CN109706121A

CN109706121A - 一种基于碱基编辑的通用型car-t细胞及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN109706121A
Application number: CN201910075912.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋海娟; 尚小云; 刘慧莹; 徐凡丽; 马少文; 赵丹
Original assignee: Suzhou Mao Hang Bio Technology Co Ltd
Current assignee: Suzhou Mao Hang Bio Technology Co Ltd
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明属于免疫治疗领域，公开了一种基于碱基编辑的通用型CAR‑T细胞及其制备方法，以及该通用型CAR‑T细胞在制备肿瘤细胞治疗药物中的应用。本发明采用BE‑Plus系统敲除异体T细胞上的TRAC基因和B2M基因，优化了制备通用型CAR‑T细胞的技术方案，所得的CAR‑T细胞不产生宿主排斥反应，可以实现通用型CAR‑T细胞的异体回输。

Description

一种基于碱基编辑的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫细胞制备及免疫治疗领域，更具体的说涉及一种利用碱基编辑系统敲除TRAC和B2M双基因的通用型CAR-T细胞的制备方法及其应用。

背景技术

肿瘤一直以来都是困扰全世界的重大疾病，传统治疗方式包括手术、放疗、化疗和靶向治疗，这几种方法都有各自的局限。肿瘤免疫治疗是继手术、放疗、化疗后的新的治疗手段，尤其是免疫检查点单抗治疗与CAR-T细胞免疫治疗的崛起，免疫治疗的疗效逐渐获得肯定。2013年，《Science》杂志将肿瘤免疫治疗评选为年度十大科学突破之首。2016年1月，美国基于免疫治疗与靶向治疗发展，提出癌症“登月计划”。

嵌合抗原受体T细胞（CAR-T细胞）：CAR-T细胞治疗是利用基因工程技术将受试者T淋巴细胞体外转染嵌合受体CAR，形成对特定抗原有特异性识别能力的效应T细胞，经过体外扩增后回输到受试者体内，回输的CAR-T细胞通过高效特异的非MHC限制性方式识别特定的肿瘤细胞表面抗原，并对肿瘤细胞完成杀伤。2017年，FDA批准了靶向CD19的基于4-1BB的二代CAR-T产品上市。然而，CAR-T细胞在治疗肿瘤方面也有一些缺点：一是引起细胞因子风暴等副作用；二是目前过继细胞治疗还是基于自体细胞的回输疗法，需要抽取病人一定量的外周血，之后在体外对T淋巴细胞进行修饰改造以及体外扩增，修饰好的自体T细胞增殖到一定数目再回输回病人体内，但是大部分病人尤其是肿瘤病人在进行CAR-T细胞治疗前，经过了放化疗等，免疫系统已经遭到破坏，其自身的T细胞数量、活性及增殖能力有所衰减，这些障碍限制了自体外周血单核细胞的使用，影响了CAR-T细胞治疗和肿瘤临床治疗的应用和发展。因此，针对范围更广，成本更低的通用型CAR-T细胞疗法的出现变得极为迫切。

有研究者把目光转向同种异体嵌合抗原受体细胞的回输，利用健康人外周血分离的T淋巴细胞进行同种异体细胞治疗，优势在于健康人的T细胞较多，活力和功能均优于肿瘤病人自体的T淋巴细胞。但也存在诸多障碍：一方面，供体CAR-T细胞进入受体病人体内，会产生强的移植物抗宿主反应（GVHD），同时，作为异体细胞受体体内也可能会存在宿主抗移植物反应（HVGR）。另一方面，应用免疫抑制类药物抑制受体免疫系统活性，可以排除HVGR，但同时又会影响CAR-T细胞的回输疗效；通过HLA配型预防GVHD，但HLA配型成功难度大，且耗时耗财。

中国专利201710983276.X公开了采取多基因敲除的方法同时抑制了T细胞抗原受体（TCR）和主要组织相容性复合体（MHCI，MHCII），制作通用型的CAR-T细胞的方法。T细胞受体（T cell receptor， TCR）是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子，外周血中主要为TCRα/β T细胞，是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。人类白细胞抗原（HLAs）是免疫细胞表面的一种蛋白，也被称为“移植抗原”，如果HLA不匹配，移植排斥的发生率就会非常高。HLA Ⅰ类基因几乎分布于身体全部细胞表面，是一个异二聚体，由重链（α链）与β2微球蛋白组成（B2M）。然而目前公开的技术方案是分为两步制备细胞：首先在T细胞活化24h后先进行CAR感染制备CAR-T细胞，随后再进行电转带有敲除目的基因的sgRNA的CRISPR/Cas9载体，最终成功构建通用型CAR-T细胞。该方法制备过程复杂，加上CRISPR-Cas9介导的基因编辑存在严重的脱靶效应，使其在临床应用上存在一定的安全隐患，

为了解决TCR和HLA所导致GVHD和CRISPR-Cas9所显示出的缺陷和局限性，本领域技术人员致力于开发能够简化、优化制备过程、降低制备成本的技术方案。本发明采用 BE-Plus系统来敲除异体T细胞上的TCR（TRAC基因）和HLA基因（B2M基因），以优化制备通用型CAR-T细胞的技术方案；所得的CAR-T细胞不产生宿主排斥反应，可以实现通用型CAR-T细胞的异体回输。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种通用型CAR-T细胞，该CAR-T细胞可以降低同种异体细胞治疗的免疫排斥反应，实现通用型CAR-T细胞的异体回输。

本发明要解决的技术问题之二是提供一种利用单碱基编辑系统进行基因敲除的通用型CAR-T细胞的制备方法，该制备工艺简化操作流程。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种通用型CAR-T细胞在抗肿瘤细胞治疗中的应用。

为解决以上问题，本发明采用如下技术方案：

为了提高基因编辑效率以实现在体基因编辑，本发明采用基于CRISPR/Cas9技术的单碱基编辑器（base editor, BE）。BE-PlUS系统优势在于，第一，与CRISPR-Cas9相比，BE-PLUS具有更高的编辑效率，较低的插入突变率以及更低的脱靶率；第二，与Cas9核酸酶介导的基因编辑相比，BEs可以高效修改点突变基因，是在体基因编辑的良好工具。BE-Plus双质粒系统（scFv-APOBEC-UGI，GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBEC N端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Work window由4-8 扩为4-16，使得效率变高。

BE-Plus双质粒系统基本原理为：BE Plus系统携带大鼠胞嘧啶脱氨酶APOBEC1的Cas9，可将胞嘧啶（C）转变为尿嘧啶（U），尿嘧啶DNA糖基酶抑制剂UDI抑制碱基切除修复机制，使UG配对得以保留，并在后续复制过程中，U替换成T，突变产物理论上可达50%。再通过dCas9和MMR机制，以UG中的U为模板，将UG替换修复成UA，后续复制变为TA，产率在15%~75%之间。使用的基因敲除方法为Istop，为在基因编码区内，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止。

本发明采用来源于鳞翅目昆虫的PiggyBac转座子，在哺乳动物宿主中活性较高，而且携带片段较大。另外，采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。

在本发明的第一方面，提供一种基因敲除的通用型CAR-T细胞。

作为本发明优选的技术方案，所述的CAR能识别抗原CD19，CD133，EGFRVⅢ，BCMA，CEA，CD20，Her2，MUC1，MSLN，LewisY，GPC3，c-met中的一种。

在本发明的实施方式中，术语MSLN-CAR指MSLN嵌合抗原受体，包含有靶向MSLN的scFv序列。

scFv：全称single-chain antibody fragment，即单链抗体片段。

在本发明的实施方式中，术语MSLN-scFv指抗MSLN单链抗体片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

作为本发明优选的技术方案，通用型CAR-T细胞敲除的基因为TRAC和B2M双基因，通用型CAR-T细胞采用的基因敲除方法是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

作为本发明优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，BE-Plus系统中TRAC-sgRNA和B2M-sgRNA寡核苷酸的设计和构建，具体步骤为：①明确待敲除TRAC和B2M基因的编码区（CDs）20bp-NGG目标序列（PAM序列），使其包含完整的目标密码子CAA、CAG、CGA；②目标单碱基C位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；③目标单碱基T位于目标序列的（左端）第1-16位，效率不一样，优选为第4-16位；并且目标密码子的上游紧邻碱基最好不能为G；④按照选定的特异性靶序列，分别合成正向具有5’- N20-NGG-3’特征的寡核苷酸链及与其互补的反向寡核苷酸链，通过退火获得互补寡核苷酸双链片段；⑤对pGL3-U6-sgRNA质粒进行线性化，并向反应体系中加入BsaⅠ内切酶进行酶切反应；⑥将步骤④和⑤中所获得双链sgRNA寡核苷酸与线性化的pGL3-U6-sgRNA质粒进行混合，并向体系中加入T4 DNA连接酶，进行连接；⑦将步骤⑥中所获得的连接产物转化DH5α感受态细胞并涂Amp⁺平板（50μg/ml）,并挑取克隆测序。通过对人TRAC和B2M基因序列进行分析，选定敲除TRAC和B2M的编码区，优化选出sgRNA，具体序列为：靶向TRAC和B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO：1-4所示：

TRAC-sgRNA-F：5’-ttcggaacccaatcactgac-3’ （SEQ ID NO.1）

TRAC-sgRNA-R：5’-gtcagtgattgggttccgaa -3’ （SEQ ID NO.2）

B2M-sgRNA-F：5’-ttaccccacttaactatctt-3’ （SEQ ID NO.3）

B2M-sgRNA-R：5’- aagatagttaagtggggtaa-3’ （SEQ ID NO.4）

所获的sgRNA核苷酸序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型的载体上。

在本发明的第二方面，提供一种TRAC和B2M双基因敲除的通用型CAR-T细胞的制备方法，该方法简单易行，具体步骤如下：

1)TRAC-sgRNA和B2M-sgRNA的设计、构建其功能验证；

2)从供者提供的外周血中分离外周血单个核细胞（perpheral blood mononuclearcell，PBMC），并从PBMC中分选出CD3阳性T细胞；

3)分别准备或制备scFv-CAR转座子，靶向TRAC的sgRNA质粒（pGL3-U6-TRAC-sgR BE），靶向B2M的sgRNA质粒（pGL3-U6-B2M-sgR BE），转座酶质粒、BE Plus双质粒；

4)利用转染系统，将步骤3）所得的scFv-CAR转座子质粒、转座酶质粒、BE-Plus双质粒、靶向TRAC的sgRNA质粒和靶向B2M的sgRNA质粒6种质粒共转染步骤2）所得的分选细胞；

5)将转染后的细胞进行体外培养并大量扩增；

6)生物素标记的TCR抗体和生物素标记的HLA抗体经磁珠分选出TRAC与B2M双基因敲除的CAR-T细胞，利用此方法实现快速、简单、高效、特异性敲除TRAC和B2M基因的通用型CAR-T细胞。

以上scFv-CAR转座子为表达嵌合抗原受体的质粒载体。

作为本发明优选的技术方案，所述的基因敲除方法是通过BE-Plus系统来实现，包括SV201-pGL3-U6-gRNA-Puromycin mut Bsa1 ACCG（图1），SV211-pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1（图2），SV209-pST1374-N-NLS-GCN4-D10A（图3）。

作为本发明优选的技术方案，步骤3）中所述scFv-CAR识别的靶标分子包括CD19，CD133，EGFRVⅢ，BCMA，CEA，CD20，Her2，MUC1，MSLN，LewisY，GPC3，c-met中的一种。所述scFv-CAR载体采用PiggyBac-transposon睡美人转座子系统，载体上依次串联人EF1α启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区scFv序列、c-myc表位标记、CD8 Hinge嵌合受体铰链区、CD8Transmembrane嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

作为本发明优选的技术方案，步骤3）中scFv-CAR质粒的包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244,2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合，优选为CD28-4-1BB；所述胞内信号传导区优选为CD28-4-1BB-CD3ζ，其中CD28核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，4-1BB核苷酸序列如SEQ IDNO.8所示，CD3ζ核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD8核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。胞内信号传导区可介导外源基因在宿主细胞内高效整合，并高效稳定表达。

本发明中转染的方式可以通过电转和lipo2000，lipo3000脂质体转染。

作为本发明优选的技术方案，步骤4）中转染方式优选为电转转染，通过电转体系将构建好的多个载体导入分选所得细胞。

本发明的第三方面，提供一种TRAC和B2M双基因敲除的通用型CAR-T细胞在抗肿瘤细胞治疗中的应用。

本发明与现有的技术相比，具有如下优点：

1)本发明优选采用第三代CAR，使用PiggyBac转座子系统提高了转染效率和转基因的表达效率，采用人自身的EF1α启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达，简化了CAR-T的制备程序，增强了系统的负载量。

2)本发明采用的质粒系统，制备工艺相对简单，通过转座酶将外源基因整合入基因组，操作简单而且整合效率相对较高。相对于逆转录病毒系统更安全。

3)本发明基于BE-PLUS基因编辑系统，将正常氨基酸密码子突变为终止密码子，使翻译过程提前终止，与“基础版”的CRISPR/Cas9系统相比，该系统在不引入DNA双链断裂也不需要重组修复模板的情况下实现更加安全，高效精准的单碱基编辑。

总的来说，异体来源的T细胞经过基因工程改造，可以克服自体CAR-T细胞面临的诸如重现性、制备时间，以及由慢病毒载体产生的CAR-T细胞倾向于由分化的T细胞亚群组成，与较差的体内耐受性相关等限制。结合第三代CAR-T技术制备一种可以异体回输的通用型CAR-T细胞，使CAR-T细胞能够同时应用于不同病人来杀伤肿瘤细胞，随时可以制备所需通用型CAR-T，及时回输病人。

附图说明

图1为本发明实施例1、2中SV201-pGL3-U6-gRNA-Puromycin mut Bsa1 ACCG载体图谱；

图2为本发明中实施例2中SV211-pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1基因结构图；

图3为本发明中实施例2中SV209-pST1374-N-NLS-GCN4-D10A基因结构图；

图4为本发明实施例3中TRAC和B2M基因突变率结果示图；

图5为本发明实施例4中SV009-PB-MSLN CAR-puro-3^rd载体图谱；

图6为本发明实施例4中super piggybac transposase质粒图谱；

图7为本发明实施例5中不同效靶比条件下，TRAC-B2M双敲除且靶向MSLN的CAR-T细胞和MSLN CAR-T细胞，分别对Raji人淋巴瘤细胞系杀伤效率折线图；

图8为本发明实施例5中不同效靶比条件下，TRAC-B2M双敲除且靶向MSLN的CAR-T细胞和靶向MSLN的CAR-T细胞、T细胞，分别对K562白血病细胞系杀伤效率折线图。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，具体说明发明的实施例不应解释为限制本分明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照制造商所建议的条件。除非另有说明，否则百分比按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

虽然在本发明的实施例中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处列举优选的材料和方法。

实施例1构建重组表达载体。

本发明中使用的单碱基编辑系统为BE-Plus：通过CT突变引入终止密码子，从而实现基因敲除。BE-Plus双质粒系统（scFv-APOBEC-UGI，GCN4-D10A），在D10A的N端接10个GCN4，APOBEC N端接一个scFv。这样GCN4-D10A可以招募10个scFv-APOBEC，使突变的机率增大。Work window由4-8 扩为4-16，使得效率变高。

本发明中使用SV201-pGL3-U6-gRNA-Puromycin mut Bsa1 ACCG（见图1）作为骨架载体，经过限制性内切酶Bsa1（NEB）酶切线性化，在T4连接酶作用下，与人工合成的sgRNA连接，形成重组载体。

TRAC-sgRNA与B2M-sgRNA的合成：选择sgRNA为反向sgRNA（CCA为目标密码子，GGG为PAM序列）。TRAC-sgRNA合成单向核苷酸序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2退火使之结合成双链黏性末端产物，导入SV201-pGL3-U6-gRNA-Puromycin mut Bsa1 ACCG质粒，制备质粒pGL3-U6-TRAC-sgR BE；B2M-sgRNA合成单向核苷酸序列SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4退火使之结合成双链黏性末端产物，导入SV201-pGL3-U6-gRNA-Puromycin mut Bsa1 ACCG质粒，制备质粒pGL3-U6-B2M-sgR BE。

实施例2 sgRNA功能验证。

1)细胞培养与转染。

A.使用电转试剂盒转染HEK293T细胞验证sgRNA的打靶效率，将 2 µg pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1（见图2）、 2.0 µg 的 pST1374-N-NLS-GCN4-D10A（见图3）、2µgpGL3-U6-TRAC sgRNA BE质粒与电转液混匀，共转染细胞， 6~8 小时后换液，并加入Blasticidin（invitrigen,ant-bl-1）和 Puromycin（invitrigen,ant-pr-1）药筛，48 小时后收取细胞。

B.使用电转试剂盒转染HEK293T细胞验证sgRNA的打靶效率，将 2 µg pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1（见图2）、 2.0 µg 的 pST1374-N-NLS-GCN4-D10A（见图3）、2µgpGL3-U6-B2M sgRNA BE质粒与电转液混匀，共转染细胞， 6~8 小时后换液，并加入Blasticidin（invitrigen,ant-bl-1）和 Puromycin（invitrigen,ant-pr-1）药筛，48 小时后收取细胞。

2) T7EN1 酶切检测。

将收集的细胞进行DNA提取，对目标基因进行PCR扩增后进行纯化回收。使用T7EN1酶切检测突变体，用 3%的琼脂糖胶电泳检测，并进行TA克隆测序，结果如图4所示，评估目标基因被切割后的效率。

结果显示TRAC和B2M基因突变率分别达到36%和48%。

实施例3 PBMC细胞制备及CD3 阳性T细胞的分选。

1)用采血袋采集健康人外周血（边采集边摇晃使得外周血与抗凝剂充分混合）80-100mL，于无菌的细胞制备车间分离PBMC。将外周血转移至50ml离心管中，室温800g，离心15分钟，吸取上层黄色自体血浆于新的50ml离心管中，56℃灭活30分钟，置于-20℃备用；向下层的细胞层加入等体积的PBS，上下颠倒混匀；

2)吸取15ml淋巴细胞分离液（Ficoll-Paque Plus, GE）于新的50ml离心管底部，并沿管壁缓慢加入30ml稀释血液至淋巴分离液上层，将离心管置于离心机，450g，慢升慢降离心25分钟，no break；

3) 离心结束后，小心吸取淋巴细胞分离液上方的白膜层细胞，转入一个新的50ml离心管中，加入50ml PBS清洗，300g，慢升慢降离心10min；

4) 弃上清，保留离心管底部的细胞沉淀；再次加入PBS 50ml，160g，慢升慢降离心15min；

5) 弃上清；最后加入PBS，300g，慢升慢降离心10min，弃上清，即得到PBMC细胞；

6) 按照CD3 T细胞分选试剂盒（EasySepTM Human T Cell Isolation Kit货号：#1795，厂商：STEMCELL）分选（5）PBMC中的CD3阳性T细胞，具体如下：

a）调整细胞密度为5×10⁷cells/mL，将细胞加入到5mL的细胞冻存管；

b）加入分离液Isolation Cocktail 50ul/mL，混匀后静置5分钟；

c）用涡旋仪将RapidSheresTM试剂涡旋30秒，使颗粒混合均匀，按照40ul/mL的比例添加到细胞中并混匀；

d）补加PBS至2.5mL并上下吹打2~3次，置于磁力架上3分钟；

e）倾斜磁力架将液体转移到新的细胞培养皿，即得到分选的CD3阳性T细胞。

实施例4 利用单碱基编辑系统制备TRAC和B2M双基因敲除通用型CAR-T细胞。

以靶向MSLN为例，即制备SV009-PB-MSLN CAR-puro-3^rd载体（图5所示），MSLN scFv序列如SEQ ID NO.5所示。

取2-3×10⁷ PBMC用含10%FBS的AIM-V培养基（含IL-2细胞因子）进行培养。将实施例2中特异性靶向TRAC和B2M基因的sgRNA质粒，与pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1、pST1374-N-NLS-GCN4-D10A载体质粒、SV009-PB-MSLN CAR-puro-3^rd载体质粒、superpiggybac transposase质粒（见图6）一起成功转染CD3阳性T细胞，扩增后进行测序，依据测序结果筛选具有敲除效果的电转细胞，用生物素标记的TCR抗体和生物素标记的HLA抗体经磁珠分选出TCR与HLA双基因敲除的通用型靶向MSLN的CAR-T细胞。

具体步骤为：将上述六种质粒各3.5μg与Amaxa电转试剂盒中的电转试剂混合，获得包含该六种质粒的100μl电转混合液，其中原始质粒pGL3-U6-sgRNA、pST1374-scFv-APOBEC-UGI-GB1 和pST1374-N-NLS-GCN4-D10A 3个质粒作为对照；将所述两组电转混合液加入2-3×10⁶个PBMC细胞中进行电转；细胞转染2h后换液，采用偶联CD3/CD28抗体的磁珠富集CD3阳性T细胞；转染5-6天后加入0.5μg/ml的 puromycin，筛选并培养扩增转染后的T细胞，用生物素标记的TCR抗体和生物素标记的HLA抗体经磁珠分选出TCR与HLA双基因敲除的通用型靶向MSLN的CAR-T细胞。CAR-T细胞在体外培养满足治疗用细胞数目后，抽取部分T细胞，做无菌检测，T细胞表型检测，满足临床治疗CAR-T细胞释放标准后才可用于治疗。

实施例5 利用单碱基编辑系统制备TRAC和B2M双基因敲除且靶向MSLN的通用型CAR-T细胞体外杀伤验证。

分别培养K562细胞、Raji细胞和效应细胞TRAC-B2M双基因敲除且靶向MSLN的CAR-T细胞（TRAC-B2M^KO MSLN CAR-T）、靶向MSLN的CAR-T细胞与T细胞。

收集靶细胞（K562、Raji）各4×10⁵ cells和效应细胞（CAR-T细胞）各3×10⁶cells，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；用1ml PBS溶液分别重悬靶细胞和效应细胞，300g，离心10min，慢升慢降，弃上清；重复一次；用700μl培养基（AIM-V培养基+10%FBS）重悬效应细胞，用2ml培养基（1640培养基+10%FBS）重悬靶细胞。

设置效靶比为1:1、5:1、10:1、20:1的实验孔，并设置对照组，每组3个复孔，37℃5% CO₂培养箱中培养2h；500g，离心5min，慢升慢降平板离心；取每个孔的20μl上清到新96孔板中，并且每孔加入50μl底物溶液（避光操作），室温避光孵育15min；每孔加入50μl终止液，酶标仪检测490nm吸光度。结果如图7、8所示，不同效靶比条件下，TRAC-B2M双基因敲除且靶向MSLN的CAR-T细胞在Raji靶细胞系中和在K562白血病细胞系中杀伤效率明显强于患者自体来源的T细胞；当效靶比为20:1时，本发明制得的TRAC-B2M^KO MSLN CAR-T细胞肿瘤杀伤能力分别为60%和42%，而单独的MSLN CAR-T细胞肿瘤杀伤能力为55%和36%。

序列表

<110> 苏州茂行生物科技有限公司

<120> 一种基于碱基编辑的通用型CAR-T细胞及其制备方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcggaaccc aatcactgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtcagtgatt gggttccgaa 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttaccccact taactatctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aagatagtta agtggggtaa 20

<210> 5

<211> 845

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tactctagag ccaccatgct gctgctggtc acttctctgc tgctgtgcga actgccccac 60

cccgcctttc tgctgattcc cggcagccag gtgcagctgc agcagtccgg accagagctg 120

gagaagcctg gagcctccgt gaagatcagc tgcaaggcca gcggctactc cttcaccggc 180

tatacaatga actgggtgaa gcagagccac ggcaagtccc tggagtggat cggcctgatc 240

accccctaca acggcgccag ctcctataat cagaagtttc ggggcaaggc caccctgaca 300

gtggacaagt ctagctccac cgcctatatg gacctgctgt ctctgacaag cgaggattcc 360

gccgtgtact tctgcgcaag gggaggatat gacggaagag gctttgatta ctggggccag 420

ggcaccacag tgaccgtgtc tagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg atcctctggc 480

ggcggctctg acatcgagct gacacagtcc ccagcaatca tgtctgccag cccaggagag 540

aaggtgacca tgacatgttc cgccagctcc agcgtgagct acatgcactg gtatcagcag 600

aagtctggca ccagccctaa gaggtggatc tatgatacat ctaagctggc aagcggagtg 660

ccaggccgct tctccggctc tggcagcggc aattcctact ctctgaccat cagctccgtg 720

gaggccgagg acgatgccac atactattgt cagcagtgga gcaagcaccc tctgacctac 780

ggcgccggca caaagctgga gatcaaggcc tccgaacaga aactgatttc cgaggaagat 840

ctgtt 845

<210> 6

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttcgtccccg tgttcctgcc tgccaagcca acaactaccc ctgctccacg accacctact 60

ccagcaccta ccatcgcaag tcagcccctg tcactgcgac ctgaggcttg ccggccagca 120

gctggaggag cagtgcacac ccgaggcctg gacttcgcat gcgatatcta catttgggca 180

ccactggctg gaacctgtgg ggtcctgctg ctgagcctgg tcatcaccct gtattgtaac 240

cacagaaat 249

<210> 7

<211> 123

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggagcaaac gctcccgact gctgcattcc gactacatga acatgacacc tcggagacca 60

ggccccacta gaaagcatta ccagccatat gccccaccca gggatttcgc agcctatcgg 120

agc 123

<210> 8

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cggttcagcg tcgtgaaaag ggggcgcaag aaactgctgt acatcttcaa gcagcctttt 60

atgcgcccag tgcagacaac tcaggaggaa gacggatgct cttgtcggtt cccagaggag 120

gaggaaggag gctgcgagct g 141

<210> 9

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agagtgaagt tcagccggag cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60

tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gaatatgacg tgctggataa gcgacgagga 120

cgggaccccg aaatgggagg aaaacccaga aggaagaacc ctcaggaggg gctgtataat 180

gaactgcaga aagacaagat ggctgaggca tacagcgaaa ttggaatgaa aggagagcgc 240

cgacggggga agggacacga tgggctgtac cagggactgt caaccgccac taaagatacc 300

tacgacgcac tgcacatgca ggctctgccc ccaagatga 339

Claims

1.一种通用型CAR-T细胞，其特征在于，TRAC和B2M双基因敲除且表达靶向特定抗原的嵌合抗原受体的T细胞，采用的基因敲除是通过BE-Plus系统或Cas9、ZFN、TALEN基因敲除方法来实现。

2.如权利要求1所述的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述的基因敲除通过BE-Plus系统来实现，具体为：选定基因敲除的位点，设计靶点序列sgRNA，随后筛选出靶点序列，具体如下所示：

TRAC-sgRNA-F：如SEQ ID NO.1所示；

TRAC-sgRNA-R：如SEQ ID NO.2所示；

B2M-sgRNA-F：如SEQ ID NO.3所示；

B2M-sgRNA-R：如SEQ ID NO.4所示；

所述的靶点序列可用于质粒载体上，慢病毒载体上，或用于逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或其他类型的载体上。

3.如权利要求1或2所述的通用型CAR-T细胞，其特征在于，所述的嵌合抗原受体识别抗原CD19，CD133，EGFRVⅢ，BCMA，CEA，CD20，Her2，MUC1，MSLN，LewisY，GPC3，c-met中的一种。

4.如权利要求3所述的通用型CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）从供者提供的外周血中分离PBMC，并从PBMC中分选出CD3阳性T细胞；

（2）利用转染系统，将表达嵌合抗原受体的质粒、转座酶质粒、BE-Plus双质粒、靶向TRAC的sgRNA质粒和靶向B2M的sgRNA质粒共转染步骤（1）所得的CD3阳性T细胞；

（3）将转染后的细胞进行体外扩增培养，利用分选方法分选出TRAC与B2M双基因敲除的CAR-T细胞，收集并对其进行检测。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述表达嵌合抗原受体的质粒为scFv-CAR转座子质粒，优选采用PiggyBac-transposon睡美人转座子系统，载体上依次串联启动子、信号肽、胞膜外抗原结合区scFv序列、c-myc表位标记、铰链区、嵌合受体跨膜区、胞内信号传导区和T2A短肽连接的抗性基因puromycin制备而成的。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域选自4-1BB、CD28、CD27、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、LIGHT、B7-H3、特异性结合CD83的配体、ICAM-1、HVEM(LIGHTR)、CD160、淋巴细胞功能相关的抗原-1（LFA-1）、IL2Rα、CD103、CD11b、CD11c、TRANCE/RANKL、SLAMF4(CD244, 2B4)、CD69、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)中的一种或多种的任意组合。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述启动子为人EF1α启动子，所述胞内信号传导区包含编码共刺激因子区域，该共刺激因子区域为CD28-4-1BB，所述胞内信号传导区为CD28-4-1BB-CD3ζ，铰链区为CD8 Hinge嵌合受体铰链，跨膜区为CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中所述的靶向TRAC的sgRNA质粒是通过将SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得；所述的靶向B2M的sgRNA质粒是通过将SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4所示的靶点序列退火获得的互补寡核苷酸双链片段导入pGL3-U6-sgRNA质粒所得。

9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，其步骤（2）中转染的方法优选电转转染方式，将构建好的多个质粒利用电转的方式转染入目标细胞中。

10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述分选方法为利用生物素标记的TCR抗体和生物素标记的HLA抗体经磁珠分选出TRAC与B2M双基因敲除的CAR-T细胞。

11.如权利要求3所述的通用型CAR-T细胞的用途，其特征在于，用于制备靶向特定抗原的抗肿瘤的细胞治疗药物。

12.如权利要求3所述的通用型CAR-T细胞在异体治疗药物中的应用。