胞／ｃｍ２（２００，０００）、３×１０５細胞／ｃｍ２（３００，０００）及び５×１０５細胞／ｃｍ２（５００，０００）で、静置培養容器に播種した。細胞数及び生存率は３日ごとに評価した。増殖倍数は、終了細胞数と開始細胞数の比として計算した。
図６Ａ～６Ｂに示すように、５×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種された細胞は、９日で成長プラトーに達した。３×１０５／ｃｍ２の密度で播種された細胞は１２日目までに、５×１０５細胞／ｃｍ２で播種された細胞が９日目に到達した細胞数に匹敵する細胞数に達した（図６Ａ～６Ｂ）。２×１０５細胞／ｃｍ２及び１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種された細胞は、１２日目までに成長プラトーに達することなく適度な増殖を示した（図６Ａ～６Ｂ）。試験された播種密度の中では、５×１０４細胞／ｃｍ２細胞の密度で播種された細胞において、最低レベルの増殖が観察された（図６Ａ～６Ｂ）。１×１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種された細胞は、２×１０５細胞／ｃｍ２（１８５．５倍）及び３×１０５細胞／ｃｍ２（１６４．６倍）の密度で播種された細胞と比較して、総細胞数は少ないが、より強い増殖倍数率（２２３．４倍）を示した（図６Ｃ）。５×１０５細胞／ｃｍ２及び５×１０４細胞／ｃｍ２のいずれかで播種された細胞の増殖倍数率は約１００倍であった（図６Ｃ）。
要約すると、これらの結果は、３×１０５細胞／ｃｍ２～５×１０５細胞／ｃｍ２の間の細胞播種密度の範囲が編集後の効率的なＴ細胞増殖を提供したことを示す。
実施例６：ＴＣＲαβ枯渇のための最適化条件の特定
本実施例では、編集後に残存するＴＣＲαβ＋細胞の最適な枯渇のための条件の特定について報告する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９媒介性遺伝子編集は、典型的には、Ｔ細胞の＞９０％でＴＣＲαβ発現のアブレーションをもたらす。移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を最小限に抑えるために、残存するＴＣＲαβ＋Ｔ細胞は、ＴＣＲαβ＋枯渇プロセスによって更に減少させる場合がある。
要約すると、細胞をビオチン結合－ＴＣＲαβ抗体及び抗ビオチンマイクロビーズとインキュベートした。過剰な非結合抗体及びμビーズを除去した後、細胞をマグネットカラムに通し、標識されたＴＣＲαβ＋細胞をカラムに捕捉した。非結合のＴＣＲαβ－細胞は、ＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファー中の０．５％ＨＳＡを含むターゲットバッグに溶出される。溶出した細胞を一晩培養して細胞を回復させ、その後、製剤配合のために採取した。
ＣＡＲを発現するＴ細胞産物の４つのバッチをＴＣＲαβ枯渇のために処理した。本格的規模プロセスから３つのバッチを生成し、中規模プロセスから１つのバッチ（ＣＴＸ１１０－１８－０１）を生成した。インプット細胞数は、ドナーの変動及び増殖規模により、７．４×１０９細胞～３２．０×１０９細胞まで変動した（表７）。枯渇後の細胞数の回復率は７５％～１１３．３３％の範囲であった（表７）。１００％又は１１３％の細胞数の回復率は、インプット細胞数の過小評価が原因である場合がある（表７）。ＣＴＸ１１０－１８－０１バッチからのインプット細胞（８４．５％）を除いて、インプット及びアウトプット細胞の生存率は９０％を超えていた（表７）。インプット細胞及びアウトプット細胞のＴＣＲαβ＋の平均パーセントは、それぞれ、２．０６％及び０％であった。
Figure 2023501580000008
要するに、これらの結果は、ＴＲＡＣ遺伝子及びβ２Ｍ遺伝子が遺伝的に破壊されたＣＡＲ発現Ｔ細胞からのＴＣＲαβの効率的な枯渇を示している。
実施例７：抗ＣＤ１９ＣＡＲを発現し、遺伝子破壊されたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞を作製するための製造プロセス開発（ＣＴＸ１１０）。
概略
ＣＴＸ１１０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変された同種Ｔ細胞で構成されるＣＤ１９指向性Ｔ細胞免疫療法である。
改変には、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子の標的破壊が含まれる。ＴＲＡＣ座位を破壊することで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の発現の減少がもたらされ、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の可能性を低減させることが意図される一方、β２Ｍ座位を破壊することで、主要組織適合複合体タイプＩ（ＭＨＣ Ｉ）タンパク質の発現の減少がもたらされ、宿主拒絶反応の可能性を低減させることによって持続性を向上させることが意図される。抗ＣＤ１９ ＣＡＲを加えることにより、改変Ｔ細胞がＣＤ１９発現腫瘍細胞に誘導される。
ＣＡＲは、抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８共刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインで構成されている。ＣＴＸ１１０ ＣＡＲの発現は、ＥＦ－１αプロモーターによって誘導される。
ＣＴＸ１１０の例示的な製造プロセスが図７Ａに示されている。
製造プロセスの発展
ＣＴＸ１１０の製造プロセスは、研究規模、開発規模及び臨床規模を含む３つの生産規模で実施した。研究規模プロセスは小規模で実施し、研究規模プロセスを規模拡大して、開発規模プロセス及び臨床規模プロセスに移行した。初期開発キャンペーン（４ロット）は、実現可能性及び操作パラメータの調整のために、原薬の実験室グレードの出発物質を使用して実施した。その後、ＧＭＰ由来の出発物質（ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９及びｒＡＡＶ－１３８）の使用及び定量的許容基準を、開発規模プロセスと運用上同一である臨床規模プロセスに実装した。
出発物質の選択
ＣＴＸ１１０の生成用出発物質は、以下のとおりである：
－ 健康なドナーから収集されたロイコパック、
－ 細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ、
－ ２つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するＴＡ－１及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するβ２Ｍ－１、及び
－ 抗ＣＤ１９ ＣＡＲ遺伝子をコードする組換えＡＡＶ－６ベクター（ｒＡＡＶ－１３８）。
ＣＴＸ１１０の遺伝子改変並びに編集されたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座の作製に使用される構成要素についての構造情報を以下に示す。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼのアミノ酸配列（配列番号１）：
Figure 2023501580000009
Figure 2023501580000010
Figure 2023501580000011
Figure 2023501580000012
Figure 2023501580000013
Figure 2023501580000014
Figure 2023501580000015
Figure 2023501580000016
Figure 2023501580000017
Figure 2023501580000018
Figure 2023501580000019
Figure 2023501580000020
（ｉ）健康なドナー全体の細胞編集パフォーマンス
健康なドナー（男性、ｎ＝１０）からのＴ細胞を、ロイコパックから分離し、クライオチューブで凍結した。以下の濃度の遺伝子編集成分を使用して、各ドナーの解凍細胞で編集効率を評価した：Ｃａｓ９（３００μｇ／ｍＬ）、ＴＡ－１（７５μｇ／ｍＬ）及びΒ２Ｍ－１（１５０μｇ／ｍＬ及び２００μｇ／ｍＬ）。
全てのドナーからの編集された細胞の４０％超がＣＡＲを発現した。β２Ｍ及びＴＲＡＣノックアウト率は、それぞれ総細胞集団の８０％及び９５％を超えていた（表１２）。ドナー間でのＴ細胞の分離はすべて、ＣＴＸ１１０の製造に受け入れられると見なされ、堅牢な生成プロセスを示している。
Figure 2023501580000021
（ｉｉ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ
配列番号１のＣａｓ９ヌクレアーゼを本実施例で使用した。以下の表１４にまとめられた結果は、同様のレベルのＴＣＲαβ－及びΒ２Ｍ－細胞並びに二重陰性細胞が存在したことを示す。
（ｉｉｉ）ｒＡＡＶ－１３８ベクター
上記で開示されたｒＡＡＶ－１３８ベクターを使用して、ＭＯＩの影響を評価し、目的のＣＡＲ＋発現を達成した。ＭＯＩを増加させて細胞を形質導入し、ＣＡＲ＋発現を定量化した。上記の実施例４を参照されたい。図７Ｂに提示されたデータは、２０，０００のＭＯＩの選択を支持する。
規模拡大の開発のために、選択されたＭＯＩの上記の出発物質との適合性を検証するための研究を実施した。細胞を、０～２３，０００の範囲のＭＯＩで形質導入した。エレクトロポレーション及びウイルス感染とそれに続く１１日間の増殖後、ＣＡＲ＋発現をフローサイトメトリーによって定量化した。結果を図７Ｃに示す。ＡＡＶ用量依存性であるＣＡＲ＋発現は、ＭＯＩが０の場合の２．１％ＣＡＲ＋から、ＭＯＩが２３，０００の場合の５６．２％ＣＡＲ＋の範囲であった。ＣＡＲ＋発現は、４，７００のＭＯＩで飽和した。
ＧＭＰ ｒＡＡＶ－１３８（ＭＯＩ ２３，０００）に感染した細胞のＣＡＲ発現は、非ＧＭＰベクター（ＭＯＩ ２０，０００）で得られたものと同等であり、それぞれ、５６．２％及び５５．４％であった。規模拡大の生成には、２０，０００のＭＯＩが選択された。
（ｉｖ）リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）のｉｎ ｓｉｔｕでの形成
固定濃度の細胞を使用して、ＴＣＲを標的化するｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１、配列番号２）及びβ２Ｍ（Β２Ｍ－１；配列番号６）を標的化するｓｇＲＮＡとＣａｓ９（配列番号１）のインキュベーションによって形成されるＲＮＰ複合体の濃度を増加させてエレクトロポレーションを行った。ＴＡ－１／Ｃａｓ９及びβ２Ｍ／Ｃａｓ９複合体のｉｎ ｓｉｔｕでの形成は、３００μｇ／ｍＬのＣａｓ９ヌクレアーゼの最終結合濃度（各ガイドと結合した１５０μｇ／ｍＬのＣａｓ９ヌクレアーゼの最終濃度に相当）を使用して評価した。ＴＡ－１及びΒ２Ｍ－１の最終濃度は、３７．５μｇｇ／ｍＬ～３００μｇｇ／ｍＬまで変化した。
図７Ｄで示すように、３７．５μｇ／ｍＬ～７５μｇ／ｍＬのＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ濃度は、ＴＣＲαβのより高い編集をもたらした。１５０μｇ／ｍＬ又は３００μｇ／ｍＬのＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ濃度では、ＴＣＲαβの更なる編集は提供されず、Ｂ２Ｍの編集は減少した。試験した濃度の中で、７５μｇ／ｍＬのＴＡ－１ ｓｇＲＮＡは、ＴＣＲαβ、β２Ｍ及びＴＣＲαβとβ２Ｍのダブルノックアウト（ＤＫＯ）の編集に最高の効率を提供した。図７Ｅで示すように、７５μｇ／ｍＬ～１５０μｇ／ｍＬのＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ濃度は、β２Ｍのより高い編集をもたらし、ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡの濃度よりも高いＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡの濃度を使用して効率的な編集が達成される場合があることを示唆している。
要するに、これらの結果は、それぞれ０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬである最終濃度のＣａｓ９、ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ及びＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡを用いてＴ細胞の効率的な編集を示している。これらの濃度を達成するために、ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９及びＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９の混合物を、それぞれ２．７：１及び６．７：１のモル比で調製した。
ＲＮＰ複合体で検出された遊離Ｃａｓ９の割合を決定するには、ＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１；配列番号２）とＣａｓ９（Ｃａｓ９；配列番号１）及びＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６）とＣａｓ９（Ｃａｓ９；配列番号１）の混合物は、それぞれ２．７：１及び６．７：１のモル比で調製した。混合物を１０分間インキュベートした後、ＣＥＸ ＨＰＬＣで分析して、遊離Ｃａｓ９の量を定量した。表１３で示すように、混合物で検出された遊離Ｃａｓ９の割合が低いことは、ＲＮＰ複合体が効率的に形成されたことを示唆している。
Figure 2023501580000022
これらの結果は、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡのインキュベーションにより、Ｃａｓ９の大部分がＲＮＰ複合体内に含まれるようになることを示している。
製造プロセスの開発
（ｉ）研究プロセス
合計２２の研究ロットを、１７人の健康なボランティアからのＴ細胞を使用した研究規模プロセスによって生成した。研究規模プロセスで特定された条件を、開発規模プロセスを実施するための規模拡大のために検証及び調整した。最後に、ＧＭＰ由来の重要な出発物質を、臨床規模プロセスでの臨床材料の調製について評価した。効果的には、開発規模プロセス及び臨床規模プロセスは操作上同じである。
研究規模のプロセスは、図７Ａに示されるプロセスと同じ工程に従った。要約すると、ＰＢＭＣの凍結バイアル（ロット１～１４、１６、２１、２２）又は白血球アフェレーシス製品から濃縮された凍結Ｔ細胞（ロット１２～１５、１７～２０）のいずれかからのＴ細胞を、ゲンタマイシン又はフェノールレッドを含まないＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％ヒトＡＢ血清、ｒｈＩＬ－２及びｒｈＩＬ－７からなる「Ｔ細胞培地」で２～３日間、ＣＤ３／ＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ナノマトリックス粒子で活性化した。２日目又は３日目に、組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスを新鮮な培地で希釈するか、又は細胞を洗浄して遠心分離することのいずれかにより除去した。翌日、Ｔ細胞は、フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを含むエレクトロポレーション系トランスフェクションシステムを使用して、Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡでエレクトロポレーションした。
エレクトロポレーションからおよそ２０～６０分後、細胞を未処理のままにするか、又は１細胞当たり２０，０００若しくは５０，０００のいずれかの遺伝子コピーのＭＯＩでＡＡＶ６ｒＡＡＶ－１３８に感染させた。感染からおよそ１時間後、細胞を洗浄し、Ｔ細胞培地にプレーティングした。
ゲノム編集からおよそ１週間後、フローサイトメトリーにより、細胞のＴＣＲαβ／β２Ｍノックアウト及びＣＡＲ発現を評価した。続いて、ＴＣＲαβ－、Ｂ２Ｍ－、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋及びＣＡＲ＋である細胞のパーセンテージを計算した。
遺伝子編集後にＴＣＲαβ及びＢ２Ｍの表面発現を失い、細胞表面で検出可能なＣＡＲを発現した細胞のパーセンテージを、各プロセスのフローサイトメトリーで評価した（表１４）。研究ロット全体（ｎ＝２２）で、細胞の４３±１６％（１８～７２％）が抗ＣＤ１９ ＣＡＲの望ましい表面発現を達成し、ＴＣＲαβの表面喪失（９８±０．６６％、９７～９９％）及びＢ２Ｍ（７９±９．６％、５４～８６％）の表面喪失も示した（表１４）。開発規模プロセス及び臨床規模プロセスでも同様の結果が得られた（表１４）。研究ロットで完全に編集された細胞（ＴＣＲαβ－Ｂ２Ｍ－ＣＡＲ＋）の平均パーセンテージは、３１±１３％（１５～５９％）であった。
ＣＤ３ζの表面発現は、ＴＣＲとの複合体の形成に依存する。そのようなものであるから、これは、ＴＣＲαβの喪失に加えて、ＴＣＲの喪失の機能的な生化学的マーカーとして機能する。ＣＤ３ζ表面発現の喪失は、研究ロットで平均９６±３．５％（８５～９９％）であった。
亜集団のＣＤ４／ＣＤ８頻度を、遺伝子編集成分を含まないエレクトロポレーションによって処理された対照Ｔ細胞と比較した。研究ロットの場合、編集された細胞（ＴＣＲαβ－Ｂ２Ｍ－ＣＡＲ＋、ロット１～１１、１６～２２）には、平均して５０±１２％のＣＤ４細胞及び４５±１４％のＣＤ８細胞が含まれていた。エレクトロポレーションされた対照Ｔ細胞（ロット１～１１、１６～２１）には、５７±１２％のＣＤ４細胞及び４０±１２％のＣＤ８細胞が含まれていた。編集済みＴ細胞と対照Ｔ細胞を比較した場合、ＣＤ４又はＣＤ８の頻度の間に統計的に有意な差は観察されなかった（対にならない両側スチューデントのｔ検定）。
（ｉｉ）開発及び臨床プロセス
研究プロセスを、臨床材料の規模拡大及び生成のためにＧＭＰ施設に移管した。研究プロセスで特定された条件を、規模拡大（開発プロセス）のために検証及び調整した。最後に、ＧＭＰ由来の重要な出発物質を、臨床材料の調製について評価した（臨床プロセス）。効果的には、開発及び臨床プロセスは操作上同じである。結果を以下の表１４に提示する。
（ｉｉｉ）製造プロセス全体での遺伝子編集の比較可能性
研究プロセス及び初期規模拡大に対する臨床ロット並びに非臨床ロットの結果の比較を表１４に示す。
Figure 2023501580000023
プロセスパラメータの評価
製造運転パラメータを、表１５にまとめられている一連の小規模及び本格的規模の実験で評価した。
Figure 2023501580000024
Figure 2023501580000025
実施例８：抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを発現し、遺伝子破壊されたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法（ＣＴＸ１２０）。
ＣＴＸ１２０は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、エキソビボで遺伝子改変されたヒト同種Ｔ細胞で構成されるＢＣＭＡ指向性Ｔ細胞免疫療法である。
改変には、ＴＲＡＣ及びＢ２Ｍ遺伝子座の標的破壊及び組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ１６６、抗ＢＣＭＡ指向性キメラＴ細胞抗原受容体をコードする血清型６ｒＡＡＶ）を使用したＴＲＡＣ遺伝子座への抗ＢＣＭＡキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）導入遺伝子の挿入が含まれる。
ＣＡＲは、ＢＣＭＡに特異的なヒト化単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、それに続くＣＤ８ヒンジ並びにＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及びＣＤ３ζの細胞内シグナル伝達ドメインに融合した膜貫通領域で構成されている。ＣＴＸ１２０ ＣＡＲの発現は、伸長因子１α（ＥＦ－１α）プロモーターによって誘導される。
ＣＴＸ１２０の製造プロセスを図８Ａに示す。細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを含む出発物質の構造情報；２つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化するＴＡ－１及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化するＢ２Ｍ－１は、上記の実施例７に提供されている。ｒＡＡＶベクター中の抗ＢＣＭＡＣＡＲのアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を以下に示す（表１６及び１７）。
Figure 2023501580000026
Figure 2023501580000027
Figure 2023501580000028
Figure 2023501580000029
Figure 2023501580000030
Figure 2023501580000031
Figure 2023501580000032
Figure 2023501580000033
Figure 2023501580000034
Figure 2023501580000035
Figure 2023501580000036
ＣＴＸ１２０原薬の生成には、濃縮されたＴ細胞の解凍と、それに続く活性化及びエレクトロポレーション／形質導入が含まれ、その時点で細胞が増殖した。増殖後、ＴＣＲαβ＋細胞は枯渇した。細胞を一晩培養し、採取し、原薬試験のためにサンプリングした。図８Ａを参照されたい。ＣＴＸ１２０製造のいずれ工程でも再処理は実施されなかった。
Ｔ細胞の濃縮
Ｔ細胞は、自動化細胞処理システムを使用して、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズの混合物を使用した磁気分離により、白血病アフェレーシス材料（ロイコパック）から濃縮した。濃縮前にロイコパックを細胞数及び生存率（≧８０％）についてサンプリングした。濃縮した細胞を、ＨＳＡを含むＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーで単離し、次いで、細胞数、生存率（≧８０％）、Ｔ細胞純度（≧７０％ＣＤ３）及び無菌性についてサンプリングした。次いで、細胞を４±１℃で遠心分離し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５に５０×１０６生細胞／ｍＬの目標濃度で再懸濁させた。
Ｔ細胞の凍結保存
細胞数、生存率（≧８０％）について細胞をサンプリングし、次いで２，５００×１０６細胞／バッグ（細胞懸濁液３０～７０ｍＬ）の標的細胞数でエチレン酢酸ビニルクライオバッグに分注した。１～２バッグのＴ細胞を生成するには１つのロイコパックで十分であった。各バッグをヒートシールし、ラベルを付け、制御速度の冷凍庫に移すまで２～８℃で保管し、その後、保管のために気相液体窒素に移した。
Ｔ細胞の解凍及び活性化
濃縮されたＴ細胞の凍結バッグ１つを解凍し、３Ｌのバッグに移し、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％ヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７）で希釈した。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞を５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。次いで、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に細胞を再懸濁させ、細胞数及び生存率（≧７０％以上）についてサンプリングした。組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合した可溶性コロイド状ポリマーナノマトリックス溶液を、１：１２．５（ｖ／ｖ）の比率で添加して、細胞を活性化した。
約５００ｍＬの補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地／組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスの総量で各々、細胞を２×１０６生細胞／ｍＬの目標密度まで２つの静置細胞培養容器に播種した。静置培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で４８±４時間インキュベートした。プロセス全体を通して、静置培養容器を取り扱うときはいつでも、裂け目及び漏れ並びに透明な黄色の培地の存在について検査した。
希釈
２日後、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地を各静置培養容器に５Ｌまで添加した。細胞を更に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
エレクトロポレーション及び形質導入
補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地の量は、静置培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して最終容量を約５００ｍＬに減少させ、これを穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞を５００ｍＬの遠心分離管に移し、５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットをエレクトロポレーションバッファーに再懸濁させ、同一条件下で再度遠心分離した。細胞を、３００×１０６細胞／ｍＬの目標濃度になるまで、エレクトロポレーションバッファーに２回再懸濁させた。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、別々のマイクロ遠心チューブでＴＡ－１ ｓｇＲＮＡ（ＴＣＲを標的化する）及びＢ２Ｍ－１ ｓｇＲＮＡ（β２Ｍを標的化する）と混合した。各溶液を室温で１０分以上インキュベートして、各リボ核タンパク質複合体を形成した。２つのＣａｓ９／ｇＲＮＡ混合物を組み合わせ、細胞と混合して、Ｃａｓ９、ＴＡ－１及びＢ２Ｍ－１を、それぞれ最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬにした。混合物を取り出し、ピペッティングによりエレクトロポレーションカセットにロードした。カセットに蓋をし、フローエレクトロポレーションに基づくトランスフェクションシステムを使用して順次エレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を各カセットから１２５ｍＬ三角フラスコにプールし、３７℃で２０分以上インキュベートした。細胞を、生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞をＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で１０７細胞／ｍＬに希釈し、解凍したばかりのｒＡＡＶ－１６６ｂを２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６０分以上にわたってインキュベートした。
所望のＣＡＲ＋発現を達成するためのＭＯＩの影響は、ベクターの開発ロット（ｒＡＡＶ－１６６ｂ）を使用して評価した。ＭＯＩを増加させて細胞を形質導入し、％ＣＡＲ＋を定量化した。図８Ｂに示すように、ＡＡＶの用量依存的なＣＡＲ発現が観察された。ＣＡＲ発現は１０，０００前後のＭＯＩで飽和し、２０，０００のＭＯＩの選択を支持した。
ｉｎ ｓｉｔｕでの２つのリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形成は、上記の実施例７の記載に従って実施した。上記の表１３に示されている結果も参照されたい。
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ＤＮＡ二本鎖切断のための忠実度の高い細胞修復メカニズムである。ＨＤＲは、ＣＡＲ遺伝子の両端にある相同配列を使用して、ＡＡＶ鋳型から目的のＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲ遺伝子を導入するために使用される。
ＴＲＡＣ遺伝子座での抗ＢＣＭＡ ＣＡＲを評価するために、ｄｄＰＣＲアッセイが開発された。ＴＲＡＣ部位固有のＰＣＲプライマーセットは、統合された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ配列を増幅し、ＣＡＲ遺伝子が挿入された細胞の割合を決定するように設計した。３つのロットのＣＴＸ１２０をｄｄＰＣＲによって評価し、％ＨＤＲを表１８に示す。これらの結果は、ＴＲＡＣ遺伝子座に抗ＢＣＭＡＣＡＲが挿入されていることを確認する。
Figure 2023501580000037
細胞増殖
細胞を、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で希釈し、細胞生存率（≧７０％）及び細胞数についてサンプリングし、０．２～０．５×１０６生細胞／ｃｍ２の密度まで２つの静置培養容器及び１つの更なる静置培養容器（細胞監視のためのサテライト培養）に播種した。静置培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２でインキュベートした。細胞培養物を最大９日間インキュベートした。この間、培養物は３～４日ごとに１ｍＬの培養液用量当たり１００ＩＵのｒｈＩＬ２及びｒｈＩＬ７で補充した。サテライト静置細胞培養容器は、増殖全体の細胞数、生存率及びＴ細胞純度について試験した。サテライト培養容器内の細胞密度が約３０×１０６／ｃｍ２に達したとき、ＴＣＲαβの枯渇を実施した。サテライト培養容器の細胞密度が３０×１０６／ｃｍ２に達しなかった場合、９日目にメイン培養でＴＣＲαβの枯渇を実施した。
ＴＣＲαβの枯渇
各静置細胞培養容器の培地は、静置培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。培地の大部分を除去した後、静置培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。
細胞を、静置培養容器に接続するディップチューブを備えた５００ｍＬの遠心分離チューブに移した。生存率（≧７０％）、細胞数及び％ＣＡＲ＋細胞について細胞をサンプリングした。次いで、細胞を５４０×ｇ、２０±１℃で１５分間、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁させ、０．５％ＨＳＡを含む６５０ｍＬ未満のＰＢＳ／ＥＤＴＡにプールした。細胞懸濁液を、自動化細胞処理システムに接続されている滅菌バッグに移した。自動化細胞処理システムは、ビオチン結合抗ＴＣＲαβ抗体と共に細胞をインキュベートした。自動化細胞処理システムを使用してＴＣＲαβ＋細胞を枯渇させるために、細胞を洗浄し、抗ビオチン磁気ビーズと共にインキュベートした。細胞数、生存率（≧７０％）及び％ＣＡＲ＋細胞について細胞を試験した。
細胞の回復
枯渇した細胞を補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に再懸濁させ、３Ｌバッグ（複数可）に移し、静置細胞培養容器（複数可）に播種し、３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
細胞採取（原薬）
細胞を採取するために、静置培養容器をインキュベーターから取り外し、細胞沈降のために休ませた。ポンプを使用して、各静置培養容器から最終容量が約５００ｍＬになるまで成長培地を除去した。除去した培地を、無菌のためにサンプリングした。静置培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。各静置培養容器の内容物は、ポンプを使用して３Ｌの移送バッグに移送され、重力によって４０μｍ輸血フィルターを通して別個の滅菌３Ｌバッグに濾過された。細胞を、濃度及び生存率についてサンプリングした。
本明細書に開示される製造プロセスによって生成されるＣＴＸ１２０の細胞表現型
ＣＴＸ１２０製剤開発ロットを、Ｔ細胞集団について分析した。フローパネルを表１９に示す。
Figure 2023501580000038
疲弊マーカー
ＣＤ５７、Ｌａｇ３及びＰＤ１は、Ｔ細胞の疲弊に関連するマーカーである。表１９に定義されているマーカーを使用して、ＣＴＸ１２０医薬品の疲弊状態を評価した。図８Ｃ及び表２０で示すように、低レベルの疲弊マーカーがＣＡＲ＋ＣＴＸ１２０製剤細胞で見つかった。
Figure 2023501580000039
ＣＴＸ１２０製剤を、メモリー細胞マーカーについて評価した。ＣＤ４５ＲＯゲートでは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７及びＣＤ２７がセントラルメモリーに関連するマーカーであった。ＣＤ４５ＲＡゲートでは、ＣＤ６２Ｌが幹細胞メモリーのためのマーカーであった。ＣＤ６２Ｌ及びＣＣＲ７＋である細胞は、セントラルメモリー及び幹細胞メモリーのためのマーカーであった。ＣＤ８＋Ｔ細胞に関する結果を図８Ｄ及び表２１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞に関する結果を図８Ｅ及び表２２に示す。
Figure 2023501580000040
Figure 2023501580000041
ＣＴＸ１２０の生物活性
ＢＣＭＡ抗原で刺激したときのＣＡＲ Ｔ細胞製剤の生物活性を測定する２つのアッセイが開発された。まず、Ｔ細胞活性化時のＩＦＮγ分泌を測定した。要約すると、ＣＡＲ Ｔ細胞を組換えヒトＢＣＭＡとインキュベートした。ＣＡＲ Ｔ細胞が活性化されると、分泌されたＩＦＮγのレベルがＭｅｓｏ－Ｓｃａｌｅ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ（ＭＳＤ）によって測定された。結果を図８Ｆに示す。
次に、ＢＣＭＡ陽性ＭＭ．１Ｓ標的細胞を殺すＣＴＸ１２０ＣＡＲ－Ｔ細胞の能力は、フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイを使用して評価した。要約すると、標的細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０で標識し、ＣＴＸ１２０細胞と様々な比率でインキュベートした。ＣＴＸ１２０の細胞傷害性は、対照サンプルと比較してライブゲート内の標識細胞を評価することにより、４時間で分析した。結果を図８Ｇに示す。ＣＴＸ１２０の３つの開発ロットはすべて、用量依存的な標的細胞の細胞傷害性を示した。
まとめると、これらの結果は、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞の生成を示した。本明細書に記載されるように生成された抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、ＴＣＲ及びβ２Ｍの低い発現レベルを示し、それにより、宿主拒絶の可能性を低減した。更に、抗ＢＣＭＡ ＣＡＲ発現Ｔ細胞は、Ｔ細胞の活性化時にＢＣＭＡ陽性細胞の標的細胞死滅を示した。
実施例９：規模拡大のＴ細胞増殖のための最適化条件の特定
本実施例では、優れたＴ細胞増殖及び収量の増加のための最適なプレーティング又は再プレーティング条件の特定を報告する。本実施例において、Ｔ細胞は、編集後の同じ日に５００Ｋ／ｃｍ２よりも低い密度でプレーティングするか、又は５００Ｋ／ｃｍ２の密度で播種し、編集後の異なる日に再プレーティングした。細胞増殖を時間の経過に沿って監視した。
要約すると、健康なドナーロイコパックからの凍結保存されたＴ細胞を解凍し、４８時間活性化した。次いで、Ｃａｓ９（１５０μｇ／ｍＬ）及びＴＣＲを標的化するｓｇＲＮＡ（ＴＡ－１；配列番号２／Ｃａｓ９；配列番号１）（８０μｇ／ｍＬ）並びにＣａｓ９（１５０μｇ／ｍＬ）及びβ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡ（Ｂ２Ｍ－１；配列番号６／Ｃａｓ９；配列番号１）（２００μｇ／ｍＬ）を含むＲＮＰ複合体の存在下で、細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、細胞を２０，０００のＭＯＩのｒＡＡＶで形質導入し、次いで静置培養容器で増殖させた。詳細については上記の実施例１～４を参照されたい。
編集後、細胞を、増殖のために静置培養容器に１６６Ｋ／ｃｍ２、１２５Ｋ／ｃｍ２又は８３Ｋ／ｃｍ２で播種した。編集後に細胞の別のセットを５００Ｋ／ｃｍ２で播種し、編集後３、４、５、６又は７日目に１：４の比率（１つの容器を４つの新しい容器に分割）で再プレーティングして、更に増殖させた。再プレーティングせずに５００Ｋ／ｃｍ２で再プレーティングした細胞を、ＣＴＸ１１０基準グループとして使用した。細胞密度が３～４×１０６／ｍＬに達するまで全ての群が増殖し、その時点で細胞を採取した（表２３）。細胞数及び生存率は１～３日ごとに評価した。
Figure 2023501580000042
対照ＣＴＸ１１０基準（再プレーティングされなかった）は、７日間で３～４×１０６／ｍＬの濃度に達した（図９Ａ～９Ｂ）。３、４及び５日目に再プレーティングされた細胞（「Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５」）は、１０日間で約３～４×１０６／ｍＬの細胞濃度に達した（図９Ａ～９Ｂ）。６日目（「Ｄ６」）及び７日目（「Ｄ７」）に再プレーティングされた細胞は、約１４～１８日で３～４×１０６／ｍＬの細胞濃度に達した（図９Ａ～９Ｂ）。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、Ｄ６及びＤ７よりも約４～８日早く３．０～４．０×１０６／ｍＬの細胞濃度の目標に達した。１６６Ｋ／ｃｍ２、１２５Ｋ／ｃｍ２又は８３Ｋ／ｃｍ２でプレーティングされた細胞は、採取ポイントに達するまでに１０、１１及び１４日かかった。これは、基準グループより３、４及び７日長かった。
図１０Ａ及び１０Ｂは、７日目にＣＴＸ１１０基準から合計４～４．５ｅ８の細胞が採取され、３、４、５、６及び７日目の再プレーティンググループから採取された総細胞数が１．３ｅ９～２ｅ９であることを示し、これは、ＣＴＸ１１０対照基準よりも３～５倍多い細胞であった。
合計１．２ｅ９、１．６４ｅ９及び２．３２ｅ９の細胞は、１６６Ｋ／ｃｍ２、１２５Ｋ／ｃｍ２又は８３Ｋ／ｃｍ２のプレーティング群から採取され、これらの群は、ＣＴＸ１１０対照基準と比較して３～６倍多い細胞であった。
すべての再プレーティング群及び低密度プレーティング群の細胞生存率は、ＣＴＸ１１０基準と同様であった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。
Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング、１６６Ｋ／ｃｍ２プレーティング及び１２５Ｋ／ｃｍ２プレーティングにより、最低日数で期待される細胞数が得られることがわかった。
ＣＡＲ＋％、ＴＲＡＣ－％及びＢ２Ｍ－％を含む編集効率は、全て再プレーティング群と低プレーティング群から評価された。（図１２Ａ～１２Ｃ）ＣＴＸ１１０基準のＣＡＲ＋％は５５．９％であった。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング群は、ＣＡＲ＋％を５７．９％、５６％及び５２．６２％に維持したが、Ｄ６及びＤ７は、ＣＡＲ＋％を３８．６５％及び３５．４５％に減少させた。１６６Ｋ／ｃｍ２、１２５Ｋ／ｃｍ２又は８３Ｋ／ｃｍ２からのＣＡＲ＋％は、ＣＴＸ１１０基準からの有意な変化なしに、５９．３％、５４．９％及び５２．９％であった。ＣＴＸ１１０基準群のＴＲＡＣ－％は９４．２４％であった。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング群並びに１６６Ｋ／ｃｍ２のプレーティング群は、９３．５％、９３．６％、９３．１５％及び９３．９％と同等のＴＲＡＣ－％を維持した。ＴＲＡＣ－％のわずかな減少は、１２５Ｋ／ｃｍ２と８３Ｋ／ｃｍ２で９１．５％と９１．２％として観察された。ＴＲＡＣ－％の大幅な減少は、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング群で８８％及び８７．２％として見られた。同様の傾向は、Ｂ２Ｍ－％でも示された。ＣＴＸ１１０基準群のＢ２Ｍ－％は７７．９３％であった。Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング群並びに１６６Ｋ／ｃｍ２のプレーティング群は、７５．５１％、７５．３９％、７６．７７％及び７６．３１％と同等のＴＲＡＣ－％を維持した。Ｂ２Ｍ－％のわずかな減少は、１２５Ｋ／ｃｍ２と８３Ｋ／ｃｍ２で７１．７４％と６９．１９％として観察された。Ｂ２Ｍ－％の大幅な減少は、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング群で６０．３７％及び５８．２９％として見られた。
Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング、１６６Ｋ／ｃｍ２のプレーティング及び１２５Ｋ／ｃｍ２のプレーティングが、ＣＴＸ１１０基準と最も同等の編集効率を提供すると決定した。
再プレーティングされた集団の細胞表現型は、ＣＤ９５、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５７、ＣＤ２７及びＣＣＲ７を除き、Ｔｉｍ３を含む実施例８及び表１９に記載されているように、フローパネルを使用して決定された。図１３Ａ及び１３Ｂは、再プレーティングされた集団におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞の比率並びにＣＴＸ１１０基準を示す。ＣＤ４及びＣＤ８の比率は、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング群並びに１６６ｋ及び１２５ｋの低密度プレーティング群で十分に維持されていた。ＣＤ８＋細胞の増加は、Ｄ６及びＤ７再プレーティング群及び８３Ｋ低密度プレーティング群で見られた。
再プレーティング集団は、メモリー細胞マーカーについて評価した。ＣＡＲ＋、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ＋集団内で、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ－ＣＤ６２Ｌ－細胞及びＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ－細胞は、それぞれ、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリー（ＣＭ）Ｔ細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ）Ｔ細胞及びターミナルエフェクター（ＴＥ）Ｔ細胞として定義された。ＣＴＸ１１０製品内のこれらの集団は、サブセットとして定義された。図１４Ａ～１４Ｆは、再プレーティング集団及び低密度プレーティング群に見られるサブセットの組成を示している。ＣＡＲ＋、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ＋の集団内では、再プレーティング及び低密度プレーティング群のほとんどが、ナイーブＴ細胞の減少を示した。セントラルメモリーＴ細胞の減少は、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング群で検出されたが、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング群では有意ではなかった。ほとんどの群は、エフェクターメモリーＴ細胞の増加を示した。ターミナル分化細胞の増加は、ＣＡＲ＋及びＣＤ８＋ＣＡＲ＋細胞で見られたが、ＣＤ４＋ＣＡＲ＋細胞のほとんどでは見られなかった。
図１５Ａ～１５Ｆで示すように、低レベルの疲弊マーカーがＣＡＲ＋、ＣＤ４＋／ＣＡＲ＋及びＣＤ８＋／ＣＡＲ＋再プレーティング集団で見つかった。ＣＴＸ１１０基準と比較して、実験の１つにおいて、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング細胞でＬＡＧ３発現が増加した（図１５Ａ及び１５Ｃ）。全体として、３つ全ての疲弊マーカー（ＰＤ１、ＬＡＧ３及びＴＩＭ３）の発現は増加しなかった。全ての群でＰＤ１の発現はなかったか又は非常に低かった。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞殺傷アッセイ
次に、ＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ標的細胞を殺す、再プレーティング及び低プレーティング密度群のＣＡＲ－Ｔ細胞の能力は、フローサイトメトリーに基づく細胞傷害性アッセイを使用して評価された。要約すると、標的細胞をｅＦｌｕｏｒ６７０で標識し、ＣＡＲ－Ｔ細胞と様々な比率でインキュベートした。ＣＴＸ１１０の細胞傷害性は、対照サンプルと比較してライブゲート内の標識細胞を評価することにより、２４時間で分析した。結果を、図１６Ａ～１６Ｃで示す。ＣＴＸ１１０の全ての再プレーティング及び低密度プレーティング群は、ＣＴＸ１１０基準と同等のレベルで用量依存的な標的細胞の細胞傷害性を示した。
要するに、これらのｉｎ ｖｉｔｒｏの結果は、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５の再プレーティング並びに１６６Ｋ／ｃｍ２及び１２５Ｋ／ｃｍ２の播種密度が、ＣＴＸ１１０基準として十分な増殖、編集効率及び細胞傷害性を提供したことを示している。
ｉｎ ｖｉｖｏでの研究
次に、再プレーティング及び低密度プレーティング群のＣＡＲ－Ｔ細胞がマウスの腫瘍を殺す能力は、２つの独立した研究でｉｎ ｖｉｖｏで研究した（表２４及び２５）。Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ腫瘍細胞を、ＣＡＲ－Ｔ投与の４日前にＣＩＥＡＮＯＧマウスに接種した。毎週の生物発光（ＢＬＩ、フォトン／秒）評価により、マウスの腫瘍量を評価できる。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究＃１では、再プレーティングされたＤ５、Ｄ６及びＤ７並びにＣＴＸ１１０基準が、１マウス当たり２ｅ６、４ｅ６及び１０ｅ６のＣＡＲ＋細胞の用量で投与された。群ごと及び用量ごとに６匹のマウスが含まれた。未処理のマウスを陰性対照として使用した。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究＃２では、低密度プレーティング群（１６６Ｋ／ｃｍ２、１２５Ｋ／ｃｍ２及び８３Ｋ／ｃｍ２）及び再プレーティング群（Ｄ３、Ｄ４及びＤ６の再プレーティング）は、１マウス当たり４ｅ６ＣＡＲ＋細胞の用量で投与された。群ごとに４人のレシピエントが含まれていた。
Figure 2023501580000043
Figure 2023501580000044
ｉｎ ｖｉｖｏでの研究＃１は、３回の投与全てでＤ５再プレーティング群とＣＴＸ１１０基準の間で同等の生存率を示した。（図１７Ａ～１７Ｃ）８３Ｋ／ｃｍ２及び１６６Ｋ／ｃｍ２プレーティング群並びにＤ４の再プレーティング群は、他の試験群並びにＣＴＸ１１０基準と比較して生存率が低下していた。（図１７Ｄ）中程度の生存率を表２６及び２７に示す。
Figure 2023501580000045
Figure 2023501580000046
両研究における未処理のマウスからのＢＬＩは、２５日目及び１８日目に高い腫瘍負荷を示す罹患率の状態に達した。研究＃１では、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング群は、３つの用量全てでＤ５及びＣＴＸ１１０基準と比較してＢＬＩの早期の増加を示した（１マウス当たり２ｅ６、４ｅ６及び１０ｅ６ ＣＡＲ＋細胞；それぞれ図１８Ａ～１８Ｃ）。Ｄ５及びＣＴＸ１１０基準は、同様の腫瘍増殖動態を示した。研究＃２では、８３Ｋ／ｃｍ２のプレーティング群は、ＣＴＸ１１０基準よりも速い腫瘍増殖を示した。他の全ての試験群は、ＣＴＸ１１０基準（図１８Ｄ）と比較して、同様の又は更に遅延した腫瘍増殖を示した。
中程度の生存率及びＢＬＩによると、Ｄ６及びＤ７の再プレーティング群ではなく、Ｄ５の再プレーティング群は、ＣＴＸ１１０基準としてｉｎ ｖｉｖｏでの有効性を維持した。
増殖期間、収量、編集、疲弊／サブセットマーカー、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでの効力を使用して、最適な播種密度及び／又は再プレーティング条件を決定した。分析のまとめを表２８に示す。５日目に１：４の比率で再プレーティングすると、増殖及び編集効率が向上した。
Figure 2023501580000047
実施例１０：細胞増殖の改善
（Ａ）ＣＴＸ１１０及びＣＴＸ１２０細胞増殖アウトプットの増加のために最適化されたエレクトロポレーション
本開示に記載される方法は、エレクトロポレーションを利用して、例えば、Ｃａｓ９及びガイドＲＮＡ複合体を含む様々なリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を含む様々な核酸及びポリペプチドを、レシピエントＴ細胞に送達する。様々な製造業者からの任意の好適なエレクトロポレーション機器が、本明細書に記載の方法での使用を見つけることができるため、エレクトロポレーションプロセスで使用される機器は、特に限定されない。エレクトロポレーションで使用される細胞播種密度は、特に限定されない。
本実施例では、効率的な編集を維持しながら、より多くの容量を保持できるカセット内の細胞の数を増やしてエレクトロポレーションできるエレクトロポレーション機器を使用する。より大きいエレクトロポレーション容量は、形質導入及び増殖のためにより多くの編集された細胞を提供することにより、例えば、任意の所与の操作されたＴ細胞、例えば、ＣＴＸ１１０又はＣＴＸ１２０の操作されたＴ細胞製品のアウトプットを２倍にするのと同じくらい増加する。この容量の増加は、プロセス期間及び又は細胞の倍増を延長する必要がないため、これは、製造における利点である。
例えば、２つ以上の更なる培養容器などの更なるＴ細胞培養容器（５０００ｍＬの培地容量で５００ｃｍ２のガス透過膜表面積）に播種するために更なる細胞を利用できる。例えば、細胞数の増加に伴い、最大４ｘの培養容器に播種することができ、ここで３００ｅ６≦ｘ≦６００ｅ６の細胞を２ｘの培養容器に播種でき、６００ｅ６≦ｘ≦８００ｅ６の細胞を３ｘの培養容器に播種できるか、又は≦８００ｅ６の細胞を４ｘ培養容器に播種することができる。
いくつかの態様では、培養容器１つ当たり約４００，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種される。代わりに、培養容器１つ当たり約２５０，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は約３００，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～２５０，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～５００，０００細胞／ｃｍ２が播種されるか、又は培養容器１つ当たり約１５０，０００細胞／ｃｍ２～６００，０００細胞／ｃｍ２が播種される。
いくつかの態様では、標的播種密度は、少なくとも約１５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約２５０，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約３００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約４００，０００細胞／ｃｍ２、又は少なくとも約５００，０００細胞／ｃｍ２である。
いくつかの態様では、標的播種密度は、約２５０，０００細胞／ｃｍ２である。他の態様では、標的播種密度は、約５００，０００細胞／ｃｍ２である。
最大１ｍＬの容量を保持できるエレクトロポレーションカセットを使用できる。このシステムを使用すると、２．７×１０９細胞を最大７個のＧ１０００カセットにエレクトロポレーションできる。３ｍＬシリンジに取り付けられた使い捨ての鈍い先端の針を備えたカセットから細胞を回収することで、マイクロピペットの先端が三角フラスコに放出されるリスクも排除される。
より大きい容量を有するシステムを使用すると、細胞の形質導入工程も容易になる。形質導入のための現在の最大７ｅ８細胞を１．４ｅ９細胞に倍増すると、増殖のために最大４つの細胞培養容器に播種するのに十分な材料が生成される。従って、固定された９日目の枯渇を維持でき、同じ処理時間で１回の実行当たりのアウトプットを実質的に２倍にすることができる。
実施例の他の工程は、上記から変更されなかった。
（Ｂ）製剤の収量を増やすために３つのＴ細胞ドナーロットを使用した方法の最適化及び比較
このセクションでは、１ｘ、２ｘ、４ｘ及び４ｘでのＣＡＲ Ｔ細胞の生成について記載し、４日目に分割して、増殖法の堅牢性を実証し、現在の製剤（ＤＰ）のような材料と選択した細胞培養条件との比較分析のための材料を生成する。
このバッチの出発物質は、３人の健康なドナーアフェレーシスロットからのＣＤ４／ＣＤ８Ｔ細胞の選択であった。ＣＴＸ１１０ ＣＡＲ Ｔ細胞の選択された増殖条件は、Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳチャンバーに播種された。
Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳでの以前のＣＴＸ１１０ＣＡＲ Ｔ増殖播種及び採取細胞密度は、それぞれ５００，０００／ｃｍ２及び３０×１０６／ｃｍ２であり、≦３０×１０９のＣＡＲ Ｔ細胞を生成した。Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ培養容器内のＣＡＲ Ｔ細胞のＤＰ収量を増加させるために、本実施例が開発された。以下の表２９に記載されている３つの選択条件を選択して、３人の異なるドナーとのＣＴＸ１１０ ＤＰのような比較可能性を評価し、複数の下流分析アッセイに十分なサンプル細胞を生成した。
Figure 2023501580000048
詳細なプロトコルを以下に提供する。
ａ．ＣＴＸ１１０ ＤＳプロセス全体のために、全ての培地、ＧＭＰＩＬ－２及びＧＭＰＩＬ－７を準備した：
１．Ｔ細胞は、フル大規模（３ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）に従って活性化した
２．ＣＡＲ Ｔ細胞は、１ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ及び小規模（１ｘウェルＧＲｅｘ６Ｍ）で、選択した播種密度において１ｘウェルで増殖させるために播種された。
３．ＣＡＲ Ｔ細胞は、大規模の２分の１、条件ごとに１ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに従って、枯渇後に播種された。
ｂ．フル大規模（３ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）を実施するために、適切な数のＴ細胞を解凍した。
ｃ．フル大規模（３ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）を実施するために、適切な数のＴ細胞を活性化した。
ｄ．活性化剤を希釈した。
ｅ．フル大規模（３ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）でのエレクトロポレーション（ＥＰ）のために細胞を採取した。
ｆ．２，０４０×１０６～２，１６０×１０６のＴ細胞のエレクトロポレーション（１７～１８ ＯＣ４００カセット）。
ｇ．６ウェルファルコンプレートの２ｘウェル間で細胞を均等に移し、２０分間インキュベートした。
ｈ．ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性＋ＥＰ－ＡＡＶ対照について、ＥＰ Ｔ細胞を希釈し、５．０×１０６の総細胞を小規模（１ｘウェルＧ－Ｒｅｘ６Ｍ）で播種した。
ｉ．１，０００×１０６個のＴ細胞を形質導入した。
ｊ．増殖のために適切な培養容器に適切な数のＴ細胞を播種した：
１．Ｓ１：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに播種された合計２５０×１０６個の細胞、小規模（１ｘウェルＧ－Ｒｅｘ６Ｍ）で合計５．０×１０６個の細胞。
２．Ｓ２：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに播種された合計１２５×１０６個の細胞、小規模（１ｘウェルＧ－Ｒｅｘ６Ｍ）で合計２．５×１０６個の細胞。
３．Ｓ３：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに播種された合計６２．５×１０６個の細胞、小規模（１ｘウェルＧ－Ｒｅｘ６Ｍ）で合計１．２５×１０６個の細胞。
４．Ｓ４：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに播種された合計２５０×１０６個の細胞、小規模（１ｘウェルＧ－Ｒｅｘ６Ｍ）で合計５．０×１０６個の細胞
ｋ．各条件の詳細に従ってＣＡＲ Ｔ増殖を実施した：
１．Ｓ１：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ及びＧ－Ｒｅｘ６Ｍに、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を３日に１回よく補充した。ＴＣＲａｂ Ｆｌｏｗパネル用のＧ－Ｒｅｘ６Ｍからサンプルを取り出し、増殖の７日目にＴＣＲａｂの枯渇に進んだ。
２．Ｓ２：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ及びＧ－Ｒｅｘ６Ｍに、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を３日に１回よく補充した。ＴＣＲａｂ Ｆｌｏｗパネル用のＧ－Ｒｅｘ６Ｍからサンプルを取り出し、増殖の８日目にＴＣＲａｂの枯渇に進んだ。
３．Ｓ３：Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ及びＧ－Ｒｅｘ６Ｍに、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を３日に１回よく補充した。ＴＣＲａｂ Ｆｌｏｗパネル用のＧ－Ｒｅｘ６Ｍからサンプルを取り出し、増殖の９日目にＴＣＲａｂの枯渇に進んだ。
４．Ｓ４：
ａ．増殖の４日目
ａ．上清を除去し、ＧａｔｈＲｅｘポンプを使用してＧ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳから細胞を採取し、細胞の量を記録した。
ｂ．重力により、新しいＧ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳに５０００ｍＬの培養培地を充填し、充填した培養容器に採取した細胞量の４分の１を播種した。培養容器をインキュベーターに戻した。
ｃ．血清学的ピペットで、Ｇ－Ｒｅｘ６Ｍの新しい単一ウェルに７５ｍＬの培地を充填した。血清学的ピペットで、Ｇ－Ｒｅｘ６Ｍウェルで細胞をホモジナイズし、充填した培養容器に２５ｍＬの細胞を移した。培養容器をインキュベーターに戻した。
ｂ．Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ及びＧ－Ｒｅｘ６Ｍに、１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２及び１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－７を３日に１回よく補充した。ＴＣＲａｂ Ｆｌｏｗパネル用のＧ－Ｒｅｘ６Ｍからサンプルを取り出し、形質導入後の増殖９日目にＴＣＲａｂの枯渇に進んだ。
ｌ．大規模の２分の１（１ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）でＴＣＲａｂの枯渇を実施した。適切なフロー分析のために、枯渇前のサンプルを取得した。
ｍ．適切なフロー分析のために枯渇後のサンプルを取得し、枯渇後の標的Ｔ細胞を播種して、大規模の２分の１（１ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）を実施した。
ｎ．大規模の２分の１（１ｘ Ｇ－Ｒｅｘ５００Ｍ－ＣＳ）で採取を実施した。採取した細胞数及び得られた枯渇後の％ＣＡＲ＋に基づく：
１．計算されたＤＰ製剤の生細胞濃度：
Figure 2023501580000049
２．採取した総生細胞数をＤＰ製剤濃度で割って、目標の細胞濃度に到達するために必要な量を計算した。
Figure 2023501580000050
３．細胞を０．５倍の目標の容量まで再懸濁した。
４．再懸濁した細胞ペレットで２回目の細胞カウントを実施した。
５．目標の生細胞濃度に到達するために細胞を再懸濁するために計算された残りの容量。
６．採取細胞数の計算に基づいて、目標細胞濃度まで希釈した。
ｏ．追加のフロー特性評価及び比較可能性分析のために、適切な数の細胞を凍結保存した。
（Ｃ）細胞傷害性アッセイによって評価された細胞増殖最適化のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性
本実施例は、上記の実施例（Ｂ）で調製した細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性細胞傷害性アッセイを記載している。このアッセイでは、共培養アッセイにおける生細胞の絶対量を測定した。
Ｒａｊｉ標的癌細胞（ＣＤ１９＋）をｅＦｌｕｏｒ ６７０（ＡＰＣチャネル）増殖色素で標識し、１ウェル当たり５０Ｋ細胞でプレーティングした。試験した各条件に対して、様々な比率の非標識エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞を添加した。エフェクターＣＡＲ Ｔ細胞による標的細胞の細胞死滅は、ＤＡＰＩ生／死染色（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅチャネル）による２４時間の培養後に測定された。サンプル間を正規化するために、フロー分析中にビーズのカウントを追加した。試験サンプル中の生細胞数（ＤＡＰＩ陰性）を数え、標的細胞のみを含むウェル内の生細胞数に正規化して、細胞溶解のパーセンテージを計算した。ＣＡＲ－Ｔによる培養培地へのサイトカイン放出は、多重ＥＬＩＳＡアッセイ（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で分析した。
これらの実験では、１ｘ対２ｘ及び４ｘのＣＴＸ１１０製造条件を評価した。３人の異なるドナーからのＴ細胞を並行して分析した。Ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性は、２４時間の細胞傷害性アッセイ及びサイトカイン産生の２つの測定基準によって確認した。
Figure 2023501580000051
図２０は、ＣＡＲ Ｔ細胞溶解を測定することによるアッセイ対照ＦＡＣＳ分析を示す。ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＴＸ１１０ ＣＡＲ Ｔ細胞であった。Ｔ細胞の８１％は、ＣＡＲ＋であった。
図２１Ａ～２１Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞溶解及びサイトカイン産生を測定するアッセイ対照実験の結果を示す。本アッセイでは、凍結ストックから解凍したＣＴＸ１１０ＣＡＲ－Ｔ細胞を使用した。Ｔ細胞はＨＤＲ後６日目で８０％ＣＡＲ＋であった。
図２２Ａ～２２Ｃは、３人のドナーの各々に由来するＴ細胞が、１倍、２倍及び４倍の培養条件の間で様々な程度のｉｎ ｖｉｔｒｏ効力を有することを示すｉｎ ｖｉｔｒｏ効力分析の結果を示す。
図２３Ａ～２３Ｃは、異なる細胞濃度での細胞溶解の分析の結果を示し、ドナー１及び２に由来する細胞が、異なるパーセンテージのＣＡＲ＋細胞にもかかわらず同様の応答を示したことを示している。
図２４Ａ～２４Ｂは、ＣＡＲ＋細胞について正規化した場合の３人のドナーからの細胞溶解の分析の結果を示す。ドナー２及び３は、ＣＡＲ細胞が正規化される場合のアッセイで同様に挙動した。同じＥ：Ｔの比率でドナー２の２倍のＣＡＲ－Ｔ細胞数でアッセイを繰り返した。
ＩＦＮγ産生は、ＥＬＩＳＡによって上清でも測定した。ＩＦＮγサイトカイン分析は、Ｅ：Ｔ比に関連する用量反応の観点から細胞殺傷の結果を反映しており、ドナーの応答の間にいくらかの変動があった。ＩＬ２の測定値は、ドナー間でより変動した。ドナー２細胞の培地では、ＩＬ２の産生の大幅な減少が観察された。
要約すると、評価された各ドナーについて、２ｘ及び４ｘの培養条件の両方が１ｘの製造プロトコルと同様のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を示している。
（Ｄ）細胞増殖最適化のｉｎ ｖｉｖｏでの有効性（ｉｎ ｖｉｖｏでの生存分析）
上記の実施例（Ｃ）に従って調製されたＣＴＸ１１０細胞は、以下の表３１に示されるように、Ｎａｌｍ６異種移植腫瘍モデルにおいてマウスに４ｅ６ ＣＡＲ＋Ｔ細胞の用量で投与した。Ｎａｌｍ６－Ｆｌｕｃ－ＧＦＰ腫瘍細胞を、ＣＡＲ－Ｔ投与の４日前にＣＩＥＡＮＯＧマウスに接種した。毎週の生物発光（ＢＬＩ、フォトン／秒）評価により、マウスの腫瘍量を評価できる。
Figure 2023501580000052
以下の表３２に示すように、３人のドナー全て及び増殖条件について、ＣＡＲ＋細胞を投与した動物は、しなかった未処理の対照細胞を投与した動物と異なり、３８日目も生存し続けた。ＣＡＲ＋細胞を投与されたマウスからのＢＬＩは、同様の腫瘍増殖動態を示した。
Figure 2023501580000053
実施例１１：キメラ抗原受容体を発現し、遺伝子破壊されたＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子を有する遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法。
以下は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）遺伝子編集構成要素（ｓｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ）及びＣａｓ９ヌクレアーゼ）を使用する、ｅｘ ｖｉｖｏで遺伝子改変されるヒト同種Ｔ細胞で構成されるＴ細胞免疫療法の生成のための例示的なプロセスについて記載している。
改変には、ＴＲＡＣ及びβ２Ｍ遺伝子座の標的化破壊及び組換えアデノ随伴ウイルスベクター（例えば、抗原指向性キメラＴ細胞抗原受容体をコードする血清型６ｒＡＡＶ）を使用したＴＲＡＣ遺伝子座へのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）導入遺伝子の挿入が含まれる。
この製造プロセスを、図１９に図示する。細菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼを含む出発物質の構造情報；２つの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）、ＴＲＡＣ遺伝子座を標的化する領域１つのｓｇＲＮＡ（例えば、ＴＡ－１）及びβ２Ｍ遺伝子座を標的化する第２のｓｇＲＮＡ（例えば、Ｂ２Ｍ－１）が、本明細書で提供される。ｒＡＡＶベクター中のＣＡＲの例示的なアミノ酸配列及びヌクレオチド配列も提供される。
Ｔ細胞の濃縮
Ｔ細胞は、自動化細胞処理システムを使用して、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ４抗体でコーティングされた磁気ビーズの混合物を使用した磁気分離により、白血病アフェレーシス材料（ロイコパック）から濃縮した。濃縮前にロイコパックを細胞数及び生存率（≧８０％）についてサンプリングした。濃縮した細胞を、ＨＳＡを含むＰＢＳ／ＥＤＴＡバッファーで分離し、細胞数、生存率（≧８０％）、Ｔ細胞純度（≧７０％ＣＤ３）及び無菌性についてサンプリングした。
Ｔ細胞の凍結保存
次いで、細胞を４±１℃で遠心分離し、ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ５に５０×１０６生細胞／ｍＬの目標濃度で再懸濁させた。細胞数、生存率（≧８０％）について細胞をサンプリングし、次いで２，５００×１０６細胞／バッグ（細胞懸濁液３０～７０ｍＬ）の標的細胞数でエチレン酢酸ビニルクライオバッグに分注した。１～２バッグのＴ細胞を生成するには１つのロイコパックで十分であった。各バッグをヒートシールし、ラベルを付け、制御速度の冷凍庫に移すまで２～８℃で保管し、その後、保管のために気相液体窒素に移した。
Ｔ細胞の解凍及び活性化
濃縮されたＴ細胞の凍結バッグ１つを解凍し、３Ｌのバッグに移し、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地（Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５、５％ヒト血清、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ２、１００ＩＵ／ｍＬのｒｈＩＬ７）で希釈した。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞を５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。次いで、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に細胞を再懸濁させ、細胞数及び生存率（≧７０％以上）についてサンプリングした。組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合した可溶性コロイド状ポリマーナノマトリックス溶液を、１：１２．５（ｖ／ｖ）の比率で添加して、細胞を活性化した。
約５００ｍＬの補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地／組換えヒト化ＣＤ３及びＣＤ２８アゴニストに結合したコロイド状ポリマーナノマトリックスの各々の総量で、細胞を２×１０６生細胞／ｍＬの目標密度まで２つの静置細胞培養容器に播種した。静置培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で４８±４時間インキュベートした。プロセス全体を通して、静置培養容器を取り扱うときはいつでも、裂け目及び漏れ並びに透明な黄色の培地の存在について検査した。
希釈
２日後、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地を各静置培養容器に５Ｌまで添加した。細胞を更に３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
エレクトロポレーション及び形質導入
エレクトロポレーションのための調製において、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地の量は、静置培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して最終容量を約５００ｍＬまで減少させ、これを穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。細胞を、細胞数及び生存率（≧７０％）についてサンプリングした。細胞を５００ｍＬの遠心分離管に移し、５４０ｇ、２０±１℃で１５分間遠心分離した。細胞ペレットをエレクトロポレーションバッファーに再懸濁させ、同一条件下で再度遠心分離した。細胞を、３００×１０６細胞／ｍＬの目標濃度になるまで、エレクトロポレーションバッファーに２回再懸濁させた。
Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、ＴＲＡＣを標的化するｓｇＲＮＡと混合するか、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを別のマイクロ遠心チューブでβ２Ｍを標的化するｓｇＲＮＡと混合した。各溶液を室温で１０分以上インキュベートして、各リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成した。２つのＣａｓ９／ｇＲＮＡ混合物を組み合わせ、細胞と混合して、Ｃａｓ９、ＴＲＡＣ ｓｇＲＮＡ及びＢ２Ｍ ｓｇＲＮＡを、それぞれ最終濃度０．３ｍｇ／ｍＬ、０．０８ｍｇ／ｍＬ及び０．２ｍｇ／ｍＬにした。混合物を取り出し、ピペッティングによりエレクトロポレーションカセットにロードした。カセットにフタをし、トランスフェクションシステムを使用した静的エレクトロポレーションによって順次エレクトロポレーションを実施した。エレクトロポレーション後、細胞を各カセットから１２５ｍＬ三角フラスコにプールし、３７℃で２０分以上インキュベートした。細胞を、生存率（≧７０％）についてサンプリングした。
形質導入は、以下のように実施した。細胞をＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で１０７細胞／ｍＬに希釈し、解凍したばかりのｒＡＡＶを２０，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩで添加した。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で６０分以上にわたってインキュベートした。
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、ＤＮＡ二本鎖切断のための忠実度の高い細胞修復メカニズムである。ＨＤＲは、ＣＡＲ遺伝子の両端にある相同配列を使用して、ＡＡＶ鋳型から目的のＴＲＡＣ遺伝子座にＣＡＲ遺伝子を導入するために使用される。
細胞増殖
細胞を、補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地で希釈し、細胞生存率（≧７０％）及び細胞数についてサンプリングし、０．２～０．５×１０６生細胞／ｃｍ２の密度まで２つの静置培養容器及び１つの更なる静置培養容器（細胞監視のためのサテライト培養）に播種した。静置培養容器を３７±１℃及び５±１％ＣＯ２でインキュベートした。細胞培養物を最大９日間インキュベートした。この間、培養物は３～４日ごとに１ｍＬの培養液用量当たり１００ＩＵのｒｈＩＬ２及びｒｈＩＬ７で補充した。サテライト静置細胞培養容器は、増殖全体の細胞数、生存率及びＴ細胞純度について試験した。サテライト培養容器内の細胞密度が約３０×１０６／ｃｍ２に達したとき、ＴＣＲαβの枯渇を実施した。サテライト培養容器の細胞密度が３０×１０６／ｃｍ２に達しなかった場合、９日目にメイン培養でＴＣＲαβの枯渇を実施した。
ＴＣＲαβの枯渇
各静置細胞培養容器の培地は、静置培養容器のディップチューブに接続されたポンプを使用して、約５００ｍＬの最終容量まで減少させた。培地の大部分を除去した後、静置培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。
細胞を、静置培養容器に接続するディップチューブを備えた５００ｍＬの遠心分離チューブに移した。生存率（≧７０％）、細胞数及び％ＣＡＲ＋細胞について細胞をサンプリングした。次いで、細胞を５４０×ｇ、２０±１℃で１５分間、遠心分離した。細胞ペレットを再懸濁させ、０．５％ＨＳＡを含む６５０ｍＬ未満のＰＢＳ／ＥＤＴＡにプールした。細胞懸濁液を、自動化細胞処理システムに接続されている滅菌バッグに移した。自動化細胞処理システムは、ビオチン結合抗ＴＣＲαβ抗体と共に細胞をインキュベートした。自動化細胞処理システムを使用してＴＣＲαβ＋細胞を枯渇させるために、細胞を洗浄し、抗ビオチン磁気ビーズと共にインキュベートした。細胞数、生存率（≧７０％）及び％ＣＡＲ＋細胞（≧３０～４０％）について細胞を試験した。
細胞の回復
枯渇した細胞を補充されたＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培地に再懸濁させ、３Ｌバッグ（複数可）に移し、静置細胞培養容器（複数可）に播種し、３７±１℃及び５±１％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
細胞採取（原薬）
細胞を採取するために、静置培養容器をインキュベーターから取り外し、細胞沈降のために休ませた。ポンプを使用して、各静置培養容器から最終容量が約５００ｍＬになるまで成長培地を除去した。除去した培地を、無菌のためにサンプリングした。静置培養容器を穏やかに回転させて、細胞を培地に再懸濁させた。各静置培養容器の内容物は、ポンプを使用して３Ｌの移送バッグに移送され、重力によって４０μｍ輸血フィルターを通して別個の滅菌３Ｌバッグに濾過された。細胞を、濃度及び生存率についてサンプリングした。
均等物
本明細書でいくつかの本発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者であれば、本明細書で説明される機能を実施し、且つ／又は結果及び／若しくは１つ以上の利点を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想定するものであり、こうした変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書で説明される本発明の実施形態の範囲内にあるものと見なされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメータ、寸法、材料及び構成は例示的であることを意図し、実際のパラメータ、寸法、材料及び／又は構成は、本発明の教示が適用される特定の用途に依存することを容易に理解するものである。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多く均等物を、日常の実験のみを用いて認識するか又は確認可能である。従って、上述の実施形態は単に例として提示されており、また、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内において、本発明の実施形態が、具体的に説明及び特許請求される以外の別の方法で実践され得ることを理解されたい。本開示の本発明の実施形態は、本明細書で説明される各個別の特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法を対象とする。加えて、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法の任意の組み合わせは、こうした特徴、システム、物品、材料、キット及び／又は方法が相互に矛盾しない場合、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
本明細書中で定義され用いられる全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文献中の定義及び／又は定義される用語の普通の意味を超えて優先されるものと理解されたい。
本明細書に開示されている全ての参考文献、特許及び特許出願は、それぞれ引用されている主題に関して参照により組み込まれており、場合により文献の全体を包含する場合がある。
不定冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、本明細書及び特許請求の範囲において使用される場合、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味するものと理解されるべきである。
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「及び／又は」という表現は、等位結合される要素、すなわち一部の場合に接続的に提示され、他の場合に離接的に提示される要素の「いずれか又は両方」を意味するものとして理解されたい。「及び／又は」と共に列挙される複数の要素は、同じように、すなわちそのように結合された要素の「１つ以上」と解釈されるべきである。「及び／又は」の節によって具体的に特定される要素以外に、具体的に特定された要素に関連する又は関連しないにかかわらず、他の要素が任意選択的に提示され得る。従って、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」に対する参照は、「～を備える」などのオープンエンド用語と共に使用される場合、一実施形態ではＡのみ（任意選択的にＢ以外の要素を含む）、別の実施形態ではＢのみ（任意選択的にＡ以外の要素を含む）、更に別の実施形態ではＡ及びＢの両方（任意選択的に他の要素を含む）などを指し得る。
本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、「又は」は、上記で定義される「及び／又は」と同じ意味を有するものと理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分離する際に、「又は」又は「及び／又は」は、包括的である、すなわち要素のリストの少なくとも１つを含むが、２つ以上の数及び任意選択的に追加的な列挙されていない項目も含むものと解釈されるべきである。「～の１つのみ」若しくは「～の厳密に１つ」又は特許請求の範囲で使用されるときの「～からなる」など、反対を明らかに示す用語のみが多数の要素又は要素のリストの厳密に１つの要素の包含を指す。一般に、本明細書で使用するとき、用語「又は」は、「いずれか」、「～の１つ」、「～の１つのみ」又は「～の厳密に１つ」などの排他性の用語が先行する場合のみ、排他的代替用語（すなわち「一方又は他方であるが両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「本質的に～からなる」は、特許請求の範囲内で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
本明細書で使用する場合、本明細書及び特許請求の範囲における、１つ以上の要素の列挙に関する「少なくとも１つ」という語句は、要素の列挙内の要素の任意の１つ以上から選択される少なくとも１つの要素であるが、要素の列挙内に具体的に列挙されたあらゆる要素の少なくとも１つを必ずしも含まず、且つ要素の列挙内の要素の任意の組み合わせを必ずしも除外しないことを意味するものと理解すべきである。この定義により、具体的に特定されるそれらの要素に関係するか否かにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が意味する要素の列挙内に具体的に特定される要素以外の要素が任意選択的に存在し得ることも可能になる。従って、非限定的な例として、「Ａ及びＢの少なくとも１つ」（換言すると「Ａ又はＢの少なくとも１つ」、換言すると「Ａ及び／又はＢの少なくとも１つ」は、一実施形態では、任意選択的に２つ以上のＡを含み、Ｂが存在しない（及び任意選択的にＢ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、別の実施形態では、任意選択的に２つ以上のＢを含み、Ａが存在しない（及び任意選択的にＡ以外の要素を含む）少なくとも１つを指すことができ、更に別の実施形態では、任意選択的に２つ以上のＡを含む少なくとも１つ、且つ任意選択的に２つ以上のＢを含む少なくとも１つ（及び任意選択的に他の要素を含む）を指すなどであり得る。
同様に、反対に明確に示されない限り、２つ以上の工程又は行為を含む、本明細書で特許請求される任意の方法において、この方法の工程又は行為の順序は、必ずしもこの方法の工程又は行為が列挙される順序に限定されないことも理解されるべきである。

Claims (43)

  1. 遺伝子操作されたＴ細胞を製造する方法であって、
    （ｉ）Ｔ細胞の第１の集団を提供する工程と；
    （ｉｉ）細胞培養容器内において、Ｔ細胞活性化剤の存在下で前記Ｔ細胞の第１の集団をインキュベートして、Ｔ細胞の第２の集団を生成する工程であって、前記Ｔ細胞の第２の集団は、活性化Ｔ細胞を含む、工程と；
    （ｉｉｉ）前記Ｔ細胞の第２の集団に、第１のＣａｓ９酵素及びＴ細胞受容体α鎖定常領域（ＴＲＡＣ）遺伝子を標的化する第１のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む第１のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体並びに第２のＣａｓ９酵素及びβ２マイクログロブリン（β２Ｍ）遺伝子を標的化する第２のｇＲＮＡを含む第２のＲＮＰ複合体を導入して、Ｔ細胞の第３の集団を生成する工程であって、前記Ｔ細胞の第３の集団は、破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び破壊された前記β２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；
    （ｉｖ）前記Ｔ細胞の第３の集団をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターとインキュベートして、Ｔ細胞の第４の集団を生成する工程であって、前記ＡＡＶベクターは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、ＴＲＡＣ遺伝子座と相同な配列に隣接しており、前記Ｔ細胞の第４の集団は、前記ＣＡＲを発現し、且つ破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び破壊された前記β２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；
    （ｖ）前記Ｔ細胞の第４の集団を増殖させ、それにより増殖されたＴ細胞集団を生成する工程と；
    （ｖｉ）前記増殖されたＴ細胞集団からＴＣＲαβ＋Ｔ細胞を除去して、遺伝子操作されたＴ細胞集団を生成する工程であって、前記遺伝子操作されたＴ細胞集団は、前記ＣＡＲを発現し、且つ破壊された前記ＴＲＡＣ遺伝子及び前記β２Ｍ遺伝子を有する活性化Ｔ細胞を含む、工程と；
    （ｖｉｉ）前記遺伝子操作されたＴ細胞集団を採取する工程と
    を含む方法。
  2. 前記Ｔ細胞の第１の集団は、ヒト血液細胞から濃縮された凍結保存Ｔ細胞から誘導される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記Ｔ細胞の第１の集団は、（ａ）ヒトドナーから血液細胞を得る工程と；（ｂ）前記血液細胞からＣＤ４＋Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を濃縮する工程とを含むプロセスによって調製される、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 工程（ｂ）は、抗ＣＤ４及び／又は抗ＣＤ８抗体と結合された磁気ビーズを使用して実施される、請求項３に記載の方法。
  5. 前記Ｔ細胞の第１の集団は、少なくとも約８０％の細胞生存率並びに／又は少なくとも約８０％のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の純度を有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （ｃ）工程（ｂ）で生成された前記濃縮されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を凍結保存する工程を更に含む、請求項３～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記Ｔ細胞活性化剤は、ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストを含み、前記ＣＤ３アゴニスト及びＣＤ２８アゴニストは、ナノマトリックス粒子に結合されている、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 工程（ｉｉ）は、約２×１０６／ｃｍ２の細胞播種密度及び約２×１０６細胞／ｍＬの細胞濃度において、前記細胞培養容器で前記Ｔ細胞の第１の集団を前記Ｔ細胞活性化剤と約４８時間にわたってインキュベートすることによって実施される、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 混合物中の前記Ｔ細胞活性化剤対培地の比は、約１：１２．５（ｖ／ｖ）である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 活性化を減少させ、且つ工程（ｉｉｉ）前に細胞を回復させるために、工程（ｉｉ）後、前記Ｔ細胞の第２の集団中で前記Ｔ細胞活性化剤を希釈する工程を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 工程（ｉｉｉ）は、エレクトロポレーションによって実施される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 工程（ｉｉｉ）は、１つのエレクトロポレーションイベントを伴う、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記第１のＲＮＰ複合体及び前記第２のＲＮＰ複合体は、１つのエレクトロポレーションイベントで前記活性化Ｔ細胞に導入される、請求項１に記載の方法。
  14. 前記第１のＲＮＰ複合体中の前記第１のＣａｓ９酵素の量は、第２のＲＮＡ複合体中の前記第２のＣａｓ９酵素の量と同じである、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記第１のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、前記第２のＣａｓ９酵素の濃度は、約０．１５ｍｇ／ｍＬであり、前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡの濃度は、約０．０８ｍｇ／ｍＬであり、及び前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡの濃度は、約０．２ｍｇ／ｍＬである、請求項１１～１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 工程（ｉｉｉ）の細胞濃度は、約１００×１０６細胞／ｍＬ～約４００×１０６細胞／ｍＬ、任意選択的に約３００×１０６細胞／ｍＬである、請求項１１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 工程（ｉｉｉ）の各容器濃度における細胞数は、約３×１０８細胞である、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記ＡＡＶベクターは、約１０，０００～約８０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）値を有する、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記ＡＡＶベクターの前記ＭＯＩは、約２０，０００である、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）ベクターである、請求項１６又は１７に記載の方法。
  21. 工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約７×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約６日～約１２日にわたって細胞培養容器で前記Ｔ細胞の第４の集団を培養することによって実施される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 工程（ｖ）は、約２×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において、約７日～約９日にわたって細胞培養容器で前記Ｔ細胞の第４の集団を培養することによって実施される、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記Ｔ細胞の第４の集団は、約３×１０５細胞／ｃｍ２～約５×１０５細胞／ｃｍ２の播種密度において培養される、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記細胞培養容器は、培地交換なしで約１０日～約１２日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器である、請求項２２又は２３に記載の方法。
  25. 前記細胞培養容器は、培地交換なしで約７日～約９日にわたる細胞増殖を可能にする静置細胞培養容器である、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
  26. 工程（ｖｉ）は、前記増殖された細胞を、抗ＴＣＲαβ抗体が固定化されてるビーズに接触させ、且つ結合されていない細胞を収集することによって実施される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記増殖工程は、細胞容器において、約１５０，０００細胞／ｃｍ２～約５００，０００細胞／ｃｍ２、任意選択的に約３００，０００細胞／ｃｍ２～約５００，０００細胞／ｃｍ２の密度で前記Ｔ細胞を播種する工程を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記第１のＣａｓ９酵素、前記第２のＣａｓ９酵素又は両方は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（ｓｐＣａｓ９）である、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記第１のＣａｓ９酵素及び前記第２のＣａｓ９酵素は、同じである、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記第１のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含み、及び／又は前記第２のＣａｓ９酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
  31. 前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡは、配列番号４のスペーサー配列を含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ＴＲＡＣ遺伝子を標的化する前記第１のｇＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３２に記載の方法。
  33. 前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡは、配列番号８のスペーサー配列を含む、請求項１～３３のいずれか一項に記載の方法。
  34. 前記β２Ｍ遺伝子を標的化する前記第２のｇＲＮＡは、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項３４に記載の方法。
  35. 前記第１のｇＲＮＡ、前記第２のｇＲＮＡ又は両方は、１つ以上の２’－Ｏ－メチルホスホロチオエート修飾を含む、請求項３２～３５のいずれか一項に記載の方法。
  36. 前記ＣＡＲは、癌抗原を標的化する細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及びＣＤ３ｚ細胞質シグナル伝達ドメインを含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。
  37. 前記ＣＡＲは、ＣＤ１９に結合する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａから誘導され、及び／又は前記共刺激ドメインは、ＣＤ２８から誘導される、請求項３８に記載の方法。
  39. 前記ＣＡＲは、配列番号３７のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の方法。
  40. 前記ＣＡＲは、ＢＣＭＡに結合する、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記細胞外ドメインは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含み、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８ａから誘導され、及び／又は前記共刺激ドメインは、４－１ＢＢから誘導される、請求項４１に記載の方法。
  42. 前記ＣＡＲは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載の方法。
  43. 請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法によって生成される、遺伝子操作されたＴ細胞集団。
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