CN106103475A - 产生同种异体移植相容的t细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及工程化的T细胞，其制备方法及其作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本发明的工程化的T细胞特征在于β2‑微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达受到抑制，例如，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M和/或CIITA的基因的稀切核酸内切酶，或通过使用抑制B2M和/或CIITA表达的核酸分子。为了进一步赋予T细胞非同种反应性，至少一个编码T细胞受体组件的基因被失活，例如，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码所述TCR组件的基因的稀切核酸内切酶。另外，可以在这些修饰的T细胞上实施免疫抑制性多肽的表达以延长这些修饰的T细胞在宿主生物体中的存活。这种修饰的T细胞特别适合于同种异体移植，由其是因为它既降低了被宿主的免疫系统的排异风险，又降低了发展移植物抗宿主病的风险。本发明开辟了使用T细胞用于治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的标准和可承受的继承性免疫疗法策略的途径。

Description

产生同种异体移植相容的T细胞的方法

技术领域

本发明涉及工程化的T细胞，它们的制备方法及它们作为药物、特别是用于免疫疗法的用途。本发明的工程化的T细胞特征在于β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达受到抑制，例如，通过使用经DNA切割编码B2M和/或CIITA的基因而能够选择性失活的稀切核酸内切酶，或通过使用抑制B2M和/或CIITA的表达的核酸分子。为了进一步赋予T细胞非同种反应性(non-alloreactive)，至少一个编码T细胞受体组件的基因被失活，例如，通过使用经DNA切割编码所述TCR组件的基因而能够选择性失活的稀切核酸内切酶。另外，可以在这些修饰的T细胞上进行免疫抑制性多肽如病毒MHCI同源物或NKG2D配体的表达的步骤以便延长这些修饰的T细胞在宿主生物体中的存活。这种修饰的T细胞特别适合于同种异体移植，由其是因为它既降低了由宿主免疫系统排异的风险又降低了发展移植物抗宿主病的风险。本发明开辟了使用T细胞用于治疗癌症、感染和自身免疫性疾病的标准的和可承受的继承性免疫疗法策略的途径。

背景技术

继承性免疫疗法，涉及离体(ex vivo)产生的自体抗原特异性T细胞的转移，是治疗病毒感染和癌症的有前途的策略。可以通过抗原特异性T细胞的扩增或通过遗传设计的T细胞重定向产生继承性免疫疗法使用的T细胞(Park，Rosenberg et al.2011)。

通过转基因的T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)的遗传转移而成功产生T细胞中的新特异性(Jena，Dotti et al.2010)。CAR是由这样的靶向部分组成的合成受体：该靶向部分与在单个融合分子中的一个或多个信号结构域相关。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，包括由柔性接头连接的单克隆抗体的轻的和可变的片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。用于第一代CAR的信号结构域源自CD3ζ或Fc受体γ链的细胞质区域。已证明第一代CAR成功地重定向了T细胞的细胞毒性，然而，它们没能提供在体内的(in vivo)延长的扩增和抗肿瘤活性。来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)在内的共刺激分子的信号结构域已被单独加入(第二代)或组合加入(第三代)以增强存活率和提高CAR修饰的T细胞的增殖。CAR已经成功地使T细胞重定向于表达于来自包括淋巴瘤和实体肿瘤在内的各种的恶性肿瘤的肿瘤细胞表面上的抗原(Jena，Dotti et al.2010)。

使用继承性免疫疗法治疗患者的目前方案基于自体细胞转移。在这种方法中，从患者中回收T淋巴细胞，离体遗传修饰或选择，体外培养而必要时扩增细胞数量，并最后输注到患者体内。除了淋巴细胞输注之外，可以以支持T细胞的植入或它们在免疫应答中的参与的其他方式操纵宿主，这些方式例如是(用辐射或化疗)预调节和给予淋巴细胞生长因子(如IL-2)。每个患者接收单独制备的治疗，使用患者的自身淋巴细胞(即自体疗法)。对于实际应用，自体疗法面临大量技术性后勤障碍，它们的产生需要昂贵的专用设备和专家人员，它们必须在患者的诊断之后很短的时间内产生，并且在许多情况下，患者的预治疗已经导致了退化的免疫功能，而使患者的淋巴细胞可能功能不良并以非常低的数量存在。因为这些障碍，每个患者的自体细胞制备实际上是一种新产品，从而在效力和安全性方面产生大幅变化。

在理想情况下，人们希望使用标准化的疗法，其中同种异体治疗细胞能够预先制备，详细表征，并可用于立即给予于患者。对于同种异体，它是指获自属于相同物种但遗传上相异的个体的细胞。然而，使用同种异体细胞目前存在很多缺点。在免疫活力的宿主中，同种异体细胞迅速受到排异，这是一种称为宿主抗移植物排异(HvG)的过程，而这基本限制了转移细胞的效力。在免疫无活力的宿主中，能够植入同种异体细胞，但它们的内源性T细胞受体(TCR)特异性可能将宿主组织识别为外来物，导致移植物抗宿主病(GvHD)，这可能会导致严重的组织损伤和死亡。

为了提供同种异体T细胞，本发明人先前公开了遗传设计T细胞的方法，其中，通过使用以商标TALEN^TM(Cellectis，8，rue de la Croix Jarry，75013PARIS)更广为人知的特异性TAL核酸酶失活不同的效应子基因，具体而言是编码T细胞受体的那些。已经证明在使用RNA转染作为容许同种异体T细胞规模生产的平台的部分时在原代细胞中这种方法是高度有效的(WO 2013/176915)。

β-2微球蛋白，也称为B2M，是MHC I类分子的轻链，并因此是主要组织相容性复合体的不可缺少的部分。在人类中，由位于15号染色体上、与在6号染色体上以基因簇定位的其他MHC基因相对的b2m基因编码B2M。人类蛋白由119个氨基酸(SEQ ID NO:1)组成，并具有11.800道尔顿的分子量。β-2微球蛋白缺陷的鼠模型已经证明，B2M是MHC I类的细胞表面的表达和肽结合槽的稳定性所必需的。这进一步表明，由于β-2微球蛋白基因中的靶向的突变，来自正常细胞表面MHC I类表达缺陷的小鼠的造血移植物(haemopoietic transplant)受到正常小鼠中的NK1.1+细胞排异，提示MHC I分子表达的缺失导致易受宿主免疫系统排异的骨髓细胞(Bix et al.1991)。

CIITA蛋白(SEQ ID NO:4-NCBI参考序列：NP_000237.2)充当了II类主要组织相容性复合体基因转录(包括β2m基因转录)的正调节子，并通常称为是这些基因表达的“主控制因子”。CIITA mRNA(SEQ ID NO:5)只能在人类白细胞抗原(HLA)系统II类阳性细胞系和组织中检测到。这种高度受限的组织分布提示HLA II类基因的表达很大程度上受控于CIITA(Mach B.，et al.1994)。

继承性免疫应答是其中众多的细胞组件相互作用的复杂生物系统。专门的抗原呈递细胞(APC)能够处理异物并在MHC II类分子的情况下将异物暴露于辅助性T细胞。激活的辅助性T细胞会反过来刺激B细胞应答和细胞毒性T(CTL)细胞应答。CTL识别由MHC I类分子呈递的外源肽，但在同种异体反应性的情况下，识别和杀死带有外源MHC I类的细胞。MHC I类分子是由2个实体组成：高度多态性的跨膜重链和小的不变多肽，由B2M基因编码的β2-微球蛋白(β2-m)。MHC I类重链在细胞表面上的表达需要其与β2-m的关联。因此，在CAR T细胞中终止(abrogation)β2-M的表达会损害MHC I类的表达并且使得它们对宿主CTL是不可见的。然而，MHC I类缺陷型CASR T细胞易于被宿主NK细胞裂解，这些宿主NK细胞靶向缺陷的MHC I类分子的细胞[Ljunggren HG et al.(1990)，Immunl Today.11:237-244]。

NK细胞向与其相互作用的细胞基于它们通过不同单态或多态性受体收到的激活和抑制信号之间的平衡发挥细胞毒性功能。人类NK细胞上的一个中心的活化受体是NKG2D并且其配体包括诸如MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3的蛋白质[Raulet DH，(2003)，NatureReviews Immunology 3(10):781-79]。另一方面，通过像LIR-1/ILT2的NK受体和MHC I类分子之间的相互作用介导抑制信号[Ljunggren HG et al.(1990)，Immunl Today.11:237-244]。有些病毒如巨细胞病毒具有获得性机制以避免NK细胞介导的免疫监视。HCMV基因组编码能够防止MHC I类表面表达的蛋白(即US2、US3、US6和US11)同时表达充当阻断NK介导的细胞裂解的诱饵的MHC I类同源物蛋白(UL18)[Kim，Y et al.(2008)，PLOSPathogens.4:e1000123，and Wilkinson G.et al.(2010).J Clin Virol.41(3):206-212]。此外，HCMV通过分泌能够结合NKG2D配体并防止它们的表面表达的蛋白而干扰NKG2D途径[Welte SA et al.(2003)，Eur J Immunol 33(1):194-203]。在肿瘤细胞中，已经演变出一些机制以通过分泌NKG2D配体如ULBP2、MICB或MICA避开NKG2D响应[Waldhauer I，Steinle A(2003).Proteolytic release of soluble UL16-binding protein 2fromtumor cells.Cancer Res 2006；66(5):2520-2526；Salih HR et al.(2006)，HumImmunol.2006Mar；67(3):188-95；Salih HR et al.(2003)Blood.2003Aug 15；102(4):1389-96；Salih HR et al.(2002)J Immunol.；169(8):4098-102]。

本发明人在本文中提供了免疫疗法的策略，藉此制备的T细胞、特别是同种异体T细胞，特别适合于同种异体移植，降低了宿主抗移植物排异和发展移植物抗宿主病的风险并且使得T细胞变得“隐秘”，特别是对于APC细胞或NK细胞。

发明内容

本发明涉及制备工程化的T细胞、具体而言是获自供体的同种异体T细胞而使得它们适合于免疫疗法目的方法。本发明的方法更具体而言允许精确调节对于免疫识别和组织相容性很重要的某些效应子分子的表达。

根据一个方面，本发明提供了一种制备工程化的T细胞、优选获自供体的同种异体T细胞的方法，包括以下步骤：

a)提供T细胞，优选获自供体的同种异体T细胞；和

b)抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)在所述T细胞中的表达。

根据某些实施方式，通过基因组修饰，特别是通过在T细胞中表达稀切核酸内切酶实现B2M表达的抑制，该稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因，如SEQ ID NO:2中所列的人类β2m基因(NCBI参考序列：NG_012920.1)，或在SEQ ID NO:2的全长内具有与SEQ ID NO:2中所列的人类β2m基因至少70％，如至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性的基因。此类稀切核酸内切酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶(meganuclease)、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如Cas9)。

根据某些其他实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)在细胞条件下与编码B2M的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)由此抑制基因的转录和/或翻译的核酸分子实现抑制B2M的表达。根据具体实施方式，通过使用((例如，向T细胞中引入)反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子实现抑制B2M的表达。优选地，这种核酸分子包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸(即，编码人类B2M的mRNA；NCBI参考序列：NM_004048)。

根据某些实施方式，通过基因组修饰、特别是通过在T细胞中表达稀切核酸内切酶实现抑制CIITA的表达，该稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因，如人类CIITA基因(NCBI参考序列：NG_009628.1)，或在根据NG_009628.1的人类CIITA基因全长内具有与根据NG_009628.1的人类CIITA基因至少70％，如至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性的基因。这种稀切核酸内切酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如Cas9)。

根据某些其他实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)在细胞条件下与编码CIITA的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)，由此抑制基因的转录和/或翻译的核酸分子实现抑制CIITA的表达。根据具体实施方式，通过使用((例如，向T细胞中引入)反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子实现抑制CIITA的表达。优选地，这种核酸分子包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸(即，编码人类CIITA同种型2的mRNA)。

根据具体实施方式，可以进一步工程化而使T细胞成为非同种反应性的，特别是通过使参与自识别的一个或多个基因，如，例如，编码T细胞受体(TCR)的组件的那些失活。这能够通过基因组修饰，更具体而言通过在T细胞中表达稀切核酸内切酶而实现，该稀切核酸内切酶能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活至少一个编码T细胞受体(TCR)组件的基因，如编码TCRα或TCRβ的基因。这种稀切核酸内切酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如，Cas9)。优选地，稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活对TCRα进行编码的基因。

根据可选的实施方式，可以进一步工程化T细胞以表达针对至少一个表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原，如B-淋巴细胞抗原CD19的嵌合抗原受体(CAR)。

本发明因此在进一步的方面中提供了工程化的T细胞，具体而言是工程化的分离的T细胞，特征在于β2-微球蛋白(B2M)的表达受到抑制。

根据某些实施方式，提供的T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶。更具体而言，这种T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子，稀切核酸内切酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。

根据某些其他实施方式，提供的T细胞包含抑制B2M表达的外源核酸分子。根据具体实施方式，这种核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。根据优选的实施方式，这种核酸分子包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸。

本发明进一步提供了工程化的T细胞，具体而言是工程化的分离的T细胞，特征在于II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达受到抑制。

根据某些实施方式，提供的T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶。更具体而言，这种T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子，稀切核酸内切酶可以是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。

根据某些其他实施方式，提供的T细胞包含抑制CIITA表达的外源核酸分子。根据具体实施方式，这种核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。根据优选的实施方式，这种核酸分子包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸。

根据具体实施方式，T细胞可以进一步具有至少一个编码TCR受体的组件的已失活基因。更具体而言，这种T细胞可以表达能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活至少一个编码T细胞受体(TCR)组件的基因的稀切核酸内切酶。因此，所述T细胞可以包含含有对稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子，该稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活对T细胞受体组件(TCR)进行编码的至少一个基因。TCR断裂提供了可以用于同种异体治疗策略的非同种反应性T细胞。

根据可选的实施方式，T细胞可以被工程化而表达针对至少一个表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原，如B-淋巴细胞抗原CD19的嵌合抗原受体(CAR)。具体而言，T细胞包含含有编码所述CAR的核苷酸序列的外源核酸分子。通过CAR的靶抗原的结合具有由针对病理细胞的T细胞触发免疫应答的作用，这会导致细胞之间的间隙中各种细胞因子的脱粒和酶降解。

根据一些实施方式，通过表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽如病毒MHC同源物，例如，UL18，或如NKG2D配体来进行T细胞的另外的修饰而赋予其隐秘性。

根据一些实施方式，本发明的T细胞表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽。根据更具体的实施方式，所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物，如UL18。T细胞可以包含含有对与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。根据其他更具体的实施方式，所述非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。T细胞可以包含含有对与SEQ ID NO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

由于本发明，工程化的T细胞能够用作治疗性产品，理想地作为“现成”产品，用于治疗或预防癌症，细菌或病毒感染，或自身免疫性疾病。

因此，本发明还提供了一种工程化的T细胞或组合物，如包含该工程化的T细胞而适用于作为药物的药物组合物。根据某些实施方式，工程化的T细胞或组合物适用于治疗癌症，并更具体而言适用于治疗淋巴瘤。根据某些其他实施方式，工程化的T细胞或组合物适用于治疗病毒感染。根据某些其他实施方式，工程化的T细胞或组合物适用于治疗细菌感染。

应该理解的是，对于本发明的一个方面在本文中给出的细节也适用于本发明的任何其他方面。

附图说明

图1：供体T细胞、宿主T细胞和抗原呈递细胞之间正常关系的示意图。

图2：根据本发明的遗传修饰的治疗T细胞和患者T细胞和肿瘤细胞的示意图。

图3：在TCR阳性和TCR阴性细胞之间的前向角侧散射(FSC)分布(细胞尺寸的指征)的对比。

图4：TRAC TALE核酸酶mRNA电穿孔之后TCRα/β和CD3在人类原代T细胞上的表达的流式细胞术分析(顶部)。

图5：在以下情况下在人类原代T细胞表面上的HLA_ABC表达的流式细胞术分析：A.对照T细胞中；B.在β2m TALE核酸酶mRNA电穿孔之后。

图6：A.用或不用编码单链CAR的mRNA电穿孔T细胞之后的CAR表达(抗F(ab’)2)的流式细胞术分析。B.在与daudi细胞共培养的电穿孔T细胞上的CD107a表达(脱粒的标志物)的流式细胞术分析。

图7：具有不同宿主免疫细胞的同种异体CAR T细胞(CD8+和CD4+T细胞，APC如树突状细胞和NK细胞)之间的潜在相互作用的示意图，CAR T细胞具有其由KO失活的B2M基因。符号(+)表示激活而符号(-)表示抑制。CAR T细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。MCHI的组件之一的B2M基因的失活，使得MCHI关于与宿主细胞毒性T细胞(CD8+)和与NK细胞的相互作用失能。然后，NK细胞能够通过活化因子路径如NKG2D/NKG2D配体发挥其对同种异体CART细胞的激活作用。

图8：具有不同宿主免疫细胞的同种异体CAR T细胞(CD8+和CD4+T细胞，APC如树突状细胞和NK细胞)之间的潜在相互作用的示意图，CAR T细胞具有其通过KO和表达病毒MHCI同源物失活的B2M基因。符号(+)表示激活而符号(-)表示抑制。CAR T细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。关于前图(仅仅B2M KO)，CAR T细胞和宿主CD8+T细胞之间的相互作用被削弱。在这种情况下，病毒MHCI同源物的表达经由MHCI/抑制剂受体使得与NK细胞的相互作用无效。同种异体CAR T细胞通过与病毒MHCI同源物的表达组合的B2M的KO的双重遗传修饰增强其免疫抑制性保护。

图9：同种异体CAR T细胞与不同宿主免疫细胞(CD8+和CD4+T细胞，APC如树突状细胞和NK细胞)之间的潜在相互作用的示意图，CAR T细胞具有其通过KO和表达可溶性NKG2D配体失活的B2M基因。符号(+)表示激活而符号(-)表示抑制。CAR T细胞与肿瘤细胞之间的潜在相互作用保持不变。关于前图(仅仅B2M KO)，CAR T细胞和宿主CD8+T细胞之间的相互作用被削弱。可溶性NKG2D配体的表达是失活与NK细胞的相互作用的另一种方式。在这种情况下，可溶性NKG2D配体可以结合于NK细胞上的NKG2D受体却不会发挥任何作用，与以此发挥抑制性竞争作用的CAR T细胞的NKG2D配体相对。同种异体CAR T细胞通过与可溶性NKG2D配体的表达组合的B2M的KO的双重遗传修饰增强其免疫抑制性保护。

图10：在T细胞中的β2-m表达的FACS分析。未转染的(顶部)和转染的T细胞(中间和底部)通过FACS对存活力(左)和β2-m表达(右)进行分析。

具体实施方式

除非在本文中明确定义，所使用的所有技术和科学术语具有基因疗法、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的相同含义。

类似或等效于本文的所有方法和材料能够在本发明的实践或测试中与本文中描述的合适方法和材料一起使用。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献以其全部内容结合于本文中作为参考。在冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。而且，除非另有规定，材料、方法和实施例仅是举例说明性的，而并非旨在进行限制。

除非另外指出，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这都在本领域的技术范围内。这些技术在文献中都进行了充分解释。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL，2000，Wiley and son Inc，Library of Congress，USA)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Third Edition，(Sambrook et al，2001，ColdSpring Harbor，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait ed.，1984)；Mullis et al.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins eds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal、Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；丛书，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，特别是，第154和155卷(Wu et al.eds.)和第185卷，"Gene Expression Technology"(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Veters For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos eds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；HandbookOf Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；和Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

制备工程化的T细胞的方法

在一个一般方面中，本发明涉及制备工程化的T细胞，具体而言是获自供体的同种异体T细胞的方法。

因此，本发明提供了一种制备工程化的T细胞，优选获自供体的同种异体T细胞的方法，方法包括以下步骤：

a)提供T细胞，优选获自供体的同种异体T细胞；和

b)抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)在所述T细胞中的表达。

根据某些实施方式，方法包括抑制β2-微球蛋白(B2M)的表达。可替代地，或另外，方法可以包括抑制II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)的表达。

根据某些实施方式，通过基因组修饰，更具体而言通过在T细胞中表达能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因(例如，SEQ ID NO:2中所列的β2m基因)的稀切核酸内切酶实现抑制B2M的表达。

根据某些其他实施方式，通过基因组修饰，更具体而言通过在T细胞中表达能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因(例如，人类CIITA基因)的稀切核酸内切酶实现抑制CIITA的表达。

对于使基因“失活”或基因“的失活”是指所感兴趣的基因(例如，编码B2M或CIITA的基因)不以功能性蛋白质的形式表达。在具体的实施方式中，方法的遗传修饰依赖于稀切核酸内切酶在所提供的待进行工程化的细胞中的表达，如此而使之催化一个靶向基因中的裂解从而失活所述靶向基因。由核酸内切酶所致的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制进行修复。然而，NHEJ是一个不完美的修复过程，往往会导致切割位点的DNA序列发生变化。这些机制涉及两个DNA端剩下的通过直接的再连接(Critchlowand Jackson 1998)或经由所谓的微同源性介导端连接((Betts，Brenchley et al.2003；Ma，Kim et al.2003)的重新连接。通过非同源末端连接(NHEJ)的修复通常会导致小插入或缺失并能够用于产生特定基因敲除。所述修饰可以是取代、缺失或添加至少一个核苷酸。能够通过本领域中公知的方法识别和/或选择其中发生切割诱导的突变形成事件，即，NHEJ事件的后续突变形成事件的细胞。

根据本发明要用于失活β2m基因的稀切核酸内切酶可以是，例如，TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如Cas9)。

根据具体实施方式，稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。

根据另一个具体实施方式，稀切核酸内切酶是归巢核酸内切酶，也称为大范围核酸酶。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是锌指核酸酶(ZNF)。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶。根据优选的实施方式，RNA指导的核酸内切酶是Cas9/CRISPR复合体。

根据一个具体实施方式，稀切核酸内切酶是由包含SEQ ID NO:67中所列的核苷酸序列的核酸分子编码的TAL核酸酶。根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是由包含SEQID NO:68中所列的核苷酸序列的核酸分子编码的TAL核酸酶。在还有的另一具体实施方式中，稀切核酸内切酶是由包含SEQ ID NO:67中所列的核苷酸序列的核酸分子编码的TAL核酸酶和由包含SEQ ID NO:68中所列的核苷酸序列的核酸分子编码的TAL核酸酶的组合。

为了表达于T细胞中，所述稀切核酸内切酶可以通过包含编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子的方式引入到细胞中。根据具体实施方式，本发明的方法基因进一步包括向所述T细胞中引入包含对稀切核酸内切酶，优选能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因(例如，SEQ ID NO:2中所列的人类β2m基因)的稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。例如，外源核酸分子可以包含SEQ ID NO:67或SEQ IDNO:68中所列的核苷酸序列。

因此，获得了工程化的T细胞，其表达稀切核酸内切酶，优选能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶。因此，由所述稀切核酸内切酶造成的B2M基因的失活导致B2M在工程化的T细胞中的表达受到抑制。因此，获得了工程化的T细胞，其特征在于B2M的表达受到抑制。

根据本发明要用于失活CIITA基因的稀切核酸内切酶可以是，例如，TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如Cas9)。

根据具体实施方式，稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是归巢核酸内切酶，也称之名为大范围核酸酶。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是锌指核酸酶(ZNF)。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶。根据优选的实施方式，RNA指导的核酸内切酶是Cas9/CRISPR复合体。

为了表达于T细胞中，可以通过包含编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子的方式将所述稀切核酸内切酶引入细胞中。根据具体实施方式，本发明的方法进一步包括向T细胞中引入包含对稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子，稀切核酸内切酶优选是能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶(例如，人类CIITA基因)。

因此，获得了工程化的T细胞，其表达稀切核酸内切酶，优选能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶。因此，由所述稀切核酸内切酶造成的CIITA基因的失活导致CIITA在工程化的T细胞中的表达受到抑制。因此，获得了工程化的T细胞，其特征在于CIITA的表达受到抑制。根据某些其他实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)在细胞条件下与编码B2M的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)的核酸分子，由此抑制基因的转录和/或翻译实现抑制B2M的表达。根据具体实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子实现抑制B2M的表达。

根据具体实施方式，核酸分子是反义寡核苷酸。

根据其他具体实施方式，核酸分子是核酶，优选锤头核酶。

根据其他具体实施方式，核酸是干扰性RNA(RNAi)分子，如微RNA(miRNA)、小干扰性RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。因此，根据优选的实施方式，核酸分子是微RNA。根据另一优选的实施方式，核酸分子是小干扰性RNA。根据另一优选的实施方式，核酸分子是短发夹RNA。

因此，获得了工程化的T细胞，其特征在于B2M的表达受到抑制。

因为B2M是主要组织相容性复合体(MHC)的重要结构组件，抑制B2M表达导致MHC分子在工程化的T细胞表面上的减少或消除。因此，工程化的T细胞不再将抗原呈递于表面上，该抗原由CD8+细胞识别。特别是在获自供体的同种异体T细胞的情况下，在输注到同种异体宿主中时，非自身抗原呈递性MHC分子在T细胞表面上的减少或消除防止工程化的T细胞被宿主CD8+细胞识别。这就使得工程化的T细胞特别适合于同种异体移植，特别是因为它降低被宿主免疫系统的排异的风险。

根据某些其他实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)在细胞条件下与编码CIITA的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)的核酸分子，由此抑制基因的转录和/或翻译实现抑制CIITA的表达。根据具体实施方式，通过使用(例如，向T细胞中引入)反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子实现抑制CIITA的表达。

根据具体实施方式，核酸分子是反义寡核苷酸。

根据其他具体实施方式，核酸分子是核酶，优选锤头核酶。

根据其他具体实施方式，核酸是干扰性RNA(RNAi)分子，如微RNA(miRNA)、小干扰性RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。因此，根据优选的实施方式，核酸分子是微RNA。根据另一优选的实施方式，核酸分子是小干扰性RNA。根据另一优选的实施方式，核酸分子是短发夹RNA。

因此，获得了工程化的T细胞，其特征在于CIITA的表达受到抑制。本发明还设想了本发明的工程化的T细胞不在其细胞表面上表达功能性T细胞受体(TCR)。T细胞受体是参与T细胞应答抗原呈递而活化的细胞表面受体。TCR一般由两条链(α和β)组成，其经过组装而形成异源二聚体并与CD3转导亚单元关联而形成细胞表面上存在的T细胞受体复合体。TCR的每个α和β链由免疫球蛋白样N-端可变(V)和恒定(C)区、疏水跨膜结构域和短胞质区组成。至于免疫球蛋白分子，α和β链的可变区由V(D)J重组产生，在T细胞群体内产生大量不同的抗原特异性。然而，相比于识别完整抗原的免疫球蛋白，T细胞通过与MHC分子相关的经过加工的肽片段活化，向通过T细胞的抗原识别引入另外的维度，也称为MHC限制。供体和受体之间通过T细胞受体的MHC差异的识别导致T细胞增殖和移植抗宿主病(GVHD)的潜在发展。据证明，TCR的正常表面表达取决于复合体的所有七个组件的协调合成和组装(Ashwelland Klusner 1990)。TCRα或TCRβ的失活可以导致TCR从T细胞的表面上消除，阻止同种抗原以及因此GVHD的识别。至少一个对TCR组件进行编码的基因的失活因此使得工程化的T细胞不太具有同种反应活性。对于使基因“失活”或基因“的失活”是指所关注的基因(例如，对TCR组件编码的至少一个基因)并不以功能性蛋白形式进行表达。

因此，根据具体实施方式的本发明的方法进一步包括使编码T细胞受体组件的至少一个基因失活。更具体而言，通过使用(例如，向T细胞中引入)能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一个基因的稀切核酸内切酶实现失活。根据具体实施方式，稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活对TCRα或TCRβ进行编码的基因。根据优选的实施方式，稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活对TCRα进行编码的基因。特别是在获自供体的同种异体T细胞的情况下，失活编码TCR，特别是TCRα的至少一个基因，导致在输注到同种异体宿主中时，工程化的T细胞是非同种反应性的。这使得工程化的T细胞特别适用于同种异体移植，特别是因为它降低移植物抗宿主病的风险。

根据本发明要用于失活编码T细胞受体组件的至少一个基因的稀切核酸内切酶可以是，例如，TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶(如Cas9)。

根据具体实施方式，稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是归巢核酸内切酶，也称之名为大范围核酸酶。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是锌指核酸酶(ZNF)。

根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶。根据优选的实施方式，RNA指导的核酸内切酶是Cas9/CRISPR复合体。

为了表达于T细胞中，可以通过包含编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子的方式将所述稀切核酸内切酶引入细胞中。根据具体实施方式，本发明的方法进一步包括向所述T细胞中引入包含对能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一个基因的稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

因此，获得了工程化的T细胞，其进一步表达能够通过DNA切割选择性失活编码T细胞受体(TCR)组件的至少一个基因的稀切核酸内切酶。因此，获得了工程化的T细胞，其特征在于编码T细胞受体(TCR)组件的至少一个基因被失活。

本发明设想的是工程化的T细胞进一步表达针对表达于恶性或受感染细胞的表面上的至少一个抗原的嵌合抗原受体(CAR)。因此，根据某些实施方式，本发明的方法进一步包括向所述T细胞中引入包含对针对表达于恶性细胞或受感染细胞的表面上的至少一个抗原的嵌合抗原受体(CAR)编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

根据本发明要进行修饰的T细胞可以是任何合适的T细胞。例如，T细胞可以是炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T细胞或辅助性T淋巴细胞。具体而言，T细胞是细胞毒性T淋巴细胞。在某些实施方式中，T细胞选自CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。它们能够从血液中提取或源自干细胞。干细胞可以是成年干细胞、胚胎干细胞，更具体而言是非人类干细胞、脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、全能干细胞或造血干细胞。典型的人类细胞是CD34+细胞。在具体实施方式中，根据本发明要进行修饰的T细胞是人类T细胞。在扩增和遗传修饰本发明的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，如患者获得细胞来源。T细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T细胞系。在另一实施方式中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一实施方式中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。

稀切核酸内切酶

根据本发明的某些实施方式，所采用的稀切核酸内切酶能够通过DNA切割选择性失活所关注的基因，如编码B2M的基因。

术语“稀切核酸内切酶”是指能够催化DNA或RNA分子、优选DNA分子内核酸之间的键的水解(切割)的野生型或变体酶。具体而言，所述核酸酶可以是核酸内切酶，更优选是高度特异性的、识别长度范围为10至45个碱基对(bp)、通常长度范围为10至35个碱基对、更通常12至20个碱基对的核酸靶位点的稀切核酸内切酶。根据本发明的核酸内切酶在特异性的多核苷酸序列，进一步称为“靶序列”处进行识别并在这些靶序列内切割核酸或进入与其相邻的序列中，这取决于所述核酸内切酶的分子结构。稀切核酸内切酶可以在特定多核苷酸序列处识别并产生单链断裂或双链断裂。

在具体的实施方式中，根据本发明的所述稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶如Cas9/CRISPR复合体。RNA指导的核酸内切酶构成其中核酸内切酶与RNA分子关联的新一代基因组工程化工具。在这个系统中，RNA分子核苷酸序列决定靶特异性并活化核酸内切酶(Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski et al.2012；Cong，Ran etal.2013；Mali，Yang et al.2013)。Cas9，也称为Csn1，是既参与crRNA生物合成又参与摧毁入侵DNA的巨型蛋白质。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)(Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski etal.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9。巨型Cas9蛋白(>1200个氨基酸)含有两个预测的核酸酶结构域，即位于蛋白质中部的HNH(McrA样)核酸酶结构域和分裂的RuvC样核酸酶结构域(RNAase H折叠)(Makarova，Grishin et al.(2006))。Cas9变体可以是不天然存在于自然界中并且是由蛋白质工程或通过随机诱变获得的Cas9核酸内切酶。例如，可以通过突变，即化脓性链球菌Cas9核酸内切酶(COG3513)的氨基酸序列中至少一个残基的缺失或插入或取代获得根据本发明的Cas9变体。

在其他具体实施方式中，所述稀切核酸内切酶也可以是归巢核酸内切酶，也已知称为大范围核酸酶。这种归巢核酸内切酶在本领域内是公知的(Stoddard 2005)。归巢核酸内切酶是高度特异性的，识别长度范围为12至45个碱基对(bp)、通常长度范围为14至40bp的DNA靶位点。根据本发明的归巢核酸内切酶例如可以对应于LAGLIDADG核酸内切酶、对应于HNH核酸内切酶或对应于GIY-YIG核酸内切酶。根据本发明优选的归巢核酸内切酶可以是I-CreI变体。“变体”核酸内切酶，即，天然不存在于自然界中而通过基因工程设计或通过随机诱变获得的核酸内切酶，可以结合DNA序列，这些DNA序列不同于由野生型核酸内切酶识别的DNA序列(参见国际申请WO2006/097854)。

在其他具体实施方式中，所述稀切核酸内切酶可以是“锌指核酸酶”(ZFN)，它一般是IIS型限制酶FokI的切割结构域和含有3个或更多个C2H2型锌指基序的DNA识别结构域之间的融合。在精确的方向和间距上两个单独的ZFN在DNA中的特定位置处的异源二聚导致DNA中的双链断裂(DSB)。使用这种嵌合内切核酸酶在本领域中已经广泛报道，正如Urnov等的综述(Genome editing with engineered zinc finger nucleases(2010)Naturereviews Genetics 11:636-646)。标准的ZFN将切割结构域融合至每个锌指结构域的C-端。为了允许两个切割结构域二聚并切割DNA，两个单独的ZFN将DNA的相对链与其相隔一定距离的C-端结合。锌指结构域和切割结构域之间最常用的接头序列要求每个结合位点的5'边缘分隔5至7个bp。产生新的锌指阵列的最直接方法是组合已知特异性的较小锌指“模块”。最常见的模块化装配过程涉及将可以各自识别3个碱基对DNA序列的三个单独锌指组合以产生可以识别9个碱基对靶位点的3-指阵列。许多选择方法已被用于产生能够靶向所需序列的锌指阵列。初始选择的工作利用噬菌体展示来从部分随机化的锌指阵列的大的池中选择出结合给定DNA靶的蛋白。最近的工作已经利用酵母单杂交系统、细菌单杂交和双杂交系统以及哺乳动物细胞。

在其他具体实施方式中，所述稀切核酸内切酶是由通常源自转录激活子样效应蛋白(TALE)或模块化碱基-对-碱基(base-per-base)结合结构域(MBBBD)的DNA结合结构域的融合产生的“TALE核酸酶”或“MBBBD-核酸酶”，含有具有核酸内切酶活性的催化结构域。这样的催化结构域通常来自酶，如例如I-TevI、ColE7、NUCA和Fok-I。取决于所选择的催化结构域，TALE核酸酶可以以单体或二聚体形式形成(WO2012138927)。这种工程化的TALE核酸酶能够以商品名TALEN^TM商购获得(Cellectis，8rue de la Croix Jarry，75013Paris，France)。一般而言，DNA结合结构域源自转录激活子样的效应子(TALE)，其中序列特异性由源自作为非限制性实例的黄单胞菌属(Xanthomonas)或青枯菌属(Ralstonia)细菌蛋白AvrBs3、PthXo1、AvrHah1、PthA、Tal1c的一系列33-35个氨基酸重复驱动。这些重复基本上区别在于指定与碱基对相互作用的两个氨基酸的位置(Boch，Scholze et al.2009；Moscouand Bogdanove 2009)。DNA靶中每个碱基对通过单一重复接触，而特异性是由重复的两个变体氨基酸(所谓的重复可变二肽，RVD)所致。TALE结合结构域可以进一步包含负责靶向序列的第一胸腺嘧啶碱基(T0)需求的N-端易位结构域和含有核定位信号(NLS)的C端结构域。TALE核酸结合结构域一般而言对应于包含多个TALE重复序列的工程化的核心TALE支架，每个重复包含特异于TALE识别位点的每个核苷酸碱基的RVD。在本发明中，所述核心支架的每个TALE重复序列是由30至42个氨基酸、更优选33或34个氨基酸制成，其中位于位置12和13处的两个关键氨基酸(即所谓的重复可变二肽，RVD)介导所述TALE结合位点序列的一个核苷酸的识别；等价的两个关键氨基酸可以特别地位于高度超过33或34个氨基酸长的TALE重复序列中除了12和13位置之外的位置。优选地，与不同核苷酸的识别相关的RVD是用于识别C的HD、用于识别T的NG、用于识别A的NI、用于识别G或A的NN。在另一实施方式中，关键氨基酸12和13可以朝着其他氨基酸残基突变以调节其对核苷酸A、T、C和G的特异性并且特别是增强这种特异性。TALE核酸结合结构域通常包含8至30个TALE重复序列。更优选地，本发明的所述核心支架包含8至20个TALE重复序列；更加优选15个TALE重复序列。它还可以包含由位于所述TALE重复序列的组的C-端，即另外的C-端半TALE重复序列的20个氨基酸组成的另外的单个截短的TALE重复序列。其他模块化碱基-对-碱基(base-per-base)特异性核酸结合结构域(MBBBD)描述于WO2014/018601中。例如，可以由新近识别的蛋白，即来自内共生真菌根霉共生产素伯克霍尔德氏菌(Burkholderia Rhizoxinica)的近期测序基因组的EAV36_BURRH、E5AW43_BURRH、E5AW45_BURRH和E5AW46_BURRH蛋白(Lackner，Moebius etal.2011)来工程化所述MBBBD。这些核酸结合性多肽包含约31至33个碱基特异性的氨基酸的模块。这些模块表现出与黄单胞杆菌属(Xanthomonas)TALE共同重复小于40％的序列同一性并表现出更多的多肽序列可变性。来自伯克霍尔德菌属(Burkholderia)和黄单胞杆菌属(Xanthomonas)的上述蛋白质的不同结构域(模块，N和C-端)适用于设计出对特异性核酸序列具有结合特性的新蛋白质或支架，并可以组合而形成嵌合TALE-MBBBD蛋白。

抑制性核酸分子

根据本发明的某些其他实施方式，所采用的核酸分子抑制B2M的表达。更具体而言，核酸可以是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。优选地，这种核酸分子包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸。

根据具体实施方式，抑制性核酸是抑制B2M表达的反义寡核苷酸。这种反义寡核苷酸是在细胞条件下与编码B2M的细胞mRNA和/或基因组DNA特异性杂交(例如，结合)，由此抑制基因的转录和/或翻译的核酸(DNA或RNA)。可以通过常规的碱基对互补完成结合。可替代地，例如，在结合至DNA双链体的情况下，可以通过在DNA双螺旋大沟中的特异性相互作用完成结合。绝对互补性，虽然是优选的，但并非是要求的。

本发明还设想的是所采用的核酸分子抑制CIITA的表达。更具体而言，核酸可以是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。优选地，这种核酸分子包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸。

根据本发明采用的反义寡核苷酸可以是DNA或RNA或者它们的嵌合混合物或衍生物或修饰版本，并可以是单链的或双链的。因此，根据优选的实施方式，反义寡核苷酸是单链的或双链的DNA分子，更优选是双链的DNA分子。根据另一优选的实施方式，反义寡核苷酸是单链的或双链的RNA分子，更优选是单链的RNA分子。

根据优选的实施方式，反义寡核苷酸是耐受内源性核酸酶例如核酸外切酶和/或核酸内切酶的修饰的寡核苷酸，而因此在体内和体外都是稳定的。

例如，可以在碱基部分、糖部分或磷酸骨架处修饰反义寡核苷酸以提高分子的稳定性。反义寡核苷酸可以包括其他附加基团如肽(例如，用于靶向宿主细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的试剂。因此，反义寡核苷酸可以结合(conjugate)至另一分子如肽或转运剂。

根据具体实施方式，反义寡核苷酸包含至少一个修饰的碱基部分，其选自包括但不限于以下各项的组中：5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟基三乙基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基Q核苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、怀丁氧苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶、(acp3)w和2,6-二氨基嘌呤。

根据其他具体实施方式，反义寡核苷酸包含至少一个选自但不限于以下各项的组中的修饰的糖部分：阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。

根据其他具体实施方式，反义寡核苷酸包含至少一个选自但不限于以下各项的组中的修饰的磷酸骨架：硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代磷酰胺酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基膦酸酯、烷基磷酸三酯和甲缩醛(formacetal)或其类似物。

例如，反义寡核苷酸可以以表达载体，如质粒或病毒载体形式递送至细胞中，当在细胞中转录时，这些表达载体产生与B2M的细胞mRNA的至少一个独特部分互补的RNA。可替代地，反义寡核苷酸可以离体产生并通过本领域内任何已知的方法引入细胞中。可以通过本领域内已知的标准方法，例如，通过使用自动化的DNA合成仪(如DNA自动合成仪可商购获自，例如，Applied Biosystems)离体合成反义寡核苷酸。已经开发了许多方法用于向细胞递送反义DNA或RNA，例如，通过直接注射或通过经设计而靶向期望的细胞的修饰(例如，使用连接至特异性结合表达于靶细胞表面上的受体或抗原的肽或抗体的反义寡核苷酸)。

根据优选的实施方式，使用了重组DNA载体，其中对抑制B2M或CIITA表达的反义寡核苷酸进行编码的核苷酸序列被置于启动子，如强Pol III或Pol II启动子的控制之下。使用这种构建体转染靶细胞如T细胞，会使得形成足量的单链RNA，其与内源性转录本形成互补碱基对，并且由此防止B2M或CIITA mRNA的翻译。根据这些实施方式，将包含编码反义寡核苷酸的核苷酸序列的DNA载体引入到细胞中，在那里发生反义RNA的转录。这种载体可以保持为游离型的或是染色体整合的，只要它可以被转录以产生反义RNA即可。编码反义RNA的序列能够通过本领域内已知的任何启动子进行表达以作用于哺乳动物、优选人细胞中。这种启动子可以是可诱导型的或组成型的。示例性的启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区域、含有劳氏肉瘤病毒的3’长端重复的启动子、疱疹胸腺嘧啶启动子和金属硫蛋白基因的调节性序列。

可替代地，取决于所使用的启动子，可以将组成地或可诱导地合成反义RNA的反义cDNA构建体引入到细胞中。

根据优选的实施方式，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸。在双链分子的情况下，这种双链反义寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:3的至少10个连续核苷酸的第一链和与所述第一链互补的第二链。在单链分子的情况下，这种单链寡核苷酸包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸。

根据其他优选的实施方式，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸。在双链分子的情况下，这种双链反义寡核苷酸包含含有SEQ ID NO:5的至少10个连续核苷酸的第一链和与所述第一链互补的第二链。在单链分子的情况下，这种单链寡核苷酸包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸。

反义寡核苷酸可以含有于B2M或CIITA mRNA的非编码或编码区的核苷酸序列。根据优选的实施方式，反义寡核苷酸包含与B2M或CIITA mRNA的5’端互补的核苷酸序列，例如，一直到(up to)并包括AUG起始密码子的5’非翻译序列。根据其他优选的实施方式，反义寡核苷酸包含与B2M或CIITA mRNA的3’非翻译序列互补的核苷酸序列。根据其他优选的实施方式，反义寡核苷酸包含与B2M或CIITA mRNA的编码区域互补的核苷酸序列。无论是经过设计而杂交至B2M或CIITA mRNA的5’、3’区域或是编码区域，反义寡核苷酸应该是长度至少六个核苷酸、优选长度至少10个核苷酸，并优选少于约100个，并且更优选长度少于约50、25、20、15或10个核苷酸。根据优选的实施方式，反义寡核苷酸长度为6至25，如10至25个核苷酸。

根据其他具体实施方式，将经设计而催化切割B2M或CIITA mRNA转录本的核酶分子用于分别防止B2M或CIITA在T细胞中翻译和表达(参见，例如，WO 90/11364和US 5,093,246用于一般性指导)。根据优选的实施方式，核酶是锤头核酶。锤头核酶在由与靶mRNA，例如，B2M mRNA，如SEQ ID NO:3中所列的人类B2M mRNA形成互补碱基对的侧接区域指定的位置处切割mRNA。唯一的要求是靶mRNA具有以下两个碱基的序列：5'-UG-3'。锤头核酶的构建和生产在本领域内是众所周知的，并更详细地描述于文献Haseloff and Gerlach(1988)中。根据优选的实施方式，核酶经过工程化而使切割识别位点位于B2M mRNA的5'端附近。根据优选的其他实施方式，核酶经过工程化而使切割识别位点位于CIITA mRNA的5'端附近。这增加了效率并使非功能性mRNA转录本的胞内积累最小化。

如同反义寡核苷酸一样，例如，根据本发明的核酶可以由修饰的寡核苷酸组成以提高稳定性。核酶可以通过本领域内已知的任何方法递送至细胞中。核酶可以以在细胞中转录时产生核酶的表达载体，如质粒或病毒载体的形式递送至T细胞中。根据优选的实施方式，所使用的重组DNA载体中对核酶编码的核苷酸序列置于启动子，如强Pol III或Pol II启动子的控制之下，如此转染的细胞会产生足量的核酶以破坏内源性mRNA并抑制翻译。与反义寡核苷酸不一样，因为核酶是催化性的，对于效力，需要较低的胞内浓度。

根据其他具体实施方式，抑制性核酸是干扰性RNA(RNAi)分子。RNA干扰是一种生物学过程，其中RNA分子抑制基因表达，典型地会导致特定mRNA的破坏。RNAi分子的典型类型包括微RNA(miRNA)、小干扰性RNA(siRNA)和短发夹RNA(shRNA)。根据优选的实施方式，RNAi分子是miRNA。根据另一优选的实施方式，RNAi分子是siRNA。根据还有的另一优选的实施方式，RNAi分子是shRNA。RNAi分子的体内源性产及其使用方法描述于，例如，US6,506,559、WO 01/36646、WO 00/44895、US2002/01621126、US2002/0086356、US2003/0108923、WO02/44321、WO 02/055693、WO 02/055692和WO 03/006477中。

根据优选的实施方式，RNAi分子是与SEQ ID NO:3互补的干扰性RNA。根据另一优选的实施方式，RNAi分子是包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸的核糖核酸分子。根据另一优选的实施方式，RNAi分子是包含与SEQ ID NO:3的20至25，如21至23个连续核苷酸相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链核糖核酸分子。

根据优选的实施方式，RNAi分子是与SEQ ID NO:5互补的干扰性RNA。根据另一优选的实施方式，RNAi分子是包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸的核糖核酸分子。根据另一优选的实施方式，RNAi分子是包含与SEQ ID NO:5的20至25，如21至23个连续核苷酸相同的第一链和与第一链互补的第二链的双链核糖核酸分子。

T细胞调节的PD1/PDL1途径的工程化

本发明旨在优选通过抑制B2M和/或CIITA的表达与TCR的失活组合而促进T细胞，特别是同种异体T细胞的植入。

作为这种方法的替代或与这种方法的组合，本发明人发现，T细胞对于PD1(程序细胞死亡蛋白1，也称为PD1；PD-1；CD279；SLEB2；hPD-1；hPD-l或hSLE1)能够被破坏，其是由PDCD1基因(NCBI-NC_000002.12)编码的288个氨基酸的表面蛋白分子。这种蛋白表达于T细胞和祖B(pro-B)细胞上，并据发现负调节T-细胞应答(Carter L.，et al.，2002)。PD-1受体/PD-L1配体复合体的形成传递抑制信号，其降低T细胞的增殖。

程序死亡配体1(PD-L1)是40kDa的1型跨膜蛋白，其被认为在特定的事件如妊娠、组织同种异体移植、自身免疫疾病和其他疾病状态如肝炎期间在抑制免疫系统方面起到主要作用。PDL-1(也称为CD274或B7H1)由CD274基因(NCBI-nm_014143)编码。

根据特定方面，PD-1和TCR的表达在本发明的工程化的T细胞中均受到抑制，这具有激活T细胞作为同种异体移植的一部分的双重效应。然而，PD-1的失活或抑制也可以作为T细胞的自体移植的一部分实施，在这种情况下不需要TCR的抑制或破坏。

根据本发明的一个进一步的方面，PD1的抑制或破坏与其配体PDL-1在移植的T细胞中的过表达组合。例如，在T细胞中发生慢病毒或逆转录病毒转化之时(其中PD-1受到抑制或破坏)，或通过本领域内报道的任何其他方式获得这种过表达。因此，由T细胞过表达的PDL1不会影响[PD1^-]移植细胞，但仅会影响来自患者的[PD1⁺]T细胞。因此，来自患者的T细胞受到抑制并且不对抗移植的细胞被激活，这有利于他们的植入和持久进入宿主。

根据优选的实施方式，本发明提供的工程化的T细胞是[PD1^-][TCR^-]，而同时过表达PDL1有助于其移植到患者中，特别是作为免疫疗法的部分。

至少一个非内源性免疫抑制性多肽的表达

根据一些优选的实施方式，用在所述T细胞中表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽的另外的步骤来进行β2M和/或CIITA的表达的抑制。

“非内源性”多肽是指不能由供体的免疫细胞正常表达的多肽，优选由已经植入免疫的细胞基因组中的外源性多核苷酸表达的多肽。例如，由此，IL12就不被认为是非内源性多肽，因为它是由来自供体免疫细胞的先前存在基因表达的。

“免疫抑制性”是指所述非内源性多肽的表达具有减轻患者宿主对抗供体的免疫细胞的免疫应答的作用。

本发明的方法因此可以包括向所述T细胞中引入包含编码至少一个非内源性免疫抑制性多肽，如病毒MHC同源物或NKG2D配体的核苷酸序列的外源核酸分子。

病毒MHC同源物的表达

根据特别优选的实施方式，表达于所述T细胞中的所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物，如例如UL18(在NCBI蛋白数据库中称为NP_044619)。

根据这些实施方式，本发明的方法可以因此包括向所述T细胞中引入包含对病毒MHC同源物，如UL18进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。外源核酸分子可以含有对与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列。

同种异体T细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用相对于图7(不表达)的情况示意性地表示于图8(表达病毒MHC同源物)中。在这两个图中，优选通过破坏(KO)β2M基因失活MHC I类。

NKG2D配体的表达

一些病毒如巨细胞病毒已经获得机制以避免NK细胞介导的免疫监视并且通过分泌能够结合NKG2D配体并防止它们的表面表达的蛋白来干扰NKG2D途径(Welte，S.A.；Sinzger，C.；Lutz，S.Z.；Singh-Jasuja，H.；Sampaio，K.L.；Eknigk，U.；Rammensee，H.G.；Steinle，A.2003“Selective intracellular retention of virally induced NKG2Dligands by the human cytomegalovirus UL16glycoprotein”.Eur.J.Immunol.，33，194-203)。在肿瘤细胞中，已经进化出一些机制通过分泌NKG2D配体如ULBP2、MICB或MICA来避开NKG2D应答(Salih HR，Antropius H，Gieseke F，Lutz SZ，Kanz L，et al.(2003)Functional expression and release of ligands for the activatingimmunoreceptor NKG2D in leukemia.Blood 102:1389-1396)。

根据其他特别优选的实施方式，待表达于所述T细胞中的非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。

根据这些实施方式，本发明的方法因此可以包括向所述T细胞中引入包含对NKG2D配体进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。核酸分子可以含有对与SEQ ID NO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽的核苷酸序列。

同种异体T细胞和宿主免疫细胞之间的相互作用相对于图7(未表达)中的情况示意性地表示于图9(表达可溶性NKG2D配体)中。在这两个图中，通过破坏(KO)β2M基因失活MHC I类。

进一步在文本中呈现的表10代表病毒MHC同源物(UL18)和NKG2D配体的组(panel)以及它们的根据本发明要进行表达的多肽序列。

嵌合抗原受体(CAR)

继承性免疫疗法，其涉及转移离体产生的自体抗原特异性T细胞，是治疗癌症或病毒感染的有前景的策略。可以通过扩增抗原特异性T细胞或通过遗传工程化重定向T细胞而产生用于继承性免疫疗法的T细胞(Park，Rosenberg et al.2011)。转移病毒抗原特异性的T细胞是用于治疗移植物相关的病毒感染和罕见病毒相关的恶性肿瘤的完善方法。类似地，已证明肿瘤特异性T细胞的分离和转移在治疗黑色素瘤方面是成功的。

通过遗传转移转基因的T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)，已成功地产生在T细胞中的新特异性(Jena，Dotti et al.2010)。CAR是由与单个融合分子中一个或多个信号结构域相关的靶向部分组成的合成受体。一般而言，CAR的结合部分由单链抗体的抗原-结合结构域(scFv)组成，包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻可变片段。基于受体或配体结构域的结合部分也已经得到了成功应用。第一代CAR的信号结构域源自CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区。已证明第一代CAR成功重定向T细胞细胞毒性，然而，它们未能提供体内的延长的扩展和抗肿瘤活性。已单独添加(第二代)或组合添加(第三代)来自包括CD28、OX-40(CD134)和4-1BB(CD137)在内的共刺激分子的信号结构域以增强CAR修饰的T细胞的存活力并提高增殖。CAR已经成功地使T细胞能够对来自包括淋巴瘤和实体肿瘤在内的各种恶性肿瘤的肿瘤细胞的表面上表达的抗原发生重定向(Jena，Dotti et al.2010)。

CD19是用于免疫疗法的有吸引力的靶，因为绝大多数B-急性淋巴细胞白血病(B-ALL)均匀地表达CD19，而在非造血细胞，以及粒细胞、红细胞和T细胞，以及骨髓干细胞上，表达是缺失的。靶向B细胞恶性肿瘤上的CA19的临床试验正在进行，连同刺激CD19的抗肿瘤响应一起。大多数输注经过遗传修饰以表达具有具体源自CD19特异性小鼠单克隆抗体FMC63的scFv区的特异性的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞(WO2013/126712)。

因此，根据某些实施方式，由工程化的T细胞表达的嵌合抗原受体是针对B-淋巴细胞抗原CD19的。

根据某些实施方式，嵌合抗原受体是单链嵌合抗原受体。作为待表达于根据本发明的工程化的T细胞中的单链嵌合抗原受体的实例是单个多肽，其包含至少一个胞外配体结合结构域、跨膜结构域和至少一个信号转导结构域，其中所述胞外配体结合结构域包含源自特异性抗CD19单克隆抗体4G7的scFv。一旦例如通过使用逆转录病毒或慢病毒转导而转导入T细胞中，这种CAR有助于识别在涉及淋巴瘤或白血病中的恶性B细胞表面上存在的CD19抗原。

根据具体实施方式，嵌合抗原受体是包含SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列或其含有在SEQ ID NO:6的整个长度范围内与SEQ ID NO:6中所列的氨基酸序列具有至少70％，如至少80％、至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的变体的多肽。优选地，变体能够结合CD19。

特别优选的嵌合抗原受体是包含SEQ ID NO:7中所列的氨基酸序列或其含有在SEQ ID NO:7的整个长度范围内与SEQ ID NO:7中所列的氨基酸序列具有至少80％，如至少90％、至少95％或至少99％序列同一性的氨基酸序列的变体的多肽。这种变体可以不同于SEQ ID NO:7中所列的多肽，区别在于在至少一个、至少两个或至少三个氨基酸残基处的替代。优选地，所述变体能够结合CD19。

根据其他某些实施方式，嵌合抗原受体可以针对：表达于恶性的或受感染细胞(如分化分子的簇)的表面上的另一抗原，如CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123和CD138，肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白-C的A1结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性的抗原如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269、TNFRSF17)，多发性骨髓瘤或淋巴母细胞白血病抗原，如选自TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)的之一，病毒特异性的表面抗原如HIV特异性抗原(如HIV gp120)；EBV特异性抗原，CMV特异性抗原，HPV特异性抗原，拉沙病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。

在其他某些实施方式中，嵌合抗原受体是多链嵌合抗原受体。由需要连续附加信号结构域的单链多肽形成现有技术引入T细胞中的嵌合抗原受体。然而，从其天然近膜位置移动信号结构域可能干扰其功能。为了克服这个缺点，本申请人最近设计了源自FcεRI的多链CAR，以允许所有相关的信号结构域的正常近膜定位。在这个新的架构中，FcεRIα链的高亲合力IgE结合结构域被胞外配体结合结构域如scFv取代以重定向对于细胞靶的T细胞特异性，并且FcεRIβ链的N-和/或C-端尾巴用于将共刺激信号置于正常的近膜位置，正如在WO2013/176916中所描述的那样。

因此，由根据本发明的工程化的T细胞表达的CAR可以是特别适于生产和扩增本发明的工程化的T细胞的多链嵌合抗原受体。这种多链CAR包含至少两个以下组件：

a)包含FcεRIα链的跨膜结构域和胞外配体结合结构域的一种多肽，

b)包含一部分N-和C-端胞质尾和FcεRIβ链的跨膜结构域的一种多肽和/或

c)包含胞浆内尾的每一部分和FcεRIγ链的跨膜结构域的至少二种多肽，由此不同多肽自发地多聚一起而形成二聚、三聚或四聚CAR。

根据这种架构(architectures)，配体结合结构域和信号结构域产生于独立多肽上。不同多肽锚入紧接附近的膜中而容许彼此之间的相互作用。在这种架构中，信号和共刺激结构域能够处于近膜位置(即，相邻于它内侧上的细胞膜)上，这被认为允许改善的共刺激结构域的功能。多亚单元架构还提供了设计对T细胞激活具有更多控制的CAR的更大灵活性和可能性。例如，有可能包括几个具有不同特异性的胞外抗原识别结构域而获得多特异性的CAR架构。还有可能控制进入多链CAR的不同亚单元之间的相对比率。已经在由本申请人最近在PCT/US2013/058005中对这种类型的架构进行了详述。

例如，通过使用融合了信号和共刺激结构域的IgE(FcεRI)(Metzger，Alcaraz etal.1986)的高亲和力受体的不同α、β和γ链，将不同链组装作为单个多链CAR的一部分就成为可能。γ链包含跨膜区和含有一个基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)的胞质尾(Cambier 1995)。

多链CAR可以包含几个胞外配体结合结构域，以同时结合靶中的不同元件，由此增强免疫细胞的活化和功能。在一个实施方式中，可以将胞外配体结合结构域置于同一跨膜多肽上的级联中，并可选地可以由接头隔开。在另一实施方式中，可以将所述不同胞外配体结合结构域置于组成多链CAR的不同跨膜多肽上。

本发明的多链CAR的信号转导结构域或胞内信号结构域负责在将胞外配体结合结构域结合于靶之后的胞内信号转导，产生免疫细胞的活化和免疫应答。换句话而言，信号转导结构域负责多链CAR表达于其中的免疫细胞的至少一个正常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是包括分泌细胞因子在内的胞溶活性或辅助子活性。

在本申请中，术语“信号转导结构域”是指转导效应子信号功能信号并指导细胞执行专门功能的蛋白的部分。

适用于单链或多链CAR的信号转导结构域的优选实例可以是Fc受体或T细胞受体和在抗原受体结合之后一致行动开始信号转导的共受体的细胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和作为相同功能能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两个独特类型的胞质信号序列，即，启动抗原依赖性的初级活化的那些，和按照不依赖抗原的方式作用而提供次级或共刺激信号的那些。初级胞质信号序列可以包含称为ITAM的基于免疫受体酪氨酸的活化基序的信号基序。ITAM是发现于充当syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点的各种受体的胞质内尾中的充分明证的信号基序。用于本发明中的ITAM的实例作为非限制性实例可以包括源自TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。根据具体实施方式，多链CAR的信号转导结构域可以包含CD3ζ信号结构域，或FcεRIβ或γ链的胞质内结构域。

根据具体实施方式，本发明的多链CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是除了抗原受体或其有效免疫应答所需的配体之外的细胞表面分子。

配体结合结构域可以是关于文献中所指的单链CAR的任何先前所用和提到的抗原受体，具体而言是单克隆抗体的scFv。

工程化的T细胞

作为本发明的结果，能够获得的工程化的T细胞具有改进的特性。具体而言，本发明提供了工程化的、优选分离的T细胞，其特征在于B2M和/或CIITA的表达受到抑制。

根据某些实施方式，本发明提供了一种工程化的、优选分离的T细胞，其表达能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。根据更具体的实施方式，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。因此，根据具体实施方式，稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是大范围核酸酶。根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是锌指核酸酶。根据还有的另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶，如Cas9。

根据某些其他实施方式，本发明提供了一种工程化的、优选分离的T细胞，其包含抑制B2M表达的外源核酸分子。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有编码抑制B2M表达的核酸分子的核苷酸序列的外源核酸分子。根据更具体的实施方式，抑制B2M表达的核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。因此，根据具体实施方式，抑制B2M表达的核酸分子是反义寡核苷酸。根据另一具体实施方式，抑制B2M表达的核酸分子是核酶，并且优选锤头核酶。根据另一具体实施方式，抑制B2M表达的核酸分子是干扰性RNA分子。

根据某些实施方式，本发明提供了一种工程化的、优选分离的T细胞，其表达能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。根据更具体的实施方式，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。因此，根据具体实施方式，稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是大范围核酸酶。根据另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是锌指核酸酶。根据还有的另一具体实施方式，稀切核酸内切酶是RNA或DNA指导的核酸内切酶，如Cas9或Argonaute。

根据某些其他实施方式，本发明提供了一种工程化的、优选分离的T细胞，其包含抑制CIITA表达的外源核酸分子。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有抑制CIITA表达的编码核酸分子的核苷酸序列的外源核酸分子。根据更具体的实施方式，抑制CIITA表达的核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰RNA(RNAi)分子。因此，根据具体实施方式，抑制CIITA表达的核酸分子是反义寡核苷酸。根据另一具体实施方式，抑制CIITA表达的核酸分子是核酶，并且优选锤头核酶。根据另一具体实施方式，抑制CIITA表达的核酸分子是干扰性RNA分子。

根据某些实施方式，工程化的T细胞进一步表达能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活至少一个对T细胞受体的组件(TCR)如TCRα进行编码的基因的稀切核酸内切酶。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。

根据某些实施方式，工程化的T细胞进一步包含表达针对至少一个表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。根据具体实施方式，所述T细胞包含含有编码所述CAR的核苷酸序列的外源核酸分子。

根据一些实施方式，本发明提供了一种工程化的、优选分离的T细胞，其表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽。根据具体实施方式，所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物，如UL18。T细胞由此可以包含含有对与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。根据其他具体实施方式，所述非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。T细胞由此可以包含含有对与SEQ ID NO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

应该理解的是，本文中关于能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶、抑制B2M表达的核酸分子、能够通过DNA切割选择性失活至少一个对T细胞受体的组件(TCR)进行编码的基因的稀切核酸内切酶和嵌合抗原受体所给的细节也适用于本发明的这个方面。

另外，在本发明的范围内也涵盖了获自根据本发明的工程化的T细胞、优选表现出这些表型之一的细胞或细胞系：

[b2m]^-[TCR]^-

[TCR]^-[PD1]^-[PDL-1]⁺

[b2m]^-[TCR]^-[PD1]^-

[b2m]^-[TCR]^-[PD1]^-[PDL-1]⁺

[b2m]^-[病毒MHC同源物]⁺

[b2m]^-[TCR]^-[病毒MHC同源物]⁺

[b2m]^-[NKG2D配体]⁺

[b2m]^-[TCR]^-[NKG2D配体]⁺

根据本发明的T细胞优选是[CAR]⁺，即，配备有定向特异性识别肿瘤细胞的嵌合抗原受体。

递送方法

本发明人已经考虑本领域中已知的任何方法以允许在细胞或所述细胞的亚细胞区室内部递送根据本发明采用的核酸分子。作为非限制性实例，这些方式包括病毒转导、电穿孔以及还有脂质体递送方式、聚合物载体、化学载体、脂质复合物、聚合复合物(polyplexes)、树枝状聚合物、纳米粒子、乳剂、天然内吞作用或吞噬途径。

根据本发明，可以通过本领域内已知的任何合适的方法将本文中详述的核酸分子引入T细胞中。用于将核酸分子引入根据本发明的T细胞中的适合的非限制性方法包括：其中核酸分子整合到细胞的基因组中的稳定转化方法，其中核酸分子未整合到细胞的基因组中的瞬时转化方法和病毒介导方法。例如，可以通过重组病毒载体(例如，逆转录病毒，腺病毒)、脂质体等将核酸分子引入到细胞中。瞬时转化方法包括，例如，微注射法、电穿孔法或粒子轰击法。在某些实施方式中，核酸分子是载体，如病毒载体或质粒。合适地，载体是由T细胞能够表达的本文中详述的各自多肽或蛋白的表达载体。

引入到T细胞中的核酸分子可以是DNA或RNA。在某些实施方式中，引入到T细胞中的核酸分子是DNA。在某些实施方式中，引入到T细胞中的核酸分子是RNA，并且特别是编码本文中详述的多肽或蛋白的mRNA，例如通过电穿孔将mRNA直接引入到T细胞中。合适的电穿孔技术描述于例如，国际出版物WO2013/176915(具体而言是桥接第29至30页的标题为“电穿孔”的小节)。可以是mRNA的具体核酸分子是包含对能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的核酸分子。可以是mRNA的另一具体核酸分子是包含对能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的核酸分子。可以是mRNA的还有的其他具体核酸分子是包含对能够通过DNA切割选择性失活至少一个对T细胞受体的一个组件(TCR)编码的基因的稀切核酸内切酶进行编码的核苷酸序列的核酸分子。

作为本发明的一个优选实施方式，例如，通过电穿孔，编码本发明的核酸内切酶的核酸分子在mRNA形式下转染以获得瞬时表达并避免外源DNA的染色体整合。本发明人已经确定了表1中展示的T细胞内的mRNA电穿孔的不同最佳条件。本发明人使用了CytoPulse技术，这种技术允许通过使用脉冲电场瞬时渗透活细胞而将物质递送到细胞内(美国专利US6010613和WO 2004/083379)。可以修改脉冲持续时间、强度以及脉冲之间的间隔以达到高转染效率而死亡率最低的最佳条件。基本上，第一高电场脉冲容许孔道形成，而随后的低电场脉冲允许将多核苷酸迁移至细胞中。在本发明的一个方面中，本发明人描述了使得在T细胞中实现mRNA的>95％转染效率，和利用电穿孔方案在T细胞中瞬时表达不同类型的蛋白质的步骤。具体而言，本发明涉及一种转化T细胞的方法，包括使所述T细胞与RNA接触并向T细胞施加由以下组成的灵活的脉冲序列：

(a)一个电脉冲，具有2250至3000V/cm的电压范围以及0.1ms的脉冲宽度，并且步骤(a)和步骤(b)的电脉冲之间的脉冲间隔为0.2至10ms；

(b)一个电脉冲，具有2250至3000V的电压范围和100ms的脉冲宽度，并且步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第1电脉冲之间的脉冲间隔100ms；和

(c)4个电脉冲，具有325V的电压，0.2ms的脉冲宽度，并且4个电脉冲每个之间的脉冲间隔2ms。

在具体实施方式中，T细胞转化方法包括使所述T细胞与RNA接触并向T细胞施加由以下组成的灵活脉冲序列：

(a)一个电脉冲，具有2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V/cm的电压，0.1ms的脉冲宽度，并且步骤(a)和(b)的电脉冲之间的脉冲间隔0.2、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ms；

(b)一个电脉冲，具有2250、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2400、2450、2500、2600、2700、2800、2900或3000V的电压，100ms的脉冲宽度，并且步骤(b)的电脉冲和步骤(c)的第1电脉冲之间的脉冲间隔100ms；和

(c)4个电脉冲，具有325V的电压，0.2ms的脉冲宽度，并且4个电脉冲每个之间的脉冲间隔2ms。

上述数值范围内包括的任何值都在本申请中公开。电穿孔介质可以是本领域中已知的任何合适的介质。优选地，电穿孔介质具有在跨过0.01至1.0毫西门子的范围内的电导率。

表1：用于测定PBMC衍生的T细胞中电穿孔所需的最低电压的不同cytopulse程序

非同种异体反应活性T细胞

虽然本发明的方法可以作为基因疗法的一部分体内地实施，例如，通过在血液循环中使用靶向T细胞的病毒载体，其会包括表达特异性稀切核酸内切酶的遗传序列，连同表达例如CAR的其他遗传序列一起，但本发明的方法总体上更意在在可获自患者或供体的培养的T细胞上体外地实践。离体工程化的工程化的T细胞能够要么作为自体治疗的一部分重新植入其所源自的患者，要么作为同种异体治疗的一部分使用。在后一种情况下，优选对细胞进一步工程化而使它们变成非异体反应活性的以确保其正确植入。因此，本发明的方法可以包括从供体获取T细胞并失活其参与MHC识别和或是免疫抑制性药物之靶的基因的另外的步骤，正如例如WO 2013/176915中所描述的那样。

T细胞受体(TCR)是细胞表面受体，其参与T细胞的活化以响应于抗原的呈递。TCR一般由α和β两条链组成，其经过组装而形成异源二聚体并与CD3转导亚单元关联以形成存在于细胞表面上的T细胞受体复合体。TCR的每个α和β链由免疫球蛋白样N-端可变(V)和恒定(C)区、疏水跨膜结构域和短胞质区组成。至于免疫球蛋白分子，由V(D)J重组产生α和β链的可变区，在T细胞群体内产生大量不同的抗原特异性。然而，相比于识别完整抗原的免疫球蛋白，T细胞通过与MHC分子相关的经加工的肽片段活化，通过T细胞向抗原识别引入额外的维度，也称为MHC限制。通过T细胞受体识别供体和接受者之间的MHC差异引起T细胞增殖和GVHD的潜在发展。据证明，TCR的正常表面表达取决于复合体的所有七个组件的协调合成和组装(Ashwell and Klusner 1990)。TCRα或TCRβ的失活可能导致TCR从T细胞的表面上消除而阻止同种抗原以及因此GVHD的识别。

因此，仍然根据本发明，可以通过使编码TCR组件的至少一个基因失活改善T细胞的植入。通过失活TCRα基因和/或TCRβ基因，致使TCR在细胞中成为无功能的。

相对于Cas9/CRISPR体系的使用，本发明人已经在编码TCR的3个外显子内确定了合适的靶序列，允许在活细胞内毒性的显著降低，而同时保留切割效率。优选的靶序列在表2中指出(+为较低比率的TCR阴性细胞，++中间比率，+++为较高比率)。

表2：在T细胞中使用Cas9的导向RNA的合适靶序列

MHC抗原也是在移植反应中发挥重要作用的蛋白质。由对所植入的组织的表面上的组织相容性抗原产生反应的T细胞介导排异，而这些抗原的最大的组是主要组织相容性抗原(MHC)。这些蛋白表达于所有高等脊椎动物的表面上，并且在人类细胞中称为HLA抗原(对于人类白细胞抗原)。与TCR类似，MHC蛋白质在T细胞刺激中发挥至关重要的作用。抗原呈递细胞(通常是树突状细胞)展示属于MHC上的细胞表面上的外源蛋白的降解产物的肽。在共刺激信号的存在下，T细胞被活化，并且将作用于也展示相同肽/MHC复合体的靶细胞。例如，刺激的T辅助细胞会靶向巨噬细胞，该巨噬细胞展示与其MHC结合的抗原，或细胞毒性T细胞(CTL)会作用于展示外源病毒肽的病毒感染的细胞。

因此，为了提供较低同种异体反应活性的T细胞，本发明的方法可以进一步包括使一个HLA基因失活或突变的步骤。

人类中，I类HLA基因簇包括三个主要的基因座，B、C和A，以及几个次要基因座。II类HLA簇也包括三种主要基因座，DP、DQ和DR，并且I类和II类基因簇都是多态的，因为在群体中I类和II基因都具有几个不同的等位基因。也有几种辅助蛋白在HLA行使功能中扮演了角色。Tapl和Tap2亚单元是将肽抗原装载于I类HLA复合体上至关重要的TAP转运子复合体的部分，并且LMP2和LMP7蛋白体亚单元在抗原蛋白水解降解成肽用于在HLA上展示时发挥作用。已经证明LMP7降低减少在细胞表面处MHC I类的量，这可能是通过稳定性的缺陷的(Fehling et al.(1999)Science 265:1234-1237)。除了TAP和LMP之外，还有TAP相关蛋白(tapasin)基因，其产物形成TAP复合体和HLAI类链之间的桥梁并增强肽负载。TAP相关蛋白的降低会导致细胞的MHC I类组装受损，MHC I类的细胞表面表达降低和免疫应答受损(Grandea et al.(2000)Immunity13:213-222和Garbi et al.(2000)Nat.Immunol.1:234-238)。任何上述基因都可以作为本发明的部分，例如，如WO 2012/012667所公开的那样进行失活。

因此，根据某些实施方式，本发明的方法进一步包括失活至少一个选自由以下各项组成的组中的基因：RFXANK、RFX5、RFXAP、TAP1、TAP2、ZXDA、ZXDB和ZXDC。例如，可以通过使用基因组修饰，更具体而言通过在T细胞中表达能够通过DNA切割选择性失活选自由RFXANK、RFX5、RFXAP、TAP1、TAP2、ZXDA、ZXDB和ZXDC组成的组中的基因的稀切核酸内切酶实现失活。

T细胞的活化和扩增

根据本发明的方法可以包括活化和/或扩增T细胞的进一步的步骤。这能够在T细胞的遗传修饰之前或之后完成，使用如，例如，美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请出版物No.20060121005中的方法。根据这些方法，本发明的T细胞能够通过与由其连接刺激与信号相关的CD3TCR复合体的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体的表面进行接触而扩增。

具体而言，T细胞群体可以在体外刺激，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段，或表面上固定的抗CD2抗体接触，或通过与结合有钙离子载体的蛋白激酶C活化子(例如，苔藓抑素)接触。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激作用，使用了结合辅助分子的配体。例如，T细胞的群体可以在适合刺激T细胞增殖的条件下与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供每种信号的试剂可以处于溶液中或结合至表面。因为本领域的普通技术人员能够易于理解，颗粒与细胞的比率可以取决于相对于靶细胞的粒度。在本发明进一步的实施方式中，细胞，如T细胞，与药剂涂覆的珠子接触，随后分离珠子和细胞，并且然后将细胞进行培养。在可替代的实施方式中，在培养之前，药剂涂覆的珠子和细胞并不分离而是一起培养。可以通过允许抗CD3和抗CD28附连于其上的顺磁珠子(3×28个珠子)接触T细胞而连接细胞表面蛋白质。在一个实施方式中，细胞(例如，4至10个T细胞)和珠子(例如，按照比率1:1的M-450CD3/CD28T顺磁珠子)混合于缓冲液，优选PBS(无二价阳离子如钙和镁)中。而且，本领域内那些普通技术人员容易理解，可以使用任何细胞浓度。可以培养混合物数小时(约3小时)至约14天或其间的任何整小时数值。在另一实施方式中，可以培养混合物21天。适于T细胞培养的条件包括可以包含增殖和活力必要的因子的合适介质(例如，最小必需培养基(Minimal Essential Media)或RPMI培养基1640，或X-vivo 5，(Lonza))，这些因子包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、1L-4、1L-7、GM-CSF、-10、-2、1L-15、TGFp和TNF，或本领域技术人员已知的用于细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括，但不限于，表面活性剂，人血浆蛋白，和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。介质能够包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20、Optimizer，以及另外的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，要么无血清，要么补充有适量的血清(或血浆)或定义的一组激素，和/或一定量的足以使T细胞生长和扩增的细胞因子。抗生素，例如，青霉素和链霉素，仅仅包含于实验培养物中，而不包含于要注入到受试者中的细胞的培养物中。靶细胞被维持于支持生长所必需的条件，例如，合适的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气+5％CO₂)下。已经暴露于变化的刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。

在另一具体实施方式中，可以通过与组织或细胞共培养扩增所述细胞。也可以在将所述细胞给予于受试者之后，例如，在受验者的血液中体内扩增所述细胞。

治疗应用

根据本发明可获得的T细胞预想用作药物，而特别是用于治疗需要其的患者中的癌症、感染(如病毒感染)或免疫疾病等的药物。因此，本发明提供了适用于用作药物的工程化的T细胞。具体而言，本发明提供了适用于治疗癌症，如淋巴瘤，或病毒感染的工程化的T细胞。本文还提供了组合物，具体而言是药物组合物，其包含至少一种本发明的工程化的T细胞。在某些实施方式中，组合物可以含有本发明的工程化的T细胞的群体。

治疗可以是缓解性的、治疗性的或预防性的。它可以是自身免疫疗法的部分或同种异体免疫疗法治疗的部分。对于自体，是指用于治疗患者的细胞、细胞系或细胞群体源自所述患者或人类白细胞抗原(HLA)相容性供体。对于同种异体，是指用于治疗患者的细胞或细胞群体并非源自所述患者而是源自供体。

本发明特别适合于同种异体免疫疗法，因为它使通常获自供体的T细胞能够转化成非同种反应性细胞。这可以根据标准方案完成，并根据需要多次再生产。获得了修饰T细胞可以汇集并给予于一个或几个患者，被制成可利用的“现成”治疗性产品。

治疗主要用于治疗诊断患有癌症的患者。癌症优选是白血病和淋巴瘤，其具有液体肿瘤，但也可以涉及实体瘤。待用本发明遗传工程化的T细胞治疗的癌症类型包括，但不限于，癌、母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤，和恶性肿瘤，例如，肉瘤、癌和黑色素瘤。成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症也包括在内。

治疗可以与一种或多种疗法组合而发生，所述疗法选自抗体疗法、化疗、细胞因子疗法、树突状细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法的组。

根据某些实施方式，本发明的T细胞在给予于患者之后可以经历强的体内T细胞扩增，并可以在体液中保持延长的一段时间，优选长达一周，更优选长达2周，甚至更加优选长达至少一个月。尽管预期根据本发明的T细胞预期在这些时间期间内保持，但预期其进入患者体内的有效期不超过一年，优选6个月、更优选2个月、并且甚至更加优选一个月。

可以以任何方便的方式，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输液、灌注或移植进行给予根据本发明的细胞或细胞群体。本文描述的组合物可以以皮下、皮内、瘤内、结内、髓内、肌肉内、通过静脉内或淋巴内注射，或腹腔内给予于患者。在一种实施方式中，本发明的细胞组合物优选通过静脉内注射给予。

给予细胞或细胞群体可以包括给予10⁴至10⁹个细胞/kg体重、优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括那些范围内细胞数的所有整数值。可以以一个或多个剂量给予细胞或细胞群体。在另一实施方式中，所述有效量的细胞作为单一剂量给予。在另一实施方式中，所述有效量的细胞作为不只一个剂量在一段时间内给予。为给予定时在管理医师的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可以获自任何来源，如血库或供体。虽然个体需要改变，但对于具体疾病或病症的给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定都在本领域的技术内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。给予的剂量将取决于接受者的年龄、健康状况和体重、如果存在的并行治疗的类型，治疗频率和所需疗效的性质。

在其他实施方式中，胃肠外给予所述有效量的细胞或包含这些细胞的组合物。所述给予可以是静脉给予。所述给予可以通过在肿瘤中注射直接完成。

在某些实施方式中，将细胞与任何数量的相关治疗方式(例如，在其之前，同时或之后)结合给予至患者，相关治疗方式包括但不限于，用药剂如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(还称为ARA-C)的治疗或针对MS患者的那他丽珠单抗(nataliziimab)治疗或针对牛皮癣患者的依法丽珠单抗(efaliztimab)治疗或针对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可以与化疗、辐射、免疫抑制剂组合使用，免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消融(immunoablative)剂如CAMPATH、抗CD3抗体或其他抗体疗法，细胞毒素(cytoxin)，氟达拉滨(fludaribine)，环孢菌素，FK506，雷帕霉素，霉酚酸，类固醇，FR901228，细胞因子，和辐照。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对于生长因子诱导的信号转导很重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu et al.，Cell 66:807-815，1 1；Henderson et al.，Immun.73:316-321，1991；Bierer et al.，Citrr.Opin.mm n.5:763-773，93)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与以下结合(例如，之前，同时或之后)给予于患者：骨髓移植，使用化疗剂如氟达拉滨的T细胞消融疗法，外部束辐射疗法(XRT)，环磷酰胺，或抗体如OKT3或CAMPATH。在另一实施方式中，本发明的细胞组合物在B细胞消融疗法如与CD20反应的药物，例如，利妥昔单抗之后进行给予。例如，在一个实施方式中，受试者可以进行高剂量化疗的标准治疗之后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，移植之后，受试者接受本发明的扩增的遗传工程化的T细胞的输注。在另外的实施方式中，在手术之前或之后给予扩增的细胞。

本发明这方面内也涵盖用于治疗需要这种治疗的患者的方法，其包括a)提供至少一种本发明的工程化的T细胞、优选所述T细胞的群体；和b)向所述患者给予所述T细胞或细胞群体。

本发明这方面内也涵盖用于使用至少一种本发明的工程化的T细胞，并且优选所述T细胞的群体制备药物的方法。因此，本发明提供了本发明的至少一种工程化的T细胞，并优选所述T细胞的群体在制备药物中的用途。优选地，这种药物适用于治疗癌症，如淋巴瘤，或病毒感染。

其他定义

-在本文中根据单字母代码指定多肽序列中的氨基酸残基，其中，例如，Q表示Gln或谷氨酰胺残基，R表示Arg或精氨酸残基，D表示Asp或天冬氨酸残基。

-氨基酸取代是指用一个氨基酸残基替换另一个，例如，在肽序列中用谷氨酰胺残基替换精氨酸残基就是氨基酸取代。

-核苷酸标识如下：单字母代码用于标识核苷酸的碱基：a是腺嘌呤，t是胸腺嘧啶，c是胞嘧啶，并且g是鸟嘌呤。对于降解的核苷酸，r代表g或a(嘌呤核苷)，k代表g或t，s代表g或c，w代表a或t，m代表a或c，y表示t或c(嘧啶核苷)，d代表g、a或t，v代表g、a或c，b代表g、t或c，h代表a、t或c，n代表g、a、t或c。

-如本文所用的，“核酸”或“多核苷酸”是指核苷酸和/或多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，寡核苷酸，通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，和通过连接、切割、核酸内切酶作用和核酸外切酶作用的任一种产生的片段。核酸分子可以由天然存在的核苷酸(如DNA和RNA)的单体或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合组成。修饰的核苷酸可以在糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基部分中具有改变。糖修饰包括，例如，用卤素、烷基、胺和叠氮基团取代一个或多个羟基，或糖可以官能化为醚或酯。此外，可以用空间和电子结构上相似的结构，如氮杂糖和碳环糖类似物取代整个糖部分。在碱基部分中的修饰实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶，酰化的嘌呤或嘧啶，或其他公知的杂环取代。核酸单体可以通过磷酸二酯键或此类连接的类似物进行连接。核酸可以是单链或双链。

-对于“连续包含与所述双链断裂的上游的序列同源的第一区、待插入所述细胞的基因组中的序列和与所述双链断裂的下游的序列同源的第二区的多核苷酸”，预想是指包含与DNA靶原位的5'和3'区同源的第一和第二部分的DNA构建体或基质。DNA构建体还包含位于第一和第二部分之间的第三部分，其含有与原位对应的DNA序列的某些同源性或可替代地不含与原位DNA靶的5'和3'区的同源性。在DNA靶的切割之后，在含有包含在所关注的基因座和这种基质中的靶基因的基因组之间刺激同源重组事件，其中含有DNA靶序列的基因组序列被基质的第三部分和基质的第一和第二部分的可变部分取代。

-对于“DNA靶”、“DNA靶序列”、“靶DNA序列”、“核酸靶序列”、“靶序列”或“加工位点”预想是指可以被根据本发明的稀切核酸内切酶靶向和加工的多核苷酸序列。这些术语是指具体的DNA位置，优选细胞中的基因组位置，而且还是指可以独立于遗传物质主体，如质粒、附加体、病毒、转座子或细胞器(如，作为非限制性实例的线粒体)中存在的一部分遗传物质。作为RNA指导的靶序列非限制性的实例，是可以将向导RNA(其指导RNA指导的核酸内切酶)杂交至期望的基因座的那些基因组序列。

-对于“递送载体”或“多种递送载体”预想是指可以在本发明中用于置入细胞接触(即“接触”)或在细胞或亚细胞区室内递送(即“引入”)本发明中所需的试剂/化学品和分子(蛋白或核酸)的任何递送载体。它包括，但不限于脂质体递送载体，病毒递送载体，药物递送载体，化学载体，聚合物载体，脂质复合物，聚合复合物，树枝状聚合物，微泡(超声造影剂)，纳米粒子，乳剂或其他合适的转移载体。这些递送载体容许递送分子、化学品、大分子(基因，蛋白)或其他载体如质粒，或穿透肽。在这些后来的情况下，递送载体是分子载体。

-术语“载体”或“多个载体”是指能够转运与之连接的另一核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于：病毒载体、质粒、RNA载体或者可以直链或环状圆形DNA或RNA分子，其可以由染色体、非染色体、非半合成或合成核酸组成。优选的载体是能够与之连接的核酸序列自体复制(游离载体)和/或表达(表达载体)的那些。大量合适的载体对本领域内的那些技术人员而言是已知的并可以商购获得。

病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、棒状病毒(例如，狂犬病和泡状口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台病毒)、正链RNA病毒如细小核糖核酸病毒和α病毒，和双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1和2型，爱波斯坦-巴尔病毒，巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘，鸡痘和金丝雀痘)。其他病毒包括，例如，诺沃克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、嗜肝性DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV族、慢病毒、泡沫病毒(Coffin，J.M.，Retroviridae：Theviruses and their replication，In Fundamental Virology，第三版，B.N.Fields，etal.，Eds.，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。

对于“慢病毒载体”是指基于HIV的慢病毒载体，因为其相对大的包装能力、降低的免疫原性及其高效率稳定转导大范围不同细胞类型的能力而对于基因递送是非常有前景的。慢病毒载体通常在三个(包装、包封和转运)或更多质粒瞬时转染到生产者细胞中之后产生。与HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面受体的相互作用进入靶细胞。在进入时，病毒RNA进行逆转录，这由病毒逆转录酶复合体介导。逆转录的产物是双链线性病毒DNA，这是在受感染细胞的DNA中病毒整合的底物。对于“整合型慢病毒载体(或LV)”，是指这种载体，作为非限制性实例，其能够整合靶细胞的基因组。与之相对，对于“非整合型慢病毒载体(或NILV)”是指并不通过病毒整合酶的作用整合靶细胞的基因组的有效基因递送载体。

-递送载体和载体可以与任何细胞穿透技术如声致穿孔(sonoporation)或电穿孔或这些技术的衍生技术关联或组合。

-对于“细胞”或“多个细胞”预想是指源于这些进行体外培养的生物体的任何真核生物活细胞、原代细胞和细胞系。

-对于“原代细胞”或“多个原代细胞”预想是指直接取自活组织(即，活检材料)并为体外生长所建立的细胞，其经过了极少群集倍增，并且因此与连续致瘤性细胞系或人工的永生化细胞系相比，更能代表由其衍生的组织的主要功能组件和特性。

作为非限制性实例的细胞系可以选自由以下各项组成的组中：CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞，U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。

所有这些细胞系可以通过本发明的方法修饰以提供细胞系模型以产生、表达、量化、检测、研究所关注的基因或蛋白质；这些模型也可以用于筛选在研究和生产及各领域中关注的生物活性分子，如作为非限制性实例的化学、生物燃料、治疗和农学。

-对于“突变”预想是指在多核苷酸(cDNA，基因)或多肽序列中的取代、缺失、插入，最高达一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、二十、二十五、三十、四十、五十或更多核苷酸/氨基酸。突变可以影响基因的编码序列或其调节性序列。它也可能影响基因组序列的结构或编码的mRNA的结构/稳定性。

-对于“一个或多个变体”，预想是指重复变体、变体、DNA结合变体、TALE核酸酶变体、通过母分子的氨基酸序列中至少一个残基突变或取代而获得的多肽变体。

-对于“功能型变体”预想是指蛋白或蛋白域的催化活性突变体；这种突变相比于其母体蛋白或蛋白结构域或另外的性质可以具有相同活性，或更高或更低活性。

-对于“基因”是指遗传的基本单位，由一段沿着染色体按照线性方式排列的DNA组成，其对特定蛋白或蛋白段进行编码。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、可选的内含子、3'非翻译区。基因可以进一步包括终止子，增强子和/或静默子(silencer)。

-正如本文所用的术语“基因座”是染色体上的DNA序列(例如，基因的)的特定物理位置。术语“基因座”可以是指染色体上的稀切核酸内切酶靶序列的特定物理位置。这种基因座可以包含由根据本发明的稀切核酸内切酶识别和/或切割的靶序列。应该理解的是，本发明所关注的基因座不仅可以限定细胞遗传物质的主体中(即，在染色体中)存在的核酸序列而且也限定一部分可以独立于所述遗传物质的主体存在的遗传物质如质粒、游离体、病毒、转座子或在细胞器中如作为非限制性实例的线粒体。

-术语“切割”是指多核苷酸的共价主链的断裂。切割可以通过各种方法，包括，但不限于，磷酸二酯键的酶促或化学水解而引发。单链切割和双链切割都是可能的，而双链切割可以作为两个独特的单链切割事件的结果而发生。双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交体切割可以导致产生钝端或交错端中的一种。

对于“融合蛋白”预想是指本领域中众所周知的过程的结果，包括最初对独立蛋白或其部分进行编码的一个或多个基因的连接，所述“融合基因”的翻译导致单个多肽具有衍生自每个初始蛋白的功能性质。

-“同一性”是指两核酸分子或多肽之间的序列同一性。同一性可以通过比对可以为比对目的对齐的每一序列中的位置而测定。当比对序列中的位置被相同碱基或氨基酸占据时，则分子在那个位置上是同一的。核酸或氨基酸序列之间的相似度或同一性是分别由核酸或氨基酸序列共享的位置上相同或匹配的核苷酸或氨基酸数目的函数。不同对齐算法和/或程序可以用于计算两序列之间的同一性，包括FASTA，或可作为GCG序列分析软件包的一部分而获得的BLAST(University of Wisconsin，Madison，Wis.)，并可以，例如，采用缺省设置进行使用。例如，设想与本文中描述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％的同一性并优选表现出基本上相同功能的多肽，以及编码这种多肽的多核苷酸。

-“抑制”或“遏制”B2M的表达是指细胞中B2M的表达减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。更具体而言，“抑制”或“遏制”B2M的表达是指细胞中B2M的含量降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。可以通过本领域内已知的任何合适的方法，如ELISA、免疫组织化学、免疫印迹(Western Blotting)或流式细胞术使用B2M特异性抗体测定细胞中蛋白的表达或含量。这种抗体通常可以从不同的来源，如从Merck Millipore，Billerica，MA，USA；或Abcam plc，Cambridge，UK商购获得。

-“抑制”或“遏制”CIITA的表达是指细胞中CIITA的表达减少至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。更具体而言，“抑制”或“遏制”CIITA的表达是指细胞中CIITA的含量降低至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。可以通过本领域内已知的任何合适的方法，如ELISA、免疫组织化学、免疫印迹(Western Blotting)或流式细胞术使用CIITA特异性抗体测定细胞中蛋白的表达或含量。这种抗体通常可以从不同的来源，如从Abcam plc,Cambridge,UK；或Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,CA,USA商购获得。

-“信号转导结构域”或“共刺激配体”是指抗原呈递细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，由此，除了通过例如TCR/CD3复合体与加载有肽的MHC分子结合提供的第一信号(primary signal)之外，提供介导T-细胞应答，包括但不限于增殖活化、分化等的信号。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也涵盖，特别是与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的抗体，如但不限于，CD27、CD28、4-IBB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关的抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体。

-“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合，由此通过细胞介导共刺激响应如，但不限于，增殖的同源结合伴侣。共刺激分子包括，但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。

-如本文中所使用的“共刺激信号”是指这样的信号，其与第一信号组合，如TCR/CD3连接，会导致T细胞增殖和/或上调或下调关键分子的信号。

-“双特异性抗体”是指单个抗体分子中具有针对两个不同抗原的结合位点的抗体。对于本领域那些技术人员应该理解到，除了标准的(canonical)抗体结构外，可以构造其他分子而具有两个结合特异性。还应该理解的是，通过双特异性抗体结合的抗原可以是同时的或按序的。可以通过化学技术(参见，例如，Kranz et al.(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78，5807)，通过“polydoma”技术(参见美国专利No.4,474,893)或通过重组DNA技术制备双特异性抗体，这本身都是已知的。作为非限制性的实例，每一结合结构域包含来自抗体重链(“VH或H区”)的至少一个可变区，其中第一结合结构域的VH区特异性地结合至淋巴细胞标志物如CD3，而第二结合结构域的VH区特异性地结合肿瘤抗原。

-如本文中所用的术语“胞外配体结合结构域”定义为能够结合配体的寡肽或多肽。优选地，该结构域能够与细胞表面分子相互作用。例如，可以选择胞外配体结合结构域而识别充当靶细胞上与具体疾病状态相关的细胞表面标志物的配体。由此可以充当配体的细胞表面标志物的实例包括与病毒、细菌和寄生虫感染、自身免疫性疾病和癌症细胞相关的那些。

-如本文所用的术语“受试者”或“患者”包括动物界的所有成员，包括非人灵长类动物和人类。

-本发明的以上书面描述提供了制备和使用的方式和方法而使本领域任何技术人员能够制备和使用它，具体而言这种实现提供了所附的权利要求的主题，其组成原始描述的一部分。

在本文中陈述数值限制或范围时，包括端点。此外，明确包括数值限制或范围内的所有值和子范围，就如同明确写出那样。

尽管一般性地描述了本发明，但可以通过参考某些具体实施例而获得进一步的理解，在本文中提供这些具体实施例仅用于举例说明的目的，而除非另外说明，并非旨在是限制性的。

实施例

切割人类CIITA的TALE核酸酶

编码靶向人类CIITA基因的外显子的TALE核酸酶的mRNA订购自CellectisBioresearch(8，rue de la Croix Jarry，75013PARIS)。以下表3指示了由两个独立实体(称为半TALE核酸酶)中的每个切割的靶序列，两个独立实体每个含有经过工程化以结合和切割于由两个通过15bp间隔子隔开的17bp长序列(称为半靶)组成的靶序列之间的重复序列。因为外显子2和外显子3由CIITA的所有转录本变体共享，两个TALEN对设计用于外显子2和外显子3。已经使用靶向这些序列的TALE核酸酶预测人类基因组而无显著脱位靶向。

表3：CIITA TALE核酸酶及其相关靶序列的描述

切割人类β2m的TALE核酸酶

编码靶向人类β2m基因的外显子的TALE核酸酶的mRNA订购自CellectisBioresearch(8，rue de la Croix Jarry，75013PARIS)。下表4指示了由两个独立实体(称为半TALE核酸酶)中的每个切割的靶序列，两个独立实体每个含有经过工程化以结合和切割于由两个通过15bp间隔子隔开的17bp长序列(称为半靶)组成的靶序列之间的重复序列。

表4：β2m TALE核酸酶及其相关靶序列的描述

切割人类TCR基因(TRAC和TRBC)的TALE核酸酶

人类基因组包含两个功能性T细胞受体β链(TRBC1和TRBC2)。在、α/βT淋巴细胞的发育期间，在每个细胞中选出这些两个恒定链之一而拼接至TCR-β的可变区并形成功能性的全长β链。以下表5展示了TRAC和2个TRBC靶序列及其相应的TALEN序列。顺序将2个TRBC靶序列选入TRBC1和TRBC2之间保存的序列中，而使相应的TALE核酸酶会同时切割TRBC1和TRBC2。

表5TRAC和TRBC TALE核酸酶的描述以及人类对应基因中的TALE核酸酶靶位点的序列。

已经设计了TRAC和CD52基因中的其他靶序列，展示于表6中。

表6：TRAC TALE核酸酶的其他靶序列。

使用Cytopulse技术活化的纯化T细胞的mRNA的电穿孔

在确定容许有效DNA电穿孔T细胞的最佳Cytopulse程序之后，我们测试了这种方法是否适用于mRNA电穿孔。

将5×10⁶个采用PHA/IL2预激活6天的纯化的T细胞重悬浮于细胞穿孔(cytoporation)缓冲液T(BTX-Harvard apparatus)中，并使用表7的优选Cytopulse程序，用10μg的编码GFP的mRNA或20μg的编码GFP或pUC的质粒在0.4cm样品槽中进行电穿孔。

表7：用于电穿孔纯化T细胞的Cytopulse程序。

转染之后48小时，细胞用活力染料(eFluor-450)染色并通过流式细胞术测定细胞活力和％存活GFP+细胞。

用本文中确定的最佳条件电穿孔RNA是无毒的，并允许转染超过95％的活细胞。

在合成中，整个数据集表明可以用DNA或RNA有效地转染T细胞。具体而言，RNA转染对细胞活力没有影响并允许细胞群体中所关注的转染基因的均匀表达水平。

可以在细胞活化之后的早期实现有效转染，与使用的活化方法无关(PHA/IL-2或CD3/CD28涂覆的珠子)。本发明者以>95％的效率实现在活化后72小时的细胞中的成功转染。另外，使用相同的电穿孔方案也可以获得有效转染解冻和活化之后的T细胞。

原代人类T细胞中用于TALE核酸酶功能性表达的mRNA电穿孔

在证明mRNA电穿孔允许在原代人类T细胞中有效表达GFP之后，我们测试了这种方法是否适用于表达其他所关注的蛋白。转录激活子样效应子核酸酶(TALE核酸酶)是通过TAL DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的位点特异性的核酸酶。它们是强大的基因组编辑工具，因为它们在实际任何所需的DNA序列处诱导了双链断裂。这些双链断裂激活非同源性末端连接(NHEJ)，这是易错DNA修复机制，潜在地导致所关注的任何所需基因的失活。可替代地，如果将适当的修复模板同时引入细胞，就可以通过同源重组修复TALE核酸酶诱导的DNA断裂，因此提供了任意修饰基因序列的可能性。

我们已经使用了mRNA电穿孔来表达经设计以特异性切割人类基因中对T细胞抗原受体的α链(TRAC)编码的序列的TALE核酸酶。这个序列中诱导的突变预计导致基因失活和TCRαβ复合体从细胞表面丢失。使用Cytopulse技术将TRAC TALE核酸酶RNA或作为对照的非编码RNA转染到激活的原代人类T淋巴细胞中。电穿孔序列如表7中所描述的，包括2个1200V的脉冲和接着的四个130V脉冲。

通过电穿孔之后7天的TCR表面表达的流式细胞术分析(图4，顶部图)，我们观察到44％的T细胞TCRαβ的表达丢失。我们通过PCR扩增TRAC基因座接着是454高通量测序分析了所转染细胞的基因组DNA。33％的所测序的等位基因(2153个中的727个)在TALE核酸酶切割位点处含有插入或缺失。

这些数据表明，使用Cytopulse技术的mRNA电穿孔获得TRAC TALE核酸酶的功能性表达。

TRAC-TALE核酸酶和TRBC-TALE核酸酶在HEK293细胞中的活性

在pEF1α长启动子的控制之下于哺乳动物表达载体中，使用限制酶消化亚克隆每个TALE核酸酶构建体。在转染前一天接种一百万个HEK293细胞。根据生产商的说明书，使用25μL脂质体lipofectamine(Invitrogen)，用2.5μg在EF1-α启动子控制之下的、编码识别T细胞受体α恒定链区(TRAC)或T细胞受体β恒定链区(TRBC)中所关注的基因组序列中的两个半靶的TALE核酸酶的两个质粒中的每一种或5μg对照pUC载体(pCLS0003)转染细胞。通过非同源末端连接(NHEJ)(其是易错机制)在活体细胞中修复由TALE核酸酶在TRAC编码序列中产生的双链切割。通过所靶向的基因组基因座处的插入或缺失的频率测定TALE核酸酶在活细胞中的活性。转染之后48h，从转染的细胞中分离出基因组DNA并使用以下引物进行位点特异性PCR：对于TRAC：5’-ATCACTGGCATCTGGACTCCA-3’(SEQ ID NO:75)，对于TRBC1：5’-AGAGCCCCTACCAGAACCAGAC-3’(SEQ ID NO:76，或对于TRBC2：5’-GGACCTAGTAACATAATTGTGC-3’(SEQ ID NO:77)，以及对于TRAC的反向引物：5’-CCTCATGTCTAGCACAGTTT-3’(SEQ ID NO:78)，对于TRBC1和TRBC2：5’-ACCAGCTCAGCTCCACGTGGT-3’(SEQ ID NO:79)。通过454测序系统(454Life Sciences)测序PCR产物。每个PCR产物获得约10,000个序列并随后对位点特异性插入或缺失事件的存在进行分析；结果列于表8中。

表8：对于靶向TRAC_T01、TRBC_T01和TRBC_T02靶的TALE核酸酶的插入缺失(Indel)的百分比

β2m和TRAC-TALE核酸酶在原代T淋巴细胞中的活性

使用限制酶消化在T7启动子的控制之下将每个TALE核酸酶构建体亚克隆于哺乳动物表达载体中。

编码切割β2m、TRAC和TRBC基因组序列的TALE核酸酶的mRNA合成自携带T7启动子下游的编码序列的质粒。使用抗CD3/CD28激活珠子(Life technologies)激活从外周血中分离出的T淋巴细胞长达5天并使用CytoLVT-P仪，通过用10μg的编码两种半TALE核酸酶的两种mRNA中的每种(或非编码RNA作为对照)电穿孔转染500万个细胞。作为由NHEJ诱导的插入和缺失的结果，β2M和/或TRAC的编码序列在一部分细胞中会在读码框之外，导致非功能性基因。电穿孔后5天，用荧光染料结合的抗β2m或抗TCR抗体通过流式细胞术针对在其细胞表面上的β2M或TCR的存在标记细胞。由于由外周血扩增的所有T淋巴细胞都正常表达β2M和TCR，β2M阴性或TCR阴性细胞的比例是TALE核酸酶活性的直接度量。

具有受靶向的TRAC基因的T细胞的功能分析

TRAC基因失活的目的是使T淋巴细胞对T细胞受体刺激无响应。如在前面的段落中所描述的，用编码切割TRAC的TALE核酸酶的mRNA转染T淋巴细胞。转染后16天，用高达5μg/mL植物血凝素(PHA，Sigma-Aldrich)处理细胞，植物血凝素是通过T细胞受体发挥作用的T细胞促细胞分裂剂。具有功能性T细胞受体的细胞在PHA处理之后应该在尺寸方面增加。在培养的三天之后，用荧光染料结合的抗TCR抗体标记细胞并通过流式细胞术分析以比较TCR阳性和TCR阴性细胞之间的细胞尺寸分布。图3显示在PHA处理之后，TCR阳性细胞尺寸显著增加而TCR阴性细胞具有与未处理的细胞相同的尺寸，表明TRAC失活使它们对TCR信号无响应。

具有受靶向的β2m基因的T细胞的功能分析

类似于上述内容，用荧光染料标记的针对B2M蛋白的抗体以及识别所有三类的MHC-I分子(HLA-A，-B或-C)的抗体来染色TALEN-转染的细胞和对照细胞(不采用RNA转染的)。TALEN转染导致B2M和MHC-I分子在超过37％的T细胞中的表面表达丢失。参见图5。

β2m-TALE核酸酶和TRAC-TALE核酸酶在原代T淋巴细胞中的基因组安全性

由于我们的构建体包括核酸酶亚单元，一个重要的问题是多次TALE核酸酶转染是否可能导致基因毒性和“紧密匹配”靶序列处的脱靶切割或半TALE核酸酶的错配。为了评估TRAC-TALE核酸酶和β2m-TALE核酸酶对细胞基因组完整性的影响，我们列出了人类基因组中表现出脱位切割潜势的序列。为了生成这个列表，我们识别基因组中相对于初始半靶具有最高达4个取代的所有序列，并随后在头碰头的取向上以相互之间9至30bp的间隔子识别潜在的半靶的对。这种分析包括由一个半TALE核酸酶分子的同源二聚体或由一个β2m半TALE核酸酶和一个TRAC半TALE核酸酶形成的异源二聚体潜在靶向的位点。我们基于考虑各个取代的成本的特异性数据和取代的位置对潜在的脱位靶进行评分(其中错配更耐受半靶的3'端处的碱基)。我们获得了173个具有反映估计切割的可能性的分数的独特序列。我们选择了15个最高分并通过对用β2m和TRAC TALE核酸酶同时转染并通过磁分离纯化为β2m-阴性、TCRαβ-阴性的T细胞中这些基因座处发现的突变频率的深度测序进行分析。结果表明，插入/缺失的最高频率为7x10^-4。这些结果使推测脱位靶比预期的靶突变的可能性低至少600倍。本研究中所用的TALE核酸酶试剂因此表现出极度特异性。

用对抗CD19单链嵌合抗原受体(CAR)编码的单顺反子mRNA电穿孔T细胞

5×10⁶个用抗CD3/CD28涂覆的珠子和IL2预先激活几天(3至5天)的T细胞重悬于细胞穿孔缓冲液T中，并不用mRNA或用10μg的编码单链CAR(SEQ ID NO:6)的mRNA在0.4cm试管中使用表7中所描述的程序进行电穿孔。

电穿孔后24h，用可固定的活力染料eFluor-780和专门评价活细胞上CAR的细胞表面表达的PE结合的山羊抗小鼠IgG F(ab')2片段染色细胞。数据如图6中所示。A表示用前述的单顺反子mRNA电穿孔的绝大多数活T细胞都在其表面上表达CAR。电穿孔之后24h，T细胞与Daudi(CD19+)细胞共培养6h并通过流式细胞术分析以检测脱粒标志物CD107a在其表面上的表达(Betts，Brenchley et al.2003)。

图6中所示的数据表明，大多数用先前描述的单顺反子mRNA电穿孔的细胞在表达CD19的靶细胞的存在下脱粒。这些结果清楚地证明，电穿孔的T细胞的表面上表达的CAR具有活性。

在下列实施例中，为了延长其存活并增强其治疗活性，本发明人描述了通过使用特异性TALEN失活B2M基因来工程化同种异体T细胞以防止NK-细胞介导的治疗性同种异体T细胞的排异的方法，与以下二者之一组合：i)由UL18和β2M组成的嵌合单链分子B2M-UL18的表达)或ii)NKG2D配体的分泌。特殊性在于，向原代T细胞施加肿瘤细胞或病毒性受感染细胞中正常出现的机制。因此，作用机制潜在地是不同的：在肿瘤细胞中，使NKG2D配体脱落导致其在表面上的存在减少，而在工程化的细胞中，分泌的一种或多种NKG2D配体会充当潜在地仍然存在于T细胞表面上的几个其他NKG2D配体的诱饵。

使用特异性B2M TALEN的有效B2M基因敲除

已经产生靶向在B2M基因(基因库登记号NC_000015)的第一编码外显子内的序列(T01，SEQ ID No:81)的特异性TALEN(左DNA结合结构域RVD：具有SEQ ID NO:82的NN-NN-HD-HD-NG-NG-NI-NN-HD-NG-NN-NG-NN-HD-NG-NG，和右DNA结合结构域RVD：具有SEQ ID NO:83的NI-NN-HD-HD-NG-HD-HD-NI-NN-NN-HD-HD-NI-NN-NI-NG)。以下表9报道了T01靶向序列的序列，以及2个另外的靶T02和T03的序列及其对应的左和右TALE序列。

表9：另外的β2m TALE核酸酶序列的描述

为了测试这个B2M特异性TALEN引发B2M基因座的易错NHEJ事件的能力，2或10μg编码TALEN的mRNA在原代T细胞中使用Pulse Agile技术根据生产商的方案进行电穿孔。转染后3天，回收细胞，并用结合至藻红蛋白(PhycoErythrin)荧光染料的特异性β2-微球蛋白抗体进行标记。细胞随后通过流式细胞术分析活力和β2-m表达。结果如图10中所示。在顶部图上，几乎100％的未转染T细胞表达β2-M(顶部右图)。用特异性B2MTALEN转染T细胞极大地降低了β2-m表达，因为在分别用2或10μgTALEN mRNA转染时38％(中右)和80％的T细胞(右下图)变成了β2-m阴性。这些数据表明，T可以高效地实现细胞中的B2M敲除。

在T细胞中生产和表达单链分子B2M-UL18

HCMV UL18编码I型跨膜糖蛋白，其与MHC I类分子享有高水平AA序列同一性，该MHC I类分子与β2-m相关并结合内源性肽。因为我们的目标是将该分子表达于B2M基因已然失效的T细胞中，因此我们的策略是产生其中β2-m和UL18被融合为单链多肽的嵌合分子。SEQ ID NO89显示了嵌合蛋白的氨基酸序列。将含有嵌合B2M-UL18的慢病毒粒子转导至T细胞中。转基因的表达通过FACS分析使用β2-m抗体进行监测。该实验的结果旨在证明B2M-UL18嵌合蛋白高效地表达于T细胞中。

NKG2D配体在T细胞中的生产和表达

NKG2D天然配体是跨膜或GPI-锚定的蛋白。为了实现这些分子由T细胞的分泌，NKG2D配体的胞外域已经在其N-端融合成分泌肽形式。在以下列列出分泌的嵌合NKG2D配体的氨基酸序列(SEQ ID NO:90至序列号SEQ ID NO:97)。将包含嵌合NKG2D配体的慢病毒粒子转染到T细胞中。使用特异性抗体通过蛋白质印迹(Western Blot)分析监测转基因在培养基上清液中的表达。该实验的结果旨在证明嵌合NKG2D配体蛋白高效表达于T细胞中。

β2-M缺陷的CAR T细胞未被同种异体细胞识别

来自健康供体A的PBMC与来自供体B的经过照射的或丝裂霉素处理的工程化的β2-m缺陷的T细胞共培养。作为对照，来自健康供体A的PBMC与来自供体B的经过照射的或丝裂霉素处理的工程化的β2-m阳性T细胞共培养。7天后，通过XTT比色法分析或通过CFSE稀释(FACS分析)测定来自供体A的细胞增殖。虽然在对照中观察到细胞增殖，但是当工程化的T细胞未表达β2-m时没有观察到细胞增殖或观察到有限的细胞增殖。这个实验的结果旨在表明同种异体反应性T细胞相对于β2-m缺陷的T细胞无法识别和增殖。

NK介导的工程化的T细胞溶胞作用的有效抑制

NK细胞纯化自健康供体A的PBMC。作为靶，产生来自健康供体B的工程化的T细胞并列于下面。a)工程化的T细胞(阴性对照)，b)β2-m缺陷的工程化的T细胞(阳性对照)，c)表达B2M-UL18(SEQ ID NO 89)的β2-m缺陷的工程化的T细胞，d-k)分别表达SP-MICAed(SEQ IDNO 90)、SP-MICBed(SEQ ID NO 91)、SP-ULBP1ed(SEQ ID NO 92)、SP-ULBP2ed(SEQ ID NO93)、SP-ULBP3ed(SEQ ID NO 94)、SP-N2DL4ed(SEQID NO 95)、SP-RET1Ged(SEQ ID NO96)、SP-RAETILed(SEQ ID NO 97)的β2-m缺陷的工程化的T细胞。这些序列报道于下表10中。

表10：病毒MHC同源物(UL18)和根据本发明要表达的一组NKG2D配体的多肽序列

通过CFSE标记分析法测定由NK细胞介导的细胞毒性。靶细胞用CFSE标记，在PBS中洗涤，与NK细胞以不同的E:T细胞比混合并在37℃下培养4小时。然后通过流式细胞术分析细胞并测定CFSE阳性的工程化的T细胞的百分比，表示工程化的T细胞在NK细胞存在下的存活。设想尽管在阳性对照(β2-m缺陷的工程化的T细胞)中观察到NK介导的细胞溶胞作用，但在β2-m缺陷的工程化的T细胞工程化的T细胞表达B2M-UL18(SEQ ID NO 89)或分泌的NKG2D配体(SP-MICAed(SEQ ID NO90)、SP-MICBed(SEQ ID NO 91)、SP-ULBP1ed(SEQ ID NO 92)、SP-ULBP2ed(SEQ ID NO 93)、SP-ULBP3ed(SEQ ID NO 94)、SP-N2DL4ed(SEQ ID NO 95)、SP-RET1Ged(SEQ ID NO 96)、SP-RAETILed(SEQ ID NO 97)时没有观察到或观察到有限的NK介导的细胞溶胞作用。这个实验的结果旨在表明在表达于工程化的T细胞中的嵌合分子充当抑制信号受体(B2M-UL18)或刺激信号受体(NKG2D配体)的诱饵时，同种异体NK细胞细胞毒性活性会被削弱。

说明书中所引述的参考文献列表

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Claims (59)

1.一种制备工程化的T细胞的方法，包括以下步骤：

a)提供T细胞；和

b)通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M和/或CIITA的基因的稀切核酸内切酶抑制β2-微球蛋白(B2M)和/或II类主要组织相容性复合体反式激活子(CIITA)在所述T细胞中的表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶实施步骤b)。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶实施步骤b)。

4.根据权利要求1至权利要求3中任一项所述的方法，其中，通过使用TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶实施步骤b)。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，使用TAL核酸酶实施步骤b)。

6.根据权利要求4所述的方法，其中，通过使用RNA指导的核酸内切酶实施步骤b)。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述RNA指导的核酸内切酶是Cas9。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

c)失活至少一个编码T细胞受体(TCR)的组件的基因。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，通过使用能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活至少一个编码T细胞受体(TCR)的组件的基因的稀切核酸内切酶实施步骤c)。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶，比如Cas9/CRISPR。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的方法，其中，所述TCR的组件是TCRα。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

d)向所述T细胞中引入包含对针对至少一个表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原的嵌合抗原受体(CAR)编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体针对B-淋巴细胞抗原CD19。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述嵌合抗原受体针对：选自分化分子的簇的抗原如CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123和CD138，肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性的抗原如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269，TNFRSF17)，多发性骨髓瘤或淋巴母细胞白血病抗原，如选自TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROTQ9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)的之一，病毒特异性的表面抗原如HIV特异性的抗原(如HIV gp120)；EBV特异性的抗原，CMV特异性抗原，HPV特异性抗原，拉沙病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。

15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，进一步包括以下的步骤：

d’)表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽。

16.根据权利要求15所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述病毒MHC同源物是UL18。

18.根据权利要求15至权利要求17中任一项所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽含有与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的氨基酸序列。

19.根据权利要求15所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。

20.根据权利要求15或19所述的方法，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽含有与SEQID NO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的氨基酸序列。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，进一步包括以下步骤：

e)扩增所获得的工程化的T细胞。

22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中，步骤a)中的所述T细胞衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述T细胞衍生自CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。

24.一种工程化的、优选分离的T细胞，其中，所述T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码B2M的基因的稀切核酸内切酶。

25.一种工程化的、优选分离的T细胞，其中，所述T细胞表达能够通过DNA切割选择性失活编码CIITA的基因的稀切核酸内切酶。

26.根据权利要求24或25所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。

27.根据权利要求26所述的工程化的T细胞，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。

28.根据权利要求27所述的工程化的T细胞，其中，所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶。

29.根据权利要求27所述的工程化的T细胞，其中，所述稀切核酸内切酶是RNA指导的核酸内切酶。

30.根据权利要求29所述的工程化的T细胞，其中，所述RNA指导的核酸内切酶是Cas9。

31.根据权利要求26至30中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述核酸是容许所述稀切核酸内切酶被所述T细胞表达的载体。

32.根据权利要求26至30中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述核酸是转染的mRNA。

33.根据权利要求24所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含抑制B2M表达的外源核酸分子。

34.根据权利要求34所述的工程化的T细胞，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:3的互补体的至少10个连续核苷酸。

35.根据权利要求25所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含抑制CIITA表达的外源核酸分子。

36.根据权利要求35所述的工程化的T细胞，其中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:5的互补体的至少10个连续核苷酸。

37.根据权利要求33至36中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述核酸分子是反义寡核苷酸、核酶或干扰性RNA(RNAi)分子。

38.根据权利要求24至37中任一项所述的工程化的T细胞，进一步特征在于至少一个编码TCR受体的组件的基因被失活。

39.根据权利要求38所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞表达能够通过DNA切割、优选双链断裂选择性失活所述至少一个编码T细胞受体(TCR)的组件的基因的稀切核酸内切酶。

40.根据权利要求39所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有编码所述稀切核酸内切酶的核苷酸序列的外源核酸分子。

41.根据权利要求40所述的工程化的T细胞，其中，所述所述稀切核酸内切酶是TAL核酸酶、大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)或RNA指导的核酸内切酶。

42.根据权利要求24至41中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞表达针对至少一种表达于恶性或受感染细胞的表面上的抗原的嵌合抗原受体(CAR)。

43.根据权利要求42所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有编码所述CAR的核苷酸序列的外源核酸分子。

44.根据权利要求42或43所述的工程化的T细胞，其中，所述CAR针对B-淋巴细胞抗原CD19。

45.根据权利要求42或43所述的工程化的T细胞，其中，所述CAR针对：选自分化分子的簇的抗原，如CD16、CD64、CD78、CD96、CLL1、CD116、CD117、CD71、CD45、CD71、CD123和CD138，肿瘤相关的表面抗原，如ErbB2(HER2/neu)、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、CD19、CD20、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂GD2、导管上皮粘蛋白、gp36、TAG-72、鞘糖脂、神经胶质瘤相关的抗原、β-人绒毛膜促性腺激素、α胎儿球蛋白(AFP)、外源凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶(prostase)、前列腺酶特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、p53、Prostein、PSMA、存活和端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF1)-I、IGF-II、IGFI受体、间皮素、呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合体(MHC)分子、5T4、ROR1、Nkp30、NKG2D、肿瘤基质抗原、纤维连接蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)和腱生蛋白C的A1结构域(TnC A1)和成纤维细胞相关蛋白(fap)；谱系特异性或组织特异性的抗原如CD3、CD4、CD8、CD24、CD25、CD33、CD34、CD133、CD138、CTLA-4、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、GM-CSF、细胞因子受体、内皮因子、主要组织相容性复合体(MHC)分子、BCMA(CD269，TNFRSF17)，多发性骨髓瘤或淋巴母细胞白血病抗原，如选自TNFRSF17(UNIPROT Q02223)、SLAMF7(UNIPROT Q9NQ25)、GPRC5D(UNIPROT Q9NZD1)、FKBP11(UNIPROT Q9NYL4)、KAMP3、ITGA8(UNIPROT P53708)和FCRL5(UNIPROT Q68SN8)的之一，病毒特异性的表面抗原如HIV特异性的抗原(如HIV gp120)；EBV特异性的抗原，CMV特异性抗原，HPV特异性抗原，拉沙病毒特异性抗原，流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。

46.根据权利要求24至45中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞表达至少一个非内源性免疫抑制性多肽。

47.根据权利要求46所述的工程化的T细胞，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是病毒MHC同源物。

48.根据权利要求47所述的工程化的T细胞，其中，所述病毒MHC同源物是UL18。

49.根据权利要求46至48中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有对与SEQ ID NO:89共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

50.根据权利要求46所述的工程化的T细胞，其中，所述非内源性免疫抑制性多肽是NKG2D配体。

51.根据权利要求46或50所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞包含含有对与SEQ IDNO:90-97中任一项共享至少80％、优选至少90％并且更优选至少95％的同一性的多肽进行编码的核苷酸序列的外源核酸分子。

52.根据权利要求24至51中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞衍生自炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。

53.根据权利要求52所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞衍生自CD4+T淋巴细胞或CD8+T淋巴细胞。

54.根据权利要求24至53中任一项所述的工程化的T细胞用于作为药物使用。

55.根据权利要求24至53中任一项所述的工程化的T细胞用于在癌症或病毒感染的治疗中使用。

56.根据权利要求24至53中任一项所述的工程化的T细胞用于在淋巴瘤的治疗中使用。

57.根据权利要求48至56中任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞源自待治疗的患者。

58.根据权利要求48至56任一项所述的工程化的T细胞，其中，所述T细胞源自供体。

59.一种包含至少一种根据权利要求24至53中任一项所述的工程化的T细胞的组合物。