CN115175928A - 用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体（car） - Google Patents

用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体（car） Download PDF

Info

Publication number
CN115175928A
CN115175928A CN202080097252.4A CN202080097252A CN115175928A CN 115175928 A CN115175928 A CN 115175928A CN 202080097252 A CN202080097252 A CN 202080097252A CN 115175928 A CN115175928 A CN 115175928A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
car
cell
ser
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080097252.4A
Other languages
English (en)
Inventor
塞西尔·希费尔-曼尼维
菲利普·迪沙泰奥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Cellectis SA
Original Assignee
Cellectis SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cellectis SA filed Critical Cellectis SA
Publication of CN115175928A publication Critical patent/CN115175928A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/54—Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464466—Adhesion molecules, e.g. NRCAM, EpCAM or cadherins
    • A61K39/464468—Mesothelin [MSLN]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及表达新型间皮素(MLSN)特异性嵌合抗原受体(抗间皮素CAR)的工程化免疫细胞以及它们在实体瘤治疗中的用途，特别适合于同种异体细胞免疫疗法。

Description

用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体 (CAR)
技术领域
本发明涉及细胞免疫疗法领域，并且更具体地涉及表达在实体瘤治疗中有用的新型间皮素(MLSN)特异性嵌合抗原受体(抗间皮素CAR)的工程化免疫细胞。
背景技术
嵌合抗原受体(CAR)是将T细胞靶向细胞表面抗原并增强T细胞功能和持久性的合成受体。间皮素是参与肿瘤侵袭的细胞表面抗原，其在间皮瘤以及肺癌、胰癌、乳腺癌、卵巢癌及其它癌症中高度表达。鼓舞人心地，近期评价胰腺癌或间皮瘤患者中主动免疫或免疫缀合物的临床试验显示出反应性且无毒性。总而言之，这些发现和使用全身或局部T细胞递送的临床前CAR疗法模型有利地支持了在多种实体瘤中的间皮素CAR疗法。
考虑到CAR疗法可能的高效率，识别解决实体瘤，从而以对健康组织最小或耐受的中靶/脱肿瘤(on-target/off-tumor)毒性实现肿瘤根除的适当抗原是重要的。
研究中的实体瘤CAR靶标为主要由遗传突变或改变的剪接(EGFRvIII)、改变的糖基化模式(MUC1)、癌症-睾丸抗原-来源的肽(MAGE)、过表达的分化抗原CEA、PSMA、GD2、MUC16、HER2/ERBB2和间皮素(MSLN)或者肿瘤-相关基质(FAP和VEGFR)所产生的改变的基因产物。
尽管过表达的抗原众多且相对常见，但是由于T细胞对于低水平抗原表达的高灵敏度(其可以大于单克隆抗体)，它们产生了有关“中靶/脱肿瘤”副作用的担忧。例如，以高细胞剂量施用的ERBB2 CAR T细胞的使用导致了致死性不良事件，这部分归因于健康肺上皮细胞和心血管细胞中低水平的ERBB2表达[Morgan,R.A.等人(2010)Case report of aserious adverse event following the administration of T cells transduced witha chimeric antigen receptor recognizing ERBB2.Mol Ther.18:843–51]。因此，最优的实体-瘤抗原靶标是其表达受限于肿瘤细胞或者仅在消耗性正常组织中以极低水平发生的一种靶标。
考虑到其在正常间皮细胞上的低表达以及在广谱实体瘤中的高表达，MSLN已成为癌症免疫疗法的有吸引力的靶标。目前报道的MSLN-靶向免疫疗法支持良好的安全性谱。MSLN是一些常见的实体瘤中的潜在CAR靶标，如至少食管癌、乳腺癌、胃癌、肝胆管型肝癌、胰癌、结肠癌、肺癌、胸腺癌、间皮瘤、卵巢癌和子宫内膜癌[Morello,A.等人.(2016)Mesothelin-Targeted CARs:Driving T Cells to Solid Tumors.Cancer Discov.6(2)；133–46]。
MSLN是通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)结构域锚定至质膜的糖蛋白。它起初作为69kDa细胞-表面蛋白合成。在通过弗林蛋白酶的氨基末端切割后，40-kDa C末端片段保持连接至膜并且释放出可溶性的32-kDa N末端片段，称为巨核细胞-增强因子(MPF)[Pastan,I.,Hassan,R.(2014)Discovery of mesothelin and exploiting it as a target forimmunotherapy.Cancer.Res.74:2907–12]。还在实体瘤患者血清中检测到了MSLN的可溶性形式，其被称为可溶性MSLN相关蛋白质(SMRP)。通过TNFα-转化酶ADAM17诱导的MSLN成熟形式的可变剪接或通过蛋白水解切割产生了SMRP。
考虑到MSLN敲除小鼠显示出正常的发育、繁殖和血细胞计数，MSLN的生物学功能似乎在正常组织中不是必需的。相反，临床前和临床研究日益显示异常的MSLN表达在通过促进癌细胞增殖，从而促进局部侵袭和转移并赋予对通过细胞毒性剂诱导的细胞凋亡的耐受性的肿瘤恶性转化以及肿瘤侵袭性两者中起到积极作用。MSLN可以通过经由其GPI结构域直接激活胞内通路或者通过与其受体CA125/MUC16的相互作用来双向起作用。MSLN单独的过表达足以组成性激活NFκB、MAPK和PI3K胞内通路，从而促进细胞增殖和对细胞凋亡的耐受性。
生理学上，MSLN在腹膜和胸膜腔以及心包的间皮细胞上表达；它在气管、卵巢、睾丸网、扁桃腺和输卵管的上皮细胞表面上最低限度地表达。一开始，在间皮瘤和卵巢癌中观察到MSLN的过表达，并且随后在肺癌、食道癌、胰癌、胃癌、胆癌、子宫内膜癌、胸腺癌、结肠癌和乳腺癌中观察到。因此，仅在美国每年MSLN过表达具有估计的340,000位患者的发病率和200万位患者的患病率。
CAR由通常来源于单-链可变片段(scFv)的胞外域、铰链、跨膜结构域和胞内域(通常包含来源于CD3ζ和共刺激受体的信号转导结构域)组成。第二代CAR通过引入挽救和放大通过CD3ζ胞质结构域所提供的激活信号的信号转导结构域进一步提高了T细胞功能和持久性。双重信号转导防止T细胞失能并通过增强T细胞增殖和细胞因子生产(IFNγ和IL2)以及通过PI3K、TRAF和/或其它通路的招募降低激活-诱导的细胞死亡来提高持久性与功能。第三代CAR包含3个信号转导结构域，通常涵盖了CD3ζ的那些和两个共刺激结构域，例如CD28和4-1BB或CD28和OX40。与第二代CAR相比，第三代CAR显示出不一致的体内抗肿瘤活性。选择适合的共刺激结构域是保持CAR T细胞活性和校准T细胞持久性所必须的。然而，理想的共刺激结构域可以基于环境，因为CAR功能取决于多种外界因素，如抗原密度、CAR化学计量学、CAR亲和力和肿瘤微环境的免疫学特性。
对于T细胞信号转导的有效起始，CAR与它们的靶抗原之间的空间距离可以是同样重要的，但是它取决于与靶标分子上表位位置有关的完全不同的结构元件组以及scFv和T细胞膜之间的间隔区结构域。一些研究已证实当在膜-更近端位置表达时，相同表位可以比膜-远端位置以更高的效率激活CAR-T细胞。例如，Hombach等人证实识别癌胚抗原(CEA)的膜-远端“N”表位的CAR T细胞仅被中等程度激活；然而，当他们工程化重组CEA蛋白以在膜-近端位置表达N表位时，相同CAR T细胞被更有效激活[Hombach AA等人(2007)T cellactivation by antibody-like immunoreceptors:the position of the bindingepitope within the target molecule determines the efficiency of activation ofredirected T cells.J Immunol.178:4650–4657]。这表明靶向肿瘤细胞上一些膜远端表位可以允许大型磷酸酶，如CD45和CD148进入突触并抑制通过CAR接合所起始的磷酸化事件。调节T细胞膜和配体-结合scFv之间的胞外间隔区序列以促进突触形成可以帮助克服由靶标表位位置所施加的立体化学限制。
有关MSLN CAR的具体担心在于来自可溶性MSLN的干扰，其在原理上可以占据并阻断scFv部分。然而，MSLN CAR T细胞激活(细胞因子分泌和细胞毒活性)似乎仍依赖于细胞表面上的MSLN表达[Carpenito C.等人.(2009)Control of large,established tumorxenografts with genetically retargeted human T cells containing CD28 andCD137 domains.PNAS.106:3360–5]。
已建立了基因修饰以表达新型合成CAR的T细胞可以有效治疗晚期难治性癌症的原理，但是对于实现这种新型治疗方式的全部潜力仍有诸多问题。工程化更安全、更有效的用于实体瘤癌症疗法的CAR需要超越受体设计和细胞工程的常规经验方法，理想地它由我们对于TCR信号转导、T细胞生物学和肿瘤微环境操纵的知识所引导。目前显而易见地，CAR和靶细胞之间的结合亲和力、Kon/Koff比以及空间限制可以影响CAR最优激活用于肿瘤识别，特别是对于实体瘤的T细胞的能力[D’Aloia,M.M.,Zizzari,I.G.,Sacchetti,B.等人.(2018)CAR-T cells:the long and winding road to solid tumors.Cell Death Dis 9:282]。
考虑到以上情况，仅对于它们对MSLN抗原的亲和力或者它们体外诱导T细胞激活和增殖的能力筛选scFv似乎不足以工程化最适合的CAR T细胞。当前数据表明到目前为止，对于单个靶标分子无法演绎地确定最优CAR亲和力，尚无识别理想亲和力范围，从而允许获得最佳体内结果的无偏方法[Srivastava,S.and Ridell,R.S.(2015)Engineering CAR-TCells:Design Concepts.Trends Immunol.36(8):494–502]。
另外，实体-瘤微环境对于MSLN CAR-T细胞造成了几种障碍，这可以限制它们的抗肿瘤效力。为了优化CAR T细胞的效率，正在评价多种方法以控制宿主肿瘤微环境或者产生可以克服免疫屏障的“武装的(armored)”CAR T细胞。这些策略包括(i)促进CAR T细胞浸润，(ii)增强CAR T细胞的功能持久性，(iii)提高CAR T细胞以克服肿瘤微环境中遇到的抑制信号和(iv)通过防止中靶/脱肿瘤毒性来改善安全性。在这些方法中，将特异性CAR结构与基因编辑的细胞组合似乎是最有前景的。Riese等人[Riese M.J.等人.Enhancedeffector responses in activated CD8+T cells deficient in diacylglycerolkinases.Cancer Res.73:3566–77]证实(例如)DGKζ的基因缺失显著提高了MSLN CAR T细胞的抗肿瘤活性，如通过效应因子细胞因子分泌、FASL和TRAIL表达以及体外细胞毒功能的增强所示。
另一方面，已发展了解决CAR T细胞的中靶/脱肿瘤毒性风险和改善安全性的不同策略。
一种这种方法是转染编码MSLN CAR的mRNA，从而导致仅几天的瞬时CAR表达。在临床前模型中，这种方法显示出前景；多次输注mRNA CAR T细胞产生了稳健的体内抗肿瘤作用[Zhao Y等人(2010)Multiple injections of electroporated autologous T cellsexpressing a chimeric antigen receptor mediate regression of humandisseminated tumor.Cancer Res.2070:9053–61]。然而，CAR的瞬时表达可以限制疗法的长期效力。宾夕法尼亚大学(University of Pennsylvania)使用用编码第二代MSLN CAR(SS1—4-1BB CAR)的mRNA电穿孔的自体同源T细胞所进行的临床试验导致了中等临床反应以及血清中炎性细胞因子的瞬时提高，包括IL12、IL6、G-CSF、MIP1β、MCP1、IL1RA和RANTES。
如果出现不良事件，则提高T细胞安全性的另一种方法是使用自杀基因以消除T细胞。在这种情况下，可以通过药物-诱导的自杀基因的激活来消除CAR T细胞，如单纯性疱疹胸苷激酶(HSV-TK)、基因可诱导的半胱天冬氨酸酶-9或者EGFRΔ基因。
在先前专利申请WO2016120216中，申请人已开发了使基因自杀的替代系统，其包括将外源表位插入到临床批准的抗体，如利妥昔单抗所识别的CAR结构中，这使得能够根据需要部分或完全耗尽输注到患者中的CAR阳性免疫细胞。这种方法的一个益处在于除了CAR之外，无自杀基因必须被共表达到细胞中。然而，这种表位的插入可以对CAR整体结构具有影响并且可以改变scFv与其同源抗原相互作用的方式。
从在同种异体治疗策略中使用的目的来说，本发明旨在通过提供更安全的工程化免疫CAR阳性细胞以体内靶向表达MSLN的细胞，如实体瘤，从而解决所有或部分上述限制。
发明内容
本发明主要涉及用于它们在免疫细胞，优选地T细胞中表达的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其用于它们对于表达间皮素的恶性细胞或组织的治疗性使用。
这类CAR提供了通常包含以下的结构：
-胞外配体结合结构域，包含来自单克隆抗间皮素抗体的VH和VL；
-跨膜结构域；和
-胞质结构域，包含CD3ξ信号转导结构域和共刺激结构域。
根据本发明的CAR的胞外配体结合结构域优选地包含来自被称为meso1的抗体的一个或几个scFv节段(segment，片段)，并且更具体地包括SEQ ID NO：3、4、5、6、7和/或8的来自其的CDR。
根据优选方面，所述CAR的所述胞外配体结合结构域包含：
-可变重VH链，包含来自抗体meso1的CDR，该CDR分别与SEQ ID NO：3(CDRH1-Meso1)、SEQ ID NO：4(CDRH2-meso1)和/或SEQ ID NO：5(CDRH3-meso1)具有至少90％的同一性，和
-可变重VL链，包含来自抗体Meso1的CDR，该CDR分别与SEQ ID NO：6(CDRL1-meso1)、SEQ ID NO：7(CDRL2-meso1)和/或SEQ ID NO：8(CDRL3-meso1)具有至少90％的同一性。
本发明的抗间皮素CAR形成外源多肽序列，其通过免疫细胞表达以用于它们在细胞表面的暴露。这些通过外源(相对于免疫细胞的原始基因组)多核苷酸序列编码，优选地通过使用稀切核酸内切酶插入特定基因组基因座，如TCR、B2m或PD1基因座。
根据一些实施方式，所述CAR还包含包括表位的其它外源多肽序列，表位可以被临床批准的抗体靶向以用于体内耗尽或通过其它配体靶向以用于它们的体内或体外检测或纯化。这种其它外源多肽节段可以被利妥昔单抗特异性识别，如在本说明书中被称为“R2”的节段。
本发明更具体地涉及用包含所述多核苷酸序列和/或表达多肽抗间皮素CAR序列的抗间皮素CAR多核苷酸序列转化的免疫细胞或免疫细胞群体。
根据本发明，可以将这些工程化免疫细胞或细胞群体进一步基因工程化、突变或基因编辑以改善它们的治疗适合性或效力，如改善它们的持久性或寿命。根据优选方面，根据本发明的工程化免疫细胞将抗间皮素CAR序列的表达与降低它们的内源基因如TCR、HLA和/或B2m基因表达的其它基因修饰组合。TGFβ受体
根据其它优选方面，工程化免疫细胞可以突变以改善它们的CAR依赖性免疫激活，特别是通过降低或抑制免疫检查点蛋白和/或其受体如PD1/PDL1的表达。
根据其它优选方面，工程化免疫细胞可以突变以改善它们的CAR依赖性免疫激活，特别是通过降低或抑制TGFβ信号通路。
根据其它优选方面，还可以将其它外源基因序列插入、与本发明的抗间皮素CAR，具体地TGFβ受体如显性失活的TGFβ受体(dnTGFβRII)的抑制剂或诱饵共转染或共表达。
提供了外源基因序列的其它实例，其表达可以与抗间皮素CAR的表达组合以改善免疫细胞的治疗效力，具体地以下那些：
-NK细胞抑制剂，如HLAG、HLAE或ULBP1；
-CRS抑制剂，如突变的IL6Ra、sGP130或IL18-BP；或者
-细胞色素P450、CYP2D6-1、CYP2D6-2、CYP2C9、CYP3A4、CYP2C19或CYP1A2，赋予所述免疫细胞对药物如环磷酰胺和/或异磷酰胺的超敏感性，
-二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙神经素或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)、mTORmut或Lckmut，赋予耐药性
-趋化因子或细胞因子，如IL-2、IL-12和IL-15。
-肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的分泌抑制剂，如CCR2/CCL2中和剂，以提高免疫细胞的治疗活性；
根据本发明的工程化免疫细胞特别适合于治疗特征为表达间皮素的细胞的病症，具体地实体瘤，通常如食管癌、乳腺癌、胃癌、肝胆管型肝癌、胰癌、结肠癌、肺癌、胸腺癌、间皮瘤、卵巢癌和/或子宫内膜癌。
因此本发明涵盖了用于产生工程化细胞的方法、所产生的治疗性细胞、包含这些细胞的细胞群体和包含它们的治疗性组合物，以及能够解决通过表达间皮素的细胞诱导的病理学的治疗方法。
附图和表的说明
图1：根据本发明的抗间皮素CAR的优选形式的结构示意图。A：CAR，包含：V1和V2，其表示包含ScFv特异性结合间皮素的序列，如来自meso1抗体的VH和VL或者VL和VH；L：接头；R1和R2，表示外源表位，如由人类批准的单克隆抗CD20抗体(例如：利妥昔单抗……)所识别的CD20表位；TM：跨膜结构域；CO-STIM：共刺激结构域；ITAM：刺激结构域，包含ITAM(基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。这种CAR通常与SEQ ID NO：21具有至少80％的多肽序列同一性。B：无外源表位的CAR，包含：来自meso1抗体的VH和VL或VL和VH；(G4S)3接头；CD8a铰链结构域、CD8a跨膜结构域；4-1BB共刺激结构域；和CD3z信号转导结构域。
图2：显示根据本发明的表达抗MSLN CAR的免疫细胞的示意图，其中已进一步引入任选的遗传属性。A.与TGFβ受体(例如：dnTGFβRII)的无活性变体的共表达和/或TGFβ受体表达的遗传减少或失活以抵抗肿瘤诱导的免疫抑制。TCR表达(例如，TCRα)的减少或失活以降低免疫T细胞的同种异体反应性，导致GvHD。B.通过基因编辑工具(如TALEN)的TGFβ受体、TCR和/或CD52表达的遗传减少或失活。
图3：在293H、A2058、HeLa和HPAC细胞表面处的间皮素蛋白表达。使用小鼠单克隆抗人MSLN抗体作为一级抗体以及APC结合的山羊抗小鼠多克隆抗体作为二级抗体，通过流式细胞术进行MSLN表达分析。
图4：在HeLa和HPAC细胞表面处的定量间皮素蛋白表达。使用基于荧光的QIFIKIT，通过流式细胞术进行MSLN表达水平分析。
图5：表示为了评价抗间皮素CAR阳性细胞的体外激活所实施的连续杀伤测定的图。
图6：原代[TCRα]neg T细胞(UCART细胞)表面处的CAR表达。将从单一供体产生的冷冻保存的UCART细胞用加组氨酸标签的重组人间皮素蛋白和PE缀合的抗组氨酸抗体或者生物素化的蛋白L以及Vioblue结合的抗生蛋白链菌素染色并通过流式细胞术分析。
图7：通过UCART细胞的CAR+部分的CD4和CD8表达。将从单一供体产生的冷冻保存的UCART细胞用FITC结合的抗CD4和BV510结合的抗CD8抗体染色并通过流式细胞术分析。
图8：通过UCART细胞的IFNg的产生。将从单一供体产生的新鲜UCART细胞与(A)HPAC(MSLN+)细胞、(B)A2058(MSLN-)细胞和(C)293H(MSLN-)细胞共培养24小时。通过ELISA对培养上清液中产生的IFNg定量。
图9：显示从通过原代[TCRα]neg T细胞(UCART细胞)的HPAC细胞的连续杀伤测定所产生的细胞胞溶％的图，其规程如图5所示。将从一个供体产生的冷冻保存的UCART细胞与HPAC细胞以1:2(A)或1:8(B)的E:T比共培养15天。
图10：UCART细胞表面处的TCRαβ表达。将从单一供体产生的冷冻保存的UCART细胞用PEvio770结合的抗TCRαβ抗体染色并通过流式细胞术分析。
图11：非工程化T细胞、TRAC基因敲除的T细胞以及TRAC基因敲除且在TCRαβ+细胞中耗尽的T细胞表面处TCRαβ受体表达的流式细胞术分析。
图12：分别暴露于培养基(红线)、+0.1μg/ml PHA-L(橙线)、+0.25μg/ml PHA-L(绿线)和+2.5μg/ml PHA-E和L(蓝线)时，非工程化T细胞、TRAC基因敲除的T细胞以及TRAC基因敲除且在TCRαβ+细胞中耗尽的T细胞表面处CD25表达的流式细胞术分析。
图13：通过包括在CAR P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2中的外源表位多肽R2，通过利妥昔单抗介导的CDC的UCART细胞耗尽的测量。
图14：显示在暴露于从两种不同供体所产生的CART细胞的TGFβ时SMAD2-3磷酸化的测量的图。
图15：以3种剂量(1×106、3×106和10×106个CAR+细胞/小鼠)注射UCARTmeso(TCR阴性抗间皮素P4-R2 CAR阳性细胞)的小鼠中的平均肿瘤体积(HPAC MSLN+细胞)。
图16：以3种剂量(1×106、3×106和10×106个CAR+细胞/小鼠)注射UCARTmeso细胞(TCR阴性抗间皮素Meso2-R2 CAR阳性细胞)的小鼠中的平均肿瘤体积。
图17：以3种剂量(1×106、3×106和10×106个CAR+细胞/小鼠)注射UCARTmeso细胞(TCR阴性抗间皮素Meso1-R2 CAR阳性细胞)的小鼠中的平均肿瘤体积。
图18：以3种剂量(A：1×106、B：3×106和C：10×106个CAR+细胞/小鼠)注射UCARTmeso细胞的小鼠中的平均肿瘤体积+/-标准偏差。分别对于Meso1-R2、P4-R2和MESO2-R2的不同剂量的比较。
图19：以两种剂量(3×106和10×106个CAR+细胞/小鼠)注射也表达dnTGFBRII的UCARTmeso细胞的小鼠中的平均肿瘤体积。
图20：A.表达具有dnTGFBRII的P4或MESO1构建体的UCARTMeso细胞中CAR和dnTGFBRII检测的比较。B.实施例5中产生的UCARTMeso细胞的CAR阳性部分中的CD4+和CD8+的百分比。
图21：实施例5中产生的UCARTMeso细胞的CAR+CD4+部分(A.)或CAR+CD8+部分(B.)中所观察到的Temra、Tem、Tcm；Tn/scm细胞的百分比。
图22：通过敲除(KO)或通过显性失活的TGFBRII(dnTGFBRII)的表达对于TGFBRII通路失活或未失活的不同的UCARTmeso细胞对H226细胞杀伤的百分比。
图23：通过实施例5中产生并且对重组间皮素蛋白暴露(A.)或未暴露(B.)的UCARTMeso细胞的IFNg的生产。
图24：UCARTmeso细胞对TGFb的敏感性的评价。A.用TGFb处理时在实施例5中产生的UCARTmeso的CAR阳性部分中pSMAD2/3阳性(灰色)或阴性(黑色)细胞的百分比。B.在存在TGFb和重组间皮素蛋白的情况下，不同UCARTmeso的增殖抑制百分比。
表1：构成实施例中所示的CAR的P4、Meso1和MESO2 scFv的不同结构域的氨基酸序列。
表2：除scFv以外，构成根据本发明的MSLN CAR的不同结构域的氨基酸序列。
表3：可以在本发明的CAR的胞外结合结构域中用于工程化细胞分选和耗尽的mAb特异性表位(以及它们相应的mAb)的实例。
表4：P4-R2、Meso1-R2、Meso1和MESO2-R2 CAR的氨基酸序列。
表5：可以插入本发明的CAR的胞外结合结构域中的mAb特异性表位(以及它们相应的mAb)的实例。
表6：TGFβRII基因的TALE核酸酶靶序列。
表7：TGFβRII基因的CRISPR靶序列。
表8：通过TALE核酸酶(TALEN)靶向的基因组序列以使TCR和CD52失活。
表9：在实施例中所使用的工程化T细胞群体的特征。
表10：对实施例5中所提供的研究所产生的6类基因修饰的T细胞的描述。
具体实施方式
除非本文具体定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与基因治疗、生物化学、遗传学和分子生物学领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
可以将与本文所述的那些类似或等同的所有方法和材料用于实践或测试本发明，其中本文描述了适合的方法和材料。本文所提及的所有专利公开、专利申请、专利和其它参考文献将以其全部内容作为参考并入。在冲突的情况下，将以本说明书，包括定义为准。此外，除非另有说明，否则材料、方法和实施例仅是说明性的而不意欲限制。
除非另有说明，本发明的实践将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology(Frederick M.AUSUBEL,2000,Wiley and son Inc,Library of Congress,USA)；Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,2001,Cold SpringHarbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait主编,1984)；Mullis等人.美国专利No.4,683,195；Nucleic AcidHybridization(B.D.Harries&S.J.Higgins主编.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins主编.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney,AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,APractical Guide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson and M.Simon主编,Academic Press,Inc.,New York)，具体地，第154和155卷(Wu等人主编.)和第185卷,"Gene Expression Technology"(D.Goeddel主编.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Calos主编,1987,ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker主编,Academic Press,London,1987)；Handbook OfExperimental Immunology,第I-IV卷(D.M.Weir and C.C.Blackwell主编,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1986)。
本发明涉及通过针对跨膜蛋白MSLN，具体地该蛋白中覆盖(span，跨)多肽序列SEQID NO：25的间皮素的特异性表位区域的过继性免疫细胞，并且更具体地通过使用针对该表位的同种异体(allogeneic)CAR-T细胞治疗实体瘤的一般方法该方法已证明特别有效。
本文描述了用于产生针对存在于恶性细胞表面的人间皮素(在Uniprot数据库中称为Q13421的MSLN_human)，并且更具体地由SEQ ID NO：25所表示的特异性间皮素多肽区域的工程化免疫细胞的方法。如本说明书的实验部分中所示，已通过使CAR针对包含SEQ IDNO：25或由其组成的该抗原区域，具体地通过使用包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10的抗体Meso1的scFv产生有效的CAR T细胞。
根据本发明的所产生的工程化免疫细胞，通常拥有包含SEQ ID NO：9和/或SEQ IDNO：10的CAR的NK或T细胞已显示出比它们具有其它在先抗间皮素CAR的对应物更高的激活、效力、杀伤活性、细胞因子释放和体内持久性。
因此，本发明涉及靶向MSLN蛋白的序列SEQ ID NO.25中所包含的特异性表位的CAR免疫细胞，其存在于恶性细胞表面，具体地工程化用于治疗实体瘤。
用于在免疫细胞中表达的MSLN-CAR的设计：
“嵌合抗原受体(CAR)”是指包含与单个融合分子中的一个或多个信号转导结构域有关的靶向部分的重组受体。通常，CAR的结合部分由单链抗体(scFv)的抗原结合结构域组成，其包含通过柔性接头连接的单克隆抗体的轻和重可变片段。还已成功使用了基于受体或配体结构域的结合部分。CAR的信号转导结构域通常来源于CD3ζ或Fc受体γ链的胞质区，其一般与来自共刺激分子包括CD28、OX-40(CD134)、ICOS和4-1BB(CD137)的信号转导结构域组合以提高细胞的存活和增强细胞的增殖。通常在效应因子免疫细胞中表达CAR以使它们的免疫活性重定向针对在来自多种恶性肿瘤(包括淋巴瘤和实体瘤)的肿瘤细胞表面表达的抗原。CAR的组分是通过引入细胞的外源多核苷酸序列编码的CAR的任何功能性亚基。例如，该组分可以帮助与靶抗原相互作用、稳定性或CAR在细胞中的定位。
通常，这种CAR包含：
-胞外配体结合结构域，包含来自单克隆抗间皮素抗体的VH和VL；
-跨膜结构域；和
-信号转导结构域，优选地胞质结构域，包含CD3ξ信号转导结构域和共刺激结构域。
本发明更具体地涉及在免疫细胞如NK或T细胞中表达的CAR，所述CAR包含特异性结合SEQ ID NO：25的抗原结合结构域。
根据优选方面，本发明的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)具有胞外配体结合结构域，胞外配体结合结构域包含来自抗体Meso1的可变重VH链的至少一个CDR区，其选自CDRH1-Meso1(与SEQ ID NO：3具有同一性)、CDRH2-Meso1(与SEQ ID NO：4具有同一性)和CDRH3-Meso1(与SEQ ID NO：5具有同一性)，和/或来自所述抗体的可变重VL链的至少一个CDR区，其选自CDRL1-Meso1(与SEQ ID NO：6具有同一性)、CDRL2-Meso1(与SEQ ID NO：7具有同一性)和CDRL3-Meso1(与SEQ ID NO：8具有同一性)。
通常，所述胞外配体结合结构域包含：
-可变重VH链，包含来自抗体Meso1的CDR，该CDR分别与SEQ ID NO：3(CDRH1-Meso1)、SEQ ID NO：4(CDRH2-Meso1)和SEQ ID NO：5(CDRH3-Meso1)具有至少90％的同一性，和/或
-可变重VL链，包含来自抗体Meso1的CDR，该CDR分别与SEQ ID NO：6(CDRL1-Meso1)、SEQ ID NO：7(CDRL2-Meso1)和SEQ ID NO：8(CDRL3-Meso1)具有至少90％的同一性。
根据本发明的优选实施方式，间皮素特异性嵌合抗原受体具有胞外配体结合结构域，其包含分别与SEQ ID NO：9(Meso1-VH)和SEQ ID NO：10(Meso1-VL)具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且甚至更优选地至少99％的序列同一性的VH和VL链。通常，可以用来自CDR供体抗体的相应残基替代框架区中的框架残基以改变如改善抗原结合。通过本领域熟知的方法来识别这些框架替换，例如，通过CDR和框架残基的相互作用的建模来识别对于抗原结合重要的框架残基并且通过序列比对来识别特定位置处不常见的框架残基[参见，例如，Queen等人,美国专利号5,585,089；和Riechmann等人，(1988)Nature,332:323，以上文献以其全部作为参考并入本文]。
参考本领域技术人员的常规实践和知识，通过权利要求中所提供的特征，提供了本发明的多种实施方式。在表1、2、3和4中详细描述了包含在根据本发明的CAR中的详细序列，其中每行或每列应被认为是本发明的独立实施方式。
表1：构成P4、Meso1和MESO2 scFv的不同结构域的氨基酸序列
Figure BDA0003807266140000141
Figure BDA0003807266140000151
表2：除scFv以外，构成根据本发明的MSLN CAR的不同结构域的氨基酸序列
Figure BDA0003807266140000152
表3：P4-R2、Meso1-R2、Meso1和MESO2-R2 CAR的氨基酸序列
Figure BDA0003807266140000161
表4：MSLN CAR、dnTGFβRII和MSLN表位区的完整多肽序列
Figure BDA0003807266140000162
Figure BDA0003807266140000171
Figure BDA0003807266140000181
Figure BDA0003807266140000191
根据本发明的CAR的信号转导结构域或胞内信号转导结构域负责胞外配体结合结构域与靶标结合后的胞内信号转导，这导致免疫细胞和免疫应答的激活。换言之，信号转导结构域负责其中表达CAR的免疫细胞的正常效应因子功能中的至少一种的激活。例如，T细胞的效应因子功能可以是溶胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“信号转导结构域”是指转导效应因子信号功能信号并且指导细胞实施特化功能的蛋白部分。
用于CAR的信号转导结构域的优选实例可以是一致起作用以引起抗原受体接合后的信号转导的T细胞受体和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能性能力的任何合成序列。信号转导结构域包含两类不同的胞质信号转导序列，引起抗原依赖性初级激活的那些序列，和以独立于抗原的方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些序列。初级胞质信号转导序列可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序ITAM的信号转导基序。ITAM是存在于起到syk/zap70类酪氨酸激酶的结合位点作用的多种受体的胞质内尾中的良好定义的信号转导基序。在本发明中所使用的ITAM的实例可以包括作为非限制性实例的来源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、FcRε、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在优选的实施方式中，CAR的信号转导结构域可以包含CD3ζ信号转导结构域，其具有与选自由(SEQ ID NO：9)组成的组的氨基酸序列具有至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。
在具体实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包含共刺激信号分子。共刺激分子是除抗原受体或它们的配体以外的细胞表面分子，它是有效免疫应答所需的。“共刺激配体”是指抗原递呈细胞上的分子，其特异性结合T细胞上的同源共刺激分子，从而提供除通过例如TCR/CD3复合物与加载肽的MHC分子的结合所提供的初级信号外的信号，该信号介导T细胞反应，包括但不限于增殖激活、分化等。共刺激配体可以包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、M1CB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、结合Toll配体受体的激动剂或抗体以及特异性结合B7-H3的配体。尤其地，共刺激配体还涵盖了特异性结合在T细胞上递呈的共刺激分子的抗体，如但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LTGHT、NKG2C、B7-H3、特异性结合CD83的配体。
在优选的实施方式中，本发明的CAR的信号转导结构域包含一部分共刺激信号分子，其选自由以下组成的组：4-1BB(GenBank：AAA53133.)和CD28(NP_006130.1)的片段。具体地，本发明的CAR的信号转导结构域包含与4-1BB或CD28含有至少70％，优选地至少80％，更优选地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的氨基酸序列。因此，根据本发明的间皮素特异性嵌合抗原受体优选地包含与SEQ ID NO.19具有至少80％同一性的CD3ξ信号转导结构域，并且通常包含与SEQ ID NO.18.(4-1BB)具有至少80％同一性的共刺激结构域。
根据本发明的CAR通常在细胞的表面膜上表达。因此，该CAR还包括跨膜结构域。适当的跨膜结构域的明显特征包括在细胞表面上表达的能力，在本发明中细胞优选地为免疫细胞，具体地淋巴细胞或自然杀伤(NK)细胞，以及共同相互作用以指导免疫细胞针对预定靶细胞的细胞反应的能力。跨膜结构域可以来源于天然来源或来源于合成来源。跨膜结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。作为非限制性实例，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基，如α、β、γ或ζ、构成CD3复合物的多肽、IL2受体p55(α链)、p75(β链)或γ链、Fc受体的亚基链，具体地Fcγ受体III或CD蛋白。作为另外一种选择，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在优选的实施方式中，所述跨膜结构域来源于人CD8α链(例如，NP_001139345.1)。跨膜结构域可以进一步包含在所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链区。本文所使用的术语“铰链区”通常是指任何寡肽或多肽，其用来将跨膜结构域连接至胞外配体结构域。具体地，铰链区用于为胞外配体结合结构域提供更大的柔性和可接近性。铰链区可以包含上达300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸并且最优选地25至50个氨基酸。铰链区可以来源于全部或部分天然存在的分子，如来源于全部或部分的CD8、CD4或CD28的胞外区，或来源于全部或部分的抗体恒定区。作为另外一种选择，铰链区可以是合成序列，其对应于天然存在的铰链序列，或可以是完全合成的铰链序列。在优选的实施方式中，所述铰链结构域分别包含一部分的人CD8α链、FcγRIIIα受体或IgG1，或者优选地显示出与这些多肽至少80％，更优选地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的铰链多肽。
因此，根据本发明的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)包含位于胞外配体结合结构域和跨膜结构域之间的铰链，所述铰链通常选自CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链，或者与这些多肽，具体地与SEQ ID NO：16(CD8α)共有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％并且甚至更优选地至少99％的序列同一性的多肽。
根据本发明的CAR通常还包括跨膜结构域(TM)，其优选地选自CD8α和4-1BB，更优选地选自CD8α-TM或与SEQ ID NO.17(CD8αTM)显示出至少80％，更优选地至少90％、95％、97％或99％的序列同一性的多肽。
根据其它实施方式，根据本发明的间皮素特异性CAR包含用于分类、纯化和/或耗尽工程化免疫细胞的安全开关。尽管设计离体实施本发明的方法，但是可以体内耗尽以控制免疫细胞在患者中的扩增并潜在终止通过使用管理机构批准用于人治疗性使用的抗体的治疗作用。表5中列出了可以整合到本发明的CAR的胞外结合结构域中的mAb特异性表位(以及它们相应的mAb)的实例。
表5：可以插入本发明的CAR的胞外结合结构域中的mAb特异性表位(以及它们相应的mAb)的实例。
Figure BDA0003807266140000211
Figure BDA0003807266140000221
因此，根据本发明的间皮素特异性CAR优选地包含含有表5中所列的至少一个外源mAb表位的安全开关。优选地，根据本发明的间皮素特异性CAR优选地包含含有利妥昔单抗特异性结合的表位CPYSNPSLC(SEQ ID NO：26)的安全开关。更优选地，间皮素特异性CAR包含称为“R2”的安全开关，其与SEQ ID NO：15具有至少90％的同一性。
根据本发明的间皮素特异性CAR通常还包含信号肽以帮助其在工程细胞表面的表达。嵌合抗原受体(CAR)通常形成单链多肽，但是也可以以多链形式产生，如例如WO2014039523中所述。
如实例中所示，根据本发明的优选CAR是MSLN-CAR-Meso1-R2或者MSLN-CAR-Meso1，其与SEQ ID NO：21(Meso1-R2)或SEQ ID NO：22(Meso1)分别具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％并且甚至更优选地至少99％的整体氨基酸序列同一性。
图1显示了本发明的MSLN-CAR的优选多肽结构的结构。
更一般地，通过将编码CAR多肽的连续片段的不同多核苷酸序列组装到用于在本领域中所述和如例如通过[Boyiadzis,M.M.等人(2018)Chimeric antigen receptor(CAR)T therapies for the treatment of hematologic malignancies:clinicalperspective and significance.j.immunotherapy cancer 6,137]综述的免疫细胞中转染和表达的载体中产生了本发明的CAR。
本发明涉及多核苷酸和载体以及处于本文所提及的免疫细胞的生产过程中的任何中间步骤。
-“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。本发明中的“载体”包括但不限于病毒载体、质粒、RNA载体或者可由染色体、非染色体、半合成或合成核酸组成的线性或环状DNA或RNA分子。优选的载体是能够自主复制(附加型载体)和/或表达(表达载体)与它们连接的核酸的那些。大量适合的载体是本领域技术人员已知的并且是可商购的。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如，腺相关病毒(AAV)、冠状病毒、负链RNA病毒如正粘病毒(例如，流感病毒)、弹状病毒(例如，狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如，麻疹和仙台)、正链RNA病毒如小核糖核酸病毒和α病毒以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦-巴尔病毒、巨细胞病毒)和痘病毒(例如，牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其它病毒包括例如诺沃克病毒、囊膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、嗜肝DNA病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病-肉瘤，哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒，HTLV-BLV组，慢病毒，泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology，第3版，B.N.Fields等人主编，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，1996)。
具体地，本发明尤其提供了处于包含编码本文所描述的CAR的多核苷酸序列的慢病毒载体或AAV载体形式的表达载体。
该慢病毒载体可以包含可操作地连接至启动子(如脾病灶形成性病毒启动子(SFFV))的编码根据本发明的CAR的多核苷酸序列。“可操作地连接”是指其中所述组分处于使它们能够以它们的预期方式起作用的关系的并置。当其转录受所述启动子控制并且这种转录导致产生了由所述基因所编码的产物时，基因(如CAR编码多核苷酸序列)“可操作地连接”至启动子。
本发明的慢病毒载体通常含有调控元件，如5'和3'长末端重复(LTR)序列，但是还可以含有主要来源于慢病毒的其它结构和功能性遗传元件。这些结构和功能性遗传元件在本领域中是熟知的。慢病毒载体可以例如含有基因gag、pol和env。然而，优选地，本发明的慢病毒载体不含基因gag、pol和env。作为其它调控元件，慢病毒载体可以包含一种或多种(如两种或更多种)包装信号(如包装信号ψ)、启动子结合位点、反式激活响应区(TAR)和rev响应元件(RRE)。
通常侧接慢病毒基因组的5'和3'长末端重复(LTR)序列具有启动子/增强子活性并且是全长慢病毒载体转录本正确表达所必需的。LTR通常包括在双链DNA分子的5'-末端和3'-末端存在的重复序列U3RU5，它是单链RNA的5'R-U5节段和3'U3-R节段的组合，其中重复R存在于RNA两端，而U5(独特序列5)仅存在于RNA的5'端并且U3(独特序列3)仅存在于RNA的3'端。可以通过除去U3序列来改善慢病毒载体的安全性，从而导致完全缺少最初存在于LTR内的病毒启动子和增强子序列的“自失活”载体。因此，载体仅能够感染，然后整合到宿主基因组中一次，并且不可以进一步传递，从而提高了载体作为基因递送载体的使用安全性。
根据一些实施方式，慢病毒载体是自失活(SIN)慢病毒载体。根据具体实施方式，慢病毒载体含有3'LTR，其中已修饰(例如，缺失)3'LTR增强子-启动子序列(即U3序列)。
根据一些实施方式，慢病毒载体包含多核苷酸序列，其以5'至3'的顺序包含以下元件中的一个或几个：
-5'长末端重复(5'LTR)；
-启动子(如EF1-α启动子)；
-根据本发明的编码嵌合抗原受体的多核苷酸序列；和/或
-3'长末端重复(3'LTR)，优选地3'自失活LTR。
根据具体实施方式，慢病毒载体还可以包含多核苷酸序列，其以5'至3'的顺序包含以下元件中的至少一个：
-5'长末端重复(5'LTR)；
-启动子(如EF1-α启动子)；
-任选地包含安全开关如R2的根据本发明的CAR，
-编码2A肽的多核苷酸序列；
-编码与CAR共表达的任何其它多肽如dnTGFβR的多核苷酸序列；
和/或
-3'长末端重复(3'LTR)，优选地3'自失活LTR。
作为另外一种选择，慢病毒载体可以以5'至3'的顺序包含以下元件中的至少一个：
-5'长末端重复(5'LTR)；
-启动子(如EF1-α启动子)；
-编码与CAR共表达的任何其它多肽如dnTGFβR的多核苷酸序列；
-编码2A肽的多核苷酸序列；
-任选地包含安全开关如R2的根据本发明的CAR，
和/或
-3'长末端重复(3'LTR)，优选地3'自失活LTR。
通常，所得载体形成可操作地连接至项目(b)的启动子的单一转录单元并且均在所述启动子的控制下转录。
AAV载体，特别是来自AAV6家族的载体[Wang,J.等人.(2015)Homology-drivengenome editing in hematopoietic stem and progenitor cells using ZFN mRNA andAAV6 donors.Nat Biotechnol 33,1256–1263]对于通过使用位点特异性同源重组将根据本发明的MSLN-CAR引入基因组中特别有用。通常，如已在EP3276000和WO2018073391中相对于用于治疗血癌的其它CAR所教导的，通过表达稀切核酸内切酶如TALEN在免疫细胞中诱导位点特异性同源重组。CAR位点特异性整合可以具有几个益处，如更稳定的整合、将转基因置于所选基因座处的内源启动子的转录对照之下的整合、可以使内源基因座失活的整合。在以下有关治疗免疫细胞的基因组工程化部分中详细描述了这些后几个方面。
作为本发明的一个目标，提供了AAV载体，其包含如先前具体说明的编码MSLN-CAR的多核苷酸序列和任选地编码顺式调控元件(例如，2A肽切割位点)或者内部核糖体进入位点(IRES)的另一条序列，从而允许编码改善工程化免疫细胞治疗效力的产物的第三序列的共表达。在本文中提供了dnTGFβRII的过表达的实例，据发现它降低SMAD2-3的磷酸化，其同时减少肿瘤环境中通过TGFβ诱导的细胞耗竭。
术语“治疗性质”涵盖了从它们在治疗性治疗中的用途的角度来说可以改善这些细胞的不同方式。这是指将细胞基因工程化以赋予它们治疗优势益处(即治疗效力)或者有助于它们的用途或它们的生产。例如，基因工程化可以同时提供具有更好存活、更快生长、更短细胞周期、改善的免疫活性、功能性更强、更分化、对它们的靶细胞更特异、对药物更敏感或更耐受、对葡萄糖剥夺、氧或氨基酸耗尽更不敏感(即对肿瘤微环境有弹性)的效应细胞。祖细胞可以是生产性更强、受体患者更好耐受、更可能产生将在所期望的效应细胞中分化的细胞。作为实例但非限制性地提供了“治疗性质”的这些实例。
用于细胞疗法的MSLN CAR免疫细胞的基因组工程化
本发明更具体地涉及具有以下特性的细胞和试剂：
效应细胞：效应细胞是在免疫应答中保护身体的相对短寿命的激活细胞。激活的T细胞(它们包括细胞毒性T细胞和辅助性T细胞)是实施细胞介导的反应的优选的效应细胞。效应T细胞的类别是宽泛的类别，其包括对刺激如共刺激主动应答的多种T细胞类型。这包括辅助性T细胞、杀伤性T细胞、调节性T细胞和潜在的其它T细胞类型。
“免疫细胞”是指在功能上参与先天和/或适应性免疫应答的起始和/或执行的造血来源的细胞，如通常CD3或CD4阳性细胞。根据本发明的免疫细胞可以是树突细胞、杀伤树突细胞、肥大细胞、NK细胞、B细胞或选自由炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞、调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞组成的组中的T细胞。
“原代细胞”或“多个原代细胞”是直接采集自活组织(例如，活组织检查材料)并且建立了有限时间量的体外生长的预期细胞，这意味着它们可以经历有限的群体倍增次数。原代细胞与连续致瘤或人工永生细胞系相反。这些细胞系的非限制性实例为CHO-K1细胞；HEK293细胞；Caco2细胞；U2-OS细胞；NIH 3T3细胞；NSO细胞；SP2细胞；CHO-S细胞；DG44细胞；K-562细胞、U-937细胞；MRC5细胞；IMR90细胞；Jurkat细胞；HepG2细胞；HeLa细胞；HT-1080细胞；HCT-116细胞；Hu-h7细胞；Huvec细胞；Molt 4细胞。
原代免疫细胞可以从大量非限制性来源获得，包括外周血单核细胞(PBMC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和来自肿瘤如肿瘤浸润淋巴细胞。在一些实施方式中，所述免疫细胞可以源自健康供体，源自诊断患有癌症的患者或源自诊断患有感染的患者。在另一个实施方式中，所述细胞是呈现不同表型特性的混合免疫细胞群的一部分，如包含CD4、CD8和CD56阳性细胞。通过本领域中已知的多种方法，例如通过如由Schwartz J等人(Guidelines on the use of therapeuticapheresis in clinical practice-evidence-based approach from the WritingCommittee of the American Society for Apheresis:the sixth special issue(2013)J Clin Apher.28(3):145-284)综述的白细胞除去技术从供体或患者提供原代免疫细胞。
来源于干细胞的免疫细胞也被认为是根据本发明的原代免疫细胞，具体地来源于诱导的多潜能干细胞(iPS)的那些[Yamanaka,K.等人.(2008)."Generation of MouseInduced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors".Science.322(5903):949–53]。重编程因子的慢病毒表达已用于从人外周血液细胞诱导多能性细胞[Staerk,J.等人.(2010)."Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotentstem cells".Cell stem cell.7(1):20–4][Loh,YH.等人.(2010)."Reprogramming of Tcells from human peripheral blood".Cell stem cell.7(1):15–9]。
根据本发明的优选实施方式，免疫细胞通过不涉及人胚胎破坏的本领域中熟知的技术来源于人胚胎干细胞[Chung等人.(2008)Human Embryonic Stem Cell linesgenerated without embryo destruction,Cell Stem Cell 2(2):113-117]。
“基因工程”是指旨在将基因材料引入细胞、修饰基因材料和/或从细胞取出基因材料的任何方法。“基因编辑”是指允许在基因组的特定位置(基因座)添加、除去或改变基因材料的基因工程，包括精确突变(punctual mutation)。基因编辑通常涉及序列特异性试剂。
“序列特异性试剂”是指具有特异性识别基因组基因座上的所选多核苷酸序列(称为“靶序列”)的能力的任何活性分子，考虑修饰所述基因组基因座的表达，其通常为至少9bp，更优选地至少10bp，并且甚至更优选地至少12pb长。可以通过突变、缺失或插入到编码或调控多核苷酸序列，通过表观遗传变化，如通过甲基化或组蛋白修饰，或者通过与转录因子或聚合酶相互作用在转录水平干扰来改变所述表达。
序列特异性试剂的实例为核酸内切酶、RNA向导、RNAi、甲基酶、核酸外切酶、组蛋白脱乙酰基酶、核酸内切酶、末端处理酶如核酸外切酶，并且更具体地胞苷脱氨酶，如与CRISPR/cas9系统偶联以实施碱基编辑(即核苷酸替换)而不需要采取通过核酸酶的切割的那些，如例如Hess G.T.等人[Methods and applications of CRISPR-mediated baseediting in eukaryotic genomes(2017)Mol Cell.68(1):26–43]所述。
根据本发明的优选方面，所述序列特异性试剂优选地为序列特异性核酸酶试剂如与向导核酸内切酶偶联的RNA向导。
本发明旨在通过基因编辑技术，特别是通过基因靶向整合来改善免疫细胞的治疗潜力。
“基因靶向整合”是指任何已知的位点特异性方法，其允许将基因组编码序列插入、替换或修正到活细胞中。
根据本发明的一个优选方面，所述基因靶向整合包括在靶基因的基因座处的同源基因重组，以导致至少一个外源核苷酸的插入或替换，优选多个核苷酸的序列(即多核苷酸)，以及更优选编码序列。
-“DNA靶”、“DNA靶序列”、“靶DNA序列”、“核酸靶序列”、“靶序列”或“加工位点”是指可以通过根据本发明的序列特异性核酸酶试剂靶向并加工的多核苷酸序列。这些术语是指特定的DNA位置，优选细胞中的基因组位置，但也指可独立于遗传物质主体而存在的一部分遗传物质，如作为非限制性实例的质粒、附加体(episome，游离体)、病毒、转座子或细胞器如线粒体。作为RNA引导的靶序列的非限制性实例，是可以与向导RNA杂交的那些基因组序列，其将RNA引导的核酸内切酶导向至所需的基因座。
“稀切核酸内切酶”是所选择的序列特异性核酸内切酶试剂，它们的识别序列范围通常在10至50个连续碱基对，优选地12至30bp并且更优选地14至20bp的范围内。
根据本发明的优选方面，所述核酸内切酶试剂是编码“工程化”或“可编程”稀切核酸内切酶的核酸，如例如Arnould S.等人[WO2004067736]的归巢核酸内切酶、如例如UrnovF.等人[Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases(2005)Nature435:646-651]所述的锌指核酸酶(ZFN)、如例如Mussolino等人[A novel TALE nuclease scaffold enables high genome editing activity incombination with low toxicity(2011)Nucl.Acids Res.39(21):9283-9293]所述的TALE核酸酶或者如例如Boissel等人[MegaTALs:a rare-cleaving nuclease architecturefor therapeutic genome engineering(2013)Nucleic Acids Research 42(4):2591-2601]所述的MegaTAL核酸酶。
根据另一个实施方式，核酸内切酶试剂是结合RNA导向的核酸内切酶如Cas9或Cpf1使用的向导RNA，尤其根据Doudna,J.和Chapentier,E.[The new frontier of genomeengineering with CRISPR-Cas9(2014)Science346(6213):1077]所教导的，以上文献作为参考并入本文。
根据本发明的优选方面，将核酸内切酶试剂瞬时表达到细胞中，这意味着不认为将所述试剂整合到基因组中或者所述试剂长时间持续，如RNA，更具体地mRNA、蛋白或混合蛋白和核酸的复合物(例如：核糖核蛋白)的情况。
优选地，根据在本领域中熟知的技术，合成具有帽(cap)的处于mRNA形式的核酸内切酶以提高其稳定性，技术如例如Kore A.L.等人[Locked nucleic acid(LNA)-modifieddinucleotide mRNA cap analogue:synthesis,enzymatic incorporation,andutilization(2009)J Am Chem Soc.131(18):6364-5]所述。
通常，用于转染原代免疫细胞如PBMC的电穿孔步骤通常在包含平行板电极的封闭室内进行，其在所述平行板电极之间产生在整个处理体积内基本均匀的大于100伏/cm且小于5,000伏/cm的脉冲电场，如WO2004083379(其作为参考并入)中所述，具体地从第23页第25行至第29页第11行。一种这种电穿孔室优选地具有通过电极间距的平方(cm2)除以室体积(cm3)的商所定义的几何因子(cm-1)，其中几何因子小于或等于0.1cm-1，其中细胞混悬液和序列特异性试剂处于媒介物中，调节媒介物使媒介物的导电性在0.01至1.0毫西门子的范围内。通常，细胞混悬液经历一个或多个脉冲电场。通过该方法，混悬液的处理体积是可缩放的，并且室内的细胞处理时间是基本均匀的。
由于它们较高的特异性，已证明TALE核酸酶是用于治疗应用的合适的序列特异性核酸酶试剂，特别是在杂二聚体形式下－即通过与具有“右”单体(也称为“5'”或者“正向”)和“左”单体(还称为“3'”或者“反向”)的对工作，如例如Mussolino等人[TALEN facilitatetargeted genome editing in human cells with high specificity and lowcytotoxicity(2014)Nucl.Acids Res.42(10):6762-6773]所报道的。
如上所述，序列特异性试剂优选地处于核酸形式，如处于编码稀切核酸内切酶及其亚基的DNA或RNA形式，但是它们还可以是包括多核苷酸和多肽的缀合物(如所谓的“核糖核蛋白”)的一部分。这种缀合物可以用试剂如Cas9或Cpf1(RNA导向的核酸内切酶)形成，分别如Zetsche,B.等人[Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class2CRISPR-Cas System(2015)Cell 163(3):759–771]和Gao F.等人.[DNA-guided genomeediting using the Natronobacterium gregoryi Argonaute(2016)Nature Biotech]所述，其包括可以与它们各自的核酸酶复合的RNA或DNA向导。
“外源序列”是指起初不存在于所选基因座处的任何核苷酸或核酸序列。该序列可以与基因组序列同源或者是它的拷贝，或者可以是引入细胞的外源序列。相反，“内源序列”是指起初存在于基因座中的细胞基因组序列。外源序列优选地编码其表达优于未在该基因座整合该外源序列的姐妹细胞赋予治疗优势的多肽。根据本发明的方法，通过核苷酸或多核苷酸的插入进行基因编辑以表达不同多肽的内源序列被广泛地称为外源编码序列。
通过使用以上试剂和技术，本发明同时开发了通过进行以下步骤中的一个或几个用于产生治疗性细胞的方法：
-从供体或患者提供免疫细胞，优选地原代细胞；
-将如前所述的MSLN-CAR表达到这些细胞中，通常通过将MSLN-CAR编码序列借助于病毒载体引入到细胞基因组中；
-将序列特异性试剂如稀切核酸内切酶引入这种免疫细胞以诱导在内源基因的基因座处的修饰(突变或编码序列插入)；和/或
-将外源编码序列引入所述细胞以改善其治疗效力，具体地其免疫性质。
根据本发明的一些方面，免疫细胞来源于患者或相容性供体，其中表达MSLN CAR，以便进行所谓的工程化免疫细胞的“自体”输注。它们还可以来源于干细胞，如iPS细胞，干细胞来源于该患者或相容性供体或者来源于肿瘤浸润淋巴细胞(TILL)。
根据本发明的一些方面，该方法旨在提供免疫细胞的“现成”组合物，将所述免疫细胞工程化以用于同种异体治疗性治疗。
“同种异体”是指细胞来源于供体，从干细胞产生或分化，以便输注到具有不同单倍型的患者中。
这些免疫细胞通常工程化，从而相对于它们的患者宿主具有较低的同种异体反应性和/或变得更持久。更具体地，本方法包括减少TCR在T细胞或将衍生为T细胞的干细胞中的表达或使其失活的步骤。这可以通过不同的序列特异性试剂如通过基因沉默或基因编辑技术(核酸酶、碱基编辑、RNAi…)来获得。
本发明先前已使得稳健的规程和基因编辑策略对于从PBMC产生同种异体治疗级T细胞可用，具体地通过提供处于TALE核酸酶
Figure BDA0003807266140000311
形式的非常安全且特异的核酸内切酶试剂。实现了所谓的“通用T-细胞”(它是来自供体的[TCR]neg T细胞)的产生并将其成功注射到具有降低的移植物抗宿主病(GVhD)的患者中[Poirot等人(2015)MultiplexGenome-Edited T-cell Manufacturing Platform for“Off-the-Shelf”Adoptive T-cellImmunotherapies.Cancer.Res.75(18):3853-3864][Qasim,W.等人.(2017)Molecularremission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR Tcells.Science Translational 9(374)]。同时，原代T细胞中TCR或β2m组分的失活可以与编码检查点抑制剂蛋白的其它基因的失活组合，如例如WO2014184744中所述。
在优选的实施方式中，本发明提供了工程化免疫细胞的方法，其中使编码TCRα或TCRβ的至少一种基因在所述免疫细胞中失活，优选地通过稀切核酸内切酶的表达失活，然而将编码MSLN-CAR的外源多核苷酸引入所述细胞的基因组以用于稳定表达。优选地，所述外源序列在编码TCRα或TCRβ的所述基因座处，更优选地在TCRα或TCRβ的内源启动子的转录控制下整合。
在其它实施方式中，可以进一步修饰工程化免疫细胞以赋予对至少一种免疫抑制性药物的抗性，如通过使CD52，抗-CD52抗体的靶标(例如：阿仑单抗)失活，这先前已参考血癌的治疗例如在WO2013176915中进行了描述。
尽管迄今为止已将抗-CD52淋巴细胞清除剂的使用限制于液体肿瘤癌症[QuasimW.等人.(2019)Allogeneic CAR T cell therapies for leukemia Am J Hematol.94:S50–S54.]，但是本发明的一个主要方面在于对淋巴细胞清除方案耐受的基因工程淋巴细胞用于治疗实体瘤的用途。
本发明还提供了具有针对实体瘤，特别是针对间皮素阳性细胞的嵌合抗原受体的工程化淋巴细胞，它们与淋巴细胞清除处理步骤结合或在淋巴细胞清除处理步骤之后在实体瘤癌症治疗中使用。
这种淋巴细胞清除方案可以包含抗-CD52试剂，如阿仑珠单抗，或者嘌呤类似物，如用于治疗血癌的那些。
在优选的实施方式中，通过抑制或破坏淋巴细胞清除剂靶向的分子，如例如就阿仑珠单抗来说的抗原CD52的表达，使本文所描述的具有MSLN-CAR的工程化淋巴细胞对这种淋巴细胞清除方案耐受。
在其它实施方式中，例如通过如WO201575195中所述的使DCK失活，可以进一步修饰工程化免疫细胞以赋予对化疗药物，具体地嘌呤类似物药物的抗性。
如前所示，本发明的重要方面在于用具有嵌合抗原受体的基因工程淋巴细胞治疗实体瘤癌症，这些淋巴细胞对化疗或淋巴细胞清除方案耐受。这种方案可以包含靶向免疫细胞表面存在的抗原的抗体，如CD52、CD3、CD4、CD8、CD45或其它特异性标志物，以及特异性较低的药物，如嘌呤类似物(例如，氟达拉滨和/或氯法拉滨)和糖皮质激素。本发明的一个方面在于通过使编码这些淋巴细胞清除剂的至少一个分子靶标的基因，例如代谢嘌呤类似物的基因DCK或者编码糖皮质激素受体(GR)的基因的表达失活或降低，使工程化淋巴细胞对这种方案耐受。
因此，本发明更具体地集中在用于在实体癌治疗中的同种异体使用的CAR阳性细胞，其对TCR、CD52和/或DCK和/或GR的表达降低、失活或有缺陷，这使得它们对淋巴细胞清除方案的同种异体反应性较低且耐受。
在其它实施方式中，可以进一步修饰工程化免疫细胞以改善患者中其持久性或其寿命，具体地使编码MHC-I组分的基因如HLA或β2m失活，如WO2015136001中或通过Liu,X.等人.[CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells(2017)Cell Res27:154–157]所描述的。
根据本发明的优选方面，将工程化免疫细胞突变以改善其CAR依赖性免疫激活，具体地减少或抑制免疫检查点蛋白和/或它们的受体如PD1或CTLA4的表达，如WO2014184744所述。
在其它实施方式中，可以进一步修饰工程化免疫细胞以获得选自编码下列中的一个序列的另一种外源基因序列在所述细胞中的共表达：
-NK细胞抑制剂，如HLAG、HLAE或ULBP1；
-CRS抑制剂，如突变的IL6Ra、sGP130或IL18-BP；
-细胞色素P450、CYP2D6-1、CYP2D6-2、CYP2C9、CYP3A4、CYP2C19或CYP1A2，其赋予所述免疫细胞对药物如环磷酰胺和/或异磷酰胺的超敏感性；
-二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙神经素或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)、mTORmut或Lckmut，赋予耐药性；
-趋化因子或细胞因子，如IL-2、IL-12和IL-15；
-趋化因子受体，如CCR2、CXCR2或CXCR4；和/或
-肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的分泌抑制剂，如CCR2/CCL2中和剂，以提高免疫细胞的治疗活性；
本申请主张出于产生针对实体瘤的治疗性组合物的目的，在工程化免疫细胞中与编码在以上列表中所选的人多肽的另一种外源序列共表达如本文所描述的编码MSLN-CAR的至少一种外源序列的免疫细胞。
治疗性工程化免疫细胞中MSLN-CAR的表达与TGFbRII信号转导通路的破坏的组合
本发明更具体地将如前所述的编码MSLN-CAR的外源序列与编码TGFβ受体抑制剂，特别是TGFβRII抑制剂(Uniprot–P37173)的另一种外源序列的表达组合。
已将TGFβ受体描述为在肿瘤微环境中具有优势作用[Papageorgis,P.等人.(2015).Role of TGFβin regulation of the tumor microenvironment and drugdelivery(Review).International Journal of Oncology,46,933-943]。
尽管TGFβ受体在肿瘤发生中的确切作用仍有争论，但是本发明人已发现间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)与编码TGFBRII信号转导的抑制剂的另一种外源基因序列的共表达和/或通过使用序列特异性试剂使TGFβ受体信号转导失活或降低将导致工程化免疫细胞的治疗效力改善。具体地，本发明人已使用了两种不同的方法来损害TGFβRII信号转导通路，这两种方法可以组合在一起：
-TGFβRII的非活性配体，如显性失活的TGFβRII(SEQ ID NO：26)的表达，如Hiramatsu,K.等人.[Expression of dominant negative TGF-βreceptors inhibitscartilage formation in conditional transgenic mice(2011)J.Bone.Miner.Metab.29:493]所述，或者与多肽序列SEQ ID NO：26具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％的同一性的TGFβRII的类似非活性形式的表达。
和/或
-TGFβRII的内源基因序列的失活，具体地通过使用稀切核酸内切酶，如TALE核酸酶或者RNA导向的核酸内切酶(例如：Cas9或Cpf1)。
抑制受体介导的信号转导激活的抗TGFβRII IgG1单克隆抗体，如LY3022859[Tolcher,A.W.等人(2017)A phase 1study of anti-TGFβreceptor type-II monoclonalantibody LY3022859in patients with advanced solid tumors Cancer ChemotherPharmacol.79(4):673-680]也可以与根据本发明的CAR组合用于抑制TGFβ受体信号转导。
在本文中，本申请公开了TALE核酸酶的选择，它对TGFβRII基因内靶序列的选择是特别特异性的。这些TALE核酸酶已显示出最高的TGFβRII敲除效力，且脱靶切割极少，从而导致足以用于几位患者的剂量施用的大的活工程细胞群体。表6列出了这些优选的TALE-核酸酶以及它们相应的靶序列。
表6：TGFβRII基因的TALE核酸酶靶序列
Figure BDA0003807266140000341
还设计了RNA向导avec以通过使用Cas9核酸酶试剂使TGFβRII基因失活。表7中公开了它们相应的各自的靶序列。
表7：TGFβRII基因的CRISPR靶序列。
Figure BDA0003807266140000342
Figure BDA0003807266140000351
Figure BDA0003807266140000361
Figure BDA0003807266140000371
因此，本发明涵盖了设计以结合表5或6中所提及的用于使TGFβRII失活或表达降低的任何靶序列SEQ ID NO：X至Y的TALE核酸酶或RNA导向的核酸内切酶用于本说明书教导内容内的治疗性免疫细胞的生产的用途。
本发明还涉及工程化免疫细胞，其包含编码核酸酶的外源多核苷酸，如先前所提及的一种多核苷酸，以使其内源TGFβRII基因的表达失活或降低。
因此，本发明申请报道了工程化免疫细胞，特别是CAR免疫细胞，其中已引入了编码TGFβ受体抑制剂的外源序列，更具体地编码显性失活的TGFβ受体的序列。这些细胞更具体地专门用于治疗实体瘤，特别是MSLN阳性肿瘤。
因此，本申请还要求保护载体，特别是病毒载体，如本领域中所述的慢病毒载体或AAV载体，其至少包含编码显性失活TGFβRII的多核苷酸序列，和任选地间皮素特异性嵌合抗原受体。在优选的实施方式中，所述载体包含编码所述显性失活TGFβRII的第一多核苷酸序列、编码2A自切割肽的第二多核苷酸序列和编码所述间皮素特异性嵌合抗原受体的第三多核苷酸序列。
可以通过使用AAV载体，特别是来自AAV6家族的载体或者嵌合载体AAV2/6显著改善免疫细胞中的靶向插入，如先前通过Sharma A.等人[Transduction efficiency of AAV2/6,2/8and 2/9vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts.(2010)Brain Research Bulletin.81(2–3):273-278]所描述的。
因此，本发明的一个方面是包含MSLN-CAR编码序列的AAV载体在人原代免疫细胞中的转导，结合序列特异性核酸内切酶试剂如TALE核酸内切酶的表达，以提高先前引用的基因座处的基因整合。
根据本发明的优选方面，可以通过转染，更优选地通过编码所述序列特异性核酸内切酶试剂的mRNA的电穿孔将序列特异性核酸内切酶试剂引入细胞。
所获得的外源核酸序列的插入可以导致基因材料的引入、内源序列的修正或替换，更优选地相对于位于该基因座的内源基因序列的“在框内(in frame)”。
根据本发明的另一个方面，每个细胞转导105至107，优选地106至107，更优选地约5.106个病毒基因组。
根据本发明的另一个方面，可以用蛋白酶体抑制剂如硼替佐米或HDAC抑制剂处理细胞以进一步帮助同源重组。
作为本发明的一个目标，在该方法中使用的AAV载体可以包含无启动子的外源编码序列，所述编码序列是在本说明书中所提及的那些中的任一个。
本发明还提供了获得原代免疫细胞的有效方法，其可以在多个基因座，更具体地参与宿主移植相互作用和识别的基因座中基因编辑。也可以编辑其它基因座，以便改善工程化原代细胞，特别是原代T细胞的活性、存活或寿命。
图2将可以通过根据本发明的基因编辑修饰以改善工程化免疫细胞的效率的主要细胞功能绘图。在每个功能下所列的任何基因失活可以与另一种组合以获得对免疫细胞的整体治疗效力的协同作用。
更具体地，本发明提供了促使改善免疫细胞对实体瘤，特别是对MSLN阳性恶性细胞的效力的免疫细胞中的基因修饰(基因型)的组合，例如：
-[MSLN-CAR]+，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[β2m]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[β2m]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[β2m]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[PD1]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[PD1]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[PD1]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[PD1]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[β2m]-[PD1]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[PD1]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[PD1]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[PD1]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[PD1]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[PD1]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[PD1]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[β2m]-[PD1]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[PD1]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[TGFβRII]-[PD1]-[TCR]-[β2m]-。
如先前所提及的，本发明还具体地集中在CAR阳性细胞在实体癌治疗中的用途，其使得对淋巴细胞清除试剂耐受，使得它们可以与淋巴细胞清除方案组合或在淋巴细胞清除方案之后在同种异体环境中的使用它们。这些细胞优选地显示出以下基因型：
-相对于抗-CD52抗体部分或完全耐受：
-[MSLN-CAR]+[CD52]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[CD52]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[CD52]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[CD52]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[CD52]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[CD52]-[TCR]-[β2m]-，
-相对于嘌呤类似物部分或完全耐受：
-[MSLN-CAR]+[DCK]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[DCK]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[DCK]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[DCK]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[DCK]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[DCK]-[TCR]-[β2m]-，
-相对于糖皮质激素部分或完全耐受：
-[MSLN-CAR]+[GR]-[TCR]-、
-[MSLN-CAR]+[GR]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[GR]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[TGFβRII]-[GR]-[TCR]-[β2m]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[GR]-[TCR]-，
-[MSLN-CAR]+[dnTGFβRII]+[GR]-[TCR]-[β2m]-，
通过转基因在失活基因座的表达进一步改善治疗性免疫细胞
通过优选地在PD1、TCR(TCRα和/或TCRβ)或TGFβRII基因座，以及在如下文所述的其它所选的基因座的基因靶向整合，可以获得以上优选的基因型。
“基因靶向整合”是指任何已知的位点特异性方法，其允许将基因组序列插入、替换或修正到活细胞中。基因靶向整合通常涉及同源基因重组或NHEJ(非同源末端连接)机制，其通过核酸内切酶序列特异性试剂提高，以产生至少一个外源核苷酸，优选地几个核苷酸(即多核苷酸)的序列并且更优选地编码序列在预定基因座的插入或替换。
本发明的方法可以与涉及遗传转化的其它方法如病毒转导结合，并且还可以与不一定涉及整合的其它转基因表达组合。
根据一个方面，根据本发明的方法包括将突变或多核苷酸编码序列在内源基因座引入免疫细胞的步骤，突变或多核苷酸编码序列选自：
a)多核苷酸序列，其表达涉及对低葡萄糖条件响应的糖酵解和钙信号转导的减少，如提高钙信号转导的SERCA3、提高糖酵解的miR101和mir26A、动员糖酵解储备的BCAT；和/或
b)多核苷酸序列，其表达上调免疫检查点蛋白(例如，TIM3、CEACAM、LAG3、TIGIT)，如IL27RA、STAT1、STAT3；和/或
c)多核苷酸序列，其表达介导与HLA-G的相互作用，如ILT2或ILT4；和/或
d)多核苷酸序列，其表达涉及T细胞增殖的下调，如减少Treg增殖的SEMA7A、SHARPIN、降低细胞凋亡的STAT1、提高IL-2分泌的PEA15和有利于CD8记忆分化的RICTOR；和/或
e)多核苷酸序列，其表达涉及T细胞激活的下调，如mir21；和/或
f)多核苷酸序列，其表达涉及对细胞因子响应的信号转导通路，如JAK2和AURKA；和/或
g)多核苷酸序列，其表达涉及T细胞耗竭，如DNMT3、miRNA31、MT1A、MT2A、PTGER2；
优选地，通过在所述细胞中表达特异性靶向所述所选内源基因座的序列特异性试剂。
优选地插入所述转基因或外源多核苷酸序列，从而将其表达置于所述基因座之一处存在的至少一种内源启动子的转录控制之下。
如以上所提及的通过实施基因整合靶向一个基因座将有益于进一步改善本发明的治疗性免疫细胞的效力。
下文提供了可以在所选基因座表达或过表达的这些外源序列或转基因的实例：
赋予对药物或免疫耗尽剂的抗性的转基因的表达
根据本发明方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码赋予所述免疫细胞对药物的抗性的分子。
优选的外源序列的实例为赋予对叶酸类似物如甲氨蝶呤的抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)的变体、赋予对IMPDH抑制剂如麦考酚酸(MPA)或其前体药物吗替麦考酚酯(MMF)的抗性的肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)的变体、赋予对钙神经素抑制剂如FK506和/或CsA的抗性的钙神经素或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)的变体、赋予对雷帕霉素的抗性的mTOR如mTORmut的变体和赋予对伊马替尼和格列卫的抗性的Lck如Lckmut的变体。
术语“药物”在本文中用于表示通常用于与癌细胞相互作用，借此降低细胞的增殖或存活状态的化合物或其衍生物，优选地标准化疗剂。化疗剂的实例包括但不限于烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺)、代谢拮抗剂(例如，嘌呤核苷抗代谢物，如氯法拉滨、氟达拉滨或2'-脱氧腺苷、甲氨蝶呤(MTX)、5-氟尿嘧啶或其衍生物)、抗肿瘤抗生素(例如，丝裂霉素、亚德里亚霉素)、植物来源的抗肿瘤剂(例如，长春新碱、长春地辛、红豆杉醇)、顺铂、卡铂、依托泊苷等。这些试剂还可以包括(但不限于)抗癌剂TRIMETHOTRIXATETM(TMTX)、TEMOZOLOMIDETM、RALTRITREXEDTM、S-(4-硝基苄基)-6-硫肌苷(NBMPR)、6-苄基胍(6-BG)、双氯亚硝基脲(BCNU)和CAMPTOTHECINTM或者其任一种的治疗衍生物。
如本文所使用的，当修饰所述细胞或细胞群体，从而它可以在含有半最大抑制浓度(IC50，相对于未修饰的细胞或细胞群体确定所述IC50)的所述药物的培养基中至少体外增殖时，使免疫细胞对药物具有“抗性或耐受性”。
在具体的实施方式中，通过至少一种“抗药性编码序列”的表达可以赋予免疫细胞所述抗药性。所述抗药性编码序列是指赋予对试剂如以上所提及的化疗剂之一的“抗性”的核酸序列。本发明的抗药性编码序列可以编码对抗代谢产物、甲氨蝶呤、长春碱、顺铂、烷化剂、蒽环类抗生素、细胞毒性抗生素、抗免疫亲和素、它们的类似物或衍生物等的抗性(Takebe,N.,S.C.Zhao等人.(2001)"Generation of dual resistance to4-hydroperoxycyclophosphamide and methotrexate by retroviral transfer of thehuman aldehyde dehydrogenase class 1gene and a mutated dihydrofolatereductase gene".Mol.Ther.3(1):88-96)、(Zielske,S.P.,J.S.Reese等人.(2003)"Invivo selection of MGMT(P140K)lentivirus-transduced human NOD/SCIDrepopulating cells without pretransplant irradiation conditioning."J.Clin.Invest.112(10):1561-70)、(Nivens,M.C.,T.Felder等人.(2004)"Engineeredresistance to camptothecin and antifolates by retroviral coexpression oftyrosyl DNA phosphodiesterase-I and thymidylate synthase"Cancer ChemotherPharmacol 53(2):107-15)、(Bardenheuer,W.,K.Lehmberg等人.(2005)."Resistance tocytarabine and gemcitabine and in vitro selection of transduced cells afterretroviral expression of cytidine deaminase in human hematopoietic progenitorcells".Leukemia 19(12):2281-8)、(Kushman,M.E.,S.L.Kabler等人.(2007)"Expressionof human glutathione S-transferase P1 confers resistance to benzo[a]pyrene orbenzo[a]pyrene-7,8-dihydrodiol mutagenesis,macromolecular alkylation andformation of stable N2-Gua-BPDE adducts in stably transfected V79MZ cells co-expressing hCYP1A1"Carcinogenesis 28(1):207-14)。
更具体地，这些抗药性外源序列在根据本发明的免疫细胞中的表达使得在其中细胞疗法与化疗结合的细胞疗法治疗方案中或者在先前使用这些药物治疗的患者中使用所述免疫细胞。
已识别了可以潜在用于赋予根据本发明的抗药性的一些抗药性编码序列。抗药性编码序列的一个实例可以是例如二氢叶酸还原酶(DHFR)的突变体或修饰形式。DHFR是参与调节细胞中四氢叶酸的量的酶并且是DNA合成所必须的。叶酸类似物如甲氨蝶呤(MTX)抑制DHFR并因此在临床中用作抗肿瘤试剂。已描述了对通过在疗法中所使用的抗叶酸剂的抑制具有提高的抗性的DHFR的不同突变体形式。在具体的实施方式中，根据本发明的抗药性编码序列可以是编码人野生型DHFR的突变体形式的核酸序列(GenBank：AAH71996.1)，其包含赋予对抗叶酸剂治疗如甲氨蝶呤的抗性的至少一个突变。在具体的实施方式中，DHFR的突变体形式包含在位置G15、L22、F31或F34处，优选地在位置L22或F31处的至少一个突变氨基酸(Schweitzer等人(1990)"Dihydrofolate reductase as a therapeutic target"FasebJ 4(8):2441-52；国际专利申请WO94/24277；和美国专利US 6,642,043)。在具体的实施方式中，所述DHFR突变体形式包含在位置L22和F31处的两个突变氨基酸。通常就野生型DHFR多肽形式的氨基酸位置表示本文所描述的氨基酸位置的对应性。在具体的实施方式中，位置15处的丝氨酸残基优选地被色氨酸残基替代。在另一个具体的实施方式中，优选地用将破坏突变体DHFR与抗叶酸剂结合的氨基酸替代位置22处的亮氨酸残基，优选地用不带电的氨基酸残基，如苯丙氨酸或酪氨酸替代。在另一个具体的实施方式中，优选地用小亲水性氨基酸，如丙氨酸、丝氨酸或甘氨酸替代位置31或34处的苯丙氨酸残基。
抗药性编码序列的另一个实例还可以是肌苷-5'-单磷酸盐脱氢酶II(IMPDH2)的突变体或修饰形式，它是鸟苷核苷酸的从头合成中的限速酶。IMPDH2的突变体或修饰形式是IMPDH抑制剂抗性基因。IMPDH抑制剂可以是麦考酚酸(MPA)或其前体药物吗替麦考酚酯(MMF)。突变体IMPDH2可以在野生型人IMPDH2(Genebank：NP_000875.2)的MAP结合位点中包含至少一个，优选地两个突变，从而导致对IMPDH抑制剂的抗性显著提高。这些变体中的突变优选地处于位置T333和/或S351(Yam,P.,M.Jensen等人.(2006)"Ex vivo selectionand expansion of cells based on expression of a mutated inosine monophosphatedehydrogenase 2after HIV vector transduction:effects on lymphocytes,monocytes,and CD34+stem cells"Mol.Ther.14(2):236-44)(Jonnalagadda,M.等人.(2013)"Engineering human T cells for resistance to methotrexate andmycophenolate mofetil as an in vivo cell selection strategy."PLoS One 8(6):e65519)。
另一种药抗性编码序列是钙神经素的突变体形式。钙神经素(PP2B-NCBI：ACX34092.1)是普遍表达的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶，它参与多种生物过程并且是T细胞激活的中心。钙神经素是由催化亚基(CnA；3种同工型)和调节亚基(CnB；两种同工型)组成的杂二聚体。在T细胞受体接合后，钙神经素使转录因子NFAT去磷酸化，从而使其移位至核和活性关键靶基因如IL2。与FKBP12复合的FK506或者与CyPA复合的环胞霉素A(CsA)阻断NFAT对钙神经素活性位点的接近，从而防止其去磷酸化并借此抑制T细胞激活(Brewin等人(2009)"Generation of EBV-specific cytotoxic T cells that are resistant tocalcineurin inhibitors for the treatment of posttransplantationlymphoproliferative disease"Blood 114(23):4792-803)。在具体的实施方式中，所述突变体形式可以包含野生型钙神经素杂二聚体a在以下位置处的至少一个突变氨基酸：V314、Y341、M347、T351、W352、L354、K360，优选地在以下位置处的两个突变：T351和L354或者V314和Y341。在具体的实施方式中，位置341处的缬氨酸残基可以被赖氨酸或精氨酸残基替代，位置341处的酪氨酸残基可以被苯丙氨酸残基替代；位置347处的蛋氨酸可以被谷氨酸、精氨酸或色氨酸残基替代；位置351处的苏氨酸残基可以被谷氨酸残基替代；位置352处的色氨酸残基可以被半胱氨酸、谷氨酸或丙氨酸残基替代，位置353处的丝氨酸可以被组氨酸或天冬酰胺残基替代，位置354处的亮氨酸可以被丙氨酸残基替代；位置360处的赖氨酸可以被丙氨酸或苯丙氨酸残基替代。在另一个具体的实施方式中，所述突变体形式可以包含位于以下位置的野生型钙神经素杂二聚体b的至少一个突变氨基酸：V120、N123、L124或K125，优选地位置L124和K125处的两个突变。在具体的实施方式中，位置120处的缬氨酸可以被丝氨酸、门冬氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸残基替代；位置123处的天冬酰胺可以被色氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、组氨酸或丝氨酸替代；位置124处的亮氨酸可以被苏氨酸残基替代；位置125处的赖氨酸可以被丙氨酸、谷氨酸、色氨酸替代，或者可以在氨基酸序列中位置125处的赖氨酸之后添加两个残基如亮氨酸-精氨酸或异亮氨酸-谷氨酸。通常就野生型人钙神经素杂二聚体b多肽(NCBI：ACX34095.1)形式的氨基酸位置表示本文所描述的氨基酸位置的对应性。
另一个抗药性编码序列为编码人烷基鸟嘌呤转移酶(hAGT)的0(6)-甲基鸟嘌呤甲基转移酶(MGMT-UniProtKB：P16455)。AGT是DNA修复蛋白，其赋予对烷化剂如亚硝基脲和替莫唑胺(TMZ)的细胞毒性作用的抗性。6-苄基鸟嘌呤(6-BG)是AGT的抑制剂，其增强亚硝基脲毒性并且连同TMZ一起共施用以增强该试剂的细胞毒性作用。编码AGT的变体的MGMT的几种突变形式是对通过6-BG的失活高度耐受的，但保留了它们修复DNA损伤的能力(Maze,R.等人.(1999)"Retroviral-mediated expression of the P140A,but not P140A/G156A,mutant form of O6-methylguanine DNA methyltransferase protects hematopoieticcells against O6-benzylguanine sensitization to chloroethylnitrosoureatreatment"J.Pharmacol.Exp.Ther.290(3):1467-74)。在具体的实施方式中，AGT突变体形式可以包含野生型AGT位置P140处的突变氨基酸。在优选的实施方式中，所述位置140处的脯氨酸被赖氨酸残基替代。
另一个抗药性编码序列可以是多重耐药性蛋白(MDR1)基因。该基因编码被称为P-糖蛋白(P-GP)的膜糖蛋白，其参与代谢副产物跨过细胞膜的转运。P-Gp蛋白显示出对于一些结构上无关的化疗剂的宽泛特异性。因此，可以通过编码MDR-1(Genebank NP_000918)的核酸序列的表达赋予细胞抗药性。
另一个抗药性编码序列可以促进细胞毒性抗生素的产生，如来自ble或mcrA基因的那些。当暴露于各自的化疗剂博来霉素和丝裂霉素C时，ble基因或mcrA在免疫细胞中的异位表达提供了选择优势(Belcourt,M.F.(1999)“Mitomycin resistance in mammaliancells expressing the bacterial mitomycin C resistance protein MCRA”.PNAS.96(18):10489-94)。
另一个抗药性编码序列可以来自药物靶标的基因编码的突变形式，如赋予雷帕霉素抗性的mTOR(mTOR mut)的突变变体，如Lorenz M.C.等人(1995)“TOR Mutations ConferRapamycin Resistance by Preventing Interaction with FKBP12-Rapamycin”TheJournal of Biological Chemistry270,27531-27537所述，或者赋予格列卫抗性的Lck(Lckmut)的某些突变变体，如通过Lee K.C.等人(2010)“Lck is a key target ofimatinib and dasatinib in T-cell activation”,Leukemia,24:896–900所述。
如以上所描述的，该方法的基因修饰步骤可以包括向细胞引入至少包含编码抗药性编码序列的序列的外源核酸和一部分内源基因，从而在内源基因和外源核酸之间发生同源重组的步骤。在具体的实施方式中，所述内源基因可以是野生型“抗药性”基因，从而在同源重组之后，野生型基因被赋予药物抗性的基因的突变体形式替代。
提高免疫细胞体内持久性的转基因的表达
根据本方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码提高免疫细胞持久性，特别是肿瘤环境中的体内持久性的分子。
“提高持久性”是指就寿命而言延长免疫细胞的存活，特别是一旦将工程化免疫细胞注射到患者后。例如，如果修饰的细胞的平均存活比未修饰的细胞显著长至少10％，优选地20％，更优选地30％，甚至更优选地50％，则持久性提高。
当免疫细胞是同种异体的时，这是特别相关的。这可以通过引入在细胞膜或通过细胞膜异位表达和/或分泌免疫抑制多肽的编码序列，从而产生局部免疫保护来进行。多组这类多肽，具体地免疫检查点拮抗剂、来源于病毒包膜的免疫抑制肽或者NKG2D配体可以提高持久性和/或同种异体免疫细胞向患者的移植。
根据一个实施方式，通过所述外源编码序列所编码的免疫抑制多肽是细胞毒性T-淋巴细胞抗原4(CTLA-4，也称为CD152，GenBank登录号AF414120.1)的配体。所述配体多肽优选地为抗CTLA-4免疫球蛋白，如CTLA-4a Ig和CTLA-4b Ig或其功能变体。
根据一个实施方式，通过所述外源编码序列所编码的免疫抑制多肽是PD1，如PD-L1(其它名称：CD274，程序细胞死亡1配体；人多肽序列的UniProt编号：Q9NZQ7)的拮抗剂，其编码由Ig V样结构域、Ig C样结构域、疏水性跨膜结构域和30个氨基酸的胞质尾所组成的290个氨基酸的I型跨膜蛋白。PD-L1配体的这种膜结合形式在本发明中表示处于天然形式(野生型)或者处于截短形式，如例如通过除去胞内域的截短形式，或者具有一个或多个突变(Wang S等人,2003,J Exp Med.2003；197(9):1083–1091)。值得注意的，不认为PD1是根据本发明的PD-L1配体的膜结合形式。根据另一个实施方式，所述免疫抑制多肽处于分泌形式。可以通过将PD-L1的胞外域融合至免疫球蛋白的Fc部分来产生这种重组分泌的PD-L1(或可溶性PD-L1)(Haile ST等人,2014,Cancer Immunol.Res.2(7):610–615；Song MY等人.,2015,Gut.64(2):260-71)。这种重组PD-L1可以中和PD-1并终止PD-1介导的T细胞抑制。PD-L1配体可以与CTLA4 Ig共表达以用于两者进一步提高的持久性。
根据另一个实施方式，外源序列编码非人MHC同源物，特别是病毒MHC同源物或者嵌合β2m多肽，如Margalit A.等人.(2003)“Chimericβ2microglobulin/CD3ζpolypeptidesexpressed in T cells convert MHC class I peptide ligands into T cellactivation receptors:a potential tool for specific targeting of pathogenicCD8+T cells”Int.Immunol.15(11):1379-1387所述。
根据一个实施方式，外源序列编码NKG2D配体。一些病毒如巨细胞病毒具有获得性机制以避免NK细胞介导免疫监视并通过分泌能够结合NKG2D配体并防止它们表面表达的蛋白来干扰NKG2D通路(Welte,S.A等人(2003)“Selective intracellular retention ofvirally induced NKG2D ligands by the human cytomegalovirus UL16glycoprotein”.Eur.J.Immunol.,33,194–203)。在肿瘤细胞中，已进化出一些机制，其通过分泌NKG2D配体如ULBP2、MICB或MICA来逃避NKG2D反应(Salih HR,Antropius H,GiesekeF,Lutz SZ,Kanz L等人.(2003)Functional expression and release of ligands forthe activating immunoreceptor NKG2D in leukemia.Blood 102:1389–1396)。
根据一个实施方式，外源序列编码细胞因子受体如IL-12受体。IL-12是熟知的免疫细胞激活的激活剂(Curtis J.H.(2008)“IL-12Produced by Dendritic CellsAugments CD8+T Cell Activation through the Production of the Chemokines CCL1and CCL171”.The Journal of Immunology.181(12):8576-8584)。
根据一个实施方式，外源序列编码抗抑制肽或蛋白的抗体。所述抗体优选地以可溶性形式通过免疫细胞分泌。来自鲨鱼和骆驼的纳米抗体在这方面是有利的，因为它们是作为单链抗体结构化的(Muyldermans S.(2013)“Nanobodies:Natural Single-DomainAntibodies”Annual Review of Biochemistry 82:775-797)。同样还认为更易于与分泌信号多肽以及与可溶性亲水性结构域融合。
当通过破坏编码β2m或另一种MHC组分的内源基因引入外源编码序列时，以上所发展的提高细胞持久性的不同方面是特别优选的，如进一步详细说明的。
提高免疫细胞的治疗活性的转基因的表达
根据本方法的一个方面，整合到免疫细胞基因组基因座中的外源序列编码提高免疫细胞的治疗活性的分子。
“提高治疗活性”是指相对于所选靶细胞类型，根据本发明工程化的免疫细胞或细胞群体变得比非工程化细胞或细胞群体侵袭性更强。所述靶细胞由限定类型的细胞或细胞群体组成，优选地其特征为常见的表面标志物。在本说明书中，“治疗潜能”反映了治疗活性，如通过体外实验所测量的。通常，通过实施细胞溶胞或生长减少测量，将敏感性癌细胞系如Daudi细胞用于评价免疫细胞是否对所述细胞或多或少具有活性。这还可以通过测量免疫细胞脱粒水平或者趋化因子和细胞因子的生产进行评价。还可以在注射肿瘤细胞的小鼠中通过监测所得肿瘤扩大来进行实验。当免疫细胞将这些实验中出现的细胞数目减少超过10％，优选地超过20％，更优选地超过30％，更优选地超过50％时，认为活性增强显著。
根据本发明的一个方面，所述外源序列编码趋化因子或细胞因子，如IL-12。表达IL-12是特别有利的，因为这种细胞因子在文献中广泛提及为促进免疫细胞激活(ColomboM.P.等人(2002)“Interleukin-12in anti-tumor immunity and immunotherapy”Cytokine Growth Factor Rev.13(2):155-68)。
根据本发明的优选方面，外源编码序列编码或促进作用于其它免疫细胞如T-调节性细胞群体以减轻它们对所述免疫细胞的抑制作用的所分泌的因子。
根据本发明的一个方面，所述外源序列编码调节性T细胞活性的抑制剂，它是叉头/翼状螺旋转录因子3(FoxP3)的多肽抑制剂，并且更优选地是FoxP3的细胞穿膜肽抑制剂，如称为P60的抑制剂(Casares N.等人.(2010)“A peptide inhibitor of FoxP3impairs regulatory T cell activity and improves vaccine efficacy in mice.”JImmunol 185(9):5150-9)。
“调节性T细胞活性的抑制剂”是指由T细胞分泌的分子或所述分子的前体并且其允许T细胞逃逸由调节性T细胞对其进行的下调活性。通常，这种调节性T细胞活性的抑制剂具有降低所述细胞中FoxP3转录活性的作用。
根据本发明的一个方面，所述外源序列编码肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的分泌抑制剂，如CCR2/CCL2中和剂。肿瘤相关巨噬细胞(TAM)是肿瘤微环境的主要调节剂。临床病理学研究表明肿瘤中TAM的积累与不良的临床结果相关。与该证据一致，实验和动物研究支持TAM可以提供有利的微环境以促进肿瘤发育和发展的观点。(Theerawut C.等人.(2014)“Tumor-Associated Macrophages as Major Players in the Tumor Microenvironment”Cancers(Basel)6(3):1670–1690)。趋化因子配体2(CCL2)，也称为单核细胞化学引诱蛋白1(MCP1-NCBI NP_002973.1)是一种属于CC趋化因子家族的小细胞因子，由巨噬细胞分泌，在单核细胞、淋巴细胞和嗜碱性粒细胞上产生化学引诱。CCR2(C-C趋化因子受体类型2-NCBINP_001116513.2)是CCL2的受体。
尽管在所述基因座插入的编码序列通常编码改善工程化免疫细胞的治疗潜能的多肽，但是所插入的序列还可以是能够指导或抑制其它基因，如干扰RNA或向导RNA的表达的核酸。通过所插入的序列所编码的多肽可以直接或间接起作用，如信号转导蛋白或转录调控因子。
工程化的免疫细胞和免疫细胞群体
本发明还涉及根据本文所描述的方法之一可获得的多种工程化免疫细胞，其处于分离形式或作为细胞群体的一部分。
根据本发明的优选方面，工程化细胞是原代免疫细胞，如NK细胞或T细胞，它们通常是可以包括不同类型的细胞的细胞群体的一部分。一般而言，来源于患者或供体的群体是通过白细胞分离术从PBMC(外周血单核细胞)分离的。
本发明涵盖免疫细胞，免疫细胞包含不同外源编码序列和基因失活的任何组合，外源编码序列和基因失活已在上文中分别独立地描述。在这些组合中，特别优选在免疫细胞激活期间具有活性的内源启动子，具体地存在于一个TCR基因座的一个启动子，具体地TCRα启动子的转录控制下组合CAR表达的那些。
另一优选的组合是在缺氧诱导因子1基因启动子(Uniprot：Q16665)的转录控制下插入编码CAR或其组分之一的外源序列。
本发明还涉及用于治疗感染或癌症的药物组合物，其包含如前所述的工程化原代免疫细胞或免疫细胞群体，并且涉及治疗对其有需要的患者的方法，其中所述方法包括：
-根据如前所述的本发明的方法制备工程化的原代免疫细胞群体；
-任选地，纯化或分选所述工程化的原代免疫细胞；
-在将所述细胞输注到所述患者内时或之后，活化所述工程化的原代免疫细胞群体。
T细胞的激活和扩增
无论是在遗传修饰之前还是之后，根据本发明的免疫细胞可以被活化或扩增，即使它们可以独立于抗原结合机制而活化或增殖。具体地，可以使用例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公开号20060121005中所述的方法激活和扩增T细胞。可以在体外或体内扩增T细胞。通常通过与刺激CD3 TCR复合物和T细胞表面上的共刺激分子的试剂接触以产生T细胞的激活信号来扩增T细胞。例如，可以使用如钙离子载体A23187、佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)或有丝分裂凝集素如植物血凝素(PHA)的化学品来产生用于T细胞的活化信号。
作为非限制性实例，可以在体外刺激T细胞群体，如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段或固定在表面上的抗CD2抗体接触，或者通过与蛋白激酶C活化剂(例如，苔藓抑素)结合钙离子载体接触。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，使用结合辅助分子的配体。例如，可以在适合刺激T细胞增殖的条件下，使T细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。适合T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或者RPMI培养基1640或者X-vivo 5(Lonza))，其可以含有增殖和存活所必需的因子，包括血清(例如，胎牛血清或人血清)、白介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-2、IL-15、TGFp和TNF-或者技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1M-V、DMEM、MEM、a-MEM、F-12、X-Vivo 1和X-Vivo 20，优化剂(Optimizer)，其具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素，无血清或补充有适量血清(或血浆)或一组确定的激素，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如，青霉素和链霉素)仅包括在实验培养物中，而未包括在要输注到受试者中的细胞培养物中。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。已暴露于不同刺激时间的T细胞可表现出不同的特性。
在另一具体实施方式中，可以通过与组织或细胞共培养来扩增所述细胞。所述细胞也可以在体内扩增，例如在将所述细胞给予受试者后在受试者的血液中扩增。
治疗组合物和应用
上述本发明的方法允许在约15至30天的有限时间框架内产生工程化的原代免疫细胞，优选15至20天，以及最优选18至20天，使得它们保持它们完全的免疫治疗潜力，特别是在细胞毒活性方面。
这些细胞形成细胞群体，其优选源自单个供体或患者。这些细胞群体可以在封闭的培养接收器下扩增以符合最高的生产实践要求，并且可以在输注到患者内之前冷冻，从而提供“现成的”或“即用型”治疗组合物。
根据本发明，可以获得大量源自相同白细胞分离术的细胞，这对于获得足够用来治疗患者的剂量至关重要。尽管可以观察到源自不同供体的细胞群体之间的差异，但是通过白细胞分离术获得的免疫细胞的数量通常为约108至1010个PBMC细胞。PBMC包含几种类型的细胞：粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中30至60％为T细胞，其通常代表来自一个供体的108至109个原代T细胞。本发明的方法通常结束于工程化的细胞群体，其一般达到超过约108个T细胞，更一般超过约109个T细胞，甚至更一般超过约1010个T细胞，并且经常超过1011个T细胞。
因此，本发明更具体地涉及治疗有效的原代免疫细胞群体，其中所述群体中至少30％，优选50％，更优选80％的细胞已根据本文所述的任一方法修饰。
根据本发明的优选方面，超过50％的所述群体中包含的免疫细胞是TCR阴性T细胞。根据本发明更优选的方面，超过50％的所述群体中包含的免疫细胞是CAR阳性T细胞。工程化免疫细胞、细胞群体、治疗性组合物和用途。
因此，细胞的这种组合物或细胞群体可用作药物；尤其用于在对其有需要的患者中治疗癌症，特别是用于治疗淋巴瘤，但也用于治疗实体瘤，如黑素瘤、神经母细胞瘤、神经胶质瘤或者癌如肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌或卵巢癌。
本发明更具体地涉及源自单一供体的原代TCR阴性T细胞群体，其中所述群体中至少20％，优选30％，更优选50％的细胞已使用序列特异性试剂在至少两个(优选三个)不同的基因座处进行修饰。
在另一方面，本发明涉及治疗对其有需要的患者的方法，所述方法包括下列步骤中的至少一个：
(a)确定存在于患者肿瘤活组织检查的表面上的特异性抗原标志物；
(b)提供通过如前所述的本发明的方法之一工程化的工程化原代免疫细胞群体，其优选地表达针对所述特异性抗原标志物的重组受体；
(c)将所述工程化原代免疫细胞的工程化群体给予所述患者。
通常，所述细胞群体主要包含CD4和CD8阳性免疫细胞如T细胞，其可以经历稳健的体内T细胞扩增，并且可以在体外和体内持续延长量的时间。
涉及根据本发明的工程化原代免疫细胞的治疗可以是改善、治愈或预防的。它可以是自体免疫疗法的一部分，也可以是同种异体免疫疗法治疗的一部分。
在另一个实施方式中，根据本发明的所述分离细胞或者来源于所述分离细胞的细胞系可以用于治疗实体瘤，具体地实体瘤通常如食管癌、乳腺癌、胃癌、肝胆管型肝癌、胰癌、结肠癌、肺癌、胸腺癌、间皮瘤、卵巢癌和/或子宫内膜癌。
还包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
使用根据本发明的工程化免疫细胞的治疗可以与一种或多种抗癌疗法组合，所述抗癌疗法选自由抗体疗法、化疗、细胞因子疗法、树突细胞疗法、基因疗法、激素疗法、激光疗法和放射疗法组成的组。
根据本发明的优选实施方式，所述治疗可以给予经受免疫抑制治疗的患者。确实，本发明优选依赖于细胞或细胞群体，已经使细胞或细胞群体对至少一种免疫抑制剂产生抗性，原因在于编码用于这种免疫抑制剂的受体的基因被失活。在这一方面，免疫抑制治疗应有助于根据本发明的T细胞在患者内的选择和扩增。
根据本发明的细胞或细胞群体的给予可以以任何方便的方式进行，包括通过气溶胶吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。可以通过皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、静脉内或淋巴管内注射或者腹膜内注射，将本文描述的组合物给予患者。在一个实施方式中，本发明的细胞组合物优选通过静脉注射给予。
细胞或细胞群体的给予可以由每kg体重给予104-109个细胞组成，优选105至106个细胞/kg体重，包括这些范围内的所有细胞数的整数值。因此，本发明可以提供超过10个，通常超过50个，更通常超过100个且经常超过1000个剂量，该计量包含来自单个供体或患者取样的106-108个基因编辑的细胞。
细胞或细胞群体可以一剂量或多剂量给予。在另一实施方式中，所述有效量的细胞以单剂量给予。在另一实施方式中，所述有效量的细胞在一段时间内以超过一个剂量给予。给予的时机在管理医师的判断范围内，并取决于患者的临床状况。细胞或细胞群体可以从任何来源获得如血库或供体。虽然个体需求不同，但是对于特定疾病或病症，给定细胞类型的有效量的最佳范围的确定在本领域技术人员范围内。有效量是指提供治疗或预防益处的量。施用的剂量将取决于接受者的年龄、健康和体重，并发治疗的种类(如存在)，治疗频率和所期望的效果的性质。
在另一实施方式中，所述有效量的细胞或包含那些细胞的组合物是胃肠外给予的。所述给予可以是静脉内给予。所述给予可以通过在肿瘤内注射直接进行。
在本发明的某些实施方式中，将细胞与任何数量的相关治疗方式联合(例如，之前、同时或之后)给予患者，所述相关治疗方式包括但不限于用试剂如抗病毒疗法、西多福韦和白介素-2治疗，对于MS患者的阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗，或者对于银屑病患者的依法利珠单抗治疗或者对于PML患者的其它治疗。在其它实施方式中，本发明的T细胞可与化疗、放射、免疫抑制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506)、抗体或其它免疫消融剂(如CAMPATH，抗CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506，雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228，细胞因子和辐射)组合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙神经素(环胞霉素和FK506)或者抑制对于生长因子所引起的信号转导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Henderson,Naya等人，1991；Liu,Albers等人.1992；Bierer,Hollander等人.1993)。在其它实施方式中，将本发明的细胞组合物与骨髓移植、使用化疗剂(如氟达拉滨、外照射放射疗法(XRT)、环磷酰胺)或者抗体(如OKT3或CAMPATH)的T细胞消融疗法组合(例如，之前、同时或之后)给予患者。在另一个实施方式中，在B细胞消融疗法(如与CD20反应的药剂，例如，利妥昔单抗)后，给予本发明的细胞组合物。例如，在一个实施方式中，受试者可经受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植后，受试者接受本发明的扩增免疫细胞的输注。在其它实施方式中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
本发明还具体地涉及治疗患者中实体瘤的一般方法，其包括用淋巴细胞清除方案使所述患者免疫耗竭并输注使其对淋巴细胞清除方案中所使用的淋巴细胞清除试剂耐受且特异性靶向所述实体瘤的基因工程化淋巴细胞的步骤。这些基因工程化淋巴细胞优选地为CAR阳性T细胞，更优选地具有如本文所描述的MSLN-CAR。
淋巴细胞清除方案优选地包含针对免疫细胞表面存在的抗原如CD52、CD3、CD4、CD8、CD45的抗体，或者其它特异性标志物或者是药物，如嘌呤类似物(例如，氟达拉滨和/或氯法拉滨)和糖皮质激素。
根据本发明的优选实施方式，该方法包括使所述患者进行包含抗CD52抗体的淋巴细胞清除方案，并施用具有MSLN-CAR的工程化CAR T细胞，其中CD52的表达降低，不足或失活。
作为本发明的优选实施方式，淋巴细胞清除治疗可以单独或组合包含抗-CD52抗体，如阿仑珠单抗。例如，淋巴细胞清除方案可以组合环磷酰胺(通常1至3天)、氟达拉滨(1至5天)和阿仑珠单抗(1至5天)。通常，淋巴细胞清除方案可以单独或组合包含50至70mg/kg/天的环磷酰胺、20至40mg/m2/天的氟达拉滨和0.1至0.5mg/kg/天的阿仑珠单抗。
为此目的，本发明提供了用于受实体瘤影响的患者的淋巴细胞清除的组合物的组合使用，所述组合物包含抗CD52抗体和对所述抗体不敏感的靶向MSLN的工程化淋巴细胞群体，该群体优选地包含表达MSLN-CAR并且具有受损的CD52表达的MSLN-CAR。在这些工程化细胞中，已优选地通过稀切核酸内切酶，如先前描述的TALE核酸酶或RNA导向的核酸内切酶使CD52基因的等位基因失活。
本发明还提供了用于在实体瘤癌症治疗中使用的医疗试剂盒，其包含所述淋巴细胞清除组合物和对其耐受的所述工程化细胞群体。
“溶胞活性”或“细胞毒活性”或“细胞毒性”是指通过免疫细胞所赋予的靶细胞的细胞胞溶百分比。
用于确定细胞毒性的方法如下所述：
对于贴壁靶细胞(adherent target cell)：将2.104个特异性靶抗原(STA)阳性或STA阴性细胞以每孔0.1ml接种到96孔板中。铺板后第二天，用CellTrace CFSE标记STA阳性和STA阴性细胞并与4×105个T细胞共培养4小时。然后，收获细胞，用可固定活力染料(fixable viability dye)(eBioscience)染色并使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)分析。
对于悬浮靶细胞：分别用CellTrace CFSE和CellTrace Violet标记STA阳性和STA阴性细胞。将约2×104个ROR1阳性细胞与2×104个STA阴性细胞以及4×105个T细胞在96孔板中以每孔0.1ml共培养。培育4小时后，收获细胞并用可固定活力染料(eBioscience)染色并使用MACSQuant流式细胞仪(Miltenyi)分析。
可以使用以下公式计算特异性溶胞百分比：
Figure BDA0003807266140000561
-“提高的细胞毒性”是指与通过未工程化的免疫细胞所赋予的靶细胞的细胞胞溶％相比，通过工程化免疫细胞所赋予的靶细胞的细胞胞溶％提高了至少10％，如至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少100％或更多。
-“同一性”是指两个核酸分子或多肽之间的序列同一性。可以通过比较每个序列中的位置来确定同一性，所述位置可以出于比较的目的而比对。当比较序列中的位置被相同碱基占据时，则分子在该位置处是相同的。核酸或氨基酸序列之间的相似性或同一性程度取决于核酸序列共有的位置处相同或匹配核苷酸数目。可以使用多种比对算法和/或程序来计算两条序列之间的同一性，包括FASTA或BLAST，其作为GCG序列分析包(Universityof Wisconsin，Madison，Wis.)的一部分是可用的，并且可以利用例如默认设置来使用。例如，考虑了与本文所述的特定多肽具有至少70％、85％、90％、95％、98％或99％同一性并且优选地表现出基本相同的功能的多肽，以及编码这些多肽的多核苷酸。
-本文所使用的术语“受试者”或“患者”一般地表示哺乳动物，优选地灵长类动物，并且更优选地人。
本发明的上述书面描述提供了制造和使用本发明的方式和方法，从而使得本领域任何技术人员都能够制造和使用本发明，这种使能性具体地为所附权利要求的主题提供，所附权利要求构成原始描述的一部分。
当在本文中描述数值限定或范围时，包括终点。此外，数值限定或范围内的所有值和子范围都被明确地包括在内，如同明确写出一样。
已经一般性地描述了本发明，通过参考某些具体实施例可以获得进一步的理解，这些实施例仅出于说明性目的而提供，并不旨在限制所主张保护的发明的范围。
实施例
间皮素(MSLN)是糖磷脂酰肌醇(GPI)连接的细胞表面蛋白，其通常在布满胸膜、腹膜和心包的间皮瘤细胞中表达。MSLN基因编码71kDa的前体蛋白，其被加工成称为MPF(巨核细胞强化因子)的31kDa的脱落蛋白(shed protein)和40kDa的膜结合蛋白间皮素。
据报道间皮素在几种类型的恶性肿瘤如恶性间皮瘤、卵巢癌、胰腺癌和肺腺癌中高度表达(Morello等人，2016；O’Hara等人，2016)。在一些情况下，间皮素表达已与肿瘤侵袭性升高和不良的临床结果相关。
在研究中使用的MSLN特异性CAR的描述
产生了由各自scFvs P4、meso1和MESO2组成的3种第二代CAR，其包含CD8α铰链/跨膜结构域和4-1BB和CD3ζ激活域，并通过原代mesoCAR+T细胞针对表达不同水平的间皮素(MSLN)的靶细胞系的活性，对嵌合抗原受体(CAR)表达和体外抗肿瘤活性进行筛选。在某些形式中，在CAR结构中引入自灭开关“R2”。“R2”多肽包括两个CD20模拟表位(Mimotope)，其位于scFv和铰链之间以赋予对抗CD20治疗抗体如利妥昔单抗的敏感性，如先前在WO2016120216中所述。
图1提供了CAR结构的示意图。
在表1、2和3中详细描述了包含在每个CAR中的不同序列，并且表4显示了其完整氨基酸序列。
1-体外测定
对于在来自PBMC的原代T细胞中的表达筛选CAR并分别测定它们对于表达不同水平的MSLN的3种靶细胞系的抗肿瘤活性：
-HeLa(
Figure BDA0003807266140000571
CCL-2)，上皮细胞宫颈腺癌，
-HPAC(
Figure BDA0003807266140000572
CRL-2119)，上皮细胞胰腺腺癌，和
-293H或A2058细胞间皮素阴性细胞。
如图3和4所示，通过流式细胞术评价了间皮素在这些细胞表面的表达。
2-基因编辑的MSLN-UCART细胞的产生
-在第0天，将来自Hemacare(Northridge，CA 91325，USA)的冻人外周血单核细胞(PBMC)融化、清洗、计数并在补充有5％AB血清的X-vivo 15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第1天，对PBMC计数，通过流式细胞术分析以评价CD3+细胞％，离心并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2和MACS GMP T Cell TransAct(每百万CD3+细胞60μl)的X-vivo15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第4天，将T细胞和具有编码抗MSLN CAR的多核苷酸序列的rLV载体在补充有5％AB血清和350UI/ml IL2的X-vivo 15培养基中再混悬，并在涂覆纤维连接蛋白(retronectin)的板上接种。然后，将板转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第5天，清洗T细胞并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2的X-vivo 15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-如先前所报道的，在第6天，将T细胞与编码TRAC TALEN和CD52 TALEN各自右臂和左臂的mRNA共电穿孔[Poirot等人.(2013)Blood.122(21):1661]，以使TCRα和CD52基因有效失活并防止TCRαβ在原代T细胞表面表达。TALEN是Cellectis(8,rue de la CroixJarry,75013Paris,France)设计的TALE核酸酶的登记名称。下表8中指明了这些TALE核酸酶的基因组靶序列。使用AgilePulse技术进行转染。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第7天，清洗T细胞并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2的X-vivo 15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第7/8天至第18天之间，使T细胞在GRex装置中扩增。当使用GRex 6多孔细胞培养板时，在第11天和第15天去掉一半培养基，并用含有IL2的新鲜培养基替换，并在第13天添加新鲜的IL2。当使用GRex 100M时，在第11天、第13天和第15天添加新鲜IL2且不进行任何培养基更换。在扩增期间，将细胞培养物在37℃，5％CO2下培育。
-在第18天，将全部UCART细胞冷冻保存以用于随后在体外和体内测定中使用。
表8：通过TALE核酸酶(TALEN)靶向的基因组序列
Figure BDA0003807266140000591
2.1 MSLN-CAR表达分析
将P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2 CAR用于产生3种MSLN特异性UCART细胞产物。然后，体外评估不同的UCART细胞产物。
在第18天对4种UCART细胞产物进行的第一体外研究旨在确定UCART细胞表型。为此目的，通过流式细胞术分析UCART细胞表面处的CAR和TCRαβ的表达以及UCART细胞的CAR+部分表面处的CD4和CD8表达。使用均识别CAR的scFv部分的加His标签的重组人间皮素蛋白或者生物素化的蛋白L，或者识别CAR的R2自灭开关部分的生物素化的利妥昔单抗评价CAR表面表达。使用PE-vio770缀合的抗TCRαβ抗体评估TCRαβ受体表面表达。使用FITC缀合的CD4和BV510缀合的CD8抗体评估CD4和CD8表面表达。
使用识别CAR的scFv部分的加His标签的重组人间皮素蛋白，或者识别CAR的R2自灭开关部分的生物素化的利妥昔单抗通过流式细胞术评估CAR表面表达。
如图6所示，至少50％的用P4-R2、Meso1-R2或MESO2-R2修饰的UCART细胞是CAR阳性的。然而，P4-R2 CAR显示出比Meso1-R2和MESO2-R2 CAR更高的表达水平。
如图7所示，至少51％的用P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2 CAR修饰的UCART细胞的CAR+部分是CD4+。
2.2 IFNg产生和杀伤活性
对3种UCART细胞产物进行的第二体外研究旨在分析UCART细胞功能。通过与HPAC(MSLN+)或293H(MSLN-)细胞共培养24小时，根据标准程序通过ELISA定量细胞培养上清液中的IFNg，评估了UCART细胞产生细胞因子的能力。
如图8所示，通过与MSLN+细胞系共培养，用P4-R2和Meso1-R2 CAR修饰的UCART细胞分别产生了超过40000pg/ml和50000pg/ml的IFNg，并且通过与MSLN-细胞系共培养，分别产生了小于1500和200pg/ml的IFNg。尽管在与MSLN+细胞系共培养时，用Meso1-R2 CAR修饰的UCART细胞产生了与用P4-R2 CAR修饰的UCART细胞类似水平的IFNg，但是与MSLN-细胞系培养时，具有Meso1-R2 CAR的细胞产生了极低水平的IFNg。与MSLN+细胞系共培养时，用MESO2-R2 CAR修饰的UCART细胞产生了不超过15000pg/ml的IFNg。
然后，在15天的时间段内评估了UCART细胞实施HPAC细胞连续杀伤的能力，其包括以1:2和1:8的比例对MSLN+(HPAC)细胞的6轮暴露。
如图9所示，在单轮暴露于HPAC细胞后，用P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2 CAR修饰的CART细胞显示出类似的杀伤活性水平。然而，通过几轮暴露，具有Meso1-R2和P4-R2的T细胞显示出比具有MESO2-R2CAR的CART细胞高得多的连续杀伤活性，而用Meso1-R2修饰的CART细胞显示出比用P4-R2修饰的那些更持续的活性。
重要地，这些CART细胞产物中无一显示出对间皮素阴性A2058和293H细胞的显著杀伤活性。
3.UCART MSLN细胞遗传属性的功能性验证
3.1 TRAC和/或CD52基因的敲除
如图10所示，小于20％的用P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2 CAR修饰的UCART细胞保持TCRαβ+，这表明在细胞群体中TCRα基因的TALEN介导的失活水平是非常有效的。
此外，根据图11所提供的流式细胞术数据，TCRαβ+的耗尽是除去非工程化细胞和选择[CAR]+[TCR]-UCART细胞的有效步骤：与TRAC基因敲除的T细胞的8％以及TRAC基因敲除且在TCRαβ+细胞中耗尽的T细胞的0.2％相比，84％的非工程化T细胞是TCRαβ+。
为了完全证实TRAC基因敲除且在TCRαβ+细胞中耗尽的细胞表面处的TCRαβ受体检测的不存在与功能性TCRαβ受体表达的不存在有关，将非工程化T细胞、TRAC基因敲除的T细胞和TRAC基因敲除并在TCRαβ+细胞中耗尽的T细胞暴露于植物血球凝集素(PHA)24小时并通过流式细胞术分析以监测激活标志物CD25的表达。
如图12所示，在暴露于PHA时，仅非工程化T细胞在它们的表面表达显著水平的CD25。这些数据清楚地证实T细胞中TRAC基因的敲除防止功能性TCRαβ受体在细胞表面的表达。
在具有或不具有30％兔补体(Cedarlane)的50μg/ml抗CD52单克隆抗体(或者作为对照的大鼠IgG)中培养7天后，通过培育工程细胞评价CD52基因的失活。在37℃培育2小时后，用荧色物缀合的抗CD52抗体以及荧光存活力染料(eBioscience)标记细胞并通过流式细胞术分析以测量活细胞中CD52阳性和CD52阴性细胞的频率。另一方面，将细胞与抗体一起培养以选择抗性。
3.2通过使用针对R2多肽的利妥昔单抗的UCART细胞耗尽
对UCART细胞产物进行的另一项体外研究旨在评估UCART细胞的CAR+部分在用利妥昔单抗处理时将耗尽的能力。
将用P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2 CAR修饰的UCART细胞与HPAC细胞共培养2天，暴露于培养基、利妥昔单抗(RTX)、婴儿兔补体(BRC)或者利妥昔单抗和婴儿兔补体的混合物2小时，并通过流式细胞术分析以监测CAR+细胞的百分比。如图13所示，用利妥昔单抗和婴儿兔补体处理时，用P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2修饰的UCART细胞将有效耗尽。相反，用裸P4(P4-naked)(具有P4结构但无R2序列的MSLN CAR)修饰的UCART细胞未耗尽。
3.3 CAR T细胞中TGFβ信号转导通路的失活
提供给MesoCAR T细胞的另一种属性是通过使TGFb信号转导通路失活来耐受肿瘤微环境。研究了两种不同的策略，即通过敲除或通过过表达TGFbRII基因的显性失活形式(dnTGFbRII)使TGFbRII基因表达失活。
3.3.1.通过KO的TGFbRII失活
用10μg编码两个靶向TGFbRII基因(pCLS32939)和SEQ ID NO：156(pCLS32940)或者SEQ ID NO：157(pCLS32967)和SEQ ID NO：158(pCLS32968))的TALEN(SEQ ID NO：155的右臂和左臂的mRNA电穿孔激活的T细胞。转染后3天，收获T细胞，提取gDNA并进行PCR以扩增扩增子。通过深度测序分析PCR产物并且结果显示用通过pCLS32939和pCLS32940编码的TALEN或者通过pCLS32967和pCLS32968编码的TALEN的转染分别显示出96.62％和97.28％的基因编辑(即插入和/或缺失)，从而证实了TGFbRII KO的高效率。
3.3.2.通过dnTGFbRII过表达的TGFbRII失活
使用两种不同的供体并且使用编码不同的MSLN CAR且具有或不具有通过2A切割肽分隔的dnTGFbRII(SEQ ID NO：24)的rLV载体如实施例2所述产生MSLN-CAR T细胞。在产生过程后，将不同的MSLN-CAR T细胞融化，并以300万个细胞/ml与70UI/ml IL-2一起接种。融化后一天，将细胞暴露于5ng/ml TGFb(R&D systems)。1小时后，通过用生物素化的重组间皮素蛋白(LakePharma)和亮紫421抗生蛋白链菌素(BD)对细胞进行细胞表面染色，将细胞对于CAR表达染色。另外，根据供应商的说明，用PE缀合的抗磷酸SMAD2/3(BD)进行MSLN-CAR T细胞的胞内染色。通过流式细胞术分析细胞，并且确定CAR阳性或CAR阴性亚群中的磷酸化SMAD2/3状态(图14)。结果证实在不存在dnTGFbRII时，细胞对于SMAD2/3的磷酸化是阳性的(图14，左图)，而在存在dnTGFbRII时，仅CAR阳性细胞可以显示出SMAD2/3磷酸化减少(图14，右图)。这些结果显示TGFb信号转导可能在表达dnTGFbRII的MSLN-CART细胞中受损。
4-体内实验
实施了初步体内研究以定义和证实动物/肿瘤模型和CAR T细胞的给予途径。将在NSG小鼠中皮下(SC)注射的HPAC肿瘤细胞选择作为用于评估表达3种所选的mesoCAR构建体的T细胞的体内抗肿瘤活性的动物/肿瘤模型。尽管就细胞表面的表达水平、细胞毒性和IFNγ分泌而言，meso1-R2较低，但是这在研究中得到了保留，并将其与P4-R2和MESO2-R2 CAR相比较。
然后，评估表达mesoCAR候选和P4-CAR的人T细胞它们的体内抗肿瘤活性。简言之，向NSG小鼠植入MSLN+细胞系(HPAC细胞，SC注射)，然后用mesoCAR+T细胞处理(IV注射，3种剂量)。通过监测肿瘤生长评价mesoCAR+T细胞活性。
所评估的3种mesoCAR+T细胞以不同的活性水平显示出对HPAC肿瘤细胞的体内抗肿瘤活性。与所评估的其它mesoCAR+T细胞相比，表达MESO2-R2 CAR的T细胞显示出较低的活性。
4.1动物模型选择的依据
由于mesoCAR+T细胞的人特异性，标准免疫活性动物模型中的研究由于通过异种免疫反应的人T细胞的快速靶向和除去而不适用。所选的动物模型是高度免疫缺陷的NSG小鼠株(来自Jackson laboratory的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ株)，因为它允许人MSLN+肿瘤细胞和人CAR T细胞两者的移植。
4.2动物/肿瘤模型的建立
4.2.1 Hela和HPAC移植
在本研究中使用了两种间皮素表达肿瘤细胞系：HeLa(
Figure BDA0003807266140000631
CCL-2)，上皮细胞宫颈腺癌，和HPAC(
Figure BDA0003807266140000632
CRL-2119)，上皮细胞胰腺腺癌。该第一研究的目的在于评估NSG小鼠(6-8周大)皮下(SC)注射后，HeLa和HPAC细胞的肿瘤成瘤(tumor take)和肿瘤生长参数。
简言之，在第0天，将小鼠根据它们的个体体重随机分成4组，每组6只小鼠并接受HeLa(1×106或10×106个细胞/小鼠)或者HPAC细胞(2×106或10×106个细胞/小鼠)的SC注射。根据文献[Abate-Daga,D.等人.(2014).A Novel Chimeric Antigen ReceptorAgainst Prostate Stem Cell Antigen Mediates Tumor Destruction in a HumanizedMouse Model of Pancreatic.Cancer.Hum.Gene Ther；Arjomandnejad等人.(2014)Helacell line xenograft tumor as a suitable cervical cancer model:Growth kineticcharacterization and immunohistochemis-try array.Arch.Iran.Med.；Kusakawa等人.(2015)Characterization of invivo tumorigenicity tests using severeimmunodeficient NOD/Shi-scid IL2Rγnull mice for detection of tumorigeniccellular impurities in human cell-processed therapeutic products.Regen.Ther.]选择肿瘤细胞的量。
每天监测体重、存活力和行为。一周测量三次肿瘤体积。在第61天(研究结束)终止存活的小鼠。对本研究中所有终止的动物，并且如果可能，对所有安乐死的垂死或已死的动物进行尸体检剖(宏观检查)。
HPAC和Hela肿瘤两者在NSG小鼠中生长。HPAC肿瘤的生长比Hela肿瘤更快。注射1×106和10×106个HeLa细胞的小鼠的平均肿瘤体积V(500mm3)分别为519mm3和498mm3，其平均达到时间为55天和49天。注射2×106和10×106个HPAC细胞的小鼠的平均肿瘤体积V(500mm3)分别为557mm3和500mm3，其平均达到时间为24天和23天。
4.2.2 NSG小鼠中Hela和HPAC肿瘤上的间皮素表达
第二研究的目标在于在NSG小鼠中在肿瘤细胞皮下注射和生长后评估HPAC和Hela肿瘤两者中间皮素的表达水平。
简言之，在第0天，将小鼠根据它们的个体体重随机分成2组，每组3只小鼠并接受HeLa(10×106个细胞/小鼠)或者HPAC细胞(2×106个细胞/小鼠)的SC注射。每天监测体重、存活力和行为。一周测量三次肿瘤体积。当肿瘤体积达到300-500mm3时，收集肿瘤。通过间皮素表达的免疫组织化学(IHC)分析来分析肿瘤样品。在第63天(研究结束)处死最后的小鼠。
HPAC和Hela肿瘤两者在NSG小鼠中生长。如在先前研究中所观察到的，HPAC肿瘤的生长比Hela肿瘤更快。注射HeLa细胞或HPAC细胞的小鼠分别在40天和28天达到300mm3的平均肿瘤体积。
另外，对小鼠上收集的肿瘤使用IHC检查了肿瘤细胞上间皮素的表达。两种肿瘤表达间皮素。
基于这些确认数据，决定使用HPAC细胞(2×106个细胞，SC注射)来评估mesoCAR+T细胞的抗肿瘤活性。
4.2.3 HPAC-luc-GFP肿瘤细胞移植
通过Cellectis产生了表达荧火虫荧光素酶和GFP(HPAC-luc-GFP)的HPAC细胞，并且如前所述评估了NSG小鼠中HPAC-luc-GFP细胞的肿瘤成瘤和肿瘤生长。
简言之，在第0天，3只小鼠接受HPAC-luc-GFP细胞(2×106个细胞/小鼠)的SC注射。每天监测体重、存活力和行为。每周测量三次肿瘤体积，并且在第7天、第14天和第24天进行生物发光成像。每天监测存活力和行为。
由于这些条件提供了对于该测定的敏感性，因此决定使用野生型HPAC细胞(SC注射，2×106个细胞/小鼠)来评估mesoCAR+T细胞的体内活性。
4.3 UCARTmeso候选对NSG小鼠中HPAC肿瘤的抗肿瘤活性的评估
本研究的目的在于使用初步研究所定义的处理条件，比较3种UCARTmeso候选(P4-R2、MESO2-R2和meso1-R2)在具有皮下HPAC肿瘤的NSG小鼠中的抗肿瘤活性。评估了3种CAR+T细胞剂量(1、3和10×106个CAR阳性细胞/小鼠)。
使用来自相同供体的PBMC产生了UCARTmeso和对照T细胞。未对TCRαβ阴性细胞纯化UCARTmeso和对照T细胞。所使用的T细胞的特性在表9中。
表9：本研究中所使用的T细胞的特性。
Figure BDA0003807266140000651
第18天：生产过程结束(冷冻前)；
％CAR+：在第18天，相对于CD45+的％CD45+/CAR+(对于P4-R2 CAR使用重组MSLN蛋白并且对于Meso1-R2和MESO2-R2 CAR使用L-蛋白，通过流式细胞术测量)
％CD4+：在第18天，相对于CD45+的％CD45+/CAR+/CD4+
％CD8+：在第18天，相对于CD45+的％CD45+/CAR+/CD8+
％TCRαβ-：在第18天，相对于CD45+的％CD45+/TCRαβ-
简言之，在第7天，85只NSG小鼠接受HPAC肿瘤细胞(2×106个细胞/小鼠)的皮下注射。在第0天，将80只具有肿瘤的小鼠根据肿瘤体积随机分成16组，每组5只小鼠。
在第0天(对于组1至15)或者在第12天(对于组16)注射人T细胞(UCARTmeso细胞和对照中KO TRAC/NT细胞)。对于UCARTmeso细胞，根据批次中CAR阳性细胞百分比定义所注射的细胞总数，以对每只小鼠注射指定数目的CAR阳性细胞(1、3或10×106个CAR阳性细胞)。
通过测量肿瘤体积评估UCARTmeso候选CAR(P4-R2、Meso1-R2和MESO2-R2)的抗肿瘤活性(图15、16和17)。所有UCARTmeso细胞显示出抗肿瘤活性，尽管不同CAR T细胞之间的活性水平不同。
如图18所示，在高剂量(10×106)，对于所有CAR候选观察到抗肿瘤活性。3×106个MESO2-R2 CAR+细胞不能控制HPAC肿瘤生长。
结论
已建立了允许评估靶向间皮素的CAR T细胞的抗肿瘤活性的动物/肿瘤模型和处理条件。使用该动物模型体内评估了3种CAR候选MESO2-R2、Meso1-R2和P4-R2)的活性，并且所有CAR T细胞显示出对HPAC细胞的抗肿瘤活性。
然而，与表达Meso1-R2的CAR+T细胞相比，MESO2-R2 CAR+T细胞的活性较低。
在具有所选属性(R2自灭开关和TRAC KO)的CAR T细胞中，Meso1-R2 CAR T细胞候选在3个所评估的剂量下显示出最高的体内活性。
4.4-表达dnTGFBRII的UCARTmeso候选的抗肿瘤活性的评估
本研究的目的在于比较NSG小鼠中还表达dnTGFBRII的2个UCARTmeso候选(P4-R2、MESO1-R2)的抗肿瘤活性。简言之，在第0天，每组4至6只小鼠接受HPAC细胞(2×106个细胞/小鼠)的SC注射。每天监测体重、存活力和行为。一周测量三次肿瘤体积。每天监测存活力和行为。
利用来自相同供体的PBMC产生所有表达dnTGFBRII的UCARTmeso，并且评估了2个CAR+T细胞剂量(3和10×106个CAR阳性细胞/小鼠)。
通过测量肿瘤体积评估了表达dnTGFBRII的UCARTmeso候选(P4-R2、MESO1-R2)的抗肿瘤活性(图19)。两种UCARTmeso细胞显示出抗肿瘤活性，尽管具有不同的活性水平，其中MESO1构建体显示出更好的抗肿瘤活性。
5-对于靶向间皮素的UCART(UCART MESO)的TGFBRII基因失活(KO TGFBRII)和 dnTGFBRII基因过表达方法的比较
本研究所提供的工作旨在比较TGFBRII KO和dnTGFBRII基因过表达方法并选择对于UCART MESO的最佳方法。
为了实施本研究，产生并测试了6类基因修饰的T细胞(如表10所定义)。
表10：对研究所产生的6类基因修饰的T细胞的描述。
Figure BDA0003807266140000671
5.1不同UCART MESO的产生
-在第0天，将来自Hemacare(Northridge，CA91325，USA)的冻人外周血单核细胞(PBMC)融化、清洗、计数并在补充有5％AB血清的X-vivo 15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第1天，对PBMC计数，通过流式细胞术分析以评价CD3+细胞％，离心并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2和MACS GMP T Cell TransAct(每百万CD3+细胞60μl)的X-vivo15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第4天，将T细胞和具有编码不同的抗间皮素CAR P4-CAR(SEQ ID NO：161)和MESO1 CAR(SEQ ID NO：22)的多核苷酸序列且具有或不具有dnTGFBRII基因(SEQ ID NO：24)的rLV载体在补充有5％AB血清和350UI/ml IL2的X-vivo 15培养基中再混悬，并在涂覆纤维连接蛋白的板上接种。然后，将板转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第5天，清洗T细胞并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2的X-vivo 15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第6天，用编码TRAC TALEN的右臂和左臂的mRNA且用或不用编码TGFBRIITALEN的右臂和左臂的mRNA(SEQ ID NO：157和SEQ ID NO：158)对T细胞电穿孔。使用AgilePulse技术进行转染。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第7天，清洗T细胞并在补充有5％AB血清、350UI/ml IL2的X-vivo15培养基中再混悬。然后，将细胞转移至设置为37℃，5％CO2的培育箱中。
-在第7/8天至第18天之间，使T细胞在GRex装置中扩增。在扩增期间，将细胞培养物在37℃，5％CO2下培育并不时更换培养基。
-在第18天，将全部UCART细胞冷冻保存以用于随后在体外和体内测定中使用。
5.2 UCART细胞群体的评估
在第18天，通过流式细胞术分析UCART。使用识别CAR的scFv部分以及PE缀合的抗生蛋白链菌素的生物素化的重组间皮素蛋白评估CAR表面表达。使用抗TGFBRII(来自Abcam)和APC缀合的抗小鼠IgG抗体评估dnTGFBRII。使用FITC缀合的CD4和BV510缀合的CD8抗体评估CD4和CD8表面表达。另外，使用缀合至PECy7的抗CD62L和与APC偶联的抗CD45RA分析CAR+CD4+或者CAR+CD8+阳性细胞中UCART细胞的干性。
如图20A所示，对于P4的表达检测到58％的UCART细胞并且对于MESO1的表达检测到37％的UCART细胞。另外，当用P4-dnTGFBRII和MESO1-dnTGFBRII构建体转导时，在32％和17％的UCART细胞中检测到dnTGFBR2。这些结果可以反映位于2A肽和CAR下游的dnTGFBRII的低表达。
有趣地，在CAR阳性细胞中，当UCART细胞表达P4 CAR构建体时，CD8+阳性细胞的百分比在27％至35％之间改变。然而，当表达MESO1构建体时，CD8+细胞(在CAR阳性细胞中)的百分比在36％至51％之间改变(图20B)。
另外，干性分析显示在CAR+CD4+细胞中(图21A)，使用P4CAR，未处理过的T细胞(Tn)和T记忆干细胞(Tscm)在1％至3％之间变化，然而在表达MESO1 CAR的T细胞中，该亚型较高并在6％左右变化。还在CAR+CD8+细胞中在较低程度上观察到了这种作用，因为使用P4或MESO1构建体，这种T细胞亚型分别在15％至19％之间或者19％至22％之间变化(图21B)。
这些结果证实即使较少表达或检测，与P4CAR相比，MESO1 CAR导致了更高比例的CD8+(即细胞毒的)和更高比例的Tn和Tscm亚型。重要地，通过dnTGFBRII构建体的过表达或者通过KO的TGFBRII的失活对分析的任何表型无影响。
5.3 UCART的细胞毒性和IFNγ产生的评估
在后融化恢复阶段16小时之后，将表9所示基因修饰的T细胞与H226-Luc/GFP细胞以1:3、1:1、3:1、10:1的效应因子比靶标(E:T)比混合。然后，将共培养物在37℃培育过夜，并且测量生物发光以定量H226细胞的溶胞。作为另外一种选择，在后融化恢复阶段之后，将这些基因修饰的T细胞在培养基中再混悬并以200000个细胞/孔的密度在96孔未处理或先前用75ng/孔的加His标签的重组间皮素蛋白涂覆的板中接种。在24小时培育期之后，收集细胞上清液并通过ELISA分析以定量IFNg的产生。
如图22所示，与表达P4的UCART相比，表达MESO1的UCART可以在最低剂量(1:3和1:1比例)下诱导更高的细胞毒性。
图23A证实重组间皮素蛋白能够在所产生的所有UCAR T中诱导IFNg分泌。这种产生在40,000至多达90,000pg/ml之间改变，并且无法观察到CAR构建体或TGFB通路抑制的明显影响。然而，当分析在不存在重组间皮素的情况下IFNg的分泌时(图23B)，意外地，MESO1CAR构建体产生比P4构建体少的IFNg。该结果表明在不存在抗原的情况下，表达MESO1 CAR构建体的UCART细胞受到的刺激较低，这意味着MESO1CAR具有降低的“自激活”。这是治疗背景中的重要性质，因为“自激活”往往会使CAR T细胞耗竭。
5.4 TGFb敏感性的评估
为了确定通过KO或通过dnTGFBRII过表达的TGFB通路失活的影响，将表9所述的基因修饰的T细胞暴露于TGFb 1小时并通过流式细胞术分析以评估CAR阳性细胞中pSMAD2/3阳性细胞相对于pSMAD2/3阴性细胞的分数。在另一组实验中，将所产生的UCART细胞在存在或不存在TGFb的情况下暴露于重组间皮素蛋白并在7天后计数以评价增殖。
图24A显示在无TGFb通路抑制的情况下，UCART细胞中超过95％的CAR阳性部分是pSMAD2/3阳性的。当通过dnTGFBRII过表达抑制时，67％和60％的表达P4或MESO1构建体的UCART的CAR阳性部分为pSMAD2/3阴性的。有趣地，当表达P4或MESO1构建体时，通过KO失活分别导致85％和83％的pSMAD2/3阴性细胞。该结果证实TGFBRII KO具有更强的降低SMAD2/3磷酸化的能力。
图24B显示TGFb能够以相同程度抑制表达P4或MESO1构建体的UCART的抗原介导的增殖。重要地，通过KO或dnTGFBRII过表达的TGFB通路抑制能够降低或甚至消除这种抑制。
序列表
<110> 塞勒克提斯公司（Cellectis）
<120> 用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体（CAR）
<130> P81905747PCT00
<150> PA201970835
<151> 2019-12-23
<160> 161
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P4重链可变区
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly
115 120 125
<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P4轻链可变区
<400> 2
Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
100 105 110
Thr Val Leu Ser
115
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRH1- meso1
<400> 3
Ser Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 4
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRH2- meso1
<400> 4
Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRH3- meso1
<400> 5
Val Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Ile
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRL1- meso1
<400> 6
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu His
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRL2- meso1
<400> 7
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 8
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CDRL3- meso1
<400> 8
Leu Gln His Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 9
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso1重链可变区
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Val Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso1轻链可变区
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Tyr Ser Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso2重链可变区
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Met Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly His Gly Met Tyr Gly Gly Ala Leu Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 12
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso2轻链可变区
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser
20 25 30
Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Asp Pro
85 90 95
Ser Gly Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
100 105 110
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 接头
<400> 13
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CD8&#945; 信号肽
<400> 14
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 40
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> R2自灭开关
<400> 15
Ser Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro
1 5 10 15
Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser
20 25 30
Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40
<210> 16
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CD8&#945; 铰链
<400> 16
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 17
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CD8&#945; 跨膜结构域
<400> 17
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 18
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 4-1BB共刺激结构域
<400> 18
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 19
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> CD3&#950; 信号转导结构域
<400> 19
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 20
<211> 542
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P4-R2 CAR完整序列
<400> 20
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro
50 55 60
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro
85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ile Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165 170 175
Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn
180 185 190
Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro
195 200 205
Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly
210 215 220
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp
245 250 255
Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly
260 265 270
Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Ser Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly
275 280 285
Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser
290 295 300
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr
305 310 315 320
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
325 330 335
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
340 345 350
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
355 360 365
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
370 375 380
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
385 390 395 400
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
405 410 415
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
420 425 430
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
435 440 445
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
450 455 460
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
465 470 475 480
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
485 490 495
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
500 505 510
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
515 520 525
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535 540
<210> 21
<211> 522
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso1-R2 CAR完整序列
<400> 21
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Ile Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
210 215 220
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Leu Gln His Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Ser Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr
260 265 270
Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser
275 280 285
Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala
290 295 300
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
305 310 315 320
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
325 330 335
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
340 345 350
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
355 360 365
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
370 375 380
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
385 390 395 400
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
405 410 415
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
420 425 430
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
435 440 445
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
450 455 460
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
465 470 475 480
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
485 490 495
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
500 505 510
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
515 520
<210> 22
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso1 CAR完整序列
<400> 22
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
65 70 75 80
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
85 90 95
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Asp Tyr Lys Ala Phe Asp Ile Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
165 170 175
Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
180 185 190
Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
195 200 205
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr
210 215 220
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Leu Gln His Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val
245 250 255
Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
275 280 285
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
290 295 300
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
305 310 315 320
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
325 330 335
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
340 345 350
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
355 360 365
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
370 375 380
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
385 390 395 400
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
405 410 415
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
420 425 430
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
435 440 445
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
450 455 460
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
465 470 475 480
Pro Arg
<210> 23
<211> 531
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> meso2-R2完整序列
<400> 23
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr
35 40 45
Ser Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Met Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Arg
65 70 75 80
Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser
85 90 95
Ile Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr
100 105 110
Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Gly His Gly Met Tyr Gly Gly Ala
115 120 125
Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val
145 150 155 160
Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala
165 170 175
Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Ser Ser Arg Leu Ala
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly
195 200 205
Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp
225 230 235 240
Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser His Asp Pro Ser Gly Thr
245 250 255
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Ser Asp Pro Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser
275 280 285
Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
290 295 300
Gly Gly Gly Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
305 310 315 320
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
325 330 335
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
340 345 350
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
355 360 365
Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
370 375 380
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
385 390 395 400
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
405 410 415
Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
420 425 430
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
435 440 445
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
450 455 460
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
465 470 475 480
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
485 490 495
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
500 505 510
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
515 520 525
Pro Pro Arg
530
<210> 24
<211> 199
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 显性失活dnTGF&#946;RII
<400> 24
Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu
1 5 10 15
Trp Thr Arg Ile Ala Ser Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val
20 25 30
Asn Asn Asp Met Ile Val Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro
35 40 45
Gln Leu Cys Lys Phe Cys Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln
50 55 60
Lys Ser Cys Met Ser Asn Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro
65 70 75 80
Gln Glu Val Cys Val Ala Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Thr Val Cys His Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile
100 105 110
Leu Glu Asp Ala Ala Ser Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys
115 120 125
Pro Gly Glu Thr Phe Phe Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn
130 135 140
Asp Asn Ile Ile Phe Ser Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu
145 150 155 160
Leu Leu Val Ile Phe Gln Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu
165 170 175
Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn
180 185 190
Arg Gln Gln Lys Leu Ser Ser
195
<210> 25
<211> 291
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> MSLN靶抗原区
<400> 25
Glu Val Glu Lys Thr Ala Cys Pro Ser Gly Lys Lys Ala Arg Glu Ile
1 5 10 15
Asp Glu Ser Leu Ile Phe Tyr Lys Lys Trp Glu Leu Glu Ala Cys Val
20 25 30
Asp Ala Ala Leu Leu Ala Thr Gln Met Asp Arg Val Asn Ala Ile Pro
35 40 45
Phe Thr Tyr Glu Gln Leu Asp Val Leu Lys His Lys Leu Asp Glu Leu
50 55 60
Tyr Pro Gln Gly Tyr Pro Glu Ser Val Ile Gln His Leu Gly Tyr Leu
65 70 75 80
Phe Leu Lys Met Ser Pro Glu Asp Ile Arg Lys Trp Asn Val Thr Ser
85 90 95
Leu Glu Thr Leu Lys Ala Leu Leu Glu Val Asn Lys Gly His Glu Met
100 105 110
Ser Pro Gln Ala Pro Arg Arg Pro Leu Pro Gln Val Ala Thr Leu Ile
115 120 125
Asp Arg Phe Val Lys Gly Arg Gly Gln Leu Asp Lys Asp Thr Leu Asp
130 135 140
Thr Leu Thr Ala Phe Tyr Pro Gly Tyr Leu Cys Ser Leu Ser Pro Glu
145 150 155 160
Glu Leu Ser Ser Val Pro Pro Ser Ser Ile Trp Ala Val Arg Pro Gln
165 170 175
Asp Leu Asp Thr Cys Asp Pro Arg Gln Leu Asp Val Leu Tyr Pro Lys
180 185 190
Ala Arg Leu Ala Phe Gln Asn Met Asn Gly Ser Glu Tyr Phe Val Lys
195 200 205
Ile Gln Ser Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Glu Asp Leu Lys Ala Leu
210 215 220
Ser Gln Gln Asn Val Ser Met Asp Leu Ala Thr Phe Met Lys Leu Arg
225 230 235 240
Thr Asp Ala Val Leu Pro Leu Thr Val Ala Glu Val Gln Lys Leu Leu
245 250 255
Gly Pro His Val Glu Gly Leu Lys Ala Glu Glu Arg His Arg Pro Val
260 265 270
Arg Asp Trp Ile Leu Arg Gln Arg Gln Asp Asp Leu Asp Thr Leu Gly
275 280 285
Leu Gly Leu
290
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 模拟表位R2 (利妥昔单抗)
<400> 26
Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys
1 5
<210> 27
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 帕利珠单抗表位
<400> 27
Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp
1 5 10 15
Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn
20
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 西妥昔单抗表位 1
<400> 28
Cys Gln Phe Asp Leu Ser Thr Arg Arg Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 西妥昔单抗表位 2
<400> 29
Cys Gln Tyr Asn Leu Ser Ser Arg Ala Leu Lys Cys
1 5 10
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 西妥昔单抗表位 3
<400> 30
Cys Val Trp Gln Arg Trp Gln Lys Ser Tyr Val Cys
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 西妥昔单抗表位 4
<400> 31
Cys Met Trp Asp Arg Phe Ser Arg Trp Tyr Lys Cys
1 5 10
<210> 32
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 纳武单抗表位 1
<400> 32
Ser Phe Val Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp
1 5 10 15
Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg
20 25
<210> 33
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 纳武单抗表位 2
<400> 33
Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln
1 5 10 15
Ile Lys Glu
<210> 34
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> QBEND-10 表位
<400> 34
Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser
1 5 10 15
Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala
20
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 阿仑珠单抗表位
<400> 35
Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 49
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T003387靶序列TGFbetaRII
<400> 36
ttttgtttcc ccatcagaat ataacaccag caatcctgac ttgttgcta 49
<210> 37
<211> 49
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T003401靶序列TGFbetaRII
<400> 37
tccctatgag gagtatgcct cttggaagac agagaaggac atcttctca 49
<210> 38
<211> 49
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T003400靶序列TGFbetaRII
<400> 38
tccctatgag gagtatgcct cttggaagac agagaaggac atcttctca 49
<210> 39
<211> 49
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> T003405靶序列TGFbetaRII
<400> 39
tgtgggaggc ccaagatgcc catcgtgcac agggacctca agagctcca 49
<210> 40
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 40
acagtgatca cactccatgt ggg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 41
gcagaagctg agttcaacct ggg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 42
aggttaggtc gttcttcacg agg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 43
aaagcgacct ttccccacca ggg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 44
tggatgacct ggctaacagt ggg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 45
cctgggaaac cggcaagacg cgg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 46
acagatatgg caactcccag tgg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 47
gtggaggtga gcaatccccc ggg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 48
acctacagga gtacctgacg cgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 49
gtgatcacac tccatgtggg agg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 50
gctggtgtta tattctgatg ggg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 51
cacagtgatc acactccatg tgg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 52
cacatggagt gtgatcactg tgg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 53
cagagtaggg tccagacgca ggg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 54
gcttctgctg ccggttaacg cgg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 55
gtggatgacc tggctaacag tgg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 56
gggaaagccc aaagtcacac agg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 57
aatatgacta gcaacaagtc agg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 58
atggagtgtg atcactgtgg agg 23
<210> 59
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 59
atcaccgcct tccacgccaa ggg 23
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 60
aggagcggaa gacggagttg ggg 23
<210> 61
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 61
ccacgccaag ggcaacctac agg 23
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 62
caagatgccc atcgtgcaca ggg 23
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 63
gatatggcaa ctcccagtgg tgg 23
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 64
agcagaagct gagttcaacc tgg 23
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 65
cctgtaggtt gcccttggcg tgg 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 66
gtgagcaatc ccccgggcga ggg 23
<210> 67
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 67
acagagtagg gtccagacgc agg 23
<210> 68
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 68
tagcaacaag tcaggattgc tgg 23
<210> 69
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 69
ccaagatgcc catcgtgcac agg 23
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 70
tgtggaggtg agcaatcccc cgg 23
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 71
tgcctcttgg aagacagaga agg 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 72
gcccattgag ctggacaccc tgg 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 73
ctgagttcaa cctgggaaac cgg 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 74
tgggaggacc tgcgcaagct ggg 23
<210> 75
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 75
gtactcctgt aggttgccct tgg 23
<210> 76
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 76
tcttccgctc ctcagccgtc agg 23
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 77
ctgggcagct ccctcgcccg ggg 23
<210> 78
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 78
cattgagctg gacaccctgg tgg 23
<210> 79
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 79
tggcaactcc cagtggtggc agg 23
<210> 80
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 80
caactcccag tggtggcagg agg 23
<210> 81
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 81
cgagcactgt gccatcatcc tgg 23
<210> 82
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 82
gcggtcatct tccaggatga tgg 23
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 83
agagctgctg cccattgagc tgg 23
<210> 84
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 84
accagggtgt ccagctcaat ggg 23
<210> 85
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 85
ctggacaccc tggtggggaa agg 23
<210> 86
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 86
caaagcgacc tttccccacc agg 23
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 87
gacggctgag gagcggaaga cgg 23
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 88
tactctgtct gtggatgacc tgg 23
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 89
cggcaagacg cggaagctca tgg 23
<210> 90
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 90
cccaaagtca cacaggcagc agg 23
<210> 91
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 91
taggttgccc ttggcgtgga agg 23
<210> 92
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 92
tgaggagcgg aagacggagt tgg 23
<210> 93
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 93
cctgtgcacg atgggcatct tgg 23
<210> 94
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 94
gggagctgcc cagcttgcgc agg 23
<210> 95
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 95
ttgaactcag cttctgctgc cgg 23
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 96
ccaagaggca tactcctcat agg 23
<210> 97
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 97
catgagcttc cgcgtcttgc cgg 23
<210> 98
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 98
cggagttggg gaaacaatac tgg 23
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 99
gctcctcagc cgtcaggaac tgg 23
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 100
caccagggtg tccagctcaa tgg 23
<210> 101
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 101
ctagtcatat ttcaagtgac agg 23
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 102
gctgggcagc tccctcgccc ggg 23
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 103
tgtcagagcg gtcatcttcc agg 23
<210> 104
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 104
ctgggaggac ctgcgcaagc tgg 23
<210> 105
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 105
agctgggcag ctccctcgcc cgg 23
<210> 106
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 106
tgtgttgtgg ttgatgttgt tgg 23
<210> 107
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 107
cctgctgcct gtgtgacttt ggg 23
<210> 108
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 108
acctgctgcc tgtgtgactt tgg 23
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 109
gacgcggcat gtcatcagct ggg 23
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 110
ggtcatccac agacagagta ggg 23
<210> 111
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 111
agtcaagatc tttccctatg agg 23
<210> 112
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 112
gaacatactc cagttcctga cgg 23
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 113
acgtggagct gatgtcagag cgg 23
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 114
ggggaaaggt cgctttgctg agg 23
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 115
tctggaccct actctgtctg tgg 23
<210> 116
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 116
tgggcagctc cctcgcccgg ggg 23
<210> 117
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 117
agctgatgac atgccgcgtc agg 23
<210> 118
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 118
gccgcgtcag gtactcctgt agg 23
<210> 119
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 119
caagaggcat actcctcata ggg 23
<210> 120
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 120
ggtgagcaat cccccgggcg agg 23
<210> 121
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 121
ttgctggtgt tatattctga tgg 23
<210> 122
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 122
cctatgagga gtatgcctct tgg 23
<210> 123
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 123
tgctggtgtt atattctgat ggg 23
<210> 124
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 124
cgaggatatt ggagctcttg agg 23
<210> 125
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 125
gttgatgttg ttggcacacg tgg 23
<210> 126
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 126
tgacgcggca tgtcatcagc tgg 23
<210> 127
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 127
ttgagctgga caccctggtg ggg 23
<210> 128
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 128
ttcagagcag tttgagacag tgg 23
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 129
gcggcatgtc atcagctggg agg 23
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 130
aggtcatcca cagacagagt agg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 131
gaagatgatg atgacagata tgg 23
<210> 132
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 132
tgacctggct aacagtgggc agg 23
<210> 133
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 133
tctactgcta ccgcgttaac cgg 23
<210> 134
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 134
gtccttctct gtcttccaag agg 23
<210> 135
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 135
attgagctgg acaccctggt ggg 23
<210> 136
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 136
gtcgttcttc acgaggatat tgg 23
<210> 137
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 137
catcagcctc ctgccaccac tgg 23
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 138
agttcctgac ggctgaggag cgg 23
<210> 139
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 139
actccagttc ctgacggctg agg 23
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 140
cttgaggtcc ctgtgcacga tgg 23
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 141
ttgaggtccc tgtgcacgat ggg 23
<210> 142
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 142
ccgcgtcttg ccggtttccc agg 23
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 143
gttgcccttg gcgtggaagg cgg 23
<210> 144
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 144
ctttgggctt tccctgcgtc tgg 23
<210> 145
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 145
gatcaccgcc ttccacgcca agg 23
<210> 146
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 146
tgaagtgttc tgcttcagct tgg 23
<210> 147
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 147
ctgtgcacga tgggcatctt ggg 23
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 148
ggcatcttgg gcctcccaca tgg 23
<210> 149
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 149
ttacctgccc actgttagcc agg 23
<210> 150
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 150
atcagcctcc tgccaccact ggg 23
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 151
tcgctttgct gaggtctata agg 23
<210> 152
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 152
agtcacacag gcagcaggtt agg 23
<210> 153
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 153
gaggagcgga agacggagtt ggg 23
<210> 154
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 对于TGF&#946的CRISPR靶序列;RII基因
<400> 154
tgggcagcag ctctgtgttg tgg 23
<210> 155
<211> 2781
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> R-TALEN TGFbRII pCLS32939
<400> 155
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc 60
tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac 120
cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac 180
ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag 240
gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag 300
gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa 360
cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc 420
aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccccagc aggtggtggc catcgccagc 480
aatggcggtg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 540
gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg gccatcgcca gcaatggcgg tggcaagcag 600
gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 660
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 720
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc 780
gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg 840
tgccaggccc acggcttgac cccccagcag gtggtggcca tcgccagcaa tggcggtggc 900
aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 960
accccccagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggtg gcaagcaggc gctggagacg 1020
gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg 1080
gccatcgcca gcaatggcgg tggcaagcag gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg 1140
gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg gagcaggtgg tggccatcgc cagccacgat 1200
ggcggcaagc aggcgctgga gacggtccag cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac 1260
ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc gccagccacg atggcggcaa gcaggcgctg 1320
gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccggagcag 1380
gtggtggcca tcgccagcca cgatggcggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg 1440
ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 1500
cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 1560
gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag 1620
gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 1680
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 1740
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc 1800
gccagccacg atggcggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg 1860
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc 1920
aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 1980
acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc 2040
attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc 2100
gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg 2160
gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg 2220
aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac 2280
agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc 2340
tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc 2400
tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg 2460
cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag 2520
cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc 2580
ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac 2640
atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg 2700
atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc 2760
aacttcgcgg ccgactgata a 2781
<210> 156
<211> 2781
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> L-TALEN TGFbRII pCLS32940
<400> 156
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc 60
tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac 120
cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac 180
ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag 240
gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag 300
gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa 360
cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc 420
aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 480
aatattggtg gcaagcaggc gctggagacg gtgcaggcgc tgttgccggt gctgtgccag 540
gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg gccatcgcca gcaataatgg tggcaagcag 600
gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg 660
gagcaggtgg tggccatcgc cagccacgat ggcggcaagc aggcgctgga gacggtccag 720
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc 780
gccagcaata ttggtggcaa gcaggcgctg gagacggtgc aggcgctgtt gccggtgctg 840
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc 900
aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 960
accccggagc aggtggtggc catcgccagc cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg 1020
gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg 1080
gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg 1140
gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg gagcaggtgg tggccatcgc cagcaatatt 1200
ggtggcaagc aggcgctgga gacggtgcag gcgctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac 1260
ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg 1320
gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccccagcag 1380
gtggtggcca tcgccagcaa tggcggtggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg 1440
ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 1500
cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 1560
gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag 1620
gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 1680
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaataat ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 1740
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc 1800
gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg 1860
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc 1920
aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 1980
acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc 2040
attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc 2100
gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg 2160
gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg 2220
aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac 2280
agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc 2340
tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc 2400
tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg 2460
cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag 2520
cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc 2580
ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac 2640
atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg 2700
atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc 2760
aacttcgcgg ccgactgata a 2781
<210> 157
<211> 2781
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> R-TALEN TGFbRII pCLS32967
<400> 157
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc 60
tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac 120
cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac 180
ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag 240
gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag 300
gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa 360
cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc 420
aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 480
cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 540
gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gccacgatgg cggcaagcag 600
gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg 660
gagcaggtgg tggccatcgc cagccacgat ggcggcaagc aggcgctgga gacggtccag 720
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc 780
gccagcaatg gcggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg 840
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc 900
aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 960
accccccagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggtg gcaagcaggc gctggagacg 1020
gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg 1080
gccatcgcca gcaataatgg tggcaagcag gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg 1140
gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccg gagcaggtgg tggccatcgc cagcaatatt 1200
ggtggcaagc aggcgctgga gacggtgcag gcgctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac 1260
ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg 1320
gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccccagcag 1380
gtggtggcca tcgccagcaa taatggtggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg 1440
ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 1500
aatattggtg gcaagcaggc gctggagacg gtgcaggcgc tgttgccggt gctgtgccag 1560
gcccacggct tgacccccca gcaggtggtg gccatcgcca gcaataatgg tggcaagcag 1620
gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 1680
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 1740
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc 1800
gccagcaata ttggtggcaa gcaggcgctg gagacggtgc aggcgctgtt gccggtgctg 1860
tgccaggccc acggcttgac cccccagcag gtggtggcca tcgccagcaa tggcggtggc 1920
aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 1980
acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc 2040
attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc 2100
gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg 2160
gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg 2220
aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac 2280
agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc 2340
tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc 2400
tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg 2460
cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag 2520
cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc 2580
ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac 2640
atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg 2700
atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc 2760
aacttcgcgg ccgactgata a 2781
<210> 158
<211> 2781
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> L-TALEN TGFbRII pCLS32968
<400> 158
atgggcgatc ctaaaaagaa acgtaaggtc atcgatatcg ccgatctacg cacgctcggc 60
tacagccagc agcaacagga gaagatcaaa ccgaaggttc gttcgacagt ggcgcagcac 120
cacgaggcac tggtcggcca cgggtttaca cacgcgcaca tcgttgcgtt aagccaacac 180
ccggcagcgt tagggaccgt cgctgtcaag tatcaggaca tgatcgcagc gttgccagag 240
gcgacacacg aagcgatcgt tggcgtcggc aaacagtggt ccggcgcacg cgctctggag 300
gccttgctca cggtggcggg agagttgaga ggtccaccgt tacagttgga cacaggccaa 360
cttctcaaga ttgcaaaacg tggcggcgtg accgcagtgg aggcagtgca tgcatggcgc 420
aatgcactga cgggtgcccc gctcaacttg accccccagc aggtggtggc catcgccagc 480
aataatggtg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 540
gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag 600
gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 660
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaataat ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 720
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cggagcaggt ggtggccatc 780
gccagcaata ttggtggcaa gcaggcgctg gagacggtgc aggcgctgtt gccggtgctg 840
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcaa tattggtggc 900
aagcaggcgc tggagacggt gcaggcgctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 960
accccccagc aggtggtggc catcgccagc aataatggtg gcaagcaggc gctggagacg 1020
gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg 1080
gccatcgcca gcaatattgg tggcaagcag gcgctggaga cggtgcaggc gctgttgccg 1140
gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc 1200
ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac 1260
ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc gccagcaata atggtggcaa gcaggcgctg 1320
gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg tgccaggccc acggcttgac cccccagcag 1380
gtggtggcca tcgccagcaa tggcggtggc aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg 1440
ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg accccggagc aggtggtggc catcgccagc 1500
cacgatggcg gcaagcaggc gctggagacg gtccagcggc tgttgccggt gctgtgccag 1560
gcccacggct tgaccccgga gcaggtggtg gccatcgcca gccacgatgg cggcaagcag 1620
gcgctggaga cggtccagcg gctgttgccg gtgctgtgcc aggcccacgg cttgaccccc 1680
cagcaggtgg tggccatcgc cagcaatggc ggtggcaagc aggcgctgga gacggtccag 1740
cggctgttgc cggtgctgtg ccaggcccac ggcttgaccc cccagcaggt ggtggccatc 1800
gccagcaatg gcggtggcaa gcaggcgctg gagacggtcc agcggctgtt gccggtgctg 1860
tgccaggccc acggcttgac cccggagcag gtggtggcca tcgccagcca cgatggcggc 1920
aagcaggcgc tggagacggt ccagcggctg ttgccggtgc tgtgccaggc ccacggcttg 1980
acccctcagc aggtggtggc catcgccagc aatggcggcg gcaggccggc gctggagagc 2040
attgttgccc agttatctcg ccctgatccg gcgttggccg cgttgaccaa cgaccacctc 2100
gtcgccttgg cctgcctcgg cgggcgtcct gcgctggatg cagtgaaaaa gggattgggg 2160
gatcctatca gccgttccca gctggtgaag tccgagctgg aggagaagaa atccgagttg 2220
aggcacaagc tgaagtacgt gccccacgag tacatcgagc tgatcgagat cgcccggaac 2280
agcacccagg accgtatcct ggagatgaag gtgatggagt tcttcatgaa ggtgtacggc 2340
tacaggggca agcacctggg cggctccagg aagcccgacg gcgccatcta caccgtgggc 2400
tcccccatcg actacggcgt gatcgtggac accaaggcct actccggcgg ctacaacctg 2460
cccatcggcc aggccgacga aatgcagagg tacgtggagg agaaccagac caggaacaag 2520
cacatcaacc ccaacgagtg gtggaaggtg tacccctcca gcgtgaccga gttcaagttc 2580
ctgttcgtgt ccggccactt caagggcaac tacaaggccc agctgaccag gctgaaccac 2640
atcaccaact gcaacggcgc cgtgctgtcc gtggaggagc tcctgatcgg cggcgagatg 2700
atcaaggccg gcaccctgac cctggaggag gtgaggagga agttcaacaa cggcgagatc 2760
aacttcgcgg ccgactgata a 2781
<210> 159
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> TRAC TALEN靶序列
<400> 159
ttgtcccaca gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgaga 49
<210> 160
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> CD52 TALEN靶序列
<400> 160
ttcctcctac tcaccatcag cctcctggtt atggtacagg taagagcaa 49
<210> 161
<211> 502
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> P4 CAR完整序列
<400> 161
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Thr Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp
35 40 45
Ser Val Ser Ser Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro
50 55 60
Ser Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro
85 90 95
Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro
100 105 110
Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr
115 120 125
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
Gly Ile Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser
165 170 175
Pro Gly Ala Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn
180 185 190
Val Gly Pro Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro
195 200 205
Pro Gln Tyr Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly
210 215 220
Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn
225 230 235 240
Ala Gly Val Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp
245 250 255
Tyr Tyr Cys Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly
260 265 270
Thr Gln Leu Thr Val Leu Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
275 280 285
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
290 295 300
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
305 310 315 320
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
325 330 335
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
355 360 365
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
435 440 445
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
450 455 460
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
485 490 495
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500

Claims (48)

1.一种间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，至少包含：
-胞外配体结合结构域，包含来自单克隆抗间皮素抗体的VH和VL；
-跨膜结构域；和
-胞质结构域，包含CD3ξ信号转导结构域和共刺激结构域；
其中所述胞外配体结合结构域针对MSLN抗原多肽区SEQ IDNO：25。
2.根据权利要求1所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述胞外配体结合结构域包含：
-可变重VH链，包含来自抗体Meso1的CDR，所述CDR分别与SEQ ID NO：3(CDRH1-Meso1)、SEQ ID NO：4(CDRH2-Meso1)和SEQ ID NO：5(CDRH3-Meso1)具有至少90％的同一性，和
-可变重VL链，包含来自抗体Meso1的CDR，所述CDR分别与SEQ ID NO：6(CDRL1-Meso1)、SEQ ID NO：7(CDRL2-Meso1)和SEQ ID NO：8(CDRL3-Meso1)具有至少90％的同一性。
3.根据权利要求1所述的间皮素特异性嵌合抗原受体，其中所述胞外配体结合结构域包含分别与SEQ ID NO：9(Meso1-VH)和SEQ ID NO：10(Meso1-VL)具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且甚至更优选地至少99％的序列同一性的VH和VL链。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述跨膜结构域来自下列的跨膜区：T细胞受体的α、β或ξ链、PD-1、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、LAG3、2B4、BTLA4、TIM-3、TIGIT、SIRPA、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154。
5.根据权利要求4所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述跨膜结构域与来自CD8α的SEQ ID NO.6共有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且甚至更优选地至少99％的序列同一性。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，还包含位于所述胞外配体结合结构域和所述跨膜结构域之间的铰链。
7.根据权利要求6所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述铰链选自CD8α铰链、IgG1铰链和FcγRIIIα铰链。
8.根据权利要求7所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述铰链分别与SEQID NO.16(CD8α)共有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％并且甚至更优选地至少99％的序列同一性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的间皮素特异性CAR，其中所述CAR具有多肽结构，所述多肽结构包含与SEQ ID NO.16中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的CD8α铰链和与SEQ ID NO.17中所示的氨基酸序列具有至少80％同一性的CD8α跨膜结构域。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的间皮素特异性CAR，还包含安全开关，所述安全开关包含选自表5的表位。
11.根据权利要求10所述的间皮素特异性CAR，其中所述安全开关包含由利妥昔单抗特异性结合的表位CPYSNPSLC(SEQ ID NO：26)。
12.根据权利要求10或11所述的间皮素特异性CAR，其中所述CAR包含与SEQ ID NO：15具有至少90％同一性的安全开关R2。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的间皮素特异性嵌合抗原受体，其中所述CAR包含来自4-1BB或CD28的共刺激结构域。
14.根据权利要求13所述的间皮素特异性CAR，其中所述共刺激结构域来自4-1BB和/或与SEQ ID NO：18具有至少80％的同一性。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的间皮素特异性CAR，其中所述CD3ξ信号转导结构域与SEQ ID NO：19具有至少80％的同一性。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的间皮素特异性CAR，还包含信号肽。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR是单链多肽。
18.根据权利要求17所述的间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR与SEQ IDNO：21(Meso1 CAR)或者SEQ ID NO：22(Meso1-R2 CAR)具有至少80％，优选地至少90％，更优选地至少95％，并且甚至更优选地至少99％的整体氨基酸序列同一性。
19.一种多核苷酸，编码根据权利要求1至18中任一项所述的嵌合抗原受体。
20.一种表达载体，包含权利要求19所述的多核苷酸。
21.一种工程化免疫细胞，包含根据权利要求19所述的多核苷酸或者根据权利要求20所述的表达载体。
22.一种工程化免疫细胞，在细胞表面膜处表达根据权利要求1至18中任一项所述的间皮素特异性嵌合抗原受体。
23.根据权利要求21或22所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞是T-淋巴细胞。
24.根据权利要求23所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞来自原代细胞或者分化自干细胞如iPS细胞。
25.根据权利要求23或24所述的工程化免疫细胞，来源于炎性T淋巴细胞、细胞毒性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的工程化免疫细胞，其中在所述免疫细胞中TCR的表达被降低或抑制。
27.根据权利要求26所述的工程化免疫细胞，其中在所述细胞中编码TCRα或TCRβ的至少一种基因被灭活。
28.根据权利要求27所述的工程化免疫细胞，其中所述编码TCRα或TCRβ的至少一种基因通过稀切核酸内切酶被切割。
29.根据权利要求27或28所述的工程化免疫细胞，其中编码所述间皮素特异性CAR的多核苷酸被整合到受内源启动子转录控制的内源基因座处，优选地TCRα或TCRβ基因座处。
30.根据权利要求29所述的工程化免疫细胞，来源于用于同种异体移植的供体。
31.根据权利要求21至30中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞突变以赋予对至少一种免疫抑制性药物如抗-CD52抗体的抗性。
32.根据权利要求21至31中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞进一步突变以赋予对至少一种化疗药物，具体地嘌呤类似物药物的抗性。
33.根据权利要求21至32中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞突变以改善患者中其持久性或其寿命，具体地在编码MHCI组分的基因如HLA或B2m中。
34.根据权利要求21至33中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞突变以改善其CAR依赖性免疫激活，具体地减少或抑制免疫检查点蛋白和/或其受体的表达。
35.根据权利要求21至34中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)在所述细胞中与编码TGFβ受体抑制剂或诱饵的另一种外源基因序列共表达。
36.根据权利要求35所述的工程化免疫细胞，其中TGFβ受体的所述诱饵是显性失活的TGFβ受体，如与SEQ ID NO.24具有至少80％的多肽序列同一性的受体。
37.根据权利要求36所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞包含外源多核苷酸，所述外源多核苷酸包含编码所述间皮素特异性CAR的第一多核苷酸序列、编码2A自切割肽的第二多核苷酸和编码所述显性失活的TGFβ受体的第三多核苷酸。
38.根据权利要求21至37中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞使至少一个TGFβ受体基因表达降低或失活。
39.根据权利要求38所述的工程化免疫细胞，其中所述TGFβ受体基因是TGFβRII。
40.根据权利要求21至39中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)在所述细胞中与选自编码下列的序列的另一种外源基因序列共表达：
-NK细胞抑制剂，如HLAG、HLAE或ULBP1；
-CRS抑制剂，如突变的IL6Ra、sGP130或IL18-BP；或者
-细胞色素P450、CYP2D6-1、CYP2D6-2、CYP2C9、CYP3A4、CYP2C19或CYP1A2，赋予所述免疫细胞对药物如环磷酰胺和/或异磷酰胺的超敏感性，
-二氢叶酸还原酶(DHFR)、肌苷单磷酸脱氢酶2(IMPDH2)、钙神经素或甲基鸟嘌呤转移酶(MGMT)、mTORmut或Lckmut，赋予耐药性；
-趋化因子或细胞因子，如IL-2、IL-12和IL-15；
-趋化因子受体，如CCR2、CXCR2或CXCR4；
-肿瘤相关巨噬细胞(TAM)的分泌抑制剂，如CCR2/CCL2中和剂，以提高所述免疫细胞的治疗活性。
41.根据权利要求21至40所述的工程化免疫细胞，用于在疗法中使用。
42.根据权利要求21至41中任一项所述的工程化免疫细胞，作为治疗癌症的药剂使用。
43.根据权利要求21至42中任一项所述的工程化免疫细胞，用于在特征为间皮素表达细胞的恶性前或恶性癌症病症的疗法中使用。
44.根据权利要求21至43中任一项所述的工程化免疫细胞，用于在癌症病症的疗法中使用，所述癌症病症选自食管癌、乳腺癌、胃癌、肝胆管型肝癌、胰癌、结肠癌、肺癌、胸腺癌、间皮瘤、卵巢癌和子宫内膜癌。
45.一种用于治疗患有特征为间皮素表达细胞的病症的患者的方法，包括以下步骤：
-使来自供体的免疫细胞工程化，以表达根据权利要求1至20中任一项所述的功能性间皮素特异性嵌合抗原受体(CAR)；
-将所述CAR阳性工程化免疫细胞给予患者以消除表达间皮素的细胞。
46.根据权利要求45所述的用于治疗患者的方法，包括其中使所述患者淋巴细胞清除的其它治疗步骤。
47.根据权利要求46所述的用于治疗患者的方法，其中使消除表达间皮素的细胞的所述CAR阳性工程化免疫细胞突变以赋予对淋巴细胞清除治疗的抗性。
48.根据权利要求47所述的用于治疗患者的方法，其中使消除表达间皮素的细胞的所述CAR阳性工程化免疫细胞在其CD52基因中突变。
CN202080097252.4A 2019-12-23 2020-12-22 用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体（car） Pending CN115175928A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201970835 2019-12-23
DKPA201970835 2019-12-23
PCT/EP2020/087673 WO2021130250A1 (en) 2019-12-23 2020-12-22 New mesothelin specific chimeric antigen receptors (car) for solid tumors cancer immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115175928A true CN115175928A (zh) 2022-10-11

Family

ID=74205797

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080097252.4A Pending CN115175928A (zh) 2019-12-23 2020-12-22 用于实体瘤癌症免疫疗法的新型间皮素特异性嵌合抗原受体（car）

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230068949A1 (zh)
EP (1) EP4081537A1 (zh)
JP (1) JP2023507525A (zh)
KR (1) KR20220118532A (zh)
CN (1) CN115175928A (zh)
AU (1) AU2020415318A1 (zh)
CA (1) CA3166356A1 (zh)
IL (1) IL294118A (zh)
MX (1) MX2022007833A (zh)
WO (1) WO2021130250A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118109416A (zh) * 2023-03-30 2024-05-31 广州百吉生物制药有限公司 功能增强型工程化免疫细胞及其制备和应用
WO2024153172A1 (zh) * 2023-01-19 2024-07-25 中国科学院动物研究所 一种靶向msln art-nk细胞及其制备方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113527515A (zh) * 2021-07-14 2021-10-22 南京蓝盾生物科技有限公司 一种靶向mesothelin的嵌合抗原受体及其应用
EP4395837A1 (en) * 2021-08-30 2024-07-10 CarryGenes Bioengineering, LLC Safety switches for engineered cells carrying synthetic chromosomes
WO2024096592A1 (ko) * 2022-11-02 2024-05-10 주식회사 셀렌진 메소텔린에 대한 친화도가 상승된 키메릭 항원 수용체 및 이의 용도

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US6905680B2 (en) 1988-11-23 2005-06-14 Genetics Institute, Inc. Methods of treating HIV infected subjects
US5858358A (en) 1992-04-07 1999-01-12 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6352694B1 (en) 1994-06-03 2002-03-05 Genetics Institute, Inc. Methods for inducing a population of T cells to proliferate using agents which recognize TCR/CD3 and ligands which stimulate an accessory molecule on the surface of the T cells
US6534055B1 (en) 1988-11-23 2003-03-18 Genetics Institute, Inc. Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
AU6704794A (en) 1993-04-13 1994-11-08 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Protection of human bone marrow from high dose antifolate therapy using mutated human dihydrofolate reductase dna
US7175843B2 (en) 1994-06-03 2007-02-13 Genetics Institute, Llc Methods for selectively stimulating proliferation of T cells
US6692964B1 (en) 1995-05-04 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Methods for transfecting T cells
US7067318B2 (en) 1995-06-07 2006-06-27 The Regents Of The University Of Michigan Methods for transfecting T cells
WO1997033988A1 (en) 1996-03-12 1997-09-18 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Double mutants of dihydrofolate reductase and methods of using same
IL151287A0 (en) 2000-02-24 2003-04-10 Xcyte Therapies Inc A method for stimulation and concentrating cells
US7572631B2 (en) 2000-02-24 2009-08-11 Invitrogen Corporation Activation and expansion of T cells
US6797514B2 (en) 2000-02-24 2004-09-28 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
US6867041B2 (en) 2000-02-24 2005-03-15 Xcyte Therapies, Inc. Simultaneous stimulation and concentration of cells
EP2522723B1 (en) 2003-01-28 2014-12-03 Cellectis Custom-made meganuclease and use thereof
EP1620537B1 (en) 2003-03-14 2012-10-24 Cellectis SA Large volume ex vivo electroporation method
US9272002B2 (en) * 2011-10-28 2016-03-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Fully human, anti-mesothelin specific chimeric immune receptor for redirected mesothelin-expressing cell targeting
EP2855666B1 (en) 2012-05-25 2019-12-04 Cellectis Use of pre t alpha or functional variant thereof for expanding tcr alpha deficient t cells
WO2014004549A2 (en) * 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
AU2013312838B2 (en) 2012-09-04 2018-11-29 Cellectis Multi-chain chimeric antigen receptor and uses thereof
EP2997133B1 (en) 2013-05-13 2023-08-23 Cellectis Methods for engineering highly active t cell for immunotherapy
CA2931267C (en) 2013-11-22 2023-08-15 Cellectis A method of engineering allogenic and drug resistant t-cells for immunotherapy
CN116478927A (zh) * 2013-12-19 2023-07-25 诺华股份有限公司 人间皮素嵌合抗原受体及其用途
WO2015136001A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 Cellectis Method for generating t-cells compatible for allogenic transplantation
CA2973642A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Rinat Neuroscience Corporation Mab-driven chimeric antigen receptor systems for sorting/depleting engineered immune cells
WO2018073391A1 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy
CN109593721B (zh) * 2017-09-30 2022-11-01 亘喜生物科技（上海）有限公司 具有自杀基因开关的靶向人间皮素的工程化免疫细胞

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024153172A1 (zh) * 2023-01-19 2024-07-25 中国科学院动物研究所 一种靶向msln art-nk细胞及其制备方法
CN118109416A (zh) * 2023-03-30 2024-05-31 广州百吉生物制药有限公司 功能增强型工程化免疫细胞及其制备和应用

Also Published As

Publication number Publication date
IL294118A (en) 2022-08-01
US20230068949A1 (en) 2023-03-02
EP4081537A1 (en) 2022-11-02
JP2023507525A (ja) 2023-02-22
CA3166356A1 (en) 2021-07-01
WO2021130250A1 (en) 2021-07-01
MX2022007833A (es) 2022-09-23
AU2020415318A1 (en) 2022-07-14
KR20220118532A (ko) 2022-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11498971B2 (en) BCMA (CD269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
US20200181643A1 (en) Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
US11186824B2 (en) Methods for engineering allogeneic T cell to increase their persistence and/or engraftment into patients
EP3309248B1 (en) Methods for engineering t cells for immunotherapy by using rna-guided cas nuclease system
US20180000914A1 (en) Anti-hsp70 specific chimeric antigen receptors (cars) for cancer immunotherapy
JP2023139070A (ja) ユニバーサル抗ｃｄ２２キメラ抗原受容体操作免疫細胞
US20230068949A1 (en) New mesothelin specific chimeric antigen receptors (CAR) for solid tumors cancer immunotherapy
US20240197880A1 (en) New anti-muc1 cars and gene edited immune cells for solid tumors cancer immunotherapy
CN117580868A (zh) 用于实体瘤癌症免疫疗法的新型抗-muc1 car和基因编辑的免疫细胞

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination