JP2023547520A - 免疫療法における腫瘍非依存性抗原の使用 - Google Patents

免疫療法における腫瘍非依存性抗原の使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、免疫療法において腫瘍非依存性抗原を使用する方法を提供する。本開示は、養子細胞療法において腫瘍非依存性抗原を使用する方法を提供する。【選択図】図１

Description

関連出願
本出願は、２０２０年１１月５日に出願された米国仮出願第６３／１１０，０４６号、及び２０２１年３月２６日に出願された同第６３／１６６，３５２号に対する優先権を主張するものであり、その各々は、あらゆる目的でその全体が本明細書に組み込まれる。
キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（ＣＡＲ－Ｔ）を含む養子細胞療法は、がんなどの疾患と闘うためにＴ細胞を患者に投与する免疫療法の一種である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）操作Ｔ細胞の使用は、近年、多くの前臨床及び臨床研究の対象となっている。これらの遺伝子改変Ｔ細胞は、基本的な免疫学の原理と現在の免疫療法の進歩とを組み合わせ、がんなどの疾患を攻撃するために身体自身の免疫系を利用する有望なアプローチを提供する。養子細胞療法には一般に、患者自身の免疫細胞の回収、ｅｘ ｖｉｖｏでの増大、及び腫瘍抗原特異的受容体をコードするための免疫細胞の遺伝子改変が含まれる。場合によっては、免疫細胞は同種供給源から得ることができる。遺伝子改変免疫細胞を患者に再注入することにより、腫瘍が効果的にクリアランスされる。ｅｘ ｖｉｖｏで増大させた免疫細胞の注入に基づく現在の免疫療法は、がんの処置、特に血液悪性腫瘍において顕著な成功を示している。例えば、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞で処置された進行性Ｂ細胞白血病及びリンパ腫の患者における臨床試験では、成人及び小児において長期にわたる寛解が誘導された。
これらの療法の適用範囲は、標的化可能な疾患特異的抗原の利用可能性によって制限される。腫瘍の文脈では、養子細胞療法は、標的化可能な腫瘍特異的抗原の利用可能性によって制限される。故に、標準的な養子細胞療法の治療効果を改善するための、及び標的化可能な腫瘍抗原の限られた利用可能性を克服するための方法が当該技術分野で必要とされている。本開示は、この必要性に対処し、かつこれを満足させる。
本開示は、少なくとも部分的に、養子細胞免疫療法のための腫瘍非依存性抗原の使用に基づく。
一態様では、腫瘍を有する対象に、腫瘍をマーキングするための腫瘍非依存性抗原を含む第１の組成物、及び腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する免疫細胞を含む第２の組成物を投与する。特定の実施形態では、第２の組成物は、対象の免疫細胞を腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有するように誘導することができる薬剤を含む。腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍を認識して殺傷する。
別の態様では、腫瘍非依存性抗原は、リコール抗原、すなわち、腫瘍に罹患している対象がこれまでに遭遇したことがある腫瘍非依存性抗原である。そのような場合、対象はこれまでに腫瘍非依存性抗原に対する免疫応答を開始しており、対象の免疫系は腫瘍非依存性抗原に対して訓練されていると言われる。腫瘍非依存性抗原で腫瘍をマーキングすることにより、対象の免疫系が腫瘍を認識して殺傷することができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、健康な人に問題を引き起こすことは稀であるため、通常、対象は気づかぬうちに罹る。以前にＣＭＶに感染したことのある対象は、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を発生し、その結果、免疫系がＣＭＶに対して訓練される。本開示の特定の実施形態によれば、腫瘍を発症している以前ＣＭＶに感染した対象は、ＣＭＶ由来腫瘍非依存性抗原（例えば、ＣＭＶリコール抗原）で腫瘍をマーキングし、対象のＣＭＶに対する既存免疫を利用して腫瘍を攻撃することにより、腫瘍を処置することができる。
したがって、本開示の方法は、養子細胞療法の治療効果に対する主要な障壁の１つ、特に、腫瘍に特異的な標的化可能な抗原の利用可能性が限られていることに対処する。
特定の態様では、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、対象の腫瘍部位に第１の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、第１の組成物が腫瘍非依存性抗原を含む、腫瘍マーキング工程と、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を対象に導入することと、を含む、方法が提供される。
特定の例示的実施形態では、対象は、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する。特定の例示的実施形態では、既存免疫は、腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有するメモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞を含む。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、腫瘍の細胞によって内在化される。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ペプチド、核酸、またはタンパク質である。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、担体を介して提供される。特定の例示的実施形態では、担体は、腫瘍溶解性ウイルスである。特定の例示的実施形態では、担体は、公知の細胞内在化機構を有する担体タンパク質である。特定の例示的実施形態では、担体タンパク質は、腫瘍の細胞に含まれる受容体のリガンドである。特定の例示的実施形態では、担体タンパク質はジフテリア毒素またはそのバリアントであり、受容体はＨＢ－ＥＧＦ受容体である。特定の例示的実施形態では、ジフテリア毒素またはそのバリアントは、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、受容体媒介エンドサイトーシスを介して腫瘍の細胞によって内在化される。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ヒトである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、非ヒトである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ウイルス、細菌、または真菌起源のものである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、アレルゲン、毒素、または毒液である。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素またはその非毒性バリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ｐｐ６５ペプチドである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、リコール抗原である。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、患者に対して自家である。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、患者に対して同種である。
特定の例示的実施形態では、導入は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの作製を含む。特定の例示的実施形態では、導入は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの作製を含む。
特定の例示的実施形態では、腫瘍は、液性腫瘍である。特定の例示的実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。
特定の例示的実施形態では、腫瘍マーキング工程は、第１の組成物を腫瘍内または腫瘍近位に投与することを含む。特定の例示的実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入後に実施される。特定の例示的実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入前に実施される。特定の例示的実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入と実質的に同時に実施される。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原特異的Ｔ細胞である。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、免疫受容体を含む。特定の例示的実施形態では、免疫受容体は、天然または合成免疫受容体である。
特定の例示的実施形態では、免疫受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。
特定の例示的実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、抗原結合ドメインは、完全長抗体もしくはその抗原結合断片、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む。特定の例示的実施形態では、抗原結合ドメインは、腫瘍非依存性抗原に特異的である。特定の例示的実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域を更に含む。特定の例示的実施形態では、ヒンジ領域は、抗体のＦｃ断片、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工ヒンジドメイン、ＣＤ８のアミノ酸配列を含むヒンジ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヒンジドメインである。特定の例示的実施形態では、膜貫通ドメインは、人工疎水性配列、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、またはＣＤ１５４、及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の膜貫通ドメインからなる群から選択される。特定の例示的実施形態では、細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）からなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインのうちの１つ以上と、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）またはそのバリアントに由来する細胞内ドメインと、を含む。特定の例示的実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を保有する細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ、またはそれらのバリアントからなる群から選択される細胞内ドメインを含む。
特定の例示的実施形態では、ＴＣＲは、免疫細胞または自家Ｔ細胞に対して内因性である。特定の例示的実施形態では、ＴＣＲは、免疫細胞または自家Ｔ細胞に対して外因性である。特定の例示的実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む。特定の例示的実施形態では、ＴＣＲは、野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ、及びキメラＴＣＲからなる群から選択される。特定の例示的実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲ、二量体ＴＣＲ、及び一本鎖ＴＣＲからなる群から選択される。
他の態様では、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、対象の腫瘍部位に第１の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、第１の組成物が腫瘍非依存性抗原を含む、腫瘍マーキング工程と、腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を対象に投与することと、を含む、方法が提供される。
特定の例示的実施形態では、対象は、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する。特定の例示的実施形態では、既存免疫は、腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有するメモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞を含む。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、腫瘍の細胞によって内在化される。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ペプチド、核酸、またはタンパク質である。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、担体を介して提供される。特定の例示的実施形態では、担体は、腫瘍溶解性ウイルスである。特定の例示的実施形態では、担体は、公知の細胞内在化機構を有する担体タンパク質である。特定の例示的実施形態では、担体タンパク質は、腫瘍の細胞に含まれる受容体のリガンドである。特定の例示的実施形態では、担体タンパク質はジフテリア毒素またはそのバリアントであり、受容体はＨＢ－ＥＧＦ受容体である。特定の例示的実施形態では、ジフテリア毒素またはそのバリアントは、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、受容体媒介エンドサイトーシスを介して腫瘍の細胞によって内在化される。
特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ヒトである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、非ヒトである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ウイルス、細菌、または真菌起源のものである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、アレルゲン、毒素、または毒液である。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素またはその非毒性バリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、ｐｐ６５ペプチドである。特定の例示的実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、リコール抗原である。
特定の例示的実施形態では、二重特異性抗体は、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む。特定の例示的実施形態では、第１の抗原結合ドメインは、腫瘍非依存性抗原に対する特異性を含む。特定の例示的実施形態では、第２の抗原結合ドメインは、免疫細胞に対する特異性を含む。
特定の例示的実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫ Ｔ細胞、及びγδ Ｔ細胞からなる群から選択される。
他の実施形態は、次の詳細な説明、図面、及び添付の特許請求の範囲を精査することにより明らかになるであろう。
本開示の前述及び他の特徴及び利点は、以下の例証的実施形態の詳細な説明を添付図面と併せて読むことにより、より十分に理解される。本特許のファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面／写真が含まれる。カラー図面（複数可）／写真（複数可）を含む本特許の複製は、要請及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供されるであろう。
ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドのＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞における取り込み率を示すプロットである。 示す通りに負荷したＤＣＯｎｅ ｍＤＣの培地中で検出されたＩＦＮ－γのレベルを示すプロットである。 ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドの取り込み率を示すプロットである。 ＯＶ９０細胞におけるＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドの取り込み率を示すプロットである。 Ｕ８７ＭＧ細胞におけるＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドの取り込み率を示すプロットである。 ＣＲＭ－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲートをパルスしたＤＣＯｎｅ ｍＤＣで刺激してまたは刺激せずに、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート／ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ８７－ＭＧ腫瘍細胞とともに、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした、ＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンを示すプロットである。エフェクターサイトカインＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡによって上清で分析した。 ＣＲＭ－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲートをパルスしたＤＣＯｎｅ ｍＤＣで刺激してまたは刺激せずに、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート／ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ８７－ＭＧ腫瘍細胞とともに、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした、ＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンを示すプロットである。ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでマーキングした腫瘍細胞によるＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の刺激は、ＣＤ１０７ａ発現の増加をもたらす。 ＣＲＭ－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲートをパルスしたＤＣＯｎｅ ｍＤＣで刺激してまたは刺激せずに、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート／ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋ Ｕ８７－ＭＧ腫瘍細胞とともに、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした、ＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンを示すプロットである。ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでマーキングした腫瘍細胞によるＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の刺激は、腫瘍細胞の溶解をもたらす。 ＣＡＲ Ｔ製造プロセスの２つの異なる工程でＤＣＯｎｅ ｍＤＣを添加して、１）Ｔ細胞（メモリー表現型）の濃縮及び活性化状態を改善すること、２）養子Ｔ細胞プール中で、（内因性または外因性抗原に基づいて）追加の腫瘍標的特異性を誘導すること、及び／または、３）ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増大を改善すること（表現型、生存率、及びＣＡＲ発現レベル）、が可能であることを示す。 本開示のある実施形態によるＤＣＯｎｅ ｍＤＣの使用を示す模式図である。 抗原特異的免疫細胞を作製し、抗原で腫瘍をマーキングする様々な方法を示す模式図である。
免疫療法、特に養子細胞療法において腫瘍非依存性抗原（ＴＩＡ）を使用するための方法が、本明細書で提供される。特定の態様では、ＴＩＡに対する特異性を有する免疫細胞を作製するための方法が、本明細書で提供される。本明細書に記載のＴＩＡ特異的免疫細胞を使用して、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法も提供される。そのような方法には、対象の腫瘍を腫瘍非依存性抗原でマーキングし、ＴＩＡに対する特異性を有する免疫細胞が腫瘍を認識して殺傷することができるようにする、腫瘍マーキング工程が含まれる。
本明細書に記載の方法は、本明細書で開示される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって方法及び条件は変わる場合があることを理解されたい。また、本明細書で使用される専門用語は、単にある特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、限定を意図するものではないことも理解されたい。本明細書に記載の方法では、十分に当業者の技量の範囲内である従来の分子及び細胞生物学的及び免疫学的手法が使用される。このような手法は当業者には周知であり、科学文献で説明されている。
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有する。任意の潜在的な曖昧性が生じた場合、本明細書で示す定義があらゆる辞書または外部の定義に対して先行する。文脈によって別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。「または」の使用は、別途明記しない限り、「及び／または」を意味する。「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、ならびに他の形、例えば「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる」の使用は、限定ではない。
全般的に、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質及び核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションと関連して使用される専門語は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されている。本明細書で提供される方法及び手法は全般的に、別途示されない限り、当該技術分野で周知の従来の方法に従って、また本明細書全体にわたり引用及び論じられる様々な一般的及びより具体的な参照文献に記載の通りに実施される。酵素反応及び精製手法は、当該技術分野において通常行われるようにまたは本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、有機合成化学、ならびに医薬及び製薬化学と関連して使用される専門語ならびにそれらの実験手順及び手法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な手法が、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の処置に対して使用される。
本開示がより容易に理解され得るように、厳選した用語を以下に定義する。
本明細書では、「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。一例として、「要素（ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つまたは１超の要素を意味する。
「約」は、測定可能な値（例えば、量、時間の持続期間など）に言及するときに本明細書で使用される場合、指定値から±２０％または±１０％、例えば±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することが意図されている。これは、このような変動が本開示の方法を実施するのに適切であるためである。
「活性化」は、本明細書で使用される場合、検出可能な細胞増殖を誘導するのに十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン産生、及び検出可能なエフェクター機能にも関連付けられ得る。「活性化Ｔ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂が生じているＴ細胞を指す。
本明細書で使用される場合、疾患を「軽減する」ことは、疾患の１つ以上の症状の重症度を低減することを意味する。
本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、もしくは特定の免疫担当細胞の活性化、またはその両方が含まれる場合がある。当業者は、事実上全てのタンパク質またはペプチドを含むあらゆる分子が抗原として機能し得ることを理解するであろう。
「抗原」または「抗原性」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドに関して使用される場合、一般に、Ｔ細胞受容体、抗体、あるいは特定の体液性及び／または細胞性免疫の他の要素によって特異的に認識される少なくとも１つのエピトープを含有する生体分子を指す。分子全体、または分子の１つ以上の部分が、例えばポリペプチドのＭＨＣペプチド抗原複合体への細胞内プロセシング及び後続の抗原提示の後に認識され得る。「抗原性ポリペプチド」という用語は、「ポリペプチド抗原」と互換的である。この用語には、前記ポリペプチドの抗原部分が含まれ、例えば、ポリペプチドの細胞内プロセシング後に、ＭＨＣペプチド抗原複合体の状態で産生されるものである。「抗原」または「抗原性」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドの少なくとも１つ以上の抗原性エピトープへの言及を含む。
「腫瘍非依存性抗原」は、本明細書では、対象が現在罹患している腫瘍に由来しない抗原を指す。例えば、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は外来抗原であり得る。腫瘍非依存性抗原は、ヒトまたは非ヒトであり得る。特定の実施形態では、ヒト対象の腫瘍を腫瘍非依存性抗原でマーキングする文脈において、腫瘍非依存性抗原は、非ヒト起源のものであり得る。特定の実施形態では、宿主対象の腫瘍を腫瘍非依存性抗原でマーキングする文脈において、腫瘍非依存性抗原は、非宿主起源のものであり得る。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、対象が現在罹患している腫瘍によって発現されない抗原であり得る。例えば、対象が現在膵癌に罹患している場合、腫瘍非依存性抗原は、膵癌非依存性抗原である。そのような例において、膵癌非依存性抗原は、膵癌によって発現されない非膵癌に由来する抗原、例えば、膵癌によって発現されない卵巣癌抗原であり得る。同様に、特定の抗原が特定の腫瘍タイプ内の強力な免疫応答と関連している場合、そのような抗原は、そのような抗原を発現しない同じタイプの腫瘍に導入される可能性がある。これは、例えば、卵巣癌におけるＮＹ－ＥＳＯ－１のような精巣関連抗原の場合であり得る。
腫瘍非依存性抗原は、リコール抗原であり得る。「リコール抗原」という用語は、本明細書で使用される場合、これまでに（例えば、対象の腫瘍の発生前、または腫瘍マーキング工程の前に）対象が遭遇した抗原（例えば、抗原性ポリペプチド）を指す。リコール抗原は、対象がこれまでに遭遇したことがある抗原であって、既存のメモリーリンパ球が対象に存在するものである。特定の実施形態では、リコール抗原は、例えば、以前の感染またはワクチン接種の結果として、既存のメモリーリンパ球が対象に存在する抗原（例えば、抗原性ポリペプチド）を指す。特定の実施形態では、リコール抗原は、ワクチン接種を介して対象がこれまでに遭遇したことがある抗原性ポリペプチドを指す。特定の実施形態では、リコール抗原は、前記対象に既存免疫が存在する抗原性ポリペプチドである。
更に、抗原は、組換えまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。したがって、当業者は、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、本明細書で使用される用語「抗原」をコードすることを理解するであろう。更に、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列のみによってコードされる必要がないことを理解するであろう。本開示が、２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれらに限定されないこと、及びこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するために様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。更に、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを理解するであろう。抗原が、合成により作製され得ること、または生体試料に由来し得ることは容易に明らかである。そのような生体試料には、組織試料、腫瘍試料、細胞、または生体液が含まれ得るが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「自家」という用語は、同じ個体に由来する任意の物質であって、後にその個体に再導入されるものを指すことを意味する。
「共刺激リガンド」とは、Ｔ細胞上の同族共刺激分子に特異的に結合し、それにより、一次シグナル（例えば、ペプチドを負荷したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合によってもたらされる）に加えて、増殖活性化、分化などを含むがこれらに限定されないＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドには、ＣＤ７、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ－Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ－Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンベータ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニストまたは抗体、及びＢ７－Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれ得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドにはまた、とりわけ、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子（限定されないが、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３）と特異的に結合する抗体、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドが包含される。
「共刺激分子」は、共刺激リガンドに特異的に結合し、それにより、細胞による共刺激応答（限定されないが、例えば増殖）を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子には、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体が含まれるが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなどが挙げられる。
「共刺激シグナル」は、本明細書で使用される場合、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルと組み合わせて、Ｔ細胞増殖及び／または鍵分子のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションをもたらすシグナルを指す。特定の例示的実施形態では、共刺激シグナルは、ＣＤ７０である。
「疾患」は、動物が恒常性を維持することができない動物の健康状態である。疾患が改善されない場合、動物の健康状態は悪化し続ける。これに対し、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができる健康状態である。しかし動物の健康状態は、障害がない場合ほど好ましくはない。未処置のままであっても、障害は必ずしも動物の健康状態を更に低下させるわけではない。
「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では互換的に使用され、特定の生物学的結果を得るのに効果的であるかまたは治療的もしくは予防的利益をもたらす本明細書に記載される化合物、製剤、材料、または組成物の量を指す。このような結果には、哺乳動物に投与されたときに、本開示の組成物がない場合に検出される免疫応答と比較して検出可能なレベルの免疫抑制または免疫寛容を生じさせる量が含まれ得るが、これに限定されない。免疫応答は、当該技術分野で認められている極めて多くの方法によって容易に評価することができる。本明細書において投与される組成物の量は変動するものであり、複数の要因（例えば、処置されている疾患または症状、処置されている哺乳動物の年齢及び健康及び身体状態、疾患の重症度、投与されている特定の化合物など）に基づいて容易に決定することができることが、当業者には理解されるであろう。
「コードする」とは、規定のヌクレオチド配列（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｍＲＮＡ）または規定のアミノ酸配列のいずれか、ならびにそれらから生じる生物学的特性を有する生物学的プロセスにおける他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型として機能するための、遺伝子、ｃＤＮＡ、またはｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特定の配列の固有の特性を指す。したがって、遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生させる場合、タンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に示されるコード鎖と、遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方を、その遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードする、と称することができる。
本明細書で使用される場合、「内因性」は、生物、細胞、組織、もしくは系に由来する、またはその内部で生成される任意の物質を指す。
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、生物、細胞、組織、もしくは系の外部に由来する、または外部で生成される任意の物質を指す。
本明細書で使用される「増大する」という用語は、数が増加すること、例えば、Ｔ細胞の数が増加することを指す。一実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで増大されたＴ細胞は、培養物中に当初存在する数と比較して数が増加する。別の実施形態では、ｅｘ ｖｉｖｏで増大されたＴ細胞は、培養物中の他の細胞タイプと比較して数が増加する。「ｅｘ ｖｉｖｏ」という用語は、本明細書で使用される場合、生存生物（例えば、ヒト）から取り出され、生物の外部で（例えば、培養皿、試験管、またはバイオリアクタ内で）増殖された細胞を指す。
本明細書で使用される「発現」という用語は、特定のヌクレオチド配列のそのプロモーターによって駆動される転写及び／または翻訳として定義される。
「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、発現に十分なシス作用性エレメントを含む。発現のための他のエレメントは、宿主細胞によって、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系において供給され得る。発現ベクターには、当該技術分野で公知である全てのベクター、例えば、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸のものまたはリポソームに含有されたもの）、ならびにウイルス（例えば、センダイウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）が含まれる。
「免疫応答」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞媒介性及び／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。Ｔ細胞の例示的な免疫機能としては、例えば、サイトカイン産生及び他の細胞における細胞傷害性の誘導が挙げられる。Ｂ細胞の機能には、抗体産生が含まれる。更に、この用語には、Ｔ細胞活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答、例えば、抗体産生及びマクロファージなどのサイトカイン応答性細胞の活性化が含まれる。免疫応答に関与する免疫細胞としては、Ｂ細胞及びＴ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞）などのリンパ球；抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂリンパ球、ランゲルハンス細胞などのプロフェッショナル抗原提示細胞、及びケラチノサイト、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、乏突起膠細胞などの非プロフェッショナル抗原提示細胞）；ナチュラルキラー細胞；マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞が挙げられる。特定の実施形態では、この用語は、Ｔ細胞媒介性免疫応答を指す。免疫応答は、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞依存性免疫応答であり得る。当業者は、「腫瘍に対する免疫応答」という語句が、非ヒト抗原性ポリペプチドであって、腫瘍内投与、例えば、（ｉ）樹状細胞（前記ポリペプチドを負荷した自家もしくは同種の樹状細胞を含む）、または（ｉｉ）前記ポリペプチドをコードする核酸を含むウイルス、の腫瘍内投与によって腫瘍微小環境に導入される、非ヒト抗原性ポリペプチドに対する免疫応答も含むことを理解している。
「Ｔ細胞依存性免疫応答」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはＴ細胞とＢ細胞の両方の集団が活性化され、Ｔ細胞がＴ細胞及びＢ細胞ならびに他の免疫細胞がその機能を発揮する際に更に補助する、免疫応答を指す。
「免疫抑制」という用語は、本明細書では、全体的な免疫応答を低減させることを指すために使用される。
「単離された」とは、天然状態から変化されたまたは取り出されたことを意味する。例えば、生存動物内に天然に存在する核酸またはペプチドは「単離され」ていないが、その天然状態の共存物質から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離され」ている。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができ、または、例えば宿主細胞などの非天然環境に存在することができる。
本明細書で使用される「レンチウイルス」は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。レンチウイルスは、非分裂細胞を感染させることができるという点で、レトロウイルスの中でも独特である。それらは大量の遺伝情報を宿主細胞のＤＮＡに送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶは全て、レンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで有意なレベルの遺伝子移入を実現するための手段を提供する。
本明細書で使用される「改変された」という用語は、本開示の分子または細胞の変化した状態または構造を意味する。分子は、化学的、構造的、及び機能的などの様々な方法で改変され得る。細胞は、核酸の導入によって改変され得る。
「モジュレートする」という用語は、本明細書で使用される場合、処置もしくは化合物の非存在下での対象における応答のレベルと比較した、及び／または未処置である以外は同一である対象における応答のレベルと比較した、対象における応答のレベルの検出可能な増加または低下を媒介することを意味する。この用語は、天然のシグナルまたは応答を撹乱させること及び／またはそれに影響を及ぼすことにより、対象、例えばヒトにおける有益な治療応答を媒介することを包含する。
別途明記されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重型であり、同じアミノ酸配列をコードする、全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句はまた、タンパク質をコードするヌクレオチド配列がいくつかのバージョンでイントロン（複数可）を含み得る程度まで、イントロンを含み得る。
免疫原性組成物の「非経口」投与としては、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮内、腹腔内、または胸骨内の注射または注入手法が挙げられる。
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。更に、核酸はヌクレオチドのポリマーである。したがって、本明細書で使用される核酸及びポリヌクレオチドは互換的である。当業者は、核酸がポリヌクレオチドであり、これが単量体「ヌクレオチド」に加水分解され得るという一般的知識を有する。単量体ヌクレオチドは、ヌクレオシドに加水分解され得る。本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチドには、限定されないが、当該技術分野で利用可能な任意の手段によって得られる全ての核酸配列が含まれ、これら手段には、限定されないが、組換え手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲなどを使用した組換えライブラリまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニング、ならびに合成的手段によるものが含まれる。
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドには少なくとも２つのアミノ酸が含まれている必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は設けられていない。ポリペプチドには、ペプチド結合によって互いに連結した２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質が含まれる。本明細書で使用される場合、この用語は、例えば、当該技術分野で一般にペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも称される短い鎖と、当該技術分野で一般にタンパク質と称され多くのタイプが存在する、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が含まれる。ポリペプチドには、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはそれらの組み合わせが含まれる。
抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」という用語は、特定の抗原を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識しないか、またはそれらに結合しない抗体を意味する。例えば、１つの種に由来する抗原に特異的に結合する抗体はまた、１つ以上の種に由来するその抗原にも結合し得る。しかし、そのような異種間反応性それ自体が、特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。別の例では、抗原に特異的に結合する抗体は、その抗原の異なるアレル形態にも結合し得る。しかしながら、そのような交差反応性それ自体が、特異的なものとしての抗体の分類を変更することはない。いくつかの場合では、「特異的結合」または「特異的に結合」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関して、その相互作用が、化学種の特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味するために使用され得る。例えば、抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構造を認識してそれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」と抗体とを含む反応において、エピトープＡ（または遊離した非標識のＡ）を含有する分子が存在すると、抗体に結合した標識されたＡの量が低減する。
「刺激」という用語は、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）とその同族リガンドが結合することにより誘導され、それによりシグナル伝達事象、例えば、限定されないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達を媒介する、一次応答を意味する。刺激は、例えば、ＴＧＦ－ベータのダウンレギュレーション、及び／または細胞骨格構造の再構成など、特定の分子の発現の変化を媒介することができる。
本明細書で使用される場合、「刺激分子」という用語は、抗原提示細胞上に存在する同族刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
「刺激リガンド」は、本明細書で使用される場合、抗原提示細胞（例えば、ａＡＰＣ、樹状細胞、Ｂ細胞など）上に存在する場合、Ｔ細胞上の同族結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称される）と特異的に結合することができ、それにより、活性化、免疫応答の開始、増殖などを含むがこれらに限定されないＴ細胞による一次応答を媒介するリガンドを意味する。刺激リガンドは、当該技術分野で周知であり、とりわけ、ペプチドを負荷したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
「対象」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載する方法のレシピエント、すなわち、細胞性免疫応答を開始することができ、哺乳動物であるレシピエントを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。特定の実施形態では、対象は、家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ネコなどである。「患者」及び「対象」という用語は、互換的に使用され得る。特定の実施形態では、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）に罹患したヒトである。特定の実施形態では、対象は、腫瘍（例えば、固形腫瘍）に罹患した家畜である。
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」という用語は、抗原の提示に応答してＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、主要組織適合複合体分子に結合した抗原を認識する役割を担っている。ＴＣＲは、アルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖のヘテロ二量体で構成されているが、一部の細胞ではＴＣＲはガンマ及びデルタ（γ／δ）鎖からなる。ＴＣＲは、アルファ／ベータ及びガンマ／デルタの形態で存在することができ、これらは構造的に類似しているが、解剖学的な位置及び機能は異なっている。各鎖は、可変ドメインと定常ドメインという２つの細胞外ドメインで構成されている。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、及びガンマデルタＴ細胞を含めた、ＴＣＲを含む任意の細胞上で改変され得る。
「治療」という用語は、本明細書で使用される場合、処置及び／または予防を意味する。治療効果は病態の抑制、寛解、または根絶によって得られる。
本明細書で使用される「トランスフェクトされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞に移入または導入されるプロセスを指す。「トランスフェクト」または「形質転換」または「形質導入」細胞は、外因性核酸でトランスフェクト、形質転換、または形質導入された細胞である。この細胞は、初代対象細胞及びその後代を含む。
疾患を「処置する」とは、この用語が本明細書で使用される場合、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低減させることを意味する。
「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、異常に高速で増殖する細胞物質（例えば、組織）への言及を含む。新生細胞を含む増殖は新生物（「腫瘍」としても知られる）であり、一般に、対象の体内に異質な組織塊を形成する。腫瘍は、構造組織、及び正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示す場合がある。本明細書で使用される場合、腫瘍は、造血器腫瘍及び固形腫瘍を包含することが意図される。特定の実施形態では、腫瘍は、固形腫瘍である。「腫瘍」という用語は、本明細書で使用される場合、腫瘍微小環境または腫瘍部位（すなわち、腫瘍内の領域及び腫瘍性組織のすぐ外側の領域）への言及を含む。特定の実施形態では、腫瘍微小環境または腫瘍部位は、腫瘍組織の境界内の領域を含む。特定の実施形態では、腫瘍微小環境または腫瘍部位は、腫瘍の腫瘍間質コンパートメントを含む。これは、本明細書では、新生細胞の形質膜と新たに形成された新生血管の血管壁との間に介在する全てのものとして定義される。本明細書で使用される場合、「腫瘍微小環境」または「腫瘍部位」という用語は、腫瘍が存在する対象内の位置（腫瘍を直接取り囲んでいる領域を含む）を指す。
腫瘍は、良性（例えば、良性腫瘍）または悪性（例えば、悪性腫瘍もしくはがん）であり得る。悪性腫瘍は、大きく３つの主要なタイプに分類することができる。上皮構造から生じるものは癌腫と呼ばれ、筋肉、軟骨、脂肪または骨などの結合組織から発生するものは肉腫と呼ばれ、免疫系の構成成分を含む造血構造（血球の形成に関連する構造）に影響を及ぼすものは白血病及びリンパ腫と呼ばれる。他の腫瘍としては、神経線維腫症が挙げられるが、これに限定されない。特定の例示的実施形態では、腫瘍は、膠芽腫である。特定の例示的実施形態では、腫瘍は、卵巣癌である（例えば、上皮性卵巣癌。これは更に、漿液性卵巣癌、明細胞卵巣癌、類内膜卵巣癌、粘液性卵巣癌、または混合型上皮性卵巣癌へとサブタイプ分類することができる）。
固形腫瘍は、良性または悪性であり得る組織の異常な塊である。特定の実施形態では、固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）から命名される。肉腫及び癌腫などの固形腫瘍の例としては、脂肪肉腫、線維肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、粘液肉腫、及び他の肉腫、中皮腫、滑膜腫、平滑筋肉腫、ユーイング腫瘍、結腸癌、横紋筋肉腫、膵癌、リンパ系悪性腫瘍、肺癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、肝細胞癌、腺癌、基底細胞癌、汗腺癌、扁平上皮癌、甲状腺髄様癌、褐色細胞腫脂腺癌、甲状腺乳頭癌、乳頭腺癌、乳頭癌、髄様癌、気管支原性癌、肝癌、腎細胞癌、胆管癌、ウィルムス腫瘍、絨毛癌、子宮頸癌、精上皮腫、精巣腫瘍、膀胱癌、黒色腫、ＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、例えば、脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫、膠芽腫（例えば、多形性膠芽腫）、胚腫、星状細胞腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、上衣腫、神経鞘腫、ＣＮＳリンパ腫、聴神経腫、松果体腫、血管芽腫、髄膜腫、乏突起膠腫、網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び脳転移）などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法によって治療可能であり得る癌腫としては、扁平上皮癌（様々な組織）、基底細胞癌（皮膚癌の形態）、食道癌、膀胱癌（移行上皮癌（膀胱の悪性新生物）を含む）、肝細胞癌、結腸直腸癌、気管支原性癌、肺癌（肺の小細胞癌及び非小細胞癌を含む）、結腸癌、甲状腺癌、胃癌、乳癌、卵巣癌、副腎皮質癌、膵癌、汗腺癌、前立腺癌、乳頭癌、腺癌、脂腺癌、髄様癌、乳頭腺癌、非浸潤性乳管癌または胆管癌、嚢胞腺癌、腎細胞癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、精上皮腫、胎児性癌、子宮頸癌、精巣癌、鼻咽頭癌、骨原性癌（ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、上皮癌、子宮癌などが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に開示される方法によって治療可能であり得る肉腫としては、粘液肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、骨原性肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、骨肉腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、及び他の軟部組織肉腫が挙げられるが、これらに限定されない。
「ベクター」は、単離された核酸を含み、単離された核酸を細胞の内部に送達するために使用することができる物質の組成物である。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及びウイルスを含むがこれらに限定されない多数のベクターが、当該技術分野で公知である。したがって、「ベクター」という用語は、自律的に複製するプラスミドまたはウイルスを含む。この用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどの、細胞への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
「免疫原性組成物」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫原に対する免疫応答を必要としている対象内の前記免疫原に対する特異的な免疫応答を誘導する物質を指す。組成物には、アジュバント、及び任意選択で１つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、及び／または希釈剤が含まれ得る。免疫原性組成物は、プライム・ブーストワクチン接種、例えば、時間間隔を空けた少なくとも２、３、４回、または少なくとも５回の免疫処置に用いることができる。免疫原性組成物は、前記免疫原を含む（同種）樹状細胞であり得る。
「免疫原」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドに対して特異的に指向された免疫応答を誘発することができるポリペプチドなどの化合物を指す。免疫原は、抗原、すなわち抗原性ポリペプチドでもある。これに対し、抗原は必ずしも免疫原ではない。特定の実施形態では、免疫原は、（ワクチン組成物などの免疫原性組成物中で）ワクチン接種に使用されるが、腫瘍内送達のために調製された抗原性ポリペプチドはそうではなく、対象において誘発されるべき免疫応答の標的として、または既に誘発されている免疫応答の標的として、腫瘍をマーキングするために使用される。「免疫原」という用語は、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドをコードする核酸を指すためにも使用される。更に、抗原性ポリペプチドについて記載している実施形態は、本明細書に記載の免疫原にも適用される。
抗原性ポリペプチドの文脈で本明細書で使用される「非ヒト」という用語は、細菌ポリペプチド、古細菌ドメインの生物のポリペプチド、真菌ポリペプチド、及びウイルスポリペプチドを含めた、ヒト起源ではないポリペプチドを含む。また、植物ポリペプチド及び非ヒト哺乳動物ポリペプチド、例えば、非ヒト霊長類、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、ウマ、及びロバ、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウなど）のポリペプチドも含まれる。また、カタツムリまたは他の軟体動物（Ｍｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａを含む）のポリペプチドも含まれる。「非ヒト」という用語はまた、合成ポリペプチド、すなわち、人間によって設計された人工配列を有しており、天然には存在しないかまたは天然では未だ同定されていないポリペプチドを包含する。更に、この用語は、天然配列からのアミノ酸変化を含むヒトポリペプチドを含み、この変化は、ヒト対象における免疫原性をもたらす。
「腫瘍内」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原性ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸の腫瘍への送達または輸送を指す。本明細書に記載の抗原性ポリペプチドの腫瘍内送達または輸送の一例は、当該技術分野で一般に知られている投与経路である腫瘍内投与によるものである。腫瘍内投与の代替経路として、腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療ベクターなどの腫瘍特異的担体を介して抗原を腫瘍に送達することができ、これらは、遺伝子配列を腫瘍に送達するために広く開発されている。そのようなビヒクルを使用することにより、静脈内投与または腹腔内投与によるものなどの腫瘍内投与に加えて、複数の投与経路が可能になり、続いて前記ポリペプチドをコードする核酸を腫瘍内に送達することができる（Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｄｉｓｅａｓｅｓ，６（２）：４２（２０１８）；Ａｌｅｍａｎｙ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，２，ｐ．３６－４９（２０１４）、Ｔｗｕｍａｓｉ－Ｂｏａｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ １８，ｐ．４１９－４３２（２０１８））。
「腫瘍内送達のために調製された」という語句は、本明細書で使用される場合、腫瘍内送達に適合している、及び／または腫瘍内送達を可能にする製剤中にある、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは本明細書に記載の前記ポリペプチドをコードする核酸を指す。腫瘍内送達に使用される調製物は、免疫系と腫瘍との間の相互作用に対して有益な効果を有するように構成され得る。例えば、自家または同種の樹状細胞などの樹状細胞に前記ポリペプチドを負荷することができ、この細胞は、腫瘍内投与時に、腫瘍に侵入するＴ細胞との直接的相互作用を介して、及び／またはバイスタンダー抗原提示細胞を動員することによって間接的に、追加の免疫刺激をもたらすことができる（Ｌａｕｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，５：５２（２０１７）、Ｗａｌｌｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６２，ｐ．２３４－２４２（２００５））。そのような調製物の別の例は、本明細書に記載のポリペプチドまたは核酸を、腫瘍溶解性ウイルス（または腫瘍細胞内で選択的に複製する任意の他のウイルス）などの腫瘍特異的ウイルス（腫瘍細胞を感染させ、（ｉ）腫瘍細胞内での前記核酸の発現、ならびに（ｉｉ）（それに続く）前記腫瘍細胞による前記（発現された）ポリペプチドの細胞内プロセシング及び抗原提示（ＭＨＣ）を可能にするもの）を含む、腫瘍標的化ビヒクルなどの腫瘍送達ビヒクルに含めることができるものである。当業者は、ポリペプチド、または前記ポリペプチドをコードする核酸を腫瘍内送達のために調製するための他の方法及び手段を十分に認識している。例えば、当業者は、腫瘍特異的ナノ粒子などの他の腫瘍標的化送達ビヒクルを適用することができ、または前記ポリペプチドもしくは核酸を腫瘍内に送達するために、腫瘍内注射による腫瘍内投与を適用することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍内送達のために調製されたポリペプチドまたは核酸は、腫瘍標的化ビヒクル中に含まれる。
本明細書で使用される場合、「腫瘍外」という用語は、例えば、対象の体内における、腫瘍から離れており（例えば、遠位であり）、かつ組織を直接取り囲んでいる（例えば、腫瘍微小環境を構成し得る）位置を指す。
本明細書に記載の使用のための組成物は、対象の腫瘍に対して特異的に指向された免疫応答を誘発する。「特異的に指向された」が、腫瘍に対して特異的である免疫応答を指すことを、当業者は理解している。特異性は、免疫応答の標的として非ヒト抗原性ポリペプチドで腫瘍をマーキングする工程、及び前記非ヒト抗原性ポリペプチドの抗原性部分（すなわち、標的）に対する免疫応答を誘発する工程によって導入される。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載の使用のための組成物は、前記免疫応答の標的としてマーキングされた腫瘍に対する免疫応答を誘発する際に使用するためのものである。特定の実施形態では、本明細書に記載の使用のための組成物は、前記免疫応答の標的としてマーキングされた腫瘍に対する免疫応答を誘発する際に使用するためのものであり、前記標的は、本明細書に記載の非ヒト抗原性ポリペプチドである。
特定の実施形態では、本明細書に記載の腫瘍内送達のために調製された非ヒト抗原性ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸は、免疫応答の標的として腫瘍をマーキングする目的を果たす（腫瘍をマーキングするためのポリペプチド／核酸）。したがって、特定の実施形態では、腫瘍内送達のために調製された前記ポリペプチドまたは前記核酸は、腫瘍内送達後の免疫応答の標的として腫瘍をマーキングする。
「マーキング」、「マーキングする」、または「マーキングされた」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書に記載の抗原性ポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸の腫瘍内送達による、腫瘍の抗原状態の能動的操作を指す。これにより、細胞内送達ならびにそれに続く前記腫瘍細胞による前記ポリペプチドのプロセシング及び提示を通じた腫瘍細胞の直接標識が提供されるか、または例えば、前記ポリペプチドをコードする核酸を含む樹状細胞、もしくは前記抗原性ポリペプチドを負荷した樹状細胞を使用することによる、（ｉ）細胞内送達ならびにそれに続く前記腫瘍内の非腫瘍細胞による前記ポリペプチドのプロセシング及び提示、もしくは（ｉｉ）前記腫瘍への前記抗原性ポリペプチドの細胞外送達（すなわち、マーキング前の前記腫瘍内に存在する細胞に対して細胞外）を介した、腫瘍の間接標識が提供される。本明細書で使用される場合、「腫瘍マーキング工程」という用語は、本明細書に記載の方法（例えば、ワクチン接種戦略）における工程であって、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）または抗原性ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、腫瘍部位で対象に投与する工程を指す。
範囲：本開示全体を通して、本発明の様々な態様は、範囲形式で表され得る。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであり、本開示の範囲に対する変更不可能な限定と解釈してはならないことを理解されたい。したがって、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の説明は、部分範囲、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６など、及びその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅を問わず適用される。
Ｂ．腫瘍非依存性抗原
養子細胞療法などの免疫療法における腫瘍非依存性抗原の使用を含む方法が、本明細書で提供される。本明細書で提供されるように、本開示の特定の方法は、免疫細胞の特異性を腫瘍非依存性抗原に指向させるために用いられる。腫瘍非依存性抗原への免疫細胞の特異性は、同じ腫瘍非依存性抗原で腫瘍をマーキングするために、本開示の方法により利用される。したがって、腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍は、腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する免疫細胞によって認識されかつ攻撃され得る。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、宿主起源のものであると言われる。例えば、免疫細胞がヒト対象内に含まれる場合、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原はヒト起源のものである。ヒト起源の腫瘍非依存性抗原は、対象が現在罹患している腫瘍に関連しない任意のヒト抗原であり得る。腫瘍に関連しないヒト抗原が、腫瘍に関連しない及び／または腫瘍に由来しない任意の免疫原性抗原、例えば、任意のタンパク質または核酸であり得ることが、当業者には理解されるであろう。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、非宿主起源のものであると言われる。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、非ヒト起源のものである。例えば、免疫細胞がヒト対象内に含まれる場合、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は非ヒト起源のものである。非ヒト起源の腫瘍非依存性抗原は、腫瘍に関連しない任意の非ヒト抗原であり得る。腫瘍に関連しない非ヒト抗原が、腫瘍に関連しない及び／または腫瘍に由来しない任意の免疫原性抗原、例えば、任意のタンパク質または核酸であり得ることが、当業者には理解されるであろう。非ヒト腫瘍非依存性抗原の例としては、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌起源のタンパク質及び／または核酸；アレルゲン、毒素及び毒液、または鶏卵オボアルブミン及びジャイアントキーホールリンペットであるＭｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａに由来するキーホールリンペットヘモシアニンなどの様々な供給源のモデル抗原が挙げられる。特定の実施形態では、非ヒト腫瘍非依存性抗原は、ウイルス、細菌、真菌起源のタンパク質及び／または核酸、アレルゲン、毒素、毒液、モデル抗原、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、細菌起源のものである。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素である。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素の非毒性バリアントである。例えば、特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ウイルス起源のものである。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチド、例えば、ＣＭＶ内部マトリックスタンパク質ｐｐ６５由来のペプチドである。
特定の実施形態では、免疫細胞を含む宿主は、腫瘍非依存性抗原に対してナイーブである。特定の実施形態では、宿主免疫系は、腫瘍非依存性抗原に対してナイーブである。したがって、宿主は、これまでに腫瘍非依存性抗原に遭遇したことがなく、宿主は、腫瘍非依存性抗原に対してこれまでに訓練された免疫系を含まない。
特定の実施形態では、免疫細胞を含む宿主は、これまでに腫瘍非依存性抗原に遭遇したことがある。特定の実施形態では、宿主は、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する。したがって、宿主は、腫瘍非依存性抗原に対してこれまでに訓練された免疫系を有する。そのような実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、リコール抗原であると言われる。
リコール抗原は、宿主対象がこれまでに遭遇したことがある抗原であって、既存のメモリーリンパ球が宿主に存在するものである。特定の実施形態では、リコール抗原は、既存のメモリーリンパ球が宿主に存在する腫瘍非依存性抗原を指す。リコール抗原に対する既存の免疫応答は、以前の感染またはワクチン接種の結果として存在し得る。特定の実施形態では、腫瘍非依存性リコール抗原に対する既存免疫は、以前の感染、例えばウイルス感染の結果として発生する。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、健康な人に問題を引き起こすことは稀であるため、通常、対象は気づかぬうちに罹る。以前にＣＭＶに感染したことのある対象は、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を発生し、その結果、免疫系がＣＭＶに対して訓練される。したがって、ＣＭＶに由来する腫瘍非依存性抗原は、以前にＣＭＶに感染した対象を処置するための方法で使用される場合、リコール抗原であり得る。特定の実施形態では、腫瘍非依存性リコール抗原に対する既存免疫は、ワクチン接種の結果として発生する。例えば、ＣＲＭ１９７は、結合型ワクチンにおける免疫原性アジュバントとして広く使用されている。ＣＲＭ１９７を免疫原性アジュバントとして使用したワクチン接種を以前受けたことがある対象は、ＣＲＭ１９７に対する免疫応答を発生しており、その結果、ＣＲＭ１９７に対して訓練された免疫系を有する。更に、ＣＲＭ１９７自体を、例えばジフテリアに対するワクチンとして使用したワクチン接種を以前受けたことがある対象は、ＣＲＭ１９７に対する免疫応答を発生しており、その結果、ＣＲＭ１９７に対して訓練された免疫系を有する。他のリコール抗原は当業者に公知であり、それらは例えば、限定されないが、担体タンパク質、免疫原性アジュバント、及びワクチン技術分野で公知である免疫原、ならびに遭遇するウイルス、細菌、及び真菌感染である。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、免疫原性アジュバント及び／または担体ビヒクルを指す。例えば、結合型ワクチンの文脈において、担体は、抗原が共有結合した担体タンパク質を指す。この文脈において、担体は、抗原に対する免疫応答を強化及び／またはモジュレートするように作用する免疫原性アジュバントである。担体は、抗原を送達するビヒクルを指す場合もある。例えば、本明細書に記載の特定の実施形態では、抗原は、腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療ベクターなどの腫瘍特異的担体を介して送達される。
Ｃ．抗原特異的免疫細胞及びその生成方法
抗原特異的免疫細胞を作製するための方法も、本明細書で提供される。特に、本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する免疫細胞を作製するための方法が提供される。そのような細胞は、腫瘍非依存性抗原を認識することができる免疫受容体を含む。簡潔に述べると、免疫細胞の内因性抗原認識機構を利用するか、または免疫細胞に外因性抗原認識機構を導入することにより、免疫細胞を腫瘍非依存性抗原に対して特異的にする。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、図６に示される方法によって作製される。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、免疫細胞を腫瘍非依存性抗原と接触させることによって作製される。腫瘍非依存性抗原は、免疫細胞に提供され、及び／または表面抗原の形態で（例えば抗原提示を通じて）免疫細胞に提示される。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞などの特定のリンパ球による認識のために抗原をプロセシング及び提示することにより細胞性免疫応答を媒介する、免疫細胞の不均質な群である。特定の実施形態では、抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の作製を目的に、免疫細胞に腫瘍非依存性抗原を提示するために使用される。当該技術分野で公知のように、特定のＡＰＣは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩまたはクラスＩＩ分子を介して細胞内または細胞外抗原を提示する。抗原がペプチド断片にプロセシングされると、ペプチド断片はＭＨＣに結合し、細胞表面に輸送され、そこで提示され、抗原断片に特異的なＴ細胞受容体を含む免疫細胞によって認識される。他のＡＰＣは、免疫複合体の形態でインタクトな抗原の大型複合体を提示し、これは、次いで例えばＢ細胞受容体によって認識される。抗原提示細胞の例としては、樹状細胞、マクロファージ、及びＢ細胞が挙げられる。したがって、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、細胞表面腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む、抗原提示細胞または抗原提示細胞機能を有する細胞と免疫細胞とを接触させることによって作製される。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、細胞表面腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む樹状細胞表現型を有する改変細胞と免疫細胞とを接触させることによって作製される。腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞、例えば白血病起源の改変細胞（例えば、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）を作製するために使用することができる改変細胞の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５３８９８号及び同第ＰＣＴ／ＮＬ１９／５０４５１号、ならびに米国特許出願第６３／００１，１９３号、同第６３／００１，１８９号、同第６３／１１０，００２号、及び同第６３／１１０，００３号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、白血病細胞に由来する。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、白血病を有する患者に由来する。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、白血病を有する患者の末梢血に由来する。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、急性骨髄性白血病を有する患者の末梢血に由来する。白血病起源の改変細胞は、末梢血が得られた任意の患者に由来することができ、この際、こうして得られた白血病起源の改変細胞が本明細書に開示される特徴を含んでいるならば、患者は任意のタイプの白血病を有することを、当業者は認識するであろう。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、及びＣＤ８３陽性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＤ１４、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ランゲリン、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーを含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、ＣＤ８３陽性、及びＣＤ１４陰性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＤ４０陽性、ＣＤ８０陽性、及びＣＤ８６陽性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、ＣＤ８３陽性、ＣＤ４０陽性、ＣＤ８０陽性、ＣＤ８６陽性、及びＣＤ１４陰性である。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、染色体１１ｐ１５．５～１１ｐ１２の間の遺伝子異常を含む。特定の実施形態では、遺伝子異常は、ゲノム領域の約１６Ｍｂ（例えば、約２０．７Ｍｂ～約３６．６Ｍｂ）を包含する。特定の実施形態では、遺伝子異常は、約６０の既知及び未知遺伝子の喪失を含む。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、共刺激分子を含む。特定の実施形態では、共刺激分子には、限定されないが、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡ、及びＴｏｌｌリガンド受容体が含まれる。共刺激分子の例としては、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４－１ＢＢＬ（ＣＤ１３７リガンド）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＰＤ－Ｌ１、ＩＣＯＳＬ、ＩＣＡＭ－１、リンパ球機能関連抗原３（ＬＦＡ３（ＣＤ５８））、Ｋ１２／ＳＥＣＴＭ１、ＬＩＧＨＴ、ＨＬＡ－Ｅ、Ｂ７－Ｈ３、及びＣＤ８３が挙げられる。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、少なくとも１つの内因性抗原を含む。改変細胞の白血病起源に応じて、白血病起源の改変細胞は、白血病起源に特異的な少なくとも１つの公知の内因性抗原を含み得る。特定の実施形態では、内因性抗原は、腫瘍関連抗原である。特定の実施形態では、内因性の腫瘍関連抗原は、ＷＴ－１、ＲＨＡＭＭ、ＰＲＡＭＥ、ｐ５３、サバイビン、及びＭＵＣ－１からなる群から選択され得る。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、外因性抗原またはそのペプチド断片を含む。そのような外因性抗原は、様々な抗原負荷戦略を介して白血病起源の改変細胞に提供され得る。例えば、白血病起源の改変細胞を負荷するための戦略には、限定されないが、合成長鎖ペプチド、ｍＲＮＡ負荷、ペプチドパルス、タンパク質負荷、腫瘍溶解物負荷、腫瘍細胞との共培養、ＲＮＡ／ＤＮＡトランスフェクションまたはウイルス形質導入の使用が含まれ得る。白血病起源の改変細胞を負荷するための他の戦略は、当業者に公知であり、白血病起源の改変細胞に外因性抗原を負荷するために使用され得る。一般に、白血病起源の改変細胞は、特定の分子を介して、例えばＭＨＣ ＩまたはＭＨＣ ＩＩを介して外因性抗原をプロセシングする。したがって、白血病起源の改変細胞に含まれる外因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ抗原またはＭＨＣクラスＩＩ抗原であり得る。特定の実施形態では、外因性抗原は、腫瘍関連抗原である。例えば、特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞に、ＮＹ－ＥＳＯ－１ペプチド及び／またはＷＴ－１ペプチド、または腫瘍非依存性抗原（例えばＣＭＶｐｐ６５）を負荷する。特定の実施形態では、外因性抗原は、疾患または障害、例えば、非がん関連疾患または障害に関連する。あらゆる腫瘍関連抗原または疾患もしくは障害に関連する抗原を本明細書に記載の白血病起源の改変細胞に提供することができることを、当業者は理解するであろう。したがって、特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、当業者によって企図されるあらゆる腫瘍関連抗原または疾患もしくは障害に関連する抗原を含む。
特定の実施形態では、外因性抗原は、非腫瘍関連抗原（すなわち、腫瘍非依存性抗原）である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞に、腫瘍非依存性抗原、すなわち腫瘍に関連しない抗原を負荷する。例えば、好適な腫瘍非依存性抗原には、限定されないが、ウイルス、細菌、真菌起源のタンパク質；アレルゲン、毒素及び毒液、または鶏卵オボアルブミン及びジャイアントキーホールリンペットであるＭｅｇａｔｈｕｒａ ｃｒｅｎｕｌａｔａに由来するキーホールリンペットヘモシアニンなどの様々な供給源のモデル抗原が含まれる。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、細菌起源のものである。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素である。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ジフテリア毒素の非毒性バリアントである。例えば、特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントを含む。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ウイルス起源のものである。特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチド、例えば、ＣＭＶ内部マトリックスタンパク質ｐｐ６５由来のペプチドである。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ｐｐ６５ペプチドを含む。あらゆる腫瘍非依存性抗原を本明細書に記載の白血病起源の改変細胞に提供することができることを、当業者は理解するであろう。したがって、特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、当業者によって企図されるあらゆる腫瘍非依存性抗原を含む。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞に外因性抗原またはそのペプチド断片を負荷することは、光化学的プロセス（例えば、光化学的内在化）を使用することを含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞に外因性抗原またはそのペプチド断片を負荷することは、光化学内在化を使用して実現される。特定の実施形態では、光化学的内在化は、抗原またはそのペプチド断片（例えば、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）、または抗原性ポリペプチドをコードする核酸）の白血病起源の改変細胞への送達を増強させるために使用され得る。
光化学的内在化とは、通常であれば膜不透過性である分子を、標的細胞のサイトゾルに導入するための光及び光増感剤の使用を含む送達方法を指すが、これは必ずしも標的細胞を破壊または死滅させるわけではない。この方法では、内在化または移入される分子は、光増感剤と組み合わせて細胞に適用される。細胞を適切な波長の光に曝露させると、光増感剤が活性化され、次に細胞内コンパートメント膜が破壊されて、続いて分子がサイトゾルに放出される。光化学的内在化では、光増感剤と光との間の相互作用を使用して細胞に影響を及ぼし、分子の細胞内取り込みが改善されるようにする。光化学的内在化及び様々な光増感剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０７４３２号、同第ＷＯ００／５４７０８号、同第ＷＯ０１／１８６３６号、同第ＷＯ０２／４４３９６号、同第ＷＯ０２／４４３９５号、及び同第ＷＯ０３／０２０３０９号、米国特許第６，６８０，３０１号、米国特許第５，８７６，９８９号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、光化学的内在化は、抗原を腫瘍細胞のサイトゾルに送達するために使用される。特定の実施形態では、光化学的内在化は、腫瘍細胞のサイトゾルへの抗原の送達を増強させるために使用される。
白血病起源の改変細胞への外因性抗原またはそのペプチド断片の負荷は、任意の時点で実施することができる。当業者は、当業者の必要性に最も適合するように、白血病起源の改変細胞を負荷する特定のタイミングを決定し、実行することができるであろう。例えば、特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞に、それが成熟樹状細胞表現型を呈する前に、外因性抗原またはそのペプチド断片を負荷する。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞が成熟樹状細胞表現型へと移行している間に、白血病起源の改変細胞に外因性抗原またはそのペプチド断片を負荷する。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞が成熟樹状細胞表現型を呈した後に、白血病起源の改変細胞に外因性抗原またはそのペプチド断片を負荷する。
特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１４／００６０５８号及び同第ＷＯ２０１４／０９０７９５号に記載の細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、及びＣＤ８３陽性である成熟樹状細胞表現型を含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、及びＣＤ８３陽性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ１４、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ランゲリン、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＣＤ７０、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される細胞表面マーカーを含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＭＨＣクラスＩを含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＭＨＣクラスＩＩを含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、ＣＤ８３陽性、及びＣＤ１４陰性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ４０陽性、ＣＤ８０陽性、及びＣＤ８６陽性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ＣＤ３４陽性、ＣＤ１ａ陽性、ＣＤ８３陽性、ＣＤ４０陽性、ＣＤ８０陽性、ＣＤ８６陽性、及びＣＤ１４陰性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、染色体１１ｐ１５．５～１１ｐ１２の間の遺伝子異常を含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、ゲノム領域の約１６Ｍｂ（例えば、約２０．７Ｍｂ～約３６．６Ｍｂ）を包含する遺伝子異常を含む。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、細胞株ＤＣＯｎｅの細胞であり、約６０の既知及び未知遺伝子の喪失を含む遺伝子異常を含む。
本明細書で提供されるように、特定の方法は、白血病起源の改変細胞の使用を利用し、ここで、改変細胞は非増殖性である。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は放射線照射される。特定の実施形態では、白血病起源の改変細胞は、本明細書に開示される方法で使用される前に放射線照射されている。照射は、例えば、標準的な照射デバイス（Ｇａｍｍａｃｅｌｌまたは同等物）を使用して、３０～１５０Ｇｙ（例えば、１００Ｇｙ）で１～３時間の間、ガンマ線照射することで実現され得る。照射によって、白血病起源の改変細胞（例えば、ＣＤ３４陽性細胞）を含む組成物内のあらゆる残存前駆細胞は、分裂を継続することが確実に不可能となる。細胞は、例えば、ワクチンとして使用する場合に患者に注射する前に、または培養を停止した直後に、照射してもよい。特定の実施形態では、細胞を、その免疫刺激能を維持しながら、その増殖能及び／または増大能を阻害するように照射する。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫受容体を含むように免疫細胞を改変することによって作製される。免疫細胞を、例えば免疫受容体を含むように改変する様々な方法が当業者に公知である。特定の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原に特異的な免疫受容体を含むようにｉｎ ｖｉｖｏで改変される。特定の免疫細胞サブセットに対する免疫受容体をコードする核酸のｉｎ ｖｉｖｏ媒介送達方法は説明されており、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１２０：４３３４－４３４２、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９５（５）：２４９３－２５０１、及びＡｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２０２０）２８（８）：１７８３－１７９４（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の実施形態では、免疫受容体を含むように免疫細胞を改変することは、トランスポゾンまたはウイルスベクターによって媒介される。トランスポゾンベースの方法は、例えば、米国特許第１０，５１３，６８６号、米国特許公開第ＵＳ２０１８０００２３９７Ａ１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０２００１４３６６Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０４６８１５Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１９１７３６３６Ａ１号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのトランスポゾンベースの改変について記載されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）１２（８）：８１３－８２０を参照されたい。本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原に特異的な免疫受容体は、一般に、抗原認識ドメインを含む。一般に、免疫受容体の抗原認識ドメインの可変領域は、特定の抗原（例えば、特定の腫瘍非依存性抗原）を認識しそれに結合する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。特定の実施形態では、免疫受容体は、外因性免疫受容体である。特定の実施形態では、免疫受容体は、天然免疫受容体である。天然免疫受容体の例は、Ｔ細胞受容体である。したがって、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原特異的Ｔ細胞受容体を含むように免疫細胞を改変することによって作製される。Ｔ細胞受容体は、本明細書に更に記載されている。特定の実施形態では、免疫受容体は、合成免疫受容体である。合成免疫受容体の例は、キメラ抗原受容体である。したがって、特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、キメラ抗原受容体を含むように免疫細胞を改変することによって作製される。キメラ抗原受容体は、本明細書に更に記載されている。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を使用することによって作製される。例えば、腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体によって結合される免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原に特異的な抗原結合ドメインを有する二重特異性抗体によって、腫瘍非依存性抗原特異的となる。
また、改変免疫細胞またはその前駆体（例えば、Ｔ細胞）を生成または作製するための方法も提供される。細胞は、一般に、免疫受容体（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲ）をコードする１つ以上の遺伝子操作された核酸を導入することによって操作される。１つ以上の遺伝子操作された核酸を導入することによって細胞を操作する様々な方法が当業者に公知である。細胞の操作はｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで行うことができることを当業者は理解するであろう。特定の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫受容体を含むようにｅｘ ｖｉｖｏで改変される。特定の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫受容体を含むようにｉｎ ｖｉｖｏで改変される。
特定の実施形態では、免疫受容体（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲ）は、発現ベクターによって細胞に導入される。ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードする核酸配列を含む発現ベクターは、当該技術分野で公知である。好適な発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、遺伝子操作されたハイブリッドウイルス、ネイキッドＤＮＡ（トランスポゾン媒介ベクター（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、ｐｉｇｇｙＢａｃ）、及びＰｈｉ３１などのインテグラーゼを含むがこれらに限定されない）が挙げられる。いくつかの他の好適な発現ベクターには、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びレトロウイルス発現ベクターが含まれる。
特定の実施形態では、免疫受容体をコードする核酸は、ウイルス形質導入を介して細胞に導入される。特定の実施形態では、ウイルス形質導入は、免疫受容体をコードする核酸を含むウイルスベクターと免疫細胞または前駆細胞とを接触させることを含む。目的タンパク質（例えば、免疫受容体）をコードする核酸を細胞に形質導入する際に使用するための様々なウイルスベクターが当業者に公知である。ウイルスベクターをｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ適用において使用することができることは、当業者には容易に理解されるであろう。特定の実施形態では、免疫受容体をコードする核酸は、ｅｘ ｖｉｖｏウイルス形質導入を介して免疫細胞に導入される。特定の実施形態では、免疫受容体をコードする核酸は、ｉｎ ｖｉｖｏウイルス形質導入を介して免疫細胞に導入される。
アデノウイルス発現ベクターは、アデノウイルスをベースとしたものであり、ゲノムＤＮＡへの組み込み能は低いが、宿主細胞へのトランスフェクション効率は高い。アデノウイルス発現ベクターは、（ａ）発現ベクターのパッケージングを支援し、（ｂ）宿主細胞内で免疫受容体を最終的に発現させるのに、十分なアデノウイルス配列を含有する。特定の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡであって、本開示の発現ベクターを作製するために、外来ＤＮＡ配列（例えば、外因性ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードする核酸）を挿入して、アデノウイルスＤＮＡの大きな部分を置換することができるものである（例えば、Ｄａｎｔｈｉｎｎｅ ａｎｄ Ｉｍｐｅｒｉａｌｅ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７（２０）：１７０７－１７１４を参照されたい）。
別の発現ベクターは、アデノウイルス結合系を利用するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとする。このＡＡＶ発現ベクターは、宿主ゲノムに高頻度で組み込まれる。この発現ベクターは、非分裂細胞を感染させることができるため、例えば組織培養またはｉｎ ｖｉｖｏでの、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に有用である。ＡＡＶベクターは、感染する宿主範囲が広い。ＡＡＶベクターの作製及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号及び同第４，７９７，３６８号に記載されている。
レトロウイルス発現ベクターは、宿主ゲノムへの組み込み、大量の外来遺伝物質の送達、広範な種及び細胞タイプへの感染、ならびに特殊な細胞株へのパッケージ化が可能である。レトロウイルスベクターは、核酸（例えば、外因性ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードする核酸）をウイルスゲノムの特定の位置に挿入して、複製欠損ウイルスを産生させることによって構築される。レトロウイルスベクターは幅広い細胞タイプを感染させることができるが、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲの組み込み及び安定発現には宿主細胞の分裂が必要である。
レンチウイルスベクターは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含有する、複雑なレトロウイルスであるレンチウイルスに由来する（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号及び同第５，９９４，１３６号を参照されたい）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ病原性遺伝子を多重に弱毒化することによって作製される。例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆを欠失させることにより、生物学的に安全なベクターとなる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ及びｅｘ ｖｉｖｏの両方の（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードする核酸の）遺伝子移入及び発現に使用され得る（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号を参照されたい）。レンチウイルスベクターを使用してｉｎ ｖｉｖｏで免疫細胞を形質導入するための方法は、当該技術分野で公知である。更に、免疫受容体をコードする核酸のｉｎ ｖｉｖｏレンチウイルスベクター媒介性送達は、特定の免疫細胞サブセットを標的とすることができる。例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１２０：４３３４－４３４２、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９５（５）：２４９３－２５０１、及びＡｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２０２０）２８（８）：１７８３－１７９４（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
発現ベクターは、当業者に公知の任意の手段によって宿主細胞に導入され得る。発現ベクターは、必要に応じて、トランスフェクション用のウイルス配列を含み得る。あるいは、発現ベクターは、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入され得る。宿主細胞は、発現ベクターを導入する前に培養中で増殖及び増大させ、続いてベクターの導入及び組み込みのための適切な処理を行うことができる。次いで、宿主細胞を増大させ、ベクターに存在するマーカーによってスクリーニングすることができる。使用することができる様々なマーカーが当該技術分野で公知であり、それらには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが含まれ得る。本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」という用語は、互換的に使用され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、免疫細胞またはその前駆体、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞である。
特定の実施形態では、改変免疫細胞は、治療上適切な後代を生じさせることができる遺伝子操作されたＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、及びマクロファージである。特定の実施形態では、遺伝子操作細胞は、自家細胞である。
改変免疫細胞（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲを含む）は、本開示の核酸を含む発現ベクターで宿主細胞を安定的にトランスフェクトすることによって産生され得る。本開示の改変細胞を作製するための更なる方法としては、限定されないが、化学的形質転換法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、及び／またはカチオン性ポリマーを使用する）、非化学的形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、光学的形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー、及び／または流体力学的送達）及び／または粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃及び／またはマグネトフェクションを使用するインペールフェクション）が挙げられる。免疫受容体を発現するトランスフェクト細胞は、ｅｘ ｖｉｖｏで増大させることができる。
発現ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい。発現ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに脂質ベース系（水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む）が挙げられる。
使用に適した脂質は、商業的供給源から得ることができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから得ることができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から得ることができ、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから得ることができ、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及び他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から得ることができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質原液は、約－２０℃で保存され得る。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、単独の溶媒として使用され得る。「リポソーム」は、封入脂質二重層または凝集体が生じることにより形成される様々な単層及び多層脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜と内部水性媒体とを有する小胞構造を有することを特徴とし得る。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉鎖構造の形成前に自己再構成を起こし、脂質二重層間に水及び溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。溶液中で通常の小胞構造とは異なる構造を有する組成物もまた、包含される。例えば、脂質は、ミセル構造をとる場合もあり、または単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する場合もある。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
外因性核酸を宿主細胞に導入するために、または他の方法で細胞を本開示の阻害剤に曝露させるために使用される方法を問わず、宿主細胞中の核酸の存在を確認するために様々なアッセイが実施され得る。そのようなアッセイとしては、例えば、当業者に周知の分子生物学アッセイ、例えば、サザンブロッティング及びノーザンブロッティング、ＲＴ－ＰＣＲ、ならびにＰＣＲ；生化学的アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を、例えば免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウエスタンブロット）によって、または本開示の範囲内にある薬剤を同定するための本明細書に記載されるアッセイによって検出するものが挙げられる。
一実施形態では、宿主細胞に導入される核酸は、ＲＮＡである。別の実施形態では、ＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡまたは合成ＲＮＡを含むｍＲＮＡである。ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で作製された鋳型を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって生成され得る。任意の供給源に由来する目的のＤＮＡは、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを使用して、ＰＣＲによってｉｎ ｖｉｔｒｏ ｍＲＮＡ合成用の鋳型に直接変換され得る。ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または任意の他の適切なＤＮＡの供給源であり得る。
ＰＣＲは、後に細胞に導入されるｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用の鋳型を作製するために使用され得る。ＰＣＲを実施するための方法は当該技術分野で周知である。ＰＣＲで使用するためのプライマーは、ＰＣＲの鋳型として使用するＤＮＡの領域と実質的に相補的な領域を有するように設計される。「実質的に相補的」は、本明細書で使用される場合、プライマー配列中の塩基の大部分または全てが相補的であるヌクレオチドの配列を指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに使用されるアニーリング条件下で目的のＤＮＡ標的とアニーリングまたはハイブリダイズすることができる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型の任意の部分に実質的に相補的であるように設計され得る。例えば、プライマーは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む、細胞内で通常転写される遺伝子の部分（オープンリーディングフレーム）を増幅するように設計され得る。プライマーはまた、目的の特定のドメインをコードする遺伝子の一部を増幅するように設計され得る。一実施形態では、プライマーは、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの全部または一部を含む、ヒトｃＤＮＡのコード領域を増幅するように設計される。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野で周知の合成方法によって作製される。「フォワードプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の上流にあるＤＮＡ鋳型上のヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「上流」は、本明細書では、コード鎖に対して、増幅されるＤＮＡ配列の５側の位置を指すために使用される。「リバースプライマー」は、増幅されるＤＮＡ配列の下流にある二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含有するプライマーである。「下流」は、本明細書では、コード鎖に対して、増幅されるＤＮＡ配列の３’側の位置を指すために使用される。
ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を促進する能力を有する化学構造も使用され得る。ＲＮＡは通常、５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、０～３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ配列の長さは、ＵＴＲの様々な領域とアニーリングするＰＣＲ用プライマーの設計を含むがこれに限定されない、様々な方法によって変更され得る。このアプローチを使用して、当業者は、転写されたＲＮＡのトランスフェクション後に最適な翻訳効率を実現するために必要な５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲは、目的遺伝子の天然の内因性５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的遺伝子に対して内因性ではないＵＴＲ配列を、フォワード及びリバースプライマーにＵＴＲ配列を組み込むことによって、または鋳型の任意の他の変更によって付加することができる。目的遺伝子に対して内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性及び／または翻訳効率を改変するのに有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列のＡＵリッチエレメントがｍＲＮＡの安定性を低下させ得ることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野で周知であるＵＴＲの特性に基づいて、転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計され得る。
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のコザック配列を含有し得る。あるいは、目的遺伝子に対して内因性ではない５’ＵＴＲが上記のようにＰＣＲにより付加されている場合、５’ＵＴＲ配列を付加することによってコンセンサスコザック配列を再設計することができる。コザック配列は、一部のＲＮＡ転写物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために全てのＲＮＡが必要としているわけではないように思われる。多くのｍＲＮＡに対するコザック配列の必要性は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、そのＲＮＡゲノムが細胞内で安定しているＲＮＡウイルスに由来し得る。他の実施形態では、ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨害するために、様々なヌクレオチド類似体が、３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲで使用され得る。
遺伝子クローニングを必要とせずにＤＮＡ鋳型からＲＮＡを合成できるようにするには、転写される配列の上流のＤＮＡ鋳型に転写のプロモーターを結合させる必要がある。ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとして機能する配列がフォワードプライマーの５’末端に付加されると、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に組み込まれる。一実施形態では、プロモーターは、本明細書の他所に記載されているように、Ｔ７ポリメラーゼプロモーターである。他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及びＳＰ６プロモーターのコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知である。
一実施形態では、ｍＲＮＡは、細胞内でのリボソーム結合、翻訳の開始、及び安定性ｍＲＮＡを決定する、５’末端上のキャップ及び３’ポリ（Ａ）テールの両方を有する。環状ＤＮＡ鋳型、例えばプラスミドＤＮＡでは、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長い鎖状体産物を産生する。３’ＵＴＲの末端で線状化されたプラスミドＤＮＡの転写により、たとえ転写後にポリアデニル化されたとしても真核生物のトランスフェクションには有効でない、通常サイズのｍＲＮＡがもたらされる。
線状のＤＮＡ鋳型では、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の最後の塩基を超えて転写物の３’末端を伸長させることができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）、Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５－６５（２００３））。
転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ＰＣＲ中にポリＴテール、例えば１００Ｔテール（サイズは５０～５０００Ｔであり得る）を含有するリバースプライマーを使用して生成され得るか、またはＰＣＲ後にＤＮＡライゲーションもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えを含むがこれらに限定されない任意の他の方法により生成され得る。ポリ（Ａ）テールはまた、ＲＮＡに安定性をもたらし、ＲＮＡの分解を低減させる。一般に、ポリ（Ａ）テールの長さは、転写されたＲＮＡの安定性と正に相関する。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールは、１００～５０００個のアデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、Ｅ．ｃｏｌｉポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）などのポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写後に更に伸長され得る。一実施形態では、ポリ（Ａ）テールの長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドに増加させると、ＲＮＡの翻訳効率が約２倍増加する。更に、３’末端に様々な化学基を結合させることで、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。このような結合には、改変／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び他の化合物を含めることができる。例えば、ＡＴＰ類似体は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを使用してポリ（Ａ）テールに組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、ＲＮＡの安定性を更に増加させることができる。
５’キャップもまた、ＲＮＡ分子に安定性をもたらす。例示的実施形態では、本明細書に開示される方法により産生されるＲＮＡは、５’キャップを含む。５’キャップは、当該技術分野で公知であり本明細書に記載されている手法を使用して提供される（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）、Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））。
特定の実施形態では、ＲＮＡ、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡは、細胞にエレクトロポレーションされる。細胞の透過性及び生存率を促進する因子、例えば、糖、ペプチド、脂質、タンパク質、抗酸化剤、及び界面活性剤を含んでもよい、細胞エレクトロポレーションに適した任意の溶質を含めることができる。
いくつかの実施形態では、免疫受容体をコードする核酸は、ＲＮＡ、例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで合成されたＲＮＡである。ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ合成方法は当該技術分野で公知であり、任意の公知の方法を、免疫受容体（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲ）をコードする配列を含むＲＮＡを合成するために使用することができる。ＲＮＡを宿主細胞に導入するための方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（２０１０）１５：９０５３を参照されたい。ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡの宿主細胞への導入は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われ得る。例えば、宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球など）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡをエレクトロポレーションされ得る。
本開示の方法は、がん、幹細胞、急性及び慢性感染症、ならびに自己免疫疾患の分野において、基礎研究及び治療におけるＴ細胞活性のモジュレーションに適用することができ、これには、遺伝子改変Ｔ細胞の標的がん細胞を殺傷する能力の評価が含まれる。
本方法はまた、例えばプロモーターまたは入力ＲＮＡの量を変化させることにより広範囲にわたって発現レベルを制御する能力を提供し、発現レベルを個別に調節することを可能にする。更に、ｍＲＮＡ産生のＰＣＲベースの手法は、様々な構造及びそれらのドメインの組み合わせを有するｍＲＮＡの設計を大幅に容易にする。
本開示のＲＮＡトランスフェクション法の１つの利点は、ＲＮＡトランスフェクションが本質的に一過性であり、ベクターが不要であることである。ＲＮＡ導入遺伝子は、短時間のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性化の後に、更なるウイルス配列を必要とせずに最小限の発現カセットとしてリンパ球に送達され、その中で発現され得る。これらの条件下では、導入遺伝子が宿主細胞ゲノムに組み込まれる可能性は低い。ＲＮＡのトランスフェクション効率及びリンパ球集団全体を均一に改変する能力を理由に、細胞のクローニングは必要とされない。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）によるＴ細胞の遺伝子改変は、２つの異なる戦略を利用しており、その両方が様々な動物モデルで順次試験されてきた。細胞に、リポフェクションまたはエレクトロポレーションによってｉｎ ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡをトランスフェクトする。移入されたＩＶＴ－ＲＮＡの長期発現を実現するために、様々な改変を使用してＩＶＴ－ＲＮＡを安定化させることが望ましい。
いくつかのＩＶＴベクターが文献中で知られており、それらはｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型として標準化された方法で利用され、安定化されたＲＮＡ転写物が産生されるように遺伝子改変されている。当該技術分野で使用されている現行プロトコルは、以下の構造：ＲＮＡ転写を可能にする５’ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、それに続く、非翻訳領域（ＵＴＲ）が３’及び／または５’のいずれかに隣接する目的遺伝子、ならびに５０～７０個のＡヌクレオチドを含有する３’ポリアデニルカセット、を有するプラスミドベクターに基づいている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の前に、環状プラスミドは、ＩＩ型制限酵素によってポリアデニルカセットの下流で線状化される（認識配列は切断部位に対応する）。したがって、ポリアデニルカセットは、転写物の後方のポリ（Ａ）配列に対応する。この手順の結果として、一部のヌクレオチドは、線状化後に酵素切断部位の一部として残り、３’末端のポリ（Ａ）配列を伸長させるかまたはマスクする。この非生理学的オーバーハングが、そのようなコンストラクトから細胞内で産生されるタンパク質の量に影響を及ぼすか否かは明らかではない。
別の態様では、ＲＮＡコンストラクトは、エレクトロポレーションによって細胞内に送達される。例えば、ＵＳ２００４／００１４６４５、ＵＳ２００５／００５２６３０Ａ１、ＵＳ２００５／００７０８４１Ａ１、ＵＳ２００４／００５９２８５Ａ１、ＵＳ２００４／００９２９０７Ａ１に教示されている、哺乳動物細胞への核酸コンストラクトのエレクトロポレーションの策定及び方法論を参照されたい。任意の公知の細胞タイプのエレクトロポレーションに必要な電界強度を含む様々なパラメータは、関連する研究文献、ならびに当該分野における多数の特許及び出願で一般的に公知である。例えば、米国特許第６，６７８，５５６号、米国特許第７，１７１，２６４号、及び米国特許第７，１７３，１１６号を参照されたい。エレクトロポレーションの治療応用向けの装置は、市販されており（例えば、ＭｅｄＰｕｌｓｅｒ（商標）ＤＮＡ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｏｖｉｏ／Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、また米国特許第６，５６７，６９４号；米国特許第６，５１６，２２３号、米国特許第５，９９３，４３４号、米国特許第６，１８１，９６４号、米国特許第６，２４１，７０１号、及び米国特許第６，２３３，４８２号などの特許に記載されている。エレクトロポレーションは、例えばＵＳ２００７０１２８７０８Ａ１に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞のトランスフェクションにも使用され得る。エレクトロポレーションはまた、ｉｎ ｖｉｔｒｏで核酸を細胞に送達するために利用され得る。したがって、当業者に公知の多くの利用可能なデバイス及びエレクトロポレーション系のいずれかを利用する発現コンストラクトを含む核酸の細胞へのエレクトロポレーション媒介投与は、目的のＲＮＡを標的細胞に送達するための刺激的な新規手段を提示する。
特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、免疫受容体（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲ）をコードする核酸分子の導入前、導入中、及び／または導入後にインキュベートまたは培養され得る。細胞（例えば、Ｔ細胞）は、免疫受容体をコードする核酸分子の導入前、導入中、または導入後に、例えば免疫受容体をコードするウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の細胞への形質導入前、導入中、または導入後に、インキュベートまたは培養され得る。特定の実施形態では、本方法は、免疫受容体をコードする核酸分子を導入する前に、好適な刺激剤または活性化剤で細胞を活性化または刺激することを含む。特定の実施形態では、本方法は、免疫受容体をコードする核酸分子を導入した後に、好適な刺激剤または活性化剤で細胞を活性化または刺激することを含む。
Ｄ．免疫細胞の刺激及び増大
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を通じたシグナル伝達は、一般にシグナル－１と称されるものをもたらすが、これは適切なＴ細胞活性化には不十分である。共刺激分子は、一般にシグナル－２と称される、増殖、生存、及び分化に不可欠なシグナルをもたらす。Ｔ細胞の完全な活性化にはシグナル－１とシグナル－２の両方が必要であり、これらのシグナルの強度は、得られるＴ細胞集団のサイズ（例えば、Ｔ細胞の数）に影響を与える。実際、シグナル１のみを受信しシグナル２のないナイーブＴ細胞は、無応答性であるか、及び／またはアポトーシスによって死滅する。
免疫受容体（例えば、Ｔ細胞受容体またはキメラ抗原受容体）を発現するように細胞を改変する前であろうと後であろうと、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び米国公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して、細胞を活性化し、数を増大させることができる。一般に、本開示の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、メモリーＴ細胞）は、シグナル－１及びシグナル－２がまとめてもたらされることによって増大され得る。特定の実施形態では、これらのシグナルは、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナル（すなわち、シグナル－１）を刺激する薬剤と、免疫細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンド（すなわち、シグナル－２）と、が結合した表面に、免疫細胞を接触させることによってもたらされる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの分裂促進レクチンなどの化学物質を使用して、免疫細胞に対する活性化シグナルを作り出すことができる。
免疫細胞集団（例えば、Ｔ細胞集団）は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化された抗ＣＤ２８抗体との接触によって、あるいはカルシウムイオノフォアと併せたプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）との接触によって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（例えば、ｅｘ ｖｉｖｏ）で刺激され得る。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用され得る。例えば、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団を、免疫細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。例えば、各シグナルをもたらす薬剤は、溶液中に存在し得るか、または表面にカップリングされ得る。当業者は容易に理解することができるように、細胞に対する粒子の比率は、標的細胞に対する粒子サイズに依存し得る。特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を、薬剤でコーティングされたビーズ（例えば、磁気ビーズ）と合わせ、その後ビーズと細胞を分離し、次いで細胞を培養する。特定の実施形態では、培養前に、薬剤でコーティングされたビーズと細胞を分離せず、一緒に培養する。
特定の例示的実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を刺激する及び増大させるための前述の条件は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５３８９８号及び同第ＰＣＴ／ＮＬ１９／５０４５１号、ならびに米国特許出願第６３／００１，１９３号、同第６３／００１，１８９号、同第６３／１１０，００２号、及び同第６３／１１０，００３号（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、改変細胞、例えばＤＣＯｎｅ ｍＤＣによって提供され得る。
ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、他のリンパ球を、例えば細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化の際に補助する。ＣＤ４＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４の細胞表面発現によって特徴付けられ、ナイーブＴ細胞がＭＨＣクラスＩＩ分子と相互作用するときに活性化される。ＣＤ４＋ Ｔ細胞サブセットは当該技術分野で公知であり、限定されないが、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、及びＴｆｈ細胞が含まれ、産生されるサイトカインのタイプによって概ね特徴付けられる。例えば、Ｔｈ１細胞はＩＦＮγを産生し、Ｔｈ２細胞はＩＬ－４を産生する。細胞傷害性ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ８の細胞表面発現によって特徴付けられ、同族抗原を発現する標的を攻撃する機能を果たす。ＣＤ８＋ Ｔ細胞には、例えば、Ｔｃ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔキラー細胞、及びキラーＴ細胞が含まれる。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に会合する短鎖ペプチドに結合することにより、それらの標的を認識する。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＩＬ－２及びＩＦＮγなどの重要なサイトカインを産生することが知られている。
免疫細胞を刺激する及び増大させるために本明細書で提供される様々な方法において、免疫細胞の増殖を刺激するのに適した条件は、免疫細胞にシグナル－１及びシグナル－２をもたらすことを含む。特定の実施形態では、シグナル－１は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の活性化を含む。特定の実施形態では、シグナル－２は、共刺激分子の活性化を含む。
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、増殖を支援するのに必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）及び大気（例えば、空気＋５％ＣＯ２）で維持される。様々な刺激時間に曝露された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）は、異なる特徴を呈し得る。
本明細書に開示される方法によって作製される免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ Ｔ細胞）の集団は、約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１０００倍、２０００倍、３０００倍、４０００倍、５０００倍、６０００倍、７０００倍、８０００倍、９０００倍、１０，０００倍、１００，０００倍、１，０００，０００倍、１０，０００，０００倍、またはそれを超えて、及びそれらの間のあらゆる全ての整数または部分整数に増殖され得る。一実施形態では、免疫細胞は、約２０倍～約５０倍の範囲で増大する。
培養後、細胞を別の培養装置に移す前に、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を培養装置内の細胞培地中で一定期間、または最適な継代のために細胞がコンフルエンシーまたは高い細胞密度に達するまで、インキュベートすることができる。培養装置は、細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養するために一般的に使用される任意の培養装置であり得る。特定の実施形態では、細胞を別の培養装置に移す前に、コンフルエンスのレベルは７０％以上である。特定の例示的実施形態では、コンフルエンスのレベルは９０％以上である。期間は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞培養に適した任意の時間であり得る。細胞培地は、免疫細胞の培養中に任意の時点で交換され得る。特定の例示的実施形態では、細胞培地は、約２～３日ごとに交換される。
次いで、免疫細胞を培養装置から収集し、それから免疫細胞を直ちに使用するか、または後の使用のための保存用に凍結保存することができる。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、得られた免疫細胞集団を凍結保存することを更に含む。刺激及び増大された免疫細胞が下流の改変に使用するためのものである実施形態では、新鮮なまたは凍結保存された免疫細胞は、免疫細胞への遺伝物質（例えば、免疫受容体、例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲをコードする核酸）の導入のために調製される。特定の実施形態では、凍結保存された免疫細胞は、遺伝物質の導入前に解凍される。特定の実施形態では、免疫受容体（例えば、ＴＣＲまたはＣＡＲ）をコードするＲＮＡをエレクトロポレーションするために、新鮮なまたは凍結保存された免疫細胞が調製される。
免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏ増大のための別の手順は、米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、この開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。免疫細胞を増大及び活性化するための方法は、米国特許第７，７５４，４８２号、同第８，７２２，４００号、及び同第９，５５５，１０５号にも見ることができ、これらの開示はその全体が本明細書に組み込まれる。そのような当該技術分野で認識されている増大及び活性化の方法は、本明細書に記載の方法の代替または追加であり得る。
培養工程は短くてもよく、例えば、２４時間未満、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３時間である。培養工程は、より長くてもよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日、または１４日超である。
特定の実施形態では、細胞は、数時間（約３時間）～約１４日間またはそれらの間の任意の時間単位の整数値にわたって培養され得る。免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）培養に適切な条件には、血清（例えば、ウシもしくはヒト胎児血清）、インスリン、ＩＦＮγ、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１５、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＧＦβ、及びＴＮＦ－α、または当業者に公知の細胞増殖のための任意の他の添加物を含む増殖及び生存に必要な因子を含有してもよい適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ－ｖｉｖｏ １５（Ｌｏｎｚａ））が含まれる。例えば、他の添加物としては、限定されないが、界面活性剤、プラスマネート、ならびに還元剤、例えば、Ｎ－アセチル－システイン及び２－メルカプトエタノールが挙げられ得る。培地には、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、及びビタミンが添加され、無血清であるか、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）またはホルモンの規定のセット、及び／または免疫細胞の増殖及び増大に十分な量のサイトカイン（複数可）が補充されているかのいずれかである、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ １０、及びＸ－Ｖｉｖｏ ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒが含まれ得る。抗生物質、例えば、ペニシリン及びストレプトマイシンは、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。
Ｅ．Ｔ細胞受容体
免疫受容体を含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えば、改変Ｔ細胞）のための組成物及び方法であって、免疫受容体が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば外因性ＴＣＲである組成物及び方法が、本明細書で提供される。したがって、いくつかの実施形態では、細胞は、特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子（例えば、アルファ／ベータＴＣＲをコードする核酸）を含有するように変更されている。ＴＣＲまたはその抗原結合部分には、腫瘍非依存性抗原などの標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはＴ細胞エピトープを認識するものが含まれる。
ＴＣＲは、抗原に応答して免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の活性化に関与する、６つの異なる膜結合鎖から構成されるジスルフィド結合ヘテロ二量体タンパク質である。アルファ／ベータＴＣＲ及びガンマ／デルタＴＣＲが存在する。アルファ／ベータＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む。ＴＣＲアルファ鎖とＴＣＲベータ鎖とを含むＴＣＲを発現するＴ細胞は、一般にアルファ／ベータＴ細胞と称される。ガンマ／デルタＴＣＲは、ＴＣＲガンマ鎖及びＴＣＲデルタ鎖を含む。ＴＣＲガンマ鎖とＴＣＲデルタ鎖とを含むＴＣＲを発現するＴ細胞は、一般にガンマ／デルタＴ細胞と称される。
ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖はそれぞれ、可変領域と定常領域という２つの細胞外ドメインで構成されている。ＴＣＲアルファ鎖可変領域及びＴＣＲベータ鎖可変領域は、標的抗原（例えば、腫瘍非依存性抗原）に対するＴＣＲの親和性のために必要とされる。各可変領域は、標的抗原への結合をもたらす３つの超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。ＴＣＲアルファ鎖の定常領域及びＴＣＲベータ鎖の定常領域は、細胞膜に近接している。ＴＣＲは、膜貫通領域及び短い細胞質尾部を更に含む。ＣＤ３分子は、ＴＣＲヘテロ二量体とともにアセンブリされる。ＣＤ３分子は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるチロシンリン酸化のための特徴的な配列モチーフを含む。近位シグナル伝達事象はＣＤ３分子を通じて媒介されるため、ＴＣＲ－ＣＤ３複合体相互作用は、細胞認識事象の媒介において重要な役割を果たす。
ＴＣＲの刺激は、抗原ペプチドをＴ細胞に提示しかつＴＣＲと相互作用して一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する、抗原提示細胞上の主要組織適合複合体分子（ＭＨＣ）によって引き起こされる。ＴＣＲのエンゲージメントは、正と負の両方のシグナル伝達カスケードを開始させ、細胞増殖、サイトカイン産生、及び／または活性化により誘導される細胞死をもたらす。
ＴＣＲは、野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ、及び／またはキメラＴＣＲであり得る。高親和性ＴＣＲは、野生型ＴＣＲと比較して標的抗原に対してより高い親和性を付与する、野生型ＴＣＲに対する改変の結果であり得る。高親和性ＴＣＲは、親和性成熟ＴＣＲであり得る。特定の実施形態では、野生型ＴＣＲと比較してより低い親和性のＴＣＲを得ることが望ましい場合がある。そのような低親和性ＴＣＲは、親和性調整ＴＣＲとも称される場合がある。ＴＣＲを改変するための方法及び／またはＴＣＲの親和性成熟／親和性調整のための方法は、当業者に公知である。ＴＣＲを操作する及び発現させるための手法には、それぞれのサブユニットを接続する天然ジスルフィド架橋を含むＴＣＲヘテロ二量体の生成が含まれるが、これらに限定されない（Ｇａｒｂｏｃｚｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｎａｔｕｒｅ ３８４（６６０５）：１３４－４１、Ｇａｒｂｏｃｚｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５７（１２）：５４０３－１０、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４），ＰＮＡＳ ＵＳＡ ９１：１１４０８－１１４１２、Ｄａｖｏｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９３），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（２１）：１５４５５－１５４６０、Ｇｏｌｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９７），Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．２０６：１６３－１６９、米国特許第６，０８０，８４０号）。
特定の実施形態では、外因性ＴＣＲは、完全ＴＣＲまたはその抗原結合部分もしくは抗原結合断片である。特定の実施形態では、ＴＣＲは、αβ型またはγδ型のＴＣＲを含む、インタクトまたは完全長ＴＣＲである。特定の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲより短いが、ＭＨＣ分子内で結合している特定のペプチドに結合する（例えば、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合する）抗原結合部分である。特定の実施形態では、ＴＣＲの抗原結合部分または断片は、完全長またはインタクトＴＣＲの構造ドメインの一部のみを含有する場合があるが、完全ＴＣＲが結合するペプチドエピトープ、例えばＭＨＣ－ペプチド複合体になおも結合することができる。特定の実施形態では、抗原結合部分は、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖及び可変β鎖を含有する。一般に、ＴＣＲの可変鎖は、ペプチド、ＭＨＣ、及び／またはＭＨＣ－ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含有する。
特定の実施形態では、ＴＣＲの可変ドメインは、一般に抗原認識能及び結合能ならびに抗原認識特異性及び結合特異性の主要寄与因子である超可変ループまたはＣＤＲを含有する。特定の実施形態では、ＴＣＲのＣＤＲまたはその組み合わせは、所与のＴＣＲ分子の抗原結合部位の全てまたは実質的に全てを形成する。ＴＣＲ鎖の可変領域内の様々なＣＤＲは、一般に、フレームワーク領域（ＦＲ）によって分離され、ＦＲは一般に、ＣＤＲと比較して呈されるＴＣＲ分子間の変動性が少ない（例えば、Ｊｏｒｅｓ ｅｔ ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９１３８，１９９０、Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．７：３７４５，１９８８を参照されたい。また、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：５５，２００３も参照されたい）。特定の実施形態では、ＣＤＲ３は、抗原結合または特異性を担う主要なＣＤＲであるか、あるいは抗原認識に関して、及び／またはペプチド－ＭＨＣ複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用に関して、所与のＴＣＲ可変領域上の３つのＣＤＲのうちで最も重要である。特定の実施形態では、アルファ鎖のＣＤＲ１は、特定の抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することができる。特定の実施形態では、ベータ鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用することができる。特定の実施形態では、ＣＤＲ２は、ＭＨＣ－ペプチド複合体のＭＨＣ部分との相互作用またはその認識に最も強く寄与するか、またはそれを担う主要ＣＤＲである。特定の実施形態では、β鎖の可変領域は、一般にスーパー抗原結合に関与しかつ抗原認識には関与しない、更なる超可変領域（ＣＤＲ４またはＨＶＲ４）を含有し得る（Ｋｏｔｂ（１９９５）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８：４１１－４２６）。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、可変アルファドメイン（Ｖα）及び／または可変ベータドメイン（Ｖβ）またはその抗原結合断片を含有する。特定の実施形態では、ＴＣＲのα鎖及び／またはβ鎖は、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、及び／または短い細胞質尾部もまた含有し得る（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，３ Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４：３３，１９９７を参照されたい）。特定の実施形態では、α鎖定常ドメインは、ＴＲＡＣ遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によってコードされるか、またはそのバリアントである。特定の実施形態では、β鎖定常ドメインは、ＴＲＢＣ１もしくはＴＲＢＣ２遺伝子（ＩＭＧＴ命名法）によってコードされるか、またはそのバリアントである。特定の実施形態では、定常ドメインは、細胞膜に隣接している。例えば、特定の実施形態では、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜近位定常ドメイン及び２つの膜遠位可変ドメインを含有し、これらの可変ドメインはそれぞれＣＤＲを含有する。
ＴＣＲの様々なドメインまたは領域を決定または同定することは、当業者のレベルの範囲内である。特定の実施形態では、ＴＣＲの残基は公知であるか、またはＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）付番システムに従って同定され得る（例えば、ｉｍｇｔ．ｏｒｇを参照されたい。また、Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２＆；５５－７７、及びＴｈｅ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｓｂｏｏｋ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｅｆｒａｎｃ ａｎｄ ＬｅＦｒａｎｃ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ ２００１も参照されたい）。ＩＭＧＴ付番システムは、当業者に公知の他の付番システムが存在するため、決して限定的であると解釈されるべきではなく、またＴＣＲの様々なドメインまたは領域の同定に利用可能な付番システムのいずれかを使用することは、当業者のレベルの範囲内である。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、ジスルフィド結合（複数可）などによって連結された２つの鎖α及びβ（または場合によりγ及びδ）のヘテロ二量体であり得る。特定の実施形態では、ＴＣＲの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによりＴＣＲの２つの鎖を連結する短い接続配列を含有し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、定常ドメインに２つのジスルフィド結合を含有するように、α鎖及びβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得る。特定の実施形態では、定常ドメイン及び可変ドメインのそれぞれが、システイン残基によって形成されるジスルフィド結合を含有する。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、Ｖα鎖、β鎖の配列などの公知のＴＣＲ配列（複数可）であって、実質的に完全長のコード配列が容易に入手可能である配列から作製されたものである。Ｖ鎖配列を含む完全長ＴＣＲ配列を細胞源から得るための方法は周知である。特定の実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、所与の細胞（複数可）内のＴＣＲをコードする核酸もしくは所与の細胞（複数可）から単離されたＴＣＲをコードする核酸のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、または公的に利用可能なＴＣＲのＤＮＡ配列の合成などによって、様々な供給源から得ることができる。特定の実施形態では、ＴＣＲは、生物学的供給源、例えば、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマなどの細胞、または他の公的に利用可能な供給源から得られる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで単離された細胞から得ることができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、培養Ｔ細胞ハイブリドーマまたはクローンから得ることができる。特定の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列の知識から合成的に作製することができる。特定の実施形態では、標的抗原（例えば、腫瘍非依存性抗原）に対する高親和性Ｔ細胞クローンが同定され、患者から単離され、細胞に導入される。特定の実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、またはＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１５：１６９－１８０及びＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７５：５７９９－５８０８を参照されたい。特定の実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲを単離するために、ファージディスプレイが使用される（例えば、Ｖａｒｅｌａ－Ｒｏｈｅｎａ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎａｔ Ｍｅｄ．１４：１３９０－１３９５及びＬｉ（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：３４９－３５４を参照されたい）。
特定の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、改変または操作されたものである。特定の実施形態では、特性が変化した（例えば、特定のＭＨＣ－ペプチド複合体に対する親和性がより高い）ＴＣＲを作製するために指向性進化法が使用される。特定の実施形態では、指向性進化は、酵母ディスプレイ（Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ，４，５５－６２、Ｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，９７，５３８７－９２）、ファージディスプレイ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２３，３４９－５４）、またはＴ細胞ディスプレイ（Ｃｈｅｒｖｉｎ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，３３９，１７５－８４）を含むがこれらに限定されないディスプレイ法により実現される。特定の実施形態では、ディスプレイアプローチは、公知の親ＴＣＲまたは参照ＴＣＲを操作または改変することを含む。例えば、場合によっては、ＣＤＲの１つ以上の残基が変異している変異誘発されたＴＣＲを生成するための鋳型として野生型ＴＣＲを使用することができ、特性が望ましく変化した（例えば、所望の標的抗原に対する親和性がより高い）変異体を選択する。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、導入されたジスルフィド結合（複数可）を含有し得る。特定の実施形態では、天然ジスルフィド結合は存在しない。特定の実施形態では、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する、（例えば、α鎖及びβ鎖の定常ドメイン内の）天然システインの１つ以上が、セリンまたはアラニンなどの別の残基で置換される。特定の実施形態では、導入されたジスルフィド結合は、（例えば、α鎖及びβ鎖の定常ドメイン内の）アルファ鎖及びベータ鎖上の非システイン残基をシステインに変異させることによって形成され得る。ＴＣＲの例示的な非天然ジスルフィド結合は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０００８３０号及び同第ＷＯ２００６／０３７９６０号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、システインは、α鎖の残基Ｔｈｒ４８及びβ鎖の残基Ｓｅｒ５７に、α鎖の残基Ｔｈｒ４５及びβ鎖の残基Ｓｅｒ７７に、α鎖の残基Ｔｙｒ１０及びβ鎖の残基Ｓｅｒ１７に、α鎖の残基Ｔｈｒ４５及びβ鎖の残基Ａｓｐ５９に、及び／またはα鎖の残基Ｓｅｒ１５及びβ鎖の残基Ｇｌｕ１５に導入され得る。特定の実施形態では、組換えＴＣＲにおける非天然システイン残基の存在（例えば、１つ以上の非天然ジスルフィド結合をもたらす）は、天然ＴＣＲ鎖を含有するミスマッチＴＣＲ対の過剰発現が導入された細胞における所望の組換えＴＣＲの産生に有利であり得る。
特定の実施形態では、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含有する。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、正に荷電している。特定の実施形態では、ＴＣＲ鎖は、細胞質尾部を含有する。特定の実施形態では、ＴＣＲの各鎖（例えば、アルファまたはベータ）は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端にある短い細胞質尾部を有し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、例えば細胞質尾部を介して、シグナル伝達の媒介に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合する。特定の実施形態では、この構造により、ＴＣＲがＣＤ３及びそのサブユニットなどの他の分子と会合することが可能になる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含有するＴＣＲは、細胞膜にタンパク質を固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合することができる。ＣＤ３シグナル伝達サブユニット（例えば、ＣＤ３ｙ、ＣＤ３５、ＣＤ３ｓ、及びＣＤ３ζ鎖）の細胞内尾部は、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能に関与する１つ以上の免疫受容体チロシン活性化モチーフまたはＩＴＡＭを含有する。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、完全長ＴＣＲである。特定の実施形態では、ＴＣＲは、抗原結合部分である。特定の実施形態では、ＴＣＲは、二量体ＴＣＲ（ｄＴＣＲ）である。特定の実施形態では、ＴＣＲは、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃ－ＴＣＲ）である。ＴＣＲは、細胞結合型または可溶型であり得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、細胞の表面上に発現される細胞結合型である。特定の実施形態では、ｄＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲα鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合された第１のポリペプチド、及びＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応する配列がＴＣＲβ鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のＮ末端に融合された第２のポリペプチドを含有し、第１及び第２のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって連結されている。特定の実施形態では、結合は、天然の二量体αβ ＴＣＲに存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。特定の実施形態では、鎖間ジスルフィド結合は、天然ＴＣＲには存在しない。例えば、特定の実施形態では、１つ以上のシステインが、ｄＴＣＲポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込まれ得る。特定の実施形態では、天然ジスルフィド結合と非天然ジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。特定の実施形態では、ＴＣＲは、膜に固定するための膜貫通配列を含有する。特定の実施形態では、ｄＴＣＲは、可変αドメインと、定常αドメインと、定常αドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフと、を含有するＴＣＲα鎖、及び可変βドメインと、定常βドメインと、定常βドメインのＣ末端に結合した第１の二量体化モチーフと、を含むＴＣＲβ鎖を含有し、第１及び第２の二量体化モチーフは、容易に相互作用して第１の二量体化モチーフのアミノ酸と第２の二量体化モチーフのアミノ酸との間に、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖とを一緒に連結する共有結合を形成する。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、ＭＨＣ－ペプチド複合体に結合することができるα鎖及びβ鎖を含有する単一アミノ酸鎖である、ｓｃＴＣＲである。典型的には、ｓｃＴＣＲは、当業者に公知の方法を使用して作製され得る。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／１３５９３号、同第ＷＯ９６／１８１０５号、同第ＷＯ９９／１８１２９号、同第ＷＯ０４／０３３６８５号、同第ＷＯ２００６／０３７９６０号、同第ＷＯ２０１１／０４４１８６号、米国特許第７，５６９，６６４号、ならびにＳｃｈｌｕｅｔｅｒ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６，８５９（１９９６）を参照されたい。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲ α鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲβ鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＴＣＲβ鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、及び第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、ＴＣＲβ鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第１のセグメント、ＴＣＲα鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のＮ末端に融合されたＴＣＲα鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第２のセグメント、及び第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合されたα鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびにβ鎖細胞外定常及び膜貫通配列のＮ末端に融合されたβ鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに任意選択で、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のＮ末端に融合されたＴＣＲβ鎖可変領域配列によって構成される第１のセグメント、ならびにα鎖細胞外定常ドメイン配列と膜貫通配列とを含む配列のＮ末端に融合されたα鎖可変領域配列によって構成される第２のセグメント、ならびに任意選択で、第１のセグメントのＣ末端を第２のセグメントのＮ末端に連結するリンカー配列を含有する。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲがＭＨＣ－ペプチド複合体に結合するためには、α鎖及びβ鎖が、その可変領域配列がそのような結合のために配向されるように、対合されなければならない。ｓｃＴＣＲにおけるαとβの対合を促進する様々な方法が当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、α鎖とβ鎖とを連結させて単一のポリペプチド鎖を形成するリンカー配列が含まれる。特定の実施形態では、リンカーは、α鎖のＣ末端とβ鎖のＮ末端との間、またはその逆の距離に及ぶのに十分な長さを有する必要があると同時に、リンカーの長さが標的ペプチド－ＭＨＣ複合体へのｓｃＴＣＲの結合を遮断するまたは低減させるほど長くないことも確実にする必要がある。特定の実施形態では、第１及び第２のＴＣＲセグメントを連結するｓｃＴＣＲのリンカーは、ＴＣＲ結合特異性を保持しながら単一のポリペプチド鎖を形成することができる、任意のリンカーであり得る。特定の実施形態では、リンカー配列は、例えば、式－Ｐ－ＡＡ－Ｐ－を有し得る（式中、Ｐはプロリンであり、ＡＡはアミノ酸がグリシン及びセリンであるアミノ酸配列を表す）。特定の実施形態では、第１及び第２のセグメントは、その可変領域配列がそのような結合のために配向されるように対合される。特定の実施形態では、リンカーは、１０～４５個または約１０～４５個のアミノ酸、例えば１０～３０個のアミノ酸または２６～４１個のアミノ酸残基、例えば２９、３０、３１または３２個のアミノ酸を含有し得る。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、単一アミノ酸鎖の残基間にジスルフィド結合を含有し、場合によっては、これは一本鎖分子のα領域とβ領域との間の対合の安定性を促進することができる（例えば、米国特許第７，５６９，６６４号を参照されたい）。特定の実施形態では、ｓｃＴＣＲは、一本鎖分子のα鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する、共有ジスルフィド結合を含有する。特定の実施形態では、ジスルフィド結合は、天然ｄＴＣＲに存在する天然ジスルフィド結合に対応する。特定の実施形態では、天然ＴＣＲ中のジスルフィド結合は存在しない。特定の実施形態では、ジスルフィド結合は、例えば、ｓｃＴＣＲポリペプチドの第１鎖領域及び第２鎖領域の定常領域細胞外配列に１つ以上のシステインを組み込むことによって導入された、非天然ジスルフィド結合である。例示的なシステイン変異には、上記のいずれかが含まれる。場合によっては、天然ジスルフィド結合と非天然ジスルフィド結合の両方が存在し得る。
特定の実施形態では、ｄＴＣＲまたはｓｃＴＣＲを含めた任意のＴＣＲは、Ｔ細胞の表面に活性ＴＣＲを生じさせるシグナル伝達ドメインに連結され得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、細胞の表面上に発現される。特定の実施形態では、ＴＣＲは、膜貫通配列に対応する配列を含有する。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣａまたはＣＰ膜貫通ドメインであり得る。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、非ＴＣＲ起源、例えば、ＣＤ３ｚ、ＣＤ２８、またはＢ７．１からの膜貫通領域に由来し得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、細胞質配列に対応する配列を含有する。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤ３ｚシグナル伝達ドメインを含有する。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ＣＤ３とＴＣＲ複合体を形成することができる。特定の実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、結合特性などの１つ以上の特性が変更された、組換えにより産生された天然タンパク質またはその変異型であり得る。特定の実施形態では、ＴＣＲは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種のうちの１つに由来し得る。
特定の実施形態では、ＴＣＲは、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含む。標的抗原は、標的細胞に関連する任意のタイプのタンパク質またはそのエピトープを含み得る。例えば、ＴＣＲは、標的細胞の特定の疾患状態を示す、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含み得る。特定の実施形態では、標的抗原は、ＭＨＣによってプロセシングされ、提示される。特定の実施形態では、ＴＣＲにとって特異的である抗原は、腫瘍細胞に含まれる抗原と一致する。
Ｆ．キメラ抗原受容体
免疫受容体を含む改変免疫細胞またはその前駆体（例えば、改変Ｔ細胞）のための組成物及び方法であって、免疫受容体がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である組成物及び方法が、本明細書で提供される。したがって、特定の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されている。本開示のＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。
抗原結合ドメインは、細胞内での発現のために、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメイン（両方とも本明細書の他所に記載されている）などのＣＡＲの別のドメインに作動可能に連結され得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインをコードする第１の核酸配列は、膜貫通ドメインをコードする第２の核酸に作動可能に連結され、更に、細胞内ドメインをコードする第３の核酸配列に作動可能に連結される。本明細書に記載の抗原結合ドメインは、本明細書に記載の膜貫通ドメインのいずれか、本明細書に記載の細胞内ドメインもしくは細胞質ドメインのいずれか、またはＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わされ得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載のヒンジドメインも含み得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、本明細書に記載のスペーサードメインも含み得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインのそれぞれがリンカーによって分離されている。
抗原結合ドメイン
ＣＡＲの抗原結合ドメインは、タンパク質、炭水化物、及び糖脂質を含む特定の標的抗原に結合するためのＣＡＲの細胞外領域である。特定の実施形態では、ＣＡＲは、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含む。標的抗原は、標的細胞に関連する任意のタイプのタンパク質またはそのエピトープを含み得る。例えば、ＣＡＲは、標的細胞の特定の疾患状態を示す、標的細胞上の標的抗原に対する親和性を含み得る。特定の実施形態では、標的抗原は、腫瘍非依存性抗原である。
標的とする所望の抗原に応じて、ＣＡＲは、所望の抗原標的に特異的である適切な抗原結合ドメインを含むように操作され得る。特定の実施形態では、そのような抗原は、例えば、本明細書に記載の腫瘍マーキング工程を介して、腫瘍細胞に導入され得る。任意の標的抗原に対する特異性を有するＣＡＲは、本明細書で提供される方法における使用に適している。特定の実施形態では、ＣＡＲにとって特異的である抗原は、腫瘍細胞に含まれる抗原と一致する。
特定の実施形態では、免疫受容体（例えば、ＣＡＲ）は、免疫細胞に標的抗原に対する特異性を提供する。特定の実施形態では、ＣＡＲが提供する標的抗原特異性は、免疫細胞にとって特異的である標的抗原と同じものである。そのような実施形態では、ＣＡＲ特異性は、免疫細胞の内因性特異性と一致すると言われる。特定の実施形態では、ＣＡＲが提供する標的抗原特異性は、免疫細胞にとって特異的である標的抗原と異なるものである。そのような実施形態では、ＣＡＲ特異性は、免疫細胞の内因性特異性と不一致であると言われる。したがって、免疫細胞の内因性特異性と不一致である特異性を有するＣＡＲは、多重特異性（例えば、二重特異性）免疫細胞を生じさせる。
本明細書に記載されるように、標的細胞上の特定の標的抗原に対して親和性を有するＣＡＲは、標的特異的結合ドメインを含み得る。特定の実施形態では、標的特異的結合ドメインは、マウス標的特異的結合ドメインであり、例えば、標的特異的結合ドメインは、マウス起源のものである。特定の実施形態では、標的特異的結合ドメインは、ヒト標的特異的結合ドメインであり、例えば、標的特異的結合ドメインは、ヒト起源のものである。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の標的細胞上の１つ以上の標的抗原に対して親和性を有し得る。特定の実施形態では、ＣＡＲは、標的細胞上の１つ以上の標的抗原に対して親和性を有し得る。そのような実施形態では、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲまたは多重特異性ＣＡＲである。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の標的抗原に対する親和性を付与する１つ以上の標的特異的結合ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、同じ標的抗原に対する親和性を付与する１つ以上の標的特異的結合ドメインを含む。例えば、同じ標的抗原に対して親和性を有する１つ以上の標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲは、標的抗原の別個のエピトープに結合することができる。複数の標的特異的結合ドメインがＣＡＲに存在する場合、結合ドメインはタンデムに配置することができ、かつリンカーペプチドによって分離することができる。例えば、２つの標的特異的結合ドメインを含むＣＡＲでは、結合ドメインは、オリゴリンカーもしくはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジ領域、または膜ヒンジ領域を介して、単一ポリペプチド鎖上で互いに共有結合により接続されている。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体、抗原結合断片（Ｆａｂ）、及び一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる群から選択される。抗原結合ドメインは、抗原に結合する任意のドメインを含むことができ、抗原結合ドメインには、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、非ヒト抗体、及びそれらの任意の断片が含まれ得るがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメイン部分は、哺乳動物抗体またはその断片を含む。抗原結合ドメインの選択は、標的細胞の表面上に存在する抗原のタイプ及び数に依存し得る。
本明細書で使用される場合、「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、共有結合してＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成した、免疫グロブリン（例えば、マウスまたはヒト）の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は、直接連結されるか、またはＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に接続する、もしくはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に接続する、ペプチドをコードするリンカーによって連結されるかのいずれかである。特定の実施形態では、抗原結合ドメイン（例えば、ＰＳＣＡ結合ドメイン）は、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＨ－リンカー－ＶＬの構成を有するｓｃＦｖを含む。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＶＬ－リンカー－ＶＨの構成を有するｓｃＦｖを含む。当業者は、本開示で使用するための適切な構成を選択することができるであろう。
リンカーは通常、柔軟性のためにグリシンリッチであると同時に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンリッチである。リンカーは、細胞外抗原結合ドメインの重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することができる。リンカーの非限定的な例は、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．８０（６）：１９１０－１９１７（２００８）及びＷＯ２０１４／０８７０１０に開示されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。グリシンセリン（ＧＳ）リンカーを含むがこれらに限定されない、様々なリンカー配列が当該技術分野で公知である。当業者は、本開示で使用するための適切なリンカー配列を選択することができるであろう。特定の実施形態では、本開示の抗原結合ドメインは、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、ＧＳリンカー配列によって分離されている。
定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持している。一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：５８７９－５８８３，１９８８）によって記載されているように、ＶＨ及びＶＬをコードする配列を含む核酸から発現され得る。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、及び同第４，９５６，７７８号、ならびに米国特許公開第２００５０１９６７５４号及び同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。阻害活性を有するアンタゴニストｓｃＦｖは説明されている（例えば、Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（Ｌａｒｃｈｍｔ）２００８ ２７（６）：４５５－５１、Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃａｃｈｅｘｉａ Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ Ｍｕｓｃｌｅ ２０１２ Ａｕｇｕｓｔ １２、Ｓｈｉｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９ １８３（４）：２２７７－８５、Ｇｉｏｍａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ ２００７ ９７（６）：９５５－６３、Ｆｉｆｅ ｅｔａ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｓｔ ２００６ １１６（８）：２２５２－６１、Ｂｒｏｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９７ ３（３）：１７３－８４、Ｍｏｏｓｍａｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９５ ２（１０：３１－４０）を参照されたい）。刺激活性を有するアゴニストｓｃＦｖは説明されている（例えば、Ｐｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｉ Ｃｈｅｍ ２００３ ２５２７８（３８）：３６７４０－７、Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９７ １５（８）：７６８－７１、Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９７ １７（５－６）：４２７－５５、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ２００３ １６３８（３）：２５７－６６を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ」は、抗原に結合するが一価であり、かつＦｃ部分を有さない抗体構造の断片を指す。例えば、酵素パパインによって消化された抗体は、Ｆａｂ断片２つ及びＦｃ断片を生じさせる（例えば、重（Ｈ）鎖定常領域；抗原に結合しないＦｃ領域）。
本明細書で使用される場合、「Ｆ（ａｂ’）２」は、全ＩｇＧ抗体のペプシン消化によって生じる抗体断片を指し、この断片は、２つの抗原結合（ａｂ’）（二価）領域を有し、各（ａｂ’）領域は、抗原に結合するための、Ｓ－Ｓ結合によって連結されたＨ鎖の一部及び軽（Ｌ）鎖という２つの別個のアミノ酸鎖を含んでおり、残りのＨ鎖部分は互いに連結されている。「Ｆ（ａｂ’）２」断片は、２つの個々のＦａｂ’断片に分割され得る。
特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、免疫細胞が投与され得る種と同じ種に由来し得る。例えば、ヒトでの使用の場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、ヒト抗体またはその断片を含み得る。特定の実施形態では、抗原結合ドメインは、免疫細胞が投与され得る種と異なる種に由来し得る。例えば、ヒトでの使用の場合、ＣＡＲの抗原結合ドメインは、マウス抗体またはその断片を含み得る。
膜貫通ドメイン
ＣＡＲは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをＣＡＲの細胞内ドメインに接続する膜貫通ドメインを含み得る。ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞（例えば、免疫細胞またはその前駆体）の形質膜に及び得る領域である。膜貫通ドメインは、細胞膜、例えば真核細胞膜への挿入のためのものである。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲの抗原結合ドメインと細胞内ドメインとの間に介在している。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＡＲ内のドメインの１つ以上と自然に会合している。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるため、そのようなドメインが同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合するのを回避するように選択されるか、１つ以上のアミノ酸置換によって改変され得る。
膜貫通ドメインは、天然供給源または合成供給源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、このドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質、例えばＩ型膜貫通タンパク質に由来し得る。供給源が合成である場合、膜貫通ドメインは、細胞膜へのＣＡＲの挿入を容易にする任意の人工配列、例えば人工疎水性配列であり得る。本開示で特に使用される膜貫通ドメインの例としては、限定されないが、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４（ＯＸ－４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及びＴＬＲ９に由来する（すなわち、少なくともその膜貫通領域（複数可）を含む）膜貫通ドメインが挙げられる。特定の実施形態では、膜貫通ドメインは合成であり得、その場合、膜貫通ドメインはロイシン及びバリンなどの疎水性残基を主に含む。通常、フェニルアラニン、トリプトファン、及びバリンのトリプレットは、合成膜貫通ドメインの各末端に見られる。
本明細書に記載の膜貫通ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の細胞内ドメインのいずれか、またはＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わされ得る。
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、ヒンジ領域を更に含む。特定の実施形態では、ＣＡＲは、ヒンジ領域も含み得る。ＣＡＲのヒンジ領域は、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインの間に位置する親水性領域である。特定の実施形態では、このドメインは、ＣＡＲの適切なタンパク質フォールディングを促進する。ヒンジ領域は、ＣＡＲの任意構成成分である。ヒンジ領域は、抗体のＦｃ断片、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工ヒンジ配列またはそれらの組み合わせから選択されるドメインを含み得る。ヒンジ領域の例としては、限定されないが、ＣＤ８ａヒンジ、３つのグリシン（Ｇｌｙ）ほどの小ささであり得るポリペプチドから作られた人工ヒンジ、ならびにＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４など）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインが挙げられる。
特定の実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに接続するヒンジ領域を含み、これは次に細胞内ドメインと接続する。ヒンジ領域は、任意選択で、抗原結合ドメインが標的細胞上の標的抗原を認識しそれに結合するのを支援することができる（例えば、Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．（２０１５）３（２）：１２５－１３５を参照されたい）。特定の実施形態では、ヒンジ領域は柔軟なドメインであり、したがって、抗原結合ドメインが、腫瘍細胞などの細胞上の標的抗原の特定の構造及び密度を最適に認識する構造を有することが可能になる（Ｈｕｄｅｃｅｋ ｅｔ ａｌ．，上掲）。ヒンジ領域の柔軟性により、ヒンジ領域は多くの異なる立体構造をとることが可能になる。
特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。特定の実施形態では、ヒンジ領域は、受容体に由来するヒンジ領域ポリペプチドである（例えば、ＣＤ８由来のヒンジ領域）。
ヒンジ領域は、約４アミノ酸（ａａ）～約５０アミノ酸（ａａ）、例えば、約４ａａ～約１０ａａ、約１０ａａ～約１５ａａ、約１５ａａ～約２０ａａ、約２０ａａ～約２５ａａ、約２５ａａ～約３０ａａ、約３０ａａ～約４０ａａ、または約４０ａａ～約５０ａａの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、５ａａ超、１０ａａ超、１５ａａ超、２０ａａ超、２５ａａ超、３０ａａ超、３５ａａ超、４０ａａ超、４５ａａ超、５０ａａ超、５５ａａ超、またはそれを超える長さを有し得る。
好適なヒンジ領域は、容易に選択することができ、多くの好適な長さのいずれか、例えば、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）～２０アミノ酸、２アミノ酸～１５アミノ酸、３アミノ酸～１２アミノ酸（４アミノ酸～１０アミノ酸、５アミノ酸～９アミノ酸、６アミノ酸～８アミノ酸、または７アミノ酸～８アミノ酸を含む）のものであり得、１、２、３、４、５、６、または７アミノ酸であり得る。好適なヒンジ領域は、２０アミノ酸超の長さ（例えば、３０、４０、５０、６０またはそれを超えるアミノ酸）を有し得る。
例えば、ヒンジ領域には、グリシンポリマー、グリシン－セリンポリマー、グリシン－アラニンポリマー、アラニン－セリンポリマー、及び当該技術分野で公知の他の柔軟性リンカーが含まれる。グリシン及びグリシン－セリンポリマーを使用することができ、Ｇｌｙ及びＳｅｒは両方とも比較的構造不定であるため、構成成分間の中間テザーとして機能し得る。グリシンポリマーを使用することができ、グリシンは、アラニンよりも相当に多くのｐｈｉ－ｐｓｉ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない（例えば、Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）２：７３－１４２を参照されたい）。
特定の実施形態では、ヒンジ領域は、免疫グロブリン重鎖ヒンジ領域である。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７（１）：１６２－１６６、及びＨｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９８６）１４（４）：１７７９－１７８９を参照されたい。
ヒンジ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列を含み得る。一実施形態では、ヒンジ領域は、野生型（天然）ヒンジ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸置換及び／または挿入及び／または欠失を含み得る。例えば、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０１２）２８７：５８９１－５８９７を参照されたい。
細胞内シグナル伝達ドメイン
ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインも含む。「細胞内シグナル伝達ドメイン」及び「細胞内ドメイン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する細胞（例えば、免疫細胞）のエフェクター機能のうちの少なくとも１つの活性化を担っている。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞（例えば、免疫細胞）にその専門とする機能を実施するように、例えば、標的細胞を損傷させる及び／または破壊するように指示する。
本開示で使用するための細胞内ドメインの例としては、表面受容体の細胞質部分、共刺激分子、及びＴ細胞内でシグナル伝達を開始するために協調して作用する任意の分子、ならびにこれらの要素の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能的能力を有する任意の合成配列が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、限定されないが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのいずれか、例えば、η鎖、ＦｃｓＲＩγ及びβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖など、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ ７０など）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎなど）、ならびにＴ細胞の形質導入に関与する他の分子、例えば、ＣＤ２、ＣＤ５、及びＣＤ２８が挙げられる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータ鎖、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を保有する細胞質受容体、及びそれらの組み合わせであり得る。
特定の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、１つ以上の共刺激分子の任意の部分、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４－１ＢＢ、ＰＤ－１に由来する少なくとも１つのシグナル伝達ドメイン、その任意の誘導体またはバリアント、同じ機能的能力を有するその任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
細胞内ドメインの他の例としては、ＴＣＲ、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ８６、共通ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲＩｂ）、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩＩａ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ９、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、ＫＩＲファミリータンパク質、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１２７、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌｉｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｔｏｌｌ様受容体１（ＴＬＲ１）、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、本明細書に記載の他の共刺激分子、その任意の誘導体、バリアント、または断片、同じ機能的能力を有する共刺激分子の任意の合成配列、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、１つ以上の分子または受容体に由来する断片またはドメインが挙げられる。
細胞内ドメインの追加の例としては、限定されないが、ＣＤ３、Ｂ７ファミリー共刺激、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体を含む第１、第２、及び第３世代のＴ細胞シグナル伝達タンパク質を含むがこれらに限定されない、いくつかのタイプの様々な他の免疫シグナル伝達受容体の細胞内シグナル伝達ドメインが挙げられる（例えば、Ｐａｒｋ ａｎｄ Ｂｒｅｎｔｊｅｎｓ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．（２０１５）３３（６）：６５１－６５３を参照されたい）。更に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞によって使用されるシグナル伝達ドメイン（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ａｎｄ Ｋａｕｆｍａｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）６：１９５を参照されたい）、例えば、ＮＫｐ３０のシグナル伝達ドメイン（Ｂ７－Ｈ６）（例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）１８９（５）：２２９０－２２９９を参照されたい）、及びＤＡＰ １２（例えば、Ｔｏｐｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９４（７）：３２０１－３２１２を参照されたい）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、及びＣＤ３ｚを含み得る。
本開示の主題のＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインには、ＣＡＲの活性化（すなわち、抗原及び二量体化剤による活性化）に応答して、明確かつ検出可能なシグナル（例えば、細胞による１つ以上のサイトカインの産生増加；標的遺伝子の転写における変化；タンパク質の活性における変化；細胞挙動における変化、例えば細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達応答のモジュレーションなど）をもたらす任意の所望のシグナル伝達ドメインが含まれる。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、下記のように、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つなど）のＩＴＡＭモチーフを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型のシグナル伝達鎖を含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合ＣＡＲに共有結合されておらず、代わりに細胞質中に拡散している。
本開示の主題のＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインには、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有細胞内シグナル伝達ポリペプチドが含まれる。特定の実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは、細胞内シグナル伝達ドメイン中で２回反復され、ＩＴＡＭモチーフの第１及び第２のものは、互いに６～８アミノ酸離れている。特定の実施形態では、主題のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有するヒト免疫グロブリン受容体のシグナル伝達ドメインを含み、それらは例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃＲＬ５であるが、これらに限定されない（例えば、Ｇｉｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１４）５：２５４を参照されたい）。
好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含有するポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフ含有部分であり得る。例えば、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質に由来するＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであり得る。したがって、好適な細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含有する必要はない。好適なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例としては、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）、ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）、ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）、ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）、及びＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２；ＫＡＲ関連タンパク質；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質（ｋｉｌｌｅｒ ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、キラー活性化受容体関連タンパク質（ｋｉｌｌｅｒ－ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）などとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ；Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖；Ｆｃ受容体ガンマ鎖；ｆｃ－イプシロンＲＩ－ガンマ；ｆｃＲγ；ｆｃｅＲＩγ；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ；免疫グロブリンＥ受容体高親和性ガンマ鎖などとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３－ＤＥＬＴＡ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、デルタサブユニット；ＣＤ３デルタ；ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）；ＯＫＴ３、デルタ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖などとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ－４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅなどとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３－ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）などとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３－ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺなどとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）；ＭＢ－１膜糖タンパク質；ｉｇ－アルファ；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面ＩｇＭ関連タンパク質などとしても知られる）に由来する。特定の実施形態では、本開示のＦＮ３ ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８型シグナル伝達鎖を含む。特定の実施形態では、本開示のＦＮ３ ＣＡＲにおける使用に適した細胞内シグナル伝達ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、ＣＡＲにおける細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ゼータの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。
通常、細胞内シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合、鎖全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が使用される限りにおいて、そのようなトランケートされた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに使用され得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内シグナル伝達ドメインの任意のトランケートされた部分を含む。
本明細書に記載の細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書に記載の抗原結合ドメインのいずれか、本明細書に記載の膜貫通ドメインのいずれか、またはＣＡＲに含まれ得る本明細書に記載の他のドメインのいずれかと組み合わされ得る。
Ｇ．二重特異性抗体
また、免疫細胞をがん、例えば腫瘍に指向させることができる二重特異性抗体も、本明細書で提供される。本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原に結合することができる二重特異性組換えタンパク質を指す。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原に結合することができる。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、同じ抗原の２つの異なるエピトープに結合することができる。したがって、二重特異性抗体は、第１の標的に対する結合特異性を付与する第１の抗原結合ドメイン、及び第２の標的に対する結合特異性を付与する第２の抗原結合ドメインを含む。二重特異性抗体は、２つの標的に同時に結合することができる。
二重特異性抗体がエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の標的に結合することができる抗原結合ドメインを含む場合、二重特異性抗体は、「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」と称される場合がある。ＢｉＴＥは、Ｔ細胞上の標的に特異的な第１の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）と、腫瘍細胞上の標的（例えば、腫瘍非依存性抗原）に特異的な第２のｓｃＦｖとを含む、二重特異性抗体のクラスである。ＢｉＴＥの例としては、Ｔ細胞（ＣＤ３受容体を介して）と表面にＣＤ１９受容体を有するＢ細胞とに同時に結合するブリナツモマブ、ならびにＣＤ３と、卵巣癌、前立腺癌、膵癌、及び肺癌を含む様々ながんによって発現されるＥｐＣＡＭとに同時に結合するソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）が挙げられる。ＢｉＴＥは、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０４０２２０号、同第ＷＯ２００８／１１９５６７号、同第ＷＯ２０１０／０３７８３８号、同第ＷＯ２０１３／０２６８３７号、同第ＷＯ２０１３／０２６８３３号、及び同第ＷＯ２０１７／１３４１４０号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
免疫細胞をがんに指向させることができる二重特異性抗体は、免疫細胞上の任意の抗原に対する特異性を有する抗原結合ドメインを含む。好適な抗原は、Ｔ細胞の表面に見られる抗原であり、限定されないが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体（例えば、ＣＤ３）、ＣＤ２８、及びＣＤ２の標的が含まれる。特定のＴ細胞サブセットを、そのＴ細胞サブセットをがんに指向させるために二重特異性抗体の標的とすることもできる。例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞をＣＤ４分子を介して標的とすることができ、ＣＤ８＋ Ｔ細胞をＣＤ８分子を介して標的とすることができ、制御性Ｔ細胞をＣＤ２５分子を介して標的とすることができる。他の好適な抗原を標的として、Ｔ細胞の代替となる免疫細胞サブセットをがんに指向させることができる。例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞をがんに指向させることができる二重特異性抗体は、ＮＫ細胞上の抗原、例えばＣＤ１６（例えばＣＤ１６Ａ）に対する特異性を有する抗原結合ドメインを含む。そのようなＮＫ細胞を標的とする二重特異性抗体は、ＮＫ細胞エンゲージャーとして当該技術分野で公知である。インバリアントＮＫ（ｉＮＫ）Ｔ細胞もまた、ｉＮＫ Ｔ細胞を（例えばＣＤ１ｄの細胞外ドメインを使用して）がんに指向させるために、二重特異性抗体の標的とすることができる。別の例では、ガンマ－デルタ（γδ）Ｔ細胞は、γδ Ｔ細胞を（例えばγδ ＴＣＲ及びＴＣＲ優性バリアントＶγ９Ｖδ２を介して）がんに指向させるために、二重特異性抗体の標的とすることができる。例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１９０２６３９０８Ａ１号（この開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
本開示で使用するための二重特異性抗体は、免疫細胞をがん細胞に指向させるように機能し得る。したがって、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞）に対する特異性を有する抗原結合ドメインに加えて、二重特異性抗体は、がん細胞に対する特異性を有する抗原結合ドメインを含む。特定の実施形態では、がん細胞は、腫瘍非依存性抗原を含む。したがって、本開示で使用するための二重特異性抗体は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞）に対する特異性を有する第１の抗原結合ドメイン、及び腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する第２の抗原結合ドメインを含む。
特定の実施形態では、二重特異性抗体は、細菌起源の腫瘍非依存性抗原に結合することができる。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ジフテリア毒素に結合することができる。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ジフテリア毒素の非毒性バリアントに結合することができる。例えば、特定の実施形態では、好適な腫瘍非依存性抗原は、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、ウイルス起源の好適な腫瘍非依存性抗原に結合することができる。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチド、例えば、ＣＭＶ内部マトリックスタンパク質ｐｐ６５由来のペプチドに結合することができる。
Ｈ．処置方法
養子細胞療法は、がんなどの疾患と闘うために免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を対象に投与する免疫療法である。一般に、免疫細胞を、対象自身の末梢血または腫瘍組織から得て、本開示の方法に従ってｅｘ ｖｉｖｏで刺激及び増大させ、次いで対象に投与して戻すことができる（すなわち、自家適応細胞療法）。他の実施形態では、免疫細胞を、第１の対象から（例えば、第１の対象の末梢血または腫瘍組織から）得て、本開示の方法に従ってｅｘ ｖｉｖｏで刺激及び増大させ、次いで第２の対象に投与することができる（すなわち、同種適応細胞療法）。
様々な実施形態では、免疫細胞は、本明細書の他所に記載されているように、腫瘍非依存性抗原に特異的な免疫受容体を含むように改変される。免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原に特異的な免疫受容体を含むように、ｅｘ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで改変され得る。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、免疫受容体（例えば、ＴＣＲ及び／またはＣＡＲ）を発現するように、ｅｘ ｖｉｖｏで更に改変（例えば、遺伝子改変）され得る。免疫細胞を、例えば免疫受容体を含むように改変する様々な方法が当業者に公知である。特定の実施形態では、免疫細胞は、腫瘍非依存性抗原に特異的な免疫受容体を含むようにｉｎ ｖｉｖｏで改変される。特定の免疫細胞サブセットに対する免疫受容体をコードする核酸のｉｎ ｖｉｖｏ媒介送達方法は説明されており、例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２０１２）１２０：４３３４－４３４２、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９５（５）：２４９３－２５０１、及びＡｇａｒｗａｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ（２０２０）２８（８）：１７８３－１７９４（これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の実施形態では、免疫受容体を含むように免疫細胞を改変することは、トランスポゾンまたはウイルスベクターによって媒介される。トランスポゾンベースの方法は、例えば、米国特許第１０，５１３，６８６号、米国特許公開第ＵＳ２０１８０００２３９７Ａ１号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ２０２００１４３６６Ａ１号、同第ＷＯ２０１９０４６８１５Ａ１号、及び同第ＷＯ２０１９１７３６３６Ａ１号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでのトランスポゾンベースの改変について記載されている。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１７）１２（８）：８１３－８２０を参照されたい。
「養子細胞療法」という用語は、遺伝子改変を伴わないＴ細胞療法、及び例えば免疫受容体を発現させるための遺伝子改変を伴うＴ細胞療法の両方を指す。
したがって、特定の実施形態では、疾患または障害の処置を必要とする対象において疾患または障害を処置するための方法であって、本開示の改変免疫細胞を含む組成物を投与することを含み、改変免疫細胞が免疫受容体を含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、免疫受容体は、本明細書の他所に記載されているＴＣＲ及び／またはＣＡＲである。特定の実施形態では、免疫受容体は、本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原に対する特異性を含む。
本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の使用を採用するために、本開示の態様は、そのような腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を、がん、例えば腫瘍に指向させることに関する。腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を腫瘍に指向させることは、本明細書に記載の腫瘍マーキング工程によって実現される。
本開示はまた、腫瘍非依存性抗原の使用に基づいて、免疫細胞を標的細胞、例えば標的がん細胞へと動員するという概念に基づいている。特定の実施形態では、標的がん細胞への免疫細胞の動員は、本明細書に記載の二重特異性抗体を使用して実現される。例えば、免疫細胞に対する特異性を有する第１の抗原結合ドメインと標的細胞に対する特異性を有する第２の抗原結合ドメインとを含む二重特異性抗体は、免疫細胞及び標的細胞に同時に結合して、それらを互いに近接させる。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、例えば、Ｔ細胞、Ｔ細胞サブセット（例えば、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞）、ＮＫ細胞、ｉＮＫ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞）を標的細胞へと動員することができる。腫瘍非依存性抗原の使用に基づいて、免疫細胞に対する特異性を有する第１の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体は、腫瘍非依存性抗原（例えば、ＣＭＶ ｐｐ６５ペプチドまたはＣＲＭ１９７）に対する特異性を有する第２の抗原結合ドメインを含む。
したがって、特定の実施形態では、疾患または障害の処置を必要とする対象において疾患または障害を処置するための方法であって、本開示の二重特異性抗体を含む組成物を投与することを含み、二重特異性抗体が、免疫細胞に対する特異性を有する第１の抗原結合ドメイン、及び腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有する第２の抗原結合ドメインを含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原は、標的細胞、例えばがん細胞に含まれる。したがって、二重特異性抗体は、腫瘍非依存性抗原の結合を介して免疫細胞を標的細胞へと動員することができる。
本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体の使用を採用するために、本開示の態様は、がん細胞を、腫瘍非依存性抗原を（例えば、その表面に）含むように改変することを指向することに関する。腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を使用して免疫細胞を標的細胞、例えば腫瘍細胞に指向させることは、本明細書に記載の腫瘍マーキング工程によって実現される。
特定の実施形態では、疾患または障害は、がんである。特定の実施形態では、がんは、腫瘍である。特定の実施形態では、がんは、液性腫瘍または固形腫瘍である。
特定の実施形態では、本明細書で提供される腫瘍を処置するための方法は、腫瘍マーキング工程を更に含む。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、改変免疫細胞を腫瘍部位に指向させる（例えば、動員する）ために、腫瘍非依存性抗原で腫瘍をマーキングする役割を果たす。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原を含む組成物を腫瘍部位に投与することを含む。特定の実施形態では、腫瘍部位への組成物の投与は、腫瘍内または腫瘍周囲への投与を含む。特定の実施形態では、腫瘍部位での組成物の投与は、腫瘍内または腫瘍近位への投与を含む。腫瘍をマーキングする様々な方法が当業者に公知である。腫瘍内送達に加えて、腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療ベクターなどの腫瘍特異的担体を介して腫瘍非依存性抗原を腫瘍に送達することができ、これらは、遺伝子配列を腫瘍に送達するために広く開発されている。そのような担体を使用することにより、静脈内投与または腹腔内投与によるものなどの腫瘍内投与に加えて、複数の投与経路が可能になり、続いて腫瘍非依存性抗原または腫瘍非依存性抗原をコードする核酸を腫瘍内に送達することができる。腫瘍マーキングの方法は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５３８９８号及び同第ＰＣＴ／ＮＬ１９／５０４５１号にも記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
腫瘍非依存性抗原で腫瘍をマーキングする工程は、対象への腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入前、導入後、または導入と同時に実施することができることが、当該技術分野において理解されるであろう。腫瘍マーキング工程の目的が、腫瘍を、免疫細胞が（例えば、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を介して、または腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体の使用を介して）指向し、攻撃する標的とすることであるため、当業者は、本開示を効果的なものとするために（例えば、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞が腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍を指向することを可能にするために、または腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体が免疫細胞を腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍へと動員するために）、腫瘍マーキング工程及び腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入の適切なタイミングを見出すことができるであろう。
本明細書で使用される場合、「腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入」は、本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を作製するｅｘ ｖｉｖｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方の方法を指す。例えば、特定の実施形態では、対象への腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入は、（例えば、腫瘍非依存性抗原特異的免疫受容体を含むように免疫細胞を改変することにより）ｅｘ ｖｉｖｏで作製された腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の対象への投与を含む。当業者は、ｅｘ ｖｉｖｏ操作のための免疫細胞の供給源が、同じ対象（すなわち、自家免疫細胞）または異なる対象（すなわち、同種免疫細胞）に由来し得ることを理解するであろう。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入は、例えば、腫瘍非依存性抗原特異的免疫受容体を含むように免疫細胞を形質導入することができる薬剤を含む組成物を対象に投与することによる、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの作製を含む。
特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入前に実施される。したがって、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、以下の工程：（１）本明細書に記載の方法のいずれかによって生成された腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を対象に導入すること、及び（２）対象の腫瘍部位に組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、組成物が腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む工程、を順次含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入後に実施される。したがって、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、以下の工程：（１）対象の腫瘍部位に組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、組成物が腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む工程、及び（２）本明細書に記載の方法のいずれかによって生成された腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を対象に導入すること、を順次含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程及び腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入は、実質的に同時に実施される。
特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体の導入前に実施される。したがって、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、以下の工程：（１）本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を対象に導入すること、及び（２）対象の腫瘍部位に組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、組成物が腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む工程、を順次含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程は、腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体の導入後に実施される。したがって、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、以下の工程：（１）対象の腫瘍部位に組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、組成物が腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む工程、及び（２）本明細書に記載の腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を対象に導入すること、を順次含む方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍マーキング工程及び腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体の導入は、実質的に同時に実施される。
当業者（例えば、臨床医）は、対象が本明細書に記載の処置方法を受けるのに好適であるか否かを決定することができる。好適な対象には、腫瘍、例えば固形腫瘍を有する対象が含まれる。特定の実施形態では、対象は腫瘍非依存性抗原にナイーブである、すなわち、対象は以前に腫瘍非依存性抗原に遭遇したことがない。そのような実施形態では、対象は、腫瘍マーキング工程及び腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入を含む、本明細書に記載の処置方法を受ける。
特定の実施形態では、対象は、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する。例えば、これまでにＣＭＶに感染したことのある対象では、ＣＭＶまたはそのペプチドもしくは核酸に対する特異性を有するメモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞が発生している。そのような対象において、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫は、腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍に対する標的免疫応答（例えば、腫瘍殺傷応答）を開始するのに十分であり得る。したがって、腫瘍の処置を必要とする対象において腫瘍を処置するための方法であって、対象が腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を含んでおり、対象の腫瘍部位に第１の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程を含み、第１の組成物が腫瘍非依存性抗原を含む、方法が、本明細書で提供される。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する対象において、既存免疫は、腫瘍非依存性抗原でマーキングされた腫瘍に対する標的免疫応答（例えば、腫瘍殺傷応答）を開始するには不十分であり得る。そのような実施形態では、対象は、腫瘍マーキング工程及び腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入を含む、本明細書に記載の処置方法を受ける。あるいは、対象は、腫瘍非依存性抗原に対する対象の既存免疫を刺激することができる薬剤を投与され得る。例えば、対象は、対象の既存免疫を腫瘍非依存性抗原（例えば、腫瘍細胞に含まれる）に指向させることができる腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を投与され得る。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、細胞表面腫瘍非依存性抗原またはその断片を含む樹状細胞表現型を有する改変細胞と免疫細胞とを接触させることによって作製される。腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞、例えば白血病起源の改変細胞（例えば、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）を作製するために使用することができる改変細胞の例は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０５３８９８号及び同第ＰＣＴ／ＮＬ１９／５０４５１号、ならびに米国特許出願第６３／００１，１９３号、同第６３／００１，１８９号、同第６３／１１０，００２号、及び同第６３／１１０，００３号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
図５Ａは、ＣＡＲ Ｔ製造プロセスの２つの異なる工程でＤＣＯｎｅ ｍＤＣを添加して、１）Ｔ細胞（メモリー表現型）の濃縮及び活性化状態を改善すること、２）養子Ｔ細胞プール中で、（内因性または外因性抗原に基づいて）追加の腫瘍標的特異性を誘導すること、及び／または３）ＣＡＲ発現Ｔ細胞の増大を改善すること（表現型、生存率、及びＣＡＲ発現レベル）が可能であることを示す。
図５Ｂは、本開示のある実施形態を示す。示されるように、特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）と共培養される。免疫細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内に含まれ得る。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）は、Ｔ細胞と共培養される。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞と免疫細胞との共培養は、免疫細胞増殖（例えば、Ｔ細胞増殖）を刺激する。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞とＴ細胞との共培養は、Ｔ細胞増殖を刺激する。
白血病起源の抗原負荷改変細胞と免疫細胞との共培養により、特性が改善された免疫細胞が得られる。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞とＴ細胞との共培養により、特性が改善されたＴ細胞が得られる。例えば、特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）とＴ細胞との共培養により、ＣＤ４＋ Ｔ細胞対ＣＤ８＋ Ｔ細胞の比率が増加する。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）と免疫細胞との共培養により、免疫細胞が活性化される。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞とＴ細胞との共培養により、Ｔ細胞が活性化される。白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）の使用により、免疫細胞と共培養したときに免疫細胞の特質が更に改善される。例えば、特定の実施形態では、免疫細胞と白血病起源の抗原負荷改変細胞との共培養により、抗原特異的免疫細胞が濃縮される。特定の実施形態では、Ｔ細胞と白血病起源の抗原負荷改変細胞との共培養により、抗原特異的Ｔ細胞が濃縮される。
白血病起源の抗原負荷改変細胞が任意の抗原を含み得ることは、当業者は容易に理解するであろう。例えば、本明細書に記載の方法で使用するための白血病起源の抗原負荷改変細胞は、限定されないが、腫瘍非依存性抗原、一般的なウイルス抗原（例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原もしくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原）、または他のリコール抗原（例えば、ＣＲＭ１９７）を含み得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための白血病起源の抗原負荷改変細胞は、ＥＢＶ由来抗原を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための白血病起源の抗原負荷改変細胞は、ＣＭＶ由来抗原を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための白血病起源の抗原負荷改変細胞は、ＣＲＭ１９７を含む。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するための白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）は、リコール抗原を含む。リコール抗原は、宿主対象がこれまでに遭遇したことがある抗原であって、既存のメモリーリンパ球（例えば、メモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞）が宿主に存在するものである。特定の実施形態では、リコール抗原は、既存のメモリーリンパ球が宿主に存在する腫瘍非依存性抗原を指す。リコール抗原に対する既存の免疫応答は、以前の感染またはワクチン接種の結果として存在し得る。特定の実施形態では、腫瘍非依存性リコール抗原に対する既存免疫は、以前の感染、例えばウイルス感染の結果として発生する。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、健康な人に問題を引き起こすことは稀であるため、通常、対象は気づかぬうちに罹る。以前にＣＭＶに感染したことのある対象は、ＣＭＶに対する強力な免疫応答を発生し、その結果、免疫系がＣＭＶに対して訓練される。したがって、ＣＭＶに由来する腫瘍非依存性抗原は、以前にＣＭＶに感染した対象を処置するための方法で使用される場合、リコール抗原であり得る。特定の実施形態では、腫瘍非依存性リコール抗原に対する既存免疫は、ワクチン接種の結果として発生する。例えば、ＣＲＭ１９７は、結合型ワクチンにおける免疫原性アジュバントとして広く使用されている。ＣＲＭ１９７を免疫原性アジュバントとして使用したワクチン接種を以前受けたことがある対象は、ＣＲＭ１９７に対する免疫応答を発生し、その結果、免疫系がＣＲＭ１９７に対して訓練される。更に、ＣＲＭ１９７自体を、例えばジフテリアに対するワクチンとして使用したワクチン接種を以前受けたことがある対象は、ＣＲＭ１９７に対する免疫応答を発生し、その結果、免疫系がＣＲＭ１９７に対して訓練される。他のリコール抗原は当業者に公知であり、それらは例えば、限定されないが、ワクチン技術分野で公知である担体タンパク質、免疫原性アジュバント、及び免疫原、ならびに遭遇するウイルス、細菌、及び真菌感染である。本明細書で使用される場合、「担体」という用語は、免疫原性アジュバント及び／または担体ビヒクルを指す。例えば、結合型ワクチンの文脈において、担体は、抗原が共有結合した担体タンパク質を指す。この文脈において、担体は、抗原に対する免疫応答を強化及び／またはモジュレートするように作用する免疫原性アジュバントである。担体は、抗原を送達するビヒクルを指す場合もある。例えば、本明細書に記載の特定の実施形態では、抗原は、腫瘍溶解性ウイルスまたは遺伝子治療ベクターなどの腫瘍特異的担体を介して送達される。
特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）は、免疫細胞の特異性を抗原へと再指向させる。特定の実施形態では、免疫細胞の特異性の再指向は、抗原に指向された内因性ＴＣＲを有する免疫細胞の産生を誘導するか、またはその免疫細胞を濃縮することによって実現される。したがって、特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）と免疫細胞との共培養により、抗原に対する特異性を有する内因性ＴＣＲを含む免疫細胞が得られる。
特定の実施形態では、免疫受容体（例えば、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲ）を、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）と共培養された免疫細胞に導入することにより、改善された改変免疫細胞（例えば、改善されたＣＡＲ－Ｔまたは改善されたＴＣＲ－Ｔ細胞）が得られる。そのような改善された改変免疫細胞は、白血病起源の抗原負荷改変細胞に応答して産生された内因性ＴＣＲと免疫細胞に導入された免疫受容体の両方を含み得る。そのような場合、改善された改変免疫細胞は、１つ以上の抗原に対する特異性を有し得る。例えば、改善された改変免疫細胞は、内因性ＴＣＲ（白血病起源の抗原負荷改変細胞に応答して産生されたもの）によって指向される第１の特異性と、免疫受容体によって指向される第２の特異性（免疫細胞に導入されたもの、例えばＣＡＲ及び／またはＴＣＲ）とを有し得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される処置方法において白血病起源の抗原負荷改変細胞を使用することにより、リコール抗原特異的メモリーＴ細胞が得られ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される処置方法において白血病起源の抗原負荷改変細胞を使用することにより、リコール抗原特異的メモリーＢ細胞が得られ得る。特定の実施形態では、本明細書に開示される処置方法において白血病起源の抗原負荷改変細胞を使用することにより、ウイルス特異的メモリーＴ細胞が得られ得る。腫瘍免疫療法のためのウイルス特異的メモリーＴ細胞の使用は説明されており、例えば、Ｒｏｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１９）１０：５６７を参照されたい。特定の実施形態では、本明細書に開示される処置方法において白血病起源の抗原負荷改変細胞を使用することにより、ウイルス特異的メモリーＢ細胞が得られ得る。
そのような実施形態は、有効性が改善された養子細胞療法を提供する。特定の実施形態では、改善された改変免疫細胞の有効性を増進させるために、ワクチン接種（例えば、ＤＣＯｎｅベースのワクチン、例えば、ＤＣＰ－００１再発ワクチン（ｒｅｌａｐｓｅ ｖａｃｃｉｎｅ））を、本明細書に記載の改善された養子細胞療法を受けている対象に施すことができる。改善された改変免疫細胞の有効性の増進は、少なくとも以下の方法で実現することができる：１）内因性ＴＣＲが指向する抗原に一致する免疫原を提供するワクチン接種が、内因性ＴＣＲを介して、改善された改変免疫細胞を刺激することができる、２）免疫受容体（例えば、ＣＡＲ）が指向する抗原に一致する免疫原を提供するワクチン接種が、免疫受容体を介して、改善された改変免疫細胞を刺激することができる、及び３）ワクチン接種（例えば、ＤＣＯｎｅベースのワクチン）は、例えば、免疫記憶を構築することにより、または任意の残存疾患に対するより広範な免疫制御を増進することにより、改善された改変免疫細胞の機能を更に改善することができる。
特定の実施形態では、改善された改変免疫細胞は、「より強い」免疫受容体及び「より弱い」免疫受容体を含む。より強い及びより弱いという用語の使用は、免疫受容体の実際の強度を限定することを意図するものではなく、単に次の概念を説明するためのものである。「より強い」免疫受容体、例えばＣＡＲは、活性化されたとき（すなわち、その同族抗原と接触したとき）、強いＴ細胞応答、例えば、強い増殖応答、強い細胞傷害性応答などを生じさせ得る。このため、ＣＡＲを含むＴ細胞は、急速なＴ細胞の枯渇（Ｔ細胞機能の進行性の喪失）を引き起こす場合があり、最終的には、アポトーシス調節因子と恒常性調節因子との間のバランスのシフトによりＴ細胞が破壊され得る。他方、「より弱い」免疫受容体は、特定の実施形態では、リコール抗原（例えば、感染またはワクチン接種を介してＣＭＶまたはＥＢＶにこれまでに遭遇したことのある患者におけるＣＭＶ由来抗原またはＥＢＶ由来抗原）によって活性化される。したがって、白血病起源のリコール抗原負荷改変細胞を使用する本開示の方法は、リコール抗原に応答することができる特定のＴ細胞集団、例えば、リコール抗原に応答して発生した内因性ＴＣＲを含む特定のＴ細胞集団を濃縮する。このようなＴ細胞集団は、リコール抗原の存在によってこれまでに発生していることから、訓練されたＴ細胞集団であり、かつ最適な免疫プロファイルを含み、自然に生存可能な集団である。特定の実施形態では、そのようなＴ細胞集団は、例えば慢性感染によって自然に維持される。特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、白血病起源のリコール抗原負荷改変細胞）と共培養された改善された改変免疫細胞の使用は、白血病由来の抗原負荷改変細胞と共培養されていない改変免疫細胞の使用と比較した場合、より強力な抗腫瘍効果をもたらす。
特定の実施形態では、疾患または障害（例えば、がん）を処置する方法は、図５Ｂに図示される工程を含む。例えば、がん（例えば、固形腫瘍）を処置する方法は、患者からＴ細胞を含むＰＢＭＣを単離すること、単離されたＰＢＭＣを白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ、リコール抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）と共培養して、少なくとも、１）Ｔ細胞増殖の刺激；２）ＣＤ４＋ Ｔ細胞対ＣＤ８＋ Ｔ細胞比の増加；３）Ｔ細胞集団の活性化；及び／または４）抗原特異的Ｔ細胞（例えば、リコール抗原特異的Ｔ細胞）の濃縮、をもたらすこと、免疫受容体（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をＴ細胞に導入して、改善されたＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔ細胞を作製すること、改善されたＣＡＲ－Ｔ細胞またはＴＣＲ－Ｔ細胞を患者に投与し、同時にまたはそれに続いて、ＣＡＲ－ＴまたはＴＣＲ－Ｔの機能及び生存率の改善による養子細胞療法の有効性の改善、免疫記憶の改善、及び／または残存疾患に対する免疫制御の改善をもたらすワクチン接種（例えば、ＤＣＯｎｅベースのワクチン、ＤＣＰ－００１再発ワクチン接種）を患者に施すこと、を含む。
特定の実施形態では、白血病起源の抗原負荷改変細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原負荷ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ）の使用は、本明細書に記載の様々な方法（例えば、腫瘍マーキング方法）のいずれかと併用される。
特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、光化学的プロセス（例えば、光化学的内在化）の使用を介して腫瘍非依存性抗原またはその断片を免疫細胞に導入することによって作製される。特定の実施形態では、腫瘍非依存性抗原またはその断片の免疫細胞への導入は、光化学的内在化の使用により実現される。特定の実施形態では、光化学的内在化は、抗原またはそのペプチド断片（例えば、抗原性ポリペプチド（例えば、非腫瘍抗原）、または抗原性ポリペプチドをコードする核酸）の白血病起源の改変細胞への送達を増強させるために使用され得る。
光化学的内在化とは、通常であれば膜不透過性である分子を、標的細胞のサイトゾルに導入するための光及び光増感剤の使用を含む送達方法を指すが、これは必ずしも標的細胞を破壊または死滅させるわけではない。この方法では、内在化または移入される分子は、光増感剤と組み合わせて細胞に適用される。細胞を適切な波長の光に曝露させると、光増感剤が活性化され、次に細胞内コンパートメント膜が破壊されて、続いて分子がサイトゾルに放出される。光化学的内在化では、光増感剤と光との間の相互作用を使用して細胞に作用し、分子の細胞内取り込みが改善されるようにする。光化学的内在化及び様々な光増感剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９６／０７４３２号、同第ＷＯ００／５４７０８号、同第ＷＯ０１／１８６３６号、同第ＷＯ０２／４４３９６号、同第ＷＯ０２／４４３９５号、及び同第ＷＯ０３／０２０３０９号、米国特許第６，６８０，３０１号、米国特許第５，８７６，９８９号に記載されており、これらの開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、光化学的内在化は、腫瘍非依存性抗原を腫瘍細胞のサイトゾルに送達するために使用される。特定の実施形態では、光化学的内在化は、腫瘍細胞のサイトゾルへの腫瘍非依存性抗原の送達を増強させるために使用される。
養子細胞療法のための免疫細胞の投与方法は公知であり、提供される方法及び組成物と関連して使用され得る。例えば、養子Ｔ細胞療法の方法は、例えば、Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌの米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇの米国特許第４，６９０，９１５号、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（２０１１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．８（１０）：５７７－８５に記載されている。例えば、Ｔｈｅｍｅｌｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（１０）：９２８－９３３、Ｔｓｕｋａｈａｒａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４３８（１）：８４－９、Ｄａｖｉｌａ ｅｔ ａｌ．（２０１３）ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（４）：ｅ６１３３８を参照されたい。特定の実施形態では、細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受ける対象から、またはそのような対象に由来する試料から、細胞が単離及び／または別の方法で調製される、自家移植によって行われる。したがって、特定の実施形態では、細胞は、処置を必要とする対象、例えば患者に由来するものであり、細胞は、単離及び処理後に同じ対象に投与される。
特定の実施形態では、細胞療法、例えば、養子Ｔ細胞療法は、細胞療法を受ける予定のまたは細胞療法を最終的に受ける対象以外の対象（例えば、第１の対象）から細胞が単離及び／または別の方法で調製される、同種移植によって行われる。そのような実施形態では、次いで、細胞は、異なる対象、例えば同じ種の第２の対象に投与される。特定の実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に同一である。特定の実施形態では、第１及び第２の対象は、遺伝的に類似している。特定の実施形態では、第２の対象は、第１の対象と同じＨＬＡクラスまたはスーパータイプを発現する。
特定の実施形態では、対象は、細胞または細胞含有組成物の投与前に、疾患または状態、例えば腫瘍を標的とする治療剤で処置されている。特定の実施形態では、対象は、他の治療剤に対して難治性または非応答性である。特定の実施形態では、対象は、例えば、化学療法、放射線、及び／または造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、例えば同種ＨＳＣＴを含む別の治療的介入による処置後に、持続性または再発性疾患を有する。特定の実施形態では、対象が別の療法に対して耐性となったにもかかわらず、投与により対象は効果的に処置される。
特定の実施形態では、対象は、他の治療剤に応答し、治療剤を用いた処置により疾患負荷が低減される。特定の実施形態では、対象は、最初は治療剤に応答するが、経時的に疾患または状態の再発を呈する。特定の実施形態では、対象は、再発していない。そのような実施形態では、対象は、再発のリスクがある（例えば、再発のリスクが高い）と判断され、したがって、例えば、再発の可能性を低減させるまたは再発を予防するために、細胞が予防的に投与される。特定の実施形態では、対象は、別の治療剤による以前の処置を受けていない。
特定の実施形態では、対象は、例えば、化学療法、放射線、及び／または造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）、例えば同種ＨＳＣＴを含む別の治療的介入による処置後に、持続性または再発性疾患を有する。特定の実施形態では、対象が別の療法に対して耐性となったにもかかわらず、投与により対象は効果的に処置される。
腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞は、疾患または障害、例えばがんを処置するために、動物、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与され得る。更に、本開示の細胞は、疾患を処置または軽減することが望ましい場合、がんに関連する任意の状態、特に腫瘍細胞（複数可）に対する細胞媒介性免疫応答の処置に使用され得る。本明細書に開示される方法を使用して処置されるがんのタイプは、非固形腫瘍（血液腫瘍など）または固形腫瘍であり得る。成人の腫瘍／がん及び小児の腫瘍／がんも含まれる。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍または血液腫瘍である。特定の実施形態では、がんは、癌腫である。特定の実施形態では、がんは、肉腫である。特定の実施形態では、がんは、白血病である。特定の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。
固形腫瘍は、嚢胞または液状領域を通常含有しない組織の異常な塊である。固形腫瘍は、良性または悪性であり得る。様々なタイプの固形腫瘍は、それらを形成する細胞のタイプ（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）から命名される。
細胞（例えば、腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞）の投与は、当業者に公知の任意の好都合な方法で行われ得る。細胞は、エアロゾル吸入、注射、摂取、輸血、埋入、または移植によって対象に投与され得る。本明細書に記載の組成物は、患者に、経動脈投与、皮下投与、皮内投与、腫瘍内投与、リンパ節内投与、髄内投与、筋肉内投与、静脈内（ｉ．ｖ．）注射による投与、または腹腔内投与され得る。特定の実施形態では、本開示の細胞は、対象の炎症部位、対象の局所疾患部位、リンパ節、器官、腫瘍などに直接注射される。
特定の実施形態では、細胞は、所望の投与量で投与され、いくつかの態様では、所望の投与量には、細胞もしくは細胞タイプ（複数可）の所望の用量もしくは数、及び／または細胞タイプの所望の比率が含まれる。したがって、いくつかの実施形態における細胞の投与量は、細胞総数（または体重１ｋｇあたりの数）、及び免疫細胞投与のための個々の集団またはサブタイプの所望の比率、例えばＣＤ４＋対ＣＤ８＋比に基づく。特定の実施形態では、細胞の投与量は、個々の集団における細胞または個々の細胞タイプの細胞の所望の総数（または体重１ｋｇあたりの数）に基づく。特定の実施形態では、投与量は、個々の集団における総細胞の所望の数、所望の比率、及び細胞の所望の総数などの特徴の組み合わせに基づく。
特定の実施形態では、免疫細胞の投与のために、ＣＤ８＋ Ｔ細胞及びＣＤ４＋ Ｔ細胞などの細胞の集団またはサブタイプは、Ｔ細胞の所望の用量などの総細胞の所望の用量の許容差でまたは許容差内で投与される。
特定の実施形態では、所望の用量は、細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重単位あたりの細胞の所望の数、例えば細胞／ｋｇである。特定の実施形態では、所望の用量は、最小細胞数以上または体重単位あたりの最小細胞数以上である。特定の実施形態では、所望の用量で投与された総細胞のうち、個々の集団またはサブタイプは、所望の産生比（例えば、ＣＤ４＋対ＣＤ８＋比）またはそれに近い比率で、例えば、そのような比率の特定の許容差内または許容誤差内で存在する。
特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋細胞の所望の用量及び／またはＣＤ８＋細胞の所望の用量などの、細胞の個々の集団またはサブタイプのうちの１つ以上の所望の用量の許容差で、または許容差内で投与される。特定の実施形態では、所望の用量は、サブタイプまたは集団の細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重単位あたりのそのような細胞の所望の数、例えば細胞／ｋｇである。特定の実施形態では、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの最小細胞数以上または体重単位あたりの集団もしくはサブタイプの最小細胞数以上である。したがって、特定の実施形態では、投与量は、総細胞の所望の固定用量及び所望の比率に基づく、及び／または個々のサブタイプもしくは亜集団の１つ以上、例えば各々の、所望の固定用量に基づく。したがって、特定の実施形態では、投与量は、Ｔ細胞の所望の固定用量もしくは最小用量及びＣＤ４＋細胞対ＣＤ８＋細胞の所望の比率に基づく、及び／またはＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞の所望の固定用量もしくは最小用量に基づく。
特定の実施形態では、細胞（例えば、免疫受容体を含む免疫細胞）、または細胞のサブタイプの個々の集団は、約１００万～約１０００億個の細胞、例えば、１００万～約５００億個の細胞（例えば、約５００万個の細胞、約２５００万個の細胞、約５億個の細胞、約１０億個の細胞、約５０億個の細胞、約２００億個の細胞、約３００億個の細胞、約４００億個の細胞、約５，０００万個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、例えば、約１０００万～約１０００億個の細胞（例えば、約２０００万個の細胞、約３０００万個の細胞、約４０００万個の細胞、約６０００万個の細胞、約７０００万個の細胞、約８０００万個の細胞、約９０００万個の細胞、約１００億個の細胞、約２５０億個の細胞、約５００億個の細胞、約７５０億個の細胞、約９００億個の細胞、または前述の値のいずれか２つによって規定される範囲）、場合によっては、約１億～約５００億個の細胞（例えば、約１億２千万個の細胞、約２億５千万個の細胞、約３億５千万個の細胞、約４億５千万個の細胞、約６億５千万個の細胞、約８億個の細胞、約９億個の細胞、約３０億個の細胞、約３００億個の細胞、約４５０億個の細胞）、またはこれらの範囲の間の任意の値の範囲で対象に投与される。
特定の実施形態では、総細胞（例えば、免疫受容体を含む免疫細胞）の用量及び／または細胞の個々の亜集団の用量は、１×１０５細胞／ｋｇ～約１×１０１１細胞／ｋｇまたは約１×１０５細胞／ｋｇ～約１×１０１１細胞／ｋｇ、１０４、及び１０１１細胞／キログラム（ｋｇ）体重または約１０１１細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６細胞／ｋｇ体重、例えば、１×１０５細胞／ｋｇ体重、１．５×１０５細胞／ｋｇ体重、２×１０５細胞／ｋｇ体重、もしくは１×１０６細胞／ｋｇ体重、または約１×１０５細胞／ｋｇ体重、約１．５×１０５細胞／ｋｇ体重、約２×１０５細胞／ｋｇ体重、もしくは約１×１０６細胞／ｋｇ体重の範囲内である。例えば、特定の実施形態では、細胞は、１０４～１０９個のＴ細胞／キログラム（ｋｇ）体重または約１０４～約１０９個のＴ細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重、例えば、１×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、１．５×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、２×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、もしくは１×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重、または約１×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、約１．５×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、約２×１０５個のＴ細胞／ｋｇ体重、もしくは約１×１０６個のＴ細胞／ｋｇ体重で、あるいはその特定の誤差範囲内で投与される。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法で使用するための細胞の好適な投与量範囲には、限定されないが、約１×１０５細胞／ｋｇ～約１×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０６細胞／ｋｇ～約１×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ～約１×１０８細胞／ｋｇ、約１×１０８細胞／ｋｇ～約１×１０９細胞／ｋｇ、約１×１０９細胞／ｋｇ～約１×１０１０細胞／ｋｇ、約１×１０１０細胞／ｋｇ～約１×１０１１細胞／ｋｇが含まれる。
特定の実施形態では、細胞（例えば、免疫受容体を含む免疫細胞）は、１０４～１０９個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／キログラム（ｋｇ）体重あるいは約１０４～約１０９個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／キログラム（ｋｇ）体重、例えば、１０５～１０６個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、例えば、１×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、１．５×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、２×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、あるいは１×１０６個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、あるいは約１×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、約１．５×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、約２×１０５個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重、あるいは約１×１０６個のＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞／ｋｇ体重で、あるいはその特定の誤差範囲内で投与される。特定の実施形態では、細胞は、約１×１０６個超、約２．５×１０６個超、約５×１０６個超、約７．５×１０６個超、もしくは約９×１０６個超、もしくは少なくとも約１×１０６個、約２．５×１０６個、約５×１０６個、約７．５×１０６個、もしくは約９×１０６個のＣＤ４＋細胞、及び／または少なくとも約１×１０６個、約２．５×１０６個、約５×１０６個、約７．５×１０６個、もしくは約９×１０６個のＣＤ８＋細胞、及び／または少なくとも約１×１０６個、約２．５×１０６個、約５×１０６個、約７．５×１０６個、もしくは約９×１０６個のＴ細胞で、あるいはその一定の誤差範囲内で投与される。特定の実施形態では、細胞は、約１０８～１０１２個もしくは約１０１０～１０１１個のＴ細胞、約１０８～１０１２個もしくは約１０１０～１０１１個のＣＤ４＋細胞、及び／または約１０８～１０１２個もしくは約１０１０～１０１１個のＣＤ８＋細胞で、あるいはその特定の誤差範囲内で投与される。
特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、免疫受容体を含む免疫細胞）の投与のために、細胞は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞またはサブタイプなどの複数の細胞集団またはサブタイプの所望の産生比の許容範囲でまたは許容範囲内で投与される。特定の実施形態では、所望の比率は、特定の比率であり得るかまたは比率の範囲であり得、例えば、いくつかの実施形態では、所望の比率（例えば、ＣＤ４＋細胞対ＣＤ８＋細胞の比率）は、５：１～５：１もしくは約５：１～約５：１（または約１：５より大きく約５：１より小さい）、あるいは１：３～３：１もしくは約１：３～約３：１（または約１：３より大きく約３：１より小さい）、例えば、２：１～１：５もしくは約２：１～約１：５（または約１：５より大きく約２：１より小さい、例えば、５：１、４．５：１、４：１、３．５：１、３：１、２．５：１、２：１、１．９：１、１．８：１、１．７：１、１．６：１、１．５：１、１．４：１、１．３：１、１．２：１、１．１：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、もしくは１：５、または約５：１、約４．５：１、約４：１、約３．５：１、約３：１、約２．５：１、約２：１、約１．９：１、約１．８：１、約１．７：１、約１．６：１、約１．５：１、約１．４：１、約１．３：１、約１．２：１、約１．１：１、約１：１、約１：１．１、約１：１．２、約１：１．３、約１：１．４、約１：１．５、約１：１．６、約１：１．７、約１：１．８、約１：１．９、約１：２、約１：２．５、約１：３、約１：３．５、約１：４、約１：４．５、もしくは約１：５）である。特定の実施形態では、許容差は、所望の比率の約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％以内（これらの範囲の間の任意の値を含む）である。
特定の実施形態では、免疫細胞の用量は、単回用量または複数回用量で、それを必要とする対象に投与される。特定の実施形態では、細胞の用量は、複数回用量で、例えば、１週間に１回または７日に１回、２週間に１回または１４日に１回、３週間に１回または２１日に１回、４週間に１回または２８日に１回、投与される。
疾患の予防または処置の場合、適切な投与量は、処置される疾患のタイプ、細胞または組換え受容体のタイプ、疾患の重症度及び経過、細胞が予防目的または治療目的のどちらで投与されるか、前治療、対象の病歴及び細胞に対する応答、ならびに主治医の判断に応じて異なり得る。組成物及び細胞は、いくつかの実施形態では、一度にまたは一連の処置にわたって適切に対象に投与される。
特定の実施形態では、細胞は、併用処置の一部として、例えば、別の治療的介入（例えば、抗体または操作された細胞もしくは受容体または薬剤、例えば細胞傷害剤もしくは治療剤）と同時に、または任意の順序で逐次的に投与される。特定の実施形態における細胞は、１つ以上の追加の治療剤と、または別の治療的介入に関連して、同時にまたは任意の順序で逐次的に共投与される。特定の実施形態では、細胞は、細胞集団が１つ以上の追加の治療剤の効果を高めるように、十分に近い時点で別の治療薬と共投与されるか、またはその逆である。特定の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤の前に投与される。特定の実施形態では、細胞は、１つ以上の追加の治療剤の後に投与される。特定の実施形態では、１つ以上の追加の薬剤は、例えば持続性を高めるために、ＩＬ－２などのサイトカインを含む。特定の実施形態では、本方法は、化学療法剤の投与を含む。
細胞の投与後、いくつかの実施形態では、操作された細胞集団の生物活性が、例えば多数の公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータには、ｉｎ ｖｉｖｏでの（例えばイメージングによる）、またはｅｘ ｖｉｖｏでの（例えばＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーによる）、改変されたまたは天然のＴ細胞または他の免疫細胞の抗原の特異的結合が含まれる。特定の実施形態では、標的細胞を破壊する改変免疫細胞の能力は、例えば、Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，３２（７）：６８９－７０２（２００９）、及びＨｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８５（１）：２５－４０（２００４）に記載されている細胞傷害性アッセイなどの、当該技術分野で公知の任意の好適な方法を使用して測定され得る。特定の実施形態では、細胞の生物活性は、ＣＤ １０７ａ、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦなどの１つ以上のサイトカインの発現及び／または分泌をアッセイすることによって測定される。特定の実施形態では、生物活性は、腫瘍負荷もしくは腫瘍量の低減、または再発発生の低減などの臨床転帰を評価することによって測定される。
特定の実施形態では、対象に二次処置が提供される。二次処置には、化学療法、放射線、手術、及び薬物療法が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、対象は、養子細胞療法の前に前処置療法を受けることができる。特定の実施形態では、前処置療法は、有効量のシクロホスファミドを対象に投与することを含む。特定の実施形態では、前処置療法は、有効量のフルダラビンを対象に投与することを含む。特定の実施形態では、前処置療法は、有効量のシクロホスファミドとフルダラビンとの組み合わせを対象に投与することを含む。養子細胞療法の前に前処置療法を施すことで、養子細胞療法の有効性が増加し得る。養子細胞療法のために患者を前処置する方法は、米国特許第９，８５５，２９８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
本開示の細胞は、適切な前臨床実験及び試験ならびに臨床実験及び試験で決定される投与量及び経路、及び時間で投与され得る。細胞組成物は、これらの範囲内の投与量で複数回投与され得る。本開示の細胞の投与は、当業者によって決定される所望の疾患または状態を処置するのに有用な他の方法と組み合わせることができる。
ＣＡＲ Ｔ細胞注入後の有害作用の１つがサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）として知られる免疫活性化の発生であることは、当該技術分野で公知である。ＣＲＳは、炎症性サイトカインの上昇をもたらす免疫活性化である。ＣＲＳは公知のオンターゲット毒性であり、その発生はおそらく有効性と相関している。臨床及び実験室での指標は、軽度ＣＲＳ（全身症状及び／またはグレード２の臓器毒性）から重度ＣＲＳ（ｓＣＲＳ。グレード３以上の臓器毒性、積極的臨床介入、及び／または生命を脅かす可能性がある）に及ぶ。臨床的特徴としては、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、悪心、食欲不振、頻脈／低血圧、毛細血管漏出、心機能障害、腎機能障害、肝不全、及び播種性血管内凝固が挙げられる。ＣＡＲ Ｔ細胞注入後、インターフェロン－ガンマ、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、ＩＬ－１０、及びＩＬ－６を含むサイトカインが劇的に上昇することが示されている。１つのＣＲＳシグネチャは、ＩＬ－６（重度の上昇）、ＩＦＮγ、ＴＮＦ－アルファ（中等度）、及びＩＬ－２（軽度）を含むサイトカインの上昇である。フェリチン及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を含む臨床的に利用可能な炎症マーカーの上昇も、ＣＲＳ症候群と相関することが観察されている。ＣＲＳの存在は、一般に、養子移入細胞の増大及び進行性の免疫活性化と相関している。腫瘍負荷が多い患者はより多くのｓＣＲＳを経験するため、ＣＲＳの重症度の程度は注入時の疾患負荷によって決定付けられることが実証されている。
したがって、本開示は、ＣＲＳの診断後に、操作された細胞（例えば、ＣＡＲ Ｔ細胞）の抗腫瘍効果を減弱させることなく、制御不能な炎症の生理的症状を緩和するための適切なＣＲＳ管理戦略を提供する。ＣＲＳ管理戦略は、当該技術分野で公知である。例えば、全身性コルチコステロイドが、当初の抗腫瘍応答を損なうことなく、ｓＣＲＳ（例えば、グレード３のＣＲＳ）の症状を迅速に逆転させるために投与され得る。
いくつかの実施形態では、抗ＩＬ－６Ｒ抗体が投与され得る。抗ＩＬ－６Ｒ抗体の例は、食品医薬品局により承認されたモノクローナル抗体トシリズマブであり、これはアトリズマブとしても知られている（ＡｃｔｅｍｒａまたはＲｏＡｃｔｅｍｒａとして市販されている）。トシリズマブは、インターロイキン－６受容体（ＩＬ－６Ｒ）に対するヒト化モノクローナル抗体である。トシリズマブの投与により、ＣＲＳがほぼ即座に逆転することが実証されている。
ＣＲＳは通常、観察された症候群の重症度に基づいて管理され、介入はそのように調整される。ＣＲＳ管理の決定は、臨床検査値のみに基づくのではなく、臨床徴候及び症状、ならびに介入に対する応答に基づく場合がある。
軽度から中等度の症例は、一般に、適切な症状緩和のために必要に応じて、輸液療法、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、及び抗ヒスタミン薬による症状管理により処置される。より重度の症例には、血行動態が任意の程度で不安定な患者が含まれる。血行動態が不安定な場合は、トシリズマブの投与が推奨されることが多い。ＣＲＳの第一選択の管理は、トシリズマブであり得、いくつかの実施形態では、それは８ｍｇ／ｋｇの表示用量（８００ｍｇ／用量を超えない）での６０分間にわたるＩＶであり得る。トシリズマブは、８時間おきに反復され得る。トシリズマブの初回用量に対して最適以下の応答が得られた場合は、トシリズマブの追加用量が考慮される場合がある。トシリズマブは、単独で投与することもでき、またはコルチコステロイド療法と組み合わせて投与することもできる。ＣＲＳ症状が継続または進行している、１２～１８時間で臨床的改善が不十分である、またはトシリズマブに対して応答不良である患者は、高用量コルチコステロイド療法（通常はヒドロコルチゾン１００ｍｇ ＩＶまたはメチルプレドニゾロン１～２ｍｇ／ｋｇ）で処置され得る。より重度の血行動態の不安定性またはより重度の呼吸器症状を有する患者では、ＣＲＳの経過の初期に高用量コルチコステロイド療法が患者に施される場合がある。ＣＲＳ管理指標は、公開されている基準に基づき得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｏｌ Ｂｌｏｏｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｂｍｔ．２０１８．１２．７５８、Ｎｅｅｌａｐｕ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１５：４７、Ｔｅａｃｈｅｙ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ，６（６）：６６４－６７９）。
マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）または血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）と整合する特徴が、ＣＡＲ－Ｔ療法で処置された患者で観察されており（Ｈｅｎｔｅｒ，２００７）、これはＣＲＳの臨床症状と符合する。ＭＡＳは、ＣＲＳから生じる免疫活性化に対する応答であると考えられるため、ＣＲＳの顕在化と見なすべきである。ＭＡＳは、ＨＬＨと類似している（同じく免疫刺激に対する応答である）。ＭＡＳの臨床症候群は、高度の非寛解性発熱、３つの分化系列のうち少なくとも２つに影響を及ぼす血球減少症、及び肝脾腫によって特徴付けられる。これは、血清フェリチン、可溶性インターロイキン－２受容体、及びトリグリセリドの高値、ならびに循環ナチュラルキラー（ＮＫ）活性の低下に関連している。
Ｉ．免疫細胞の供給源
増大させる前に、ｅｘ ｖｉｖｏ操作のために免疫細胞の供給源を対象から入手する。ｅｘ ｖｉｖｏ操作のための標的細胞の供給源には、例えば、自家ドナーまたは異種ドナーの血液、臍帯血、または骨髄も含まれ得る。例えば、免疫細胞の供給源は、本開示の改変免疫細胞で処置される対象からのもの、例えば、対象の血液、対象の臍帯血、または対象の骨髄であり得る。対象の非限定的な例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及びそれらのトランスジェニック種が挙げられる。特定の例示的実施形態では、対象はヒトである。
免疫細胞は、血液、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、脾組織、臍帯、リンパ、またはリンパ器官を含む多くの供給源から得ることができる。免疫細胞は、自然免疫または適応免疫の細胞などの免疫系の細胞であり、例えば、リンパ球、典型的にはＴ細胞及び／またはＮＫ細胞を含む、骨髄細胞またはリンパ系細胞である。他の例示的な細胞としては、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を含む、多分化能性及び多能性幹細胞などの幹細胞が挙げられる。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。処置される対象に関して、細胞は、同種及び／または自家であり得る。細胞は、典型的には初代細胞、例えば、対象から直接単離されたもの及び／または対象から単離されて凍結されたものである。
特定の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、もしくはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、または樹状細胞である。特定の実施形態では、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球、及び／または好塩基球である。特定の実施形態では、標的細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であるか、またはｉＰＳ細胞（例えば、対象から作製され、１つ以上の標的遺伝子の発現を変更する（例えば、それに変異を誘導する）ようにまたは操作するように操作され、例えば、Ｔ細胞、例えばＣＤ８＋ Ｔ細胞（例えば、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、もしくはエフェクターメモリーＴ細胞）、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、リンパ系前駆細胞、または造血幹細胞へと分化されたｉＰＳ細胞）に由来する細胞である。
特定の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞または他の細胞タイプの１つ以上のサブセット、例えば、全Ｔ細胞集団、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、及びその亜集団、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化可能性、増大、再循環、局在化、及び／または持続能力、抗原特異性、抗原受容体のタイプ、特定の器官もしくはコンパートメントにおける存在、マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル、及び／または分化度によって定義されるものを含む。Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋ Ｔ細胞及び／またはＣＤ８＋ Ｔ細胞のサブタイプ及び亜集団の中には、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞、及びそれらのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）細胞、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）細胞、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）細胞、または最終分化エフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然及び適応性の制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ３細胞、Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ９細胞、Ｔｈ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、ならびにデルタ／ガンマＴ細胞がある。特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能な任意の数のＴ細胞株が使用され得る。
特定の実施形態では、本方法は、対象から免疫細胞を単離すること、免疫細胞を調製すること、処理すること、培養すること、及び／または操作することを含む。特定の実施形態では、操作された細胞の調製は、１つ以上の培養及び／または調製工程を含む。記載されているように操作するための細胞は、生体試料などの試料、例えば、対象から得られるかまたは対象に由来するものから単離され得る。特定の実施形態では、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有する対象、または細胞療法を必要とする対象、または細胞療法が施される対象である。対象は、いくつかの実施形態では、細胞が単離され、処理され、及び／または操作される養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とするヒトである。したがって、いくつかの実施形態における細胞は、初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料には、対象から直接採取された組織、体液、及び他の試料、ならびに１つ以上の処理工程、例えば、分離、遠心分離、遺伝子操作（例えば、ウイルスベクターによる形質導入）、洗浄、及び／またはインキュベーションの結果として生じた試料が含まれる。生体試料は、生物学的供給源から直接得られた試料、または処理された試料であり得る。生体試料には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、及び汗などの体液、組織、ならびに臓器の試料（それらに由来する処理された試料を含む）が含まれるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、細胞が由来するまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるかもしくはそれに由来する。例示的な試料には、全血、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の器官、及び／またはそれらに由来する細胞が含まれる。試料には、細胞療法、例えば養子細胞療法の文脈では、自家及び同種の供給源からの試料が含まれる。
特定の実施形態では、細胞は、細胞株、例えばＴ細胞株に由来する。特定の実施形態における細胞は、異種供給源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、及びブタから得られる。いくつかの実施形態では、細胞の単離は、１つ以上の調製及び／または親和性に基づくものではない細胞分離工程を含む。いくつかの例では、例えば、望ましくない成分を除去し、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に対して感受性である細胞を溶解または除去するために、細胞を、洗浄し、遠心分離し、及び／または１つ以上の試薬の存在下でインキュベートする。いくつかの例では、細胞は、密度、接着特性、サイズ、感受性、及び／または特定の成分に対する耐性などの１つ以上の特性に基づいて分離される。
特定の実施形態では、対象の循環血液に由来する細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの態様では、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び／または血小板を含有し、いくつかの態様では、赤血球及び血小板以外の細胞を含有する。特定の実施形態では、対象から回収した血球を洗浄し、例えば、血漿画分を除去して、細胞をその後の処理工程に適切である緩衝液または培地に入れる。いくつかの実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。特定の実施形態では、洗浄工程は、製造業者の指示に従ってタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって実現される。特定の実施形態では、細胞は、洗浄後に様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。特定の実施形態では、血球試料の成分が除去され、細胞が培地に直接再懸濁される。特定の実施形態では、本方法は、赤血球の溶解及びパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離による末梢血からの白血球の調製などの、密度に基づく細胞分離方法を含む。
特定の実施形態では、免疫細胞は、個体の循環血液から得られる細胞であり、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球細胞を含むリンパ球、赤血球細胞、及び血小板を含有する。アフェレーシスによって回収された細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの適切な緩衝液もしくは培地に入れることができ、または洗浄液は、後続の処理工程のために、カルシウムを欠いており、かつマグネシウムを欠いている場合があるか、もしくは全てではないにしろ多くの二価カチオンを欠いている場合がある。洗浄後、細胞は、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含ＰＢＳなどに再懸濁され得る。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分が除去され、細胞が培地に直接再懸濁され得る。
特定の実施形態では、単離方法は、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの１つ以上の特定の分子の細胞内での発現または存在に基づいて、異なる細胞タイプを分離することを含む。特定の実施形態では、そのようなマーカーに基づく任意の公知の分離方法が使用され得る。特定の実施形態では、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、特定の実施形態における単離は、細胞の１つ以上の細胞表面マーカー（典型的には細胞表面マーカー）の発現または発現レベルに基づく細胞及び細胞集団の分離であって、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーションと、一般にそれに続く、洗浄工程、及び抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの、抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離によるものを含む。
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞を更なる使用のために保持する陽性選択、及び／または抗体または結合パートナーに結合していない細胞を保持する陰性選択に基づき得る。特定の実施形態では、両方の画分が、更なる使用のために保持される。特定の実施形態では、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて分離が最良に行われるように、不均質な集団内の細胞タイプを特異的に同定する抗体が利用できない場合は、陰性選択が特に有用であり得る。分離により、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞が１００％濃縮されるまたは除去される必要はない。例えば、特定のタイプの細胞（例えばマーカーを発現するもの）の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞が完全になくなる必要はない。同様に、特定のタイプの細胞（例えばマーカーを発現するもの）の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞全てが完全に除去される必要はない。
特定の実施形態では、複数回の分離工程が行われ、その際、１つの工程で陽性選択または陰性選択された画分が、後続の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される。特定の実施形態では、単一の分離工程は、例えば、複数の抗体または結合パートナー（それぞれが陰性選択の標的となるマーカーに特異的である）とともに細胞をインキュベートすることにより、複数のマーカーを同時に発現する細胞を枯渇させることができる。同様に、様々な細胞タイプで発現する複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時に陽性選択することができる。
特定の実施形態では、Ｔ細胞集団のうちの１つ以上は、表面マーカーなどの１つ以上の特定のマーカーに陽性である（マーカー＋）か、もしくはそれを高レベルで発現する（マーカーｈｌｇｈ）細胞、または１つ以上のマーカーに陰性である（マーカー－）か、もしくはそれを比較的低レベルで発現する（マーカーｌｏｗ）細胞が濃縮されるか、または枯渇される。例えば、特定の実施形態では、Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ２７＋、ＣＤ１２７＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び／またはＣＤ４５ＲＯ＋ Ｔ細胞などの１つ以上の表面マーカーに陽性であるかまたはそれを高レベルで発現する細胞は、陽性または陰性選択手法によって単離される。特定の実施形態では、そのようなマーカーは、Ｔ細胞の特定の集団（例えば、メモリー細胞以外）では存在しないか、または比較的低レベルで発現されるが、Ｔ細胞の特定の他の集団（例えば、メモリー細胞）では存在するか、または比較的高レベルで発現されるマーカーである。一実施形態では、細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞またはＴ細胞、例えばＣＤ３＋細胞）は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ４４、ＣＤ１２７、及び／またはＣＤ６２Ｌに陽性であるか、またはそれらを高い表面レベルで発現する細胞が濃縮される（すなわち、それらで陽性選択される）、及び／またはＣＤ４５ＲＡに陽性であるか、またはＣＤ４５ＲＡを高い表面レベルで発現する細胞が枯渇される（すなわち、それらで陰性選択される）。特定の実施形態では、細胞は、ＣＤ１２２、ＣＤ９５、ＣＤ２５、ＣＤ２７、及び／またはＩＬ７－Ｒａ（ＣＤ１２７）が陽性であるかまたはそれらを高い表面レベルで発現する細胞が濃縮されるかまたは枯渇される。特定の実施形態では、ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯに陽性（またはＣＤ４５ＲＡに陰性）かつＣＤ６２Ｌに陽性の細胞が濃縮される。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋ Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズ（例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｄｅｒ）を使用して陽性選択され得る。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｂ細胞、単球、または他の白血球などの非Ｔ細胞上で発現されるマーカー、例えばＣＤ１４の陰性選択によってＰＢＭＣ試料から分離される。特定の実施形態では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程を使用して、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞が分離される。そのようなＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団は、１つ以上のナイーブＴ細胞亜集団、メモリーＴ細胞亜集団、及び／またはエフェクターＴ細胞亜集団上で発現されるか、または比較的高度に発現されるマーカーの陽性選択または陰性選択によって、亜集団に更に分類され得る。特定の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択などによって、ナイーブ幹細胞、セントラルメモリー幹細胞、エフェクターメモリー幹細胞、及び／またはセントラルメモリー幹細胞が更に濃縮または枯渇される。特定の実施形態では、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の濃縮は、有効性を増加させるために、例えば、投与後の長期生存、増大、及び／または生着を改善するために行われ、これは、いくつかの態様では、そのような亜集団において特に頑健である。特定の実施形態では、Ｔｃｍ濃縮ＣＤ８＋ Ｔ細胞とＣＤ４＋ Ｔ細胞とを組み合わせることにより、有効性が更に増強される。
特定の実施形態では、メモリーＴ細胞は、ＣＤ８＋末梢血リンパ球のＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ－サブセットの両方に存在する。ＰＢＭＣは、抗ＣＤ８及び抗ＣＤ６２Ｌ抗体を使用するなどして、ＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋画分及び／またはＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋画分を濃縮または枯渇させることができる。特定の実施形態では、ＣＤ４＋ Ｔ細胞集団及びＣＤ８＋ Ｔ細胞亜集団、例えばセントラルメモリー（Ｔｃｍ）細胞が濃縮された亜集団。特定の実施形態では、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の濃縮は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、及び／またはＣＤ１２７の陽性または高表面発現に基づき、いくつかの態様では、その濃縮は、ＣＤ４５ＲＡ及び／またはグランザイムＢを発現するまたは高発現する細胞の陰性選択に基づく。特定の実施形態では、ＴＣＭ細胞が濃縮されたＣＤ８＋集団の単離は、ＣＤ４、ＣＤ１４、ＣＤ４５ＲＡを発現する細胞の枯渇、及びＣＤ６２Ｌを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって行われる。特定の実施形態では、セントラルメモリーＴ（Ｔｃｍ）細胞の濃縮は、ＣＤ４発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から開始して行われ、これはＣＤ１４及びＣＤ４５ＲＡの発現に基づく陰性選択、及びＣＤ６２Ｌに基づく陽性選択に供される。このような選択は、特定の実施形態では同時に行われ、他の態様ではいずれかの順序で逐次的に行われる。特定の実施形態では、ＣＤ８＋細胞集団または亜集団を調製する際に使用されるのと同じＣＤ４発現に基づく選択工程が、ＣＤ４＋細胞集団または亜集団を作製するためにも使用され、その結果、ＣＤ４に基づく分離からの陽性画分及び陰性画分の両方が保持され、本方法の後続の工程で（任意選択で１つ以上の更なる陽性または陰性選択工程の後に）使用される。
ＣＤ４＋ Ｔヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、及びエフェクター細胞に分類される。ＣＤ４＋リンパ球は、標準的方法によって得ることができる。特定の実施形態では、ナイーブＣＤ４＋ Ｔリンパ球は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ４＋ Ｔ細胞である。特定の実施形態では、セントラルメモリーＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ＋かつＣＤ４５ＲＯ＋である。特定の実施形態では、エフェクターＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ－かつＣＤ４５ＲＯである。一例では、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体のカクテルには、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体が含まれる。特定の実施形態では、抗体または結合パートナーは、陽性及び／または陰性選択のための細胞の分離を可能にするために、磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合される。
特定の実施形態では、細胞は、遺伝子操作の前に、または遺伝子操作に関連して、インキュベート及び／または培養される。インキュベーション工程には、培養（ｃｕｌｔｕｒｅ）、培養（ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ）、刺激、活性化、及び／または増殖が含まれ得る。特定の実施形態では、組成物または細胞は、刺激条件または刺激性剤の存在下でインキュベートされる。このような条件には、集団内の細胞の増殖、増大、活性化、及び／または生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、及び／または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように、設計されたものが含まれる。条件には、特定の培地、温度、酸素含有量、二酸化炭素含有量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、及び／または刺激因子、例えば、サイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、ならびに細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの１つ以上が含まれ得る。特定の実施形態では、刺激剤は、ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、及び／またはＩＬ－２１、例えば、少なくとも約１０単位／ｍＬのＩＬ－２濃度を含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解させ、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離によって単球を枯渇させることにより、末梢血リンパ球から単離される。あるいは、Ｔ細胞は臍帯から単離され得る。いずれにせよ、Ｔ細胞の特定の亜集団は、陽性または陰性選択手法によって更に単離され得る。
そのように単離された臍帯血単核細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１９、及びＣＤ５６を含むがこれらに限定されない特定の抗原を発現する細胞を枯渇させることができる。これらの細胞の枯渇は、単離された抗体、抗体を含む生体試料（例えば腹水）、物理的支持体に結合した抗体、及び細胞結合抗体を使用して実現され得る。
陰性選択によるＴ細胞集団の濃縮は、陰性選択された細胞に特有である表面マーカーに指向された抗体の組み合わせを使用して実現され得る。１つの例示的方法は、陰性選択された細胞上に存在する細胞表面マーカーに指向されたモノクローナル抗体のカクテルを使用する陰性磁気免疫付着またはフローサイトメトリーを介した細胞選別及び／または選択である。例えば、陰性選択によりＣＤ４＋細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体のカクテルには、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体が含まれる。
陽性または陰性選択によって所望の細胞集団を単離するために、細胞及び表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変化させることができる。特定の実施形態では、細胞とビーズを確実に最大限接触させるために、ビーズ及び細胞が一緒に混合される体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増加させる）ことが望ましい場合がある。例えば、特定の実施形態では、２０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。一実施形態では、１０億細胞／ｍｌの濃度が使用される。更なる実施形態では、１億細胞／ｍｌ超が使用される。更なる実施形態では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。なお別の実施形態では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億細胞／ｍｌの細胞濃度が使用される。更なる実施形態では、１億２５００万または１億５０００万細胞／ｍｌの濃度が使用され得る。高濃度の使用により、細胞収率、細胞活性化、及び細胞増大の増加がもたらされ得る。
Ｔ細胞はまた、単球除去工程を必要としない洗浄工程後に凍結され得る。理論に拘束されることを望まないが、凍結及びその後の解凍工程により、細胞集団中の顆粒球を除去し、単球をある程度除去することによってより均一な生成物がもたらされる。血漿及び血小板を除去する洗浄工程後、細胞は、凍結溶液中に懸濁され得る。多くの凍結溶液及びパラメータが当該技術分野で公知であり、この文脈で有用であるが、非限定的な例では、１つの方法は、２０％ＤＭＳＯ及び８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または他の好適な細胞凍結培地を使用することを含む。次いで、細胞は、毎分１℃の速度で－８０℃まで凍結され、液体窒素保存タンクの気相で保存される。他の制御凍結方法が、－２０℃で即時のまたは液体窒素中での非制御凍結に加えて使用され得る。
特定の実施形態では、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の集団は、末梢血単核細胞、臍帯血細胞、Ｔ細胞の精製集団、及びＴ細胞株などの細胞内に含まれる。特定の実施形態では、末梢血単核細胞は、Ｔ細胞の集団を含む。なお別の実施形態では、精製されたＴ細胞は、Ｔ細胞の集団を含む。
特定の実施形態では、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、試料から単離され得る。試料には、臍帯血または末梢血が含まれ得るが、これらに限定されない。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇは、フローサイトメトリー選別によって単離される。試料は、当該技術分野で公知の任意の手段によって、単離前にＴｒｅｇが濃縮され得る。単離されたＴｒｅｇは、使用前に凍結保存及び／または増大され得る。Ｔｒｅｇの単離方法は、米国特許第７，７５４，４８２号、同第８，７２２，４００号、及び同第９，５５５，１０５号、ならびに米国特許出願第１３／６３９，９２７号に記載されており、これらの内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｊ．医薬組成物及び製剤
また、医薬組成物及び製剤、例えば、所与の用量またはその部分での投与のための細胞の数を含む単位用量形態の組成物を含む、投与のための細胞を含む組成物も提供される。医薬組成物及び製剤は、一般に、１つ以上の任意選択による薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。特定の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の治療剤を含む。
「医薬製剤」という用語は、その中に含まれる活性成分の生物活性が有効であることが可能な形態であり、製剤が投与される対象に対して許容されないほど毒性である更なる成分を含まない調製物を指す。「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の医薬製剤内の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝液、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、担体の選択は、特定の細胞及び／または投与方法によって部分的に決定される。したがって、様々な好適な製剤がある。例えば、医薬組成物は、防腐剤を含有し得る。好適な防腐剤は、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、及び塩化ベンザルコニウムを含み得る。特定の実施形態では、２つ以上の防腐剤の混合物が使用される。防腐剤またはその混合物は、典型的には、全組成物の約０．０００１重量％～約２重量％の量で存在する。担体は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、それらとしては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール、もしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、緩衝剤が組成物に含まれる。好適な緩衝剤としては、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他の様々な酸及び塩が挙げられる。特定の実施形態では、２つ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、全組成物の約０．００１重量％～約４重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法が知られている。例示的方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；２１ｓｔ ｅｄ．（Ｍａｙ １，２００５）に、より詳細に記載されている。
製剤には水溶液を含めることができる。製剤または組成物は、細胞を用いて処置されている特定の適応症、疾患、または症状に対して有用な２つ以上の活性成分、例えば、細胞にとって補完的な活性（個々の活性が互いに悪影響を及ぼさない）を有するものを含んでいてもよい。このような活性成分は、意図される目的に有効な量で、組み合わせて好適に存在する。したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物には更に、他の薬学的に活性な薬剤または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、及び／またはビンクリスチンが含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物には、細胞が、疾患または症状を処置または予防するのに有効な量（例えば、治療有効量または予防有効量）で含まれる。いくつかの実施形態では、治療または予防有効性を、処置した対象の定期評価によってモニタリングする。所望の投与量を、細胞の単回のボーラス投与、細胞の複数回のボーラス投与、または細胞の持続注入投与によって送達することができる。
製剤には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、経肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、頬側投与、舌下投与、または坐剤投与のためのものが含まれる。特定の実施形態では、細胞集団は、非経口投与される。「非経口」という用語は、本明細書で使用される場合、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣内投与、及び腹腔内投与を含む。特定の実施形態では、細胞は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射による末梢全身性送達を使用して対象に投与される。特定の実施形態では、組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供される。これらは、いくつかの態様では、選択したｐＨまで緩衝され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、及び固体組成物よりも調製が容易である。更に、液体組成物の方が投与（特に注射による）がいくらか簡便である。他方で、粘性組成物は、特定組織とのより長い接触時間が得られるように、適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物に担体を含めることができ、担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、及びそれらの好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒体であり得る。
滅菌注射用溶液は、溶媒に細胞を取り入れることによって（例えば、好適な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合して）調製することができる。投与経路及び所望する調製物に応じて、組成物に補助物質、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化添加剤もしくは粘性増強添加剤、防腐剤、香味剤、及び／または着色剤を含めることができる。いくつかの態様では、標準テキストを参考にして好適な調製物が調製され得る。
組成物の安定性及び無菌性を高める様々な添加物（抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、及び緩衝液を含む）を加えることができる。微生物の活動の防止を、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、及びソルビン酸）によって確実にすることができる。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによって注射用剤形の持続的吸収を延長させることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏ投与用に使用される製剤は通常、滅菌されている。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に実現することができる。
本明細書において言及または引用した論文、特許、及び特許出願、ならびに他の全ての文献及び電子的に利用可能な情報の内容は、それぞれの個々の刊行物が参照により組み込まれることを具体的及び個別に示す場合と同じ程度まで、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。出願人は、任意のそのような論文、特許、特許出願、または他の物理的文書及び電子文書からのありとあらゆる材料及び情報を本出願に物理的に組み込む権利を留保する。
本開示をその具体的な実施形態に関して説明したが、本開示の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を施してもよく、均等物を代用してもよいことを当業者であれば理解されたい。本明細書で開示した実施形態の範囲から逸脱することなく好適な均等物を使用して、本明細書に記載の方法の他の好適な改変及び適合を施してもよいことが、当業者には容易に明らかとなるであろう。加えて、本開示の目的、趣旨、及び範囲に特定の状況、材料、組成物、プロセス、処理工程（複数可）を適合させるために、多くの改変を施してもよい。全てのこのような改変は、添付の特許請求の範囲内であることが意図されている。特定の実施形態について詳細に説明したが、同じことが、以下の実施例を参照することにより、更に明瞭に理解される。以下の実施例は、単に説明の目的上含まれており、限定は意図されていない。
Ｋ．実験的実施例
以下の実施例は、当業者に対して、本発明で取り上げる方法及び組成物の作製方法及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するために提示されており、本発明者らが自身の発明と見なすものの範囲を限定することを意図しない。使用する数字（例えば、量、温度など）に対する正確さを確保するための努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
実施例１：腫瘍抗原非依存性抗腫瘍応答を増進させるための外来抗原特異的Ｔ細胞の作製
研究グレードで市販されている、外来抗原に対する特異性を有する外来抗原特異的ＴＣＲを発現する操作Ｔ細胞またはＣＡＲ－Ｔ細胞が入手不可であることから、ＣＭＶ特異的Ｔ細胞クローンを、外来抗原で標識した腫瘍に対するエフェクターＴ細胞応答を誘導する外来抗原特異的Ｔ細胞の有効性を検討するためのツールとして使用した。
材料及び方法
ＣＲＭ１９７とＣＭＶｐｐ６５ ４９５－５０３とのカップリング（ＦＩＴＣ－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＧＧＣ）：
ＣＭＶｐｐ６５ ４９５－５０３ペプチドは、Ｃ末端ＧＧＣ及びＮ末端ＦＩＴＣを有する。ＣＲＭ１９７－マレイミドへのカップリングは、遊離システインを介して行う。最適なカップリング、及びＣＲＭ１９７－マレイミドとＣＭＶｐｐ６５ペプチドの様々な比率について、様々な条件を評価した。カップリング後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５Ｍカラムを使用したサイズ排除クロマトグラフィーを実施して、カップリングしたＣＲＭ１９７－ＦＩＴＣ－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ－ＧＧＣを、カップリングされていないＦＩＴＣ－ＮＬＶＰＭＶＡＴＶから分離した。カップリングのＱＣをウエスタンブロットを介してモニタリングした。
ＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンによるＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞の殺傷：
ＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンを様々なＥ：Ｔ比（例えば、０、１：１、２：１、５：１、１０：１）で腫瘍細胞とともに培養することにより、腫瘍殺傷を評価した。
ＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘアッセイ（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ）を使用して、活性化ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷を、６０分間のインキュベーション時間後に評価した。このアッセイで、腫瘍細胞内部の細胞溶解酵素グランザイムＢ（ＧｒｚＢ）の活性量を可視化した。腫瘍細胞での蛍光色素標識基質（ＴＦＬ４）の活性ＧｒｚＢへの結合を、フローサイトメトリーによって可視化した。ＴＦＬ４で標識し、ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞の非存在下でインキュベートした腫瘍標的細胞を陰性対照とした。
ＣＤ８ Ｔ細胞の脱顆粒のマーカーであり、細胞溶解の必要条件であるＣＤ１０７ａ発現の評価を、フローサイトメトリーを使用して実施した。ＢＤ ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用してフローサイトメトリー分析を実施した。ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してデータを分析した。
実験
ＣＲＭ１９７にカップリングしたＣＭＶｐｐ６５抗原のＤＣＯｎｅ ｍＤＣ媒介性内在化
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣを培養し、ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドを４時間及び２４時間負荷した。細胞を収集し、洗浄して、トリパンブルー（ＴＢ）を用いてまたは用いずにフローサイトメトリーにより評価した。トリパンブルーは、抗原の細胞外結合を抑制し、表面結合抗原と内在化抗原との区別を可能にする。図１は、ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドのＤＣＯｎｅ ｍＤＣ細胞における取り込み率を示すプロットである。いかなる理論にも束縛されるものではないが、ＤＣＯｎｅ ｍＤＣ上のＨＢ－ＥＧＦ受容体は、コンジュゲートしたＣＲＭ１９７リガンドを介してＣＭＶｐｐ６５ペプチドの取り込みを促進した。
ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞クローンへのＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５のＤＣＯｎｅ ｍＤＣ媒介性のプロセシング及び提示：
ＤＣＯｎｅ ｍＤＣを培養し、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート、ＣＲＭ１９７、またはＣＭＶｐｐ６５短鎖ペプチド（ＳＰ）を５時間負荷した。負荷後、負荷したＤＣＯｎｅ ｍＤＣをＣＭＶｐｐ６５－Ｔ細胞と２４時間共インキュベートし、培地に分泌されたＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡで評価した。図２は、示す通りに負荷したＤＣＯｎｅ ｍＤＣの培地中で検出されたＩＦＮ－γのレベルを示すプロットである。
ＣＲＭ１９７にカップリングしたＣＭＶｐｐ６５抗原の腫瘍細胞株による内在化
ＯＶＣＡＲ３、ＯＶ９０、及びＵ８７ＭＧ細胞を含む様々な腫瘍細胞の標識効率を、ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチド及びＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドと様々な腫瘍細胞を４時間及び２４時間インキュベートすることにより評価した。細胞を収集し、洗浄して、トリパンブルー（ＴＢ）を用いてまたは用いずにフローサイトメトリーにより評価した。図３Ａ～３Ｃは、ＯＶＣＡＲ３細胞（図３Ａ）、ＯＶ９０細胞（図３Ｂ）、及びＵ８７ＭＧ細胞（図３Ｃ）におけるＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣまたはＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５－ＦＩＴＣペプチドの取り込み率を示すプロットである。
ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート／ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞を殺傷するＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンの細胞傷害能力の評価
外来抗原特異的Ｔ細胞の細胞傷害能を試験するために、ＣＲＭ－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲートをパルスしたＤＣＯｎｅ ｍＤＣで刺激したＣＭＶｐｐ６５ Ｔ細胞クローンを、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５コンジュゲート／ペプチドでマーキングしたＨＬＡ－Ａ２＋腫瘍細胞とともに、５：１のエフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比でインキュベートした。２４時間後、共培養物から上清を収集し、エフェクターサイトカインＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡで分析した（図４Ａ）。
別の実験では、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでマーキングした腫瘍細胞株によるＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の刺激により、ＣＤ１０７ａ発現が増加することが判明した（図４Ｂ）。ＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５ペプチドコンジュゲートを負荷した腫瘍細胞の存在下または非存在下で２４時間培養し、続いて、フローサイトメトリーを使用してＣＤ１０７ａの発現を測定することにより、細胞内の細胞溶解性顆粒について分析した。ＨＬＡ欠損細胞株Ｋ５６２を陰性対照とした。図４Ｂでは、提示したデータは培地対照と比較した増加倍率である。データは、３～４回の独立した実験の平均±ＳＥＭとして提示している。
腫瘍細胞殺傷をアッセイするために、３つの異なる腫瘍細胞株にＣＲＭ１９７－ＣＭＶｐｐ６５ペプチドコンジュゲートを一晩負荷した。ＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘアッセイ（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ）を使用して、活性化ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷を、６０分間のインキュベーション時間後に評価した。このアッセイは、腫瘍細胞内部の細胞溶解酵素グランザイムＢ（ＧｒｚＢ）の活性量を可視化する。また、腫瘍細胞での蛍光色素標識基質（ＴＦＬ４）の活性ＧｒｚＢへの結合を、フローサイトメトリーによって可視化する。
腫瘍細胞株を蛍光細胞リンカー色素ＴＦＬ４で標識し、蛍光発生性グランザイムＢ基質の存在下で、ＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞とエフェクター：標的比５：１で１時間共インキュベートした。図４Ｃに示すように、ＣＭＶｐｐ６５特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞との共インキュベーションにより、マルチチャネルフローサイトメトリーにより検出される腫瘍細胞株における蛍光の検出が増加した。グランザイムＢ基質の切断後の標的腫瘍細胞株における蛍光発生性グランザイムＢの活性を、ＧｒａｎＴｏｘｉＬｕｘ（商標）キット（ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｉｎ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）を使用して測定した。ＨＬＡ欠損細胞株Ｋ５６２を陰性対照とした。図４Ｃでは、提示したデータは培地対照と比較した増加倍率である。データは、４回の独立した実験の平均±ＳＤとして提示している。

Claims (74)

  1. 腫瘍の処置を必要とする対象において前記腫瘍を処置するための方法であって、
    前記対象の前記腫瘍部位に第１の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、前記第１の組成物が腫瘍非依存性抗原を含む、前記腫瘍マーキング工程と、
    腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞を前記対象に導入することと、
    を含む、前記方法。
  2. 前記対象が、前記腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記既存免疫が、前記腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有するメモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞を含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記腫瘍非依存性抗原が、前記腫瘍の細胞によって内在化される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  5. 前記腫瘍非依存性抗原が、ペプチド、核酸、またはタンパク質である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  6. 前記腫瘍非依存性抗原が、担体を介して提供される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  7. 前記担体が、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項６に記載の方法。
  8. 前記担体が、公知の細胞内在化機構を有する担体タンパク質である、請求項６に記載の方法。
  9. 前記担体タンパク質が、前記腫瘍の細胞に含まれる受容体のリガンドである、請求項８に記載の方法。
  10. 前記担体タンパク質がジフテリア毒素またはそのバリアントであり、前記受容体がＨＢ－ＥＧＦ受容体である、請求項９に記載の方法。
  11. 前記ジフテリア毒素またはそのバリアントが、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記腫瘍非依存性抗原が、受容体媒介エンドサイトーシスを介して前記腫瘍の細胞によって内在化される、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  13. 前記腫瘍非依存性抗原が、ヒトである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  14. 前記腫瘍非依存性抗原が、非ヒトである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記腫瘍非依存性抗原が、ウイルス、細菌、または真菌起源のものである、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記腫瘍非依存性抗原が、アレルゲン、毒素、または毒液である、請求項１４または１５に記載の方法。
  17. 前記腫瘍非依存性抗原が、ジフテリア毒素またはその非毒性バリアントである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記腫瘍非依存性抗原が、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記腫瘍非依存性抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記腫瘍非依存性抗原が、ｐｐ６５ペプチドである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記腫瘍非依存性抗原が、リコール抗原である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  22. 前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞が、前記患者に対して自家である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞が、前記患者に対して同種である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  24. 前記導入することが、前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞のｅｘ ｖｉｖｏでの作製を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  25. 前記導入することが、前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの作製を含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
  26. 前記腫瘍が、液性腫瘍である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記腫瘍マーキング工程が、前記第１の組成物を前記腫瘍内または前記腫瘍近位に投与することを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  29. 前記腫瘍マーキング工程が、前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入後に実施される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  30. 前記腫瘍マーキング工程が、前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入前に実施される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  31. 前記腫瘍マーキング工程が、前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞の導入と実質的に同時に実施される、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞が、腫瘍非依存性抗原特異的Ｔ細胞である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  33. 前記腫瘍非依存性抗原特異的免疫細胞が、免疫受容体を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  34. 前記免疫受容体が、天然または合成免疫受容体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 前記免疫受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である、請求項３３または３４に記載の方法。
  36. 前記ＣＡＲが、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び共刺激ドメインと一次シグナル伝達ドメインとを含む細胞内ドメインを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 前記抗原結合ドメインが、完全長抗体もしくはその抗原結合断片、Ｆａｂ、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、または単一ドメイン抗体を含む、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記抗原結合ドメインが、前記腫瘍非依存性抗原に特異的である、請求項３５または３６４に記載の方法。
  39. 前記ＣＡＲが、ヒンジ領域を更に含む、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記ヒンジ領域が、抗体のＦｃ断片、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工ヒンジドメイン、ＣＤ８のアミノ酸配列を含むヒンジ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるヒンジドメインである、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記膜貫通ドメインが、人工疎水性配列、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、またはＣＤ１５４、及びキラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）由来の膜貫通ドメインからなる群から選択される、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記細胞内ドメインが、共刺激シグナル伝達ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３６～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記共刺激シグナル伝達ドメインが、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＰＤ－１、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ８３Ｌ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）からなる群から選択されるタンパク質の共刺激ドメインのうちの１つ以上と、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）またはそのバリアントに由来する細胞内ドメインと、を含む、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３ζ）の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を保有する細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及びＣＤ６６ｄ、またはそれらのバリアントからなる群から選択される細胞内ドメインを含む、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 前記ＴＣＲが、前記免疫細胞または自家Ｔ細胞に対して内因性である、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の方法。
  46. 前記ＴＣＲが、前記免疫細胞または自家Ｔ細胞に対して外因性である、請求項３５～４４のいずれか１項に記載の方法。
  47. 前記ＴＣＲが、ＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖を含む、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。
  48. 前記ＴＣＲが、野生型ＴＣＲ、高親和性ＴＣＲ、及びキメラＴＣＲからなる群から選択される、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 前記ＴＣＲが、完全長ＴＣＲ、二量体ＴＣＲ、及び一本鎖ＴＣＲからなる群から選択される、請求項３５～４６のいずれか１項に記載の方法。
  50. 腫瘍の処置を必要とする対象において前記腫瘍を処置するための方法であって、
    前記対象の前記腫瘍部位に第１の組成物を投与することを含む腫瘍マーキング工程であって、前記第１の組成物が腫瘍非依存性抗原を含む、前記腫瘍マーキング工程と、
    腫瘍非依存性抗原特異的二重特異性抗体を前記対象に投与することと、
    を含む、前記方法。
  51. 前記対象が、前記腫瘍非依存性抗原に対する既存免疫を有する、請求項５０に記載の方法。
  52. 前記既存免疫が、前記腫瘍非依存性抗原に対する特異性を有するメモリーＴ細胞及び／またはメモリーＢ細胞を含む、請求項５０または５１に記載の方法。
  53. 前記腫瘍非依存性抗原が、前記腫瘍の細胞によって内在化される、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 前記腫瘍非依存性抗原が、ペプチド、核酸、またはタンパク質である、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。
  55. 前記腫瘍非依存性抗原が、担体を介して提供される、請求項５０～５４のいずれか１項に記載の方法。
  56. 前記担体が、腫瘍溶解性ウイルスである、請求項５５に記載の方法。
  57. 前記担体が、公知の細胞内在化機構を有する担体タンパク質である、請求項５５に記載の方法。
  58. 前記担体タンパク質が、前記腫瘍の細胞に含まれる受容体のリガンドである、請求項５７に記載の方法。
  59. 前記担体タンパク質がジフテリア毒素またはそのバリアントであり、前記受容体がＨＢ－ＥＧＦ受容体である、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記ジフテリア毒素またはそのバリアントが、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記腫瘍非依存性抗原が、受容体媒介エンドサイトーシスを介して前記腫瘍の細胞によって内在化される、請求項５０～６０のいずれか１項に記載の方法。
  62. 前記腫瘍非依存性抗原が、ヒトである、請求項５０～６１のいずれか１項に記載の方法。
  63. 前記腫瘍非依存性抗原が、非ヒトである、請求項５０～６２のいずれか１項に記載の方法。
  64. 前記腫瘍非依存性抗原が、ウイルス、細菌、または真菌起源のものである、請求項６３に記載の方法。
  65. 前記腫瘍非依存性抗原が、アレルゲン、毒素、または毒液である、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. 前記腫瘍非依存性抗原が、ジフテリア毒素またはその非毒性バリアントである、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。
  67. 前記腫瘍非依存性抗原が、ＣＲＭ１９７またはそのバリアントである、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。
  68. 前記腫瘍非依存性抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のペプチドである、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。
  69. 前記腫瘍非依存性抗原が、ｐｐ６５ペプチドである、請求項６３～６５のいずれか１項に記載の方法。
  70. 前記腫瘍非依存性抗原が、リコール抗原である、請求項５０～６９のいずれか１項に記載の方法。
  71. 前記二重特異性抗体が、第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインを含む、請求項５０～７０のいずれか１項に記載の方法。
  72. 前記第１の抗原結合ドメインが、前記腫瘍非依存性抗原に対する特異性を含む、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記第２の抗原結合ドメインが、免疫細胞に対する特異性を含む、請求項７１または７２に記載の方法。
  74. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ｉＮＫ Ｔ細胞、及びγδ Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項５０～７３のいずれか１項に記載の方法。
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