CN107058230A - 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法 - Google Patents

一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN107058230A
CN107058230A CN201710045150.8A CN201710045150A CN107058230A CN 107058230 A CN107058230 A CN 107058230A CN 201710045150 A CN201710045150 A CN 201710045150A CN 107058230 A CN107058230 A CN 107058230A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
tcr
rnai
silence
lymphocytes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201710045150.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN107058230B (zh
Inventor
刘明录
金海峰
强邦明
万磊
韩庆梅
冯建海
张传鹏
马洪华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Original Assignee
Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd filed Critical Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Priority to CN201710045150.8A priority Critical patent/CN107058230B/zh
Publication of CN107058230A publication Critical patent/CN107058230A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN107058230B publication Critical patent/CN107058230B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，本发明是一种RNA干扰技术，特别是双靶点干扰技术沉默T细胞抗原受体，本发明还涉及表达shRNA的T细胞，所述T细胞可沉默自身的T细胞抗原受体，对异体来源的组织降低排斥作用。

Description

一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法。
背景技术
T淋巴细胞是在胸腺中分化成熟的淋巴细胞，故称胸腺依赖性淋巴细胞(Thymus-dependent lymphocyte)，简称T细胞。T细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成，是淋巴细胞中数量最多，功能最复杂的一类细胞。T细胞膜表面分子与T细胞的功能相关，也是T细胞的表面标志，可以用以分离、鉴定不同亚群的T细胞。TCR为所有T细胞表面的特征性标志，以非共价键与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR的作用是识别抗原。TCR是由两条不同肽链构成的异二聚体，由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为胞外区、跨膜区和胞质区等几部分；其特点是胞质区很短。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于胞外区。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。当细胞中导入与内源性mRNA编码区同源的双链RNA时，该mRNA发生降解而导致基因表达沉默，是一种特异性的转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing and transgenesilencing)。由于RNAi具有高度的序列专一性和有效的干扰，可以特异地将特定的基因沉默，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。RNAi技术可广泛应用到包括功能学，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析，疾病治疗等等。
机体对内外的各种致病因子有着非常完善的防御机制，其中对外来物如细菌、病毒、异物等“异己成分”的重要作用，就是攻击、破坏、清除。这主要是由于T细胞抗原受体的识别作用。每个机体内的T细胞抗原受体都是特异的，遇到来源于异体的T细胞时会发生免疫反应。而在细胞免疫治疗技术的应用中，当病人因身体虚弱，导致自体外周血中T细胞数量比较少，很难在体外诱导成CIK细胞，因此，应用异体T细胞对病人免疫治疗具有潜在优势。
发明内容
为了弥补以上不足，本发明提供了一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法，本发明为一个双靶点的RNA干扰技术，表达所述双靶点RNAi的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于异体回输降低排斥反应的用途。
本发明的方案是：
一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR-RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。
作为优选的技术方案，所述的转录TCR-RNAi的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
作为优选的技术方案，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取脐带血，分离单核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第17天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记TCR+的阳性表达率；当TCR+阳性率>90％，收获由单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。
作为优选的技术方案，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。
作为优选的技术方案，所述转录TCR-RNAi融合基因片段如下制取：通过基因合成技术将选取的TCR中的α链和β链的21个核苷酸，H1启动子，U6启动子与酶切位点的核苷酸序列构成融合基因TCR-RNAi。
本发明还提供了一种治疗肿瘤可以异体回输的药物，含有权利要求1所述的沉默T细胞抗原受体的T细胞。
本发明设计的沉默T细胞抗原受体的T细胞，能够大大降低机体的排斥反应，达到异体回输的目的，提高沉默效果。
本发明的优点
由于双靶点RNAi的基因沉默效率要比单靶点RNAi高，本发明利用双靶点RNAi来沉默TCR基因，通过磁珠筛选，去除未沉默TCR的T细胞。在异体回输时，不减弱T细胞杀伤肿瘤细胞的能力同时避免引起严重的排斥反应。
本发明中沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的各模块
(1)TCR-RNAi基因
本发明中提供了一个双靶点RNAi载体构建方法，双靶点RNAi可以提高基因沉默的效率。RNAi基因中使用的是H1启动子和U6启动子，分别连在两条不同的链上，并与酶切位点相连，设计图见图1。
(2)重组病毒表达载体
本发明中使用的载体是慢病毒载体pLent-C-GFP，pLent-N-GFP表达基因载体含有一个原始复制子(origin of replication)，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMV)，和限制性内切酶位点(NotI，AsiSI等)，选择性的抗性基因(抗氨苄青霉素)及标签蛋白(绿色荧光蛋白)。通过人工合成的TCR-RNAi基因，即目标DNA，在T4连接酶作用下，与载体DNA连接，形成转录RNAi的完整载体pLent-TCR-RNAi见图2。
(3)宿主细胞
本发明所用的宿主细胞为一种异质T淋巴细胞—CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-induced killer)。CIK是将脐血单核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群细胞。CIK细胞中的效应细胞在正常人外周血中极少，仅1％～5％。相对与普通的T淋巴细胞，本发明具有以下优势：(1)细胞增殖速度快；(2)CIK具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用；(3)杀瘤谱广，可用于白血病、肝癌、肾癌、胃癌、直肠癌等多种肿瘤的治疗；(4)典型的生物治疗模式，通过沉默T细胞受体基因工程方法改良CIK细胞，可对肿瘤进行异体杀伤，开启普遍性。
本发明中沉默掉T细胞受体的T细胞，可以是自体的T细胞，也可以是异体的T细胞。所用T细胞的数量为0.5×106～1×109/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×106-1.0×107/kg。
附图说明
图1为双靶点RNAi的基因片段的设计图；
图2为本发明所述的慢病毒表达质粒(pLent-TCR-RNAi)的示意图，其中，顺时针序列为正向基因片段，逆时针为反向基因片段；
图3是本发明脐血淋巴细胞诱导的CIK倒置显微镜下视野图；
图4是本发明脐血淋巴细胞诱导的CIK的表面分子标记TCR+表达的流式图(TCR表达率为97.9％)；
图5是本发明所述的293T细胞明视野图；
图6是显微镜下观察慢病毒表达质粒(pLent-TCR-RNAi)转染293T细胞的转染效率图；
图7是本发明所述病毒感染T细胞倒置显微镜下视野图；
图8是流式细胞术分析经过磁珠分离后的T细胞的TCR+的效率为4.5％。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：将基因片段TCR-RNAi插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP
(1)TCR-RNAi人工序列(SEQ ID NO.1)
将TCR-RNAi的核酸人工序列，委托维真生物(山东)科技有限公司合成，插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点(见图2)，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。
实施例2：pLent-TCR-RNAi沉默T细胞受体的T细胞的制备
(一)异质T淋巴细胞—CIK的制备
取60ml脐带血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离出单核细胞。用含有1000IU/mL的重组干扰素γ(购自沈阳三生制药)的CORNING培养基(购自CORNING公司)诱导培养24小时后，加入1000IU/mL的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)和50ng/mL的OKT-3继续培养24小时。每隔三天倍比加液，同时加入5％的自体血浆，培养至第17天，流式细胞术检测CIK细胞中的TCR的阳性表达率(TCR-FITC抗体购自Miltenyi公司)。TCR+阳性率>90％，视为CIK诱导成功(见图3，图4)，并留取该CIK待病毒感染。
(二)慢病毒包装质粒脂质体转染293T细胞
复苏293T细胞，培养2天，使其细胞状态达到最佳(见图5)。取6×105个细胞在六孔板中培养，为第二天的转染做准备。转染前将六孔板换成新鲜DMEM培养液(购自Gibco公司)，37℃温箱中培养1h。将LipoFiterTM脂质体转染试剂(购自汉恒生物)混匀，TCR-RNAi和辅助质粒psPAX2、pMDNA2G三种质粒以4:3:1的比例将4.0μg的DNA溶解于100μL的DMEM培养基中，同时12μL的LipoFiterTM溶于88μL的DMEM培养基中，各自室温静置20分钟。将以上两步中的DNA和LipoFiterTM混匀，室温孵育20分钟。将LipoFiterTM-DNA混合物加入六孔板的一个孔中，培养6小时后，去除LipoFiterTM-DNA培养液，加入新鲜培养基继续培养。48小时后，显微镜下观察293T细胞转染后的形态变化(见图6)。将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，测定病毒滴度，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。
(三)慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养
从-80℃拿出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×106个上述诱导的CIK细胞。将细胞悬液加入到6孔板的1个孔中，使病毒颗粒数与CIK细胞数比例约为3:1，1000g，32℃，离心90分钟。37℃，5％的CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液和聚凝胺，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％的CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量(见图7)。
(四)免疫磁珠分离已沉默T细胞受体的T细胞
用pH为7.2的PBS(购自BECKMAN公司)配置0.5％的BSA(购自Gibco公司)和2mM的EDTA(购自BECKMAN公司)，1:10稀释分离缓冲液。用缓冲液重悬2×107个病毒感染的T细胞，用30um的尼龙网(购自BD公司)过滤，300g离心10min。加入缓冲液重悬细胞，重复上述操作一次，离心后弃掉上清，加入160uL的缓冲液，加入40uL的单克隆抗体TCR(抗体购自Miltenyi公司)，混匀，4℃静置15min。加入2mL的细胞缓冲液清洗，300g离心10min，加入100uL的缓冲液重悬细胞。准备好分离柱(购自德国Miltenyi公司)，并用500uL的缓冲液清洗MS，把细胞悬液倒入柱子中，用500uL的缓冲液冲洗柱子，重复三次，收集流出的液体。
(五)流式细胞技术检测TCR-RNAi在T细胞中的表达效率
取出1×105个磁珠分离后的T细胞，利用流式细胞仪检测分离后的T细胞FITC(异硫氰酸盐)通道中T细胞的TCR阳性表达率。
(六)qRT-PCR检测TCR-RNAi在T细胞中的表达
表1 qRT-PCR引物表
从培养瓶中取出1×105个感染细胞，用RNeasy Mini Kit(购自Qiagen公司)提取总RNA，在反转录酶(购自TransGen公司)作用下合成cDNA，利用 qPCR Master Mix试剂盒(购自TransGen公司)在表1给出的引物下进行反应，定量检测感染细胞中的RNAi效果。
本发明还提供了沉默T细胞受体的T细胞的应用方法，包括肠外应用，例如局部肿瘤注射、口腔、鼻腔、皮下、静脉、动脉、肌肉内、皮内，腹腔内、胸腔内等。在特定的环境中，并不局限于应用一种治疗方法，通常选择合适、有效的治疗途径。但目前通常用于肿瘤病人的治疗方法是局部肿瘤注射和静脉回输。
本发明的目的是将一定剂量发明的沉默T细胞受体的T细胞给予动物或者病人，经过一定时间后，要引起足够的治疗或预防反应。例如，给予本发明中的T细胞在异体内发挥作用，经过一定时间后，如两个小时或更长，可以检测到、并达到预防或治疗作用。从T细胞异体回输的应用到达到预防或治疗目的的时间可以是12小时，或24小时，或更长。给予T细胞的剂量可以依据本发明中T细胞的状态，病人本身的身体状况和治疗病人的年龄、体重等而定。
本发明中病人在进行T细胞治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全，并以此为依据，确定给予病人T细胞的剂量。通过给予病人不同剂量的T细胞，根据病人不同的反应状况，来确定药物应用的起始量和总的有效剂量。
本发明还包括沉默T细胞受体的T细胞应用前进行淋巴细胞抑制的化学药物治疗，放射治疗等。通常应用的化学药物为环磷酰胺和氟达拉滨，其常用剂量分别为60mg/kg和每天25mg/m2，但具体应用剂量还要依据治疗所要取得的效果及病人的综合身体状况及病人的体重决定。
本发明中病人回输完成后，要密切观察病人的生命体征及可能出现的副作用。常见的副作用有：皮肤发红、瘙痒；病人出现心慌、胸闷、呼吸困难；腹泻；皮下出血、皮疹；持续高热。如果出现上述症状，说明病人可能出现了细胞因子综合征，应给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。
本发明中沉默T细胞受体的T细胞，可以是自体的T细胞，也可以是异体的T细胞。本发明中所用的T细胞为异体T细胞，主要就是解决自体T细胞功能不全的。所用T细胞的数量为0.5×106-1×109/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×106-1.0×107/kg。
由于本发明中的沉默T细胞受体的T细胞是针对异体回输避免排斥反应的，由于T细胞在许多癌症中发挥作用，所以本发明的方法可以用到许多癌症。包括卵巢癌、胰腺癌、肺癌(肺腺癌)、食管癌，胃癌、滑膜肉瘤及间皮瘤等。
本发明中所提及的治疗和预防，不是指100％或完全的治疗或预防，而是指不同的程度的治疗或预防，即药物应用后，可以有潜在的治疗或预防效果。
总之，本发明提供了沉默T细胞受体的T细胞、核苷酸、重组表达载体、宿主细胞、及其在治疗和预防过程中的应用。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> 一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 154
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgatcgcaa aaagggagtg tctttggtga ttctcgaaag aatcaccaaa gacactccct 60
atgggaaaga gtggtctgga aaggacgaaa caccgggaga ttcggcagct tatttcttcg 120
gaaataagct gccgaatctc ctttttgcgg ccgc 154

Claims (6)

1.一种沉默T细胞抗原受体的T细胞制备方法，其特征在于：在TCR的α链和β链基因中分别选取连续的21个核苷酸，并与相应的启动子序列依次连接起来，得到转录形成TCR-RNAi的融合基因片段，将所构建的融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞。
2.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于：所述的转录TCR-RNAi的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取脐带血，分离单核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第17天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记TCR+的阳性表达率；当TCR+阳性率>90％，收获由单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。
4.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T细胞的制备方法，其特征在于，将所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：所述携带TCR-RNAi融合基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞。
5.如权利要求1所述的一种沉默T细胞抗原受体的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述转录TCR-RNAi融合基因片段如下制取：通过基因合成技术将选取的TCR中的α链和β链的21个核苷酸，H1启动子，U6启动子与酶切位点的核苷酸序列构成融合基因TCR-RNAi。
6.一种治疗肿瘤可以异体回输的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的沉默T细胞抗原受体的T细胞。
CN201710045150.8A 2017-01-20 2017-01-20 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法 Active CN107058230B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710045150.8A CN107058230B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710045150.8A CN107058230B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN107058230A true CN107058230A (zh) 2017-08-18
CN107058230B CN107058230B (zh) 2020-03-24

Family

ID=59598096

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710045150.8A Active CN107058230B (zh) 2017-01-20 2017-01-20 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107058230B (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103475A (zh) * 2014-03-11 2016-11-09 塞勒克提斯公司 产生同种异体移植相容的t细胞的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106103475A (zh) * 2014-03-11 2016-11-09 塞勒克提斯公司 产生同种异体移植相容的t细胞的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARIO BUNSE等: "RNAi-mediated TCR Knockdown Prevents Autoimmunity in Mice Caused by Mixed TCR Dimers Following TCR Gene Transfer", 《MOLECULAR THERAPY》 *
NCBI: "GenBank登录号：JQ778269.1", 《NCBI GENBANK》 *
NCBI: "GenBank登录号：KX077088.1", 《NCBI GENBANK》 *
薛利军: "RNAi阻断大鼠T淋巴细胞CD28和OX40诱导小肠移植免疫耐受", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（博士）医药卫生科技辑》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN107058230B (zh) 2020-03-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mathewson et al. Inhibitory CD161 receptor identified in glioma-infiltrating T cells by single-cell analysis
EP3368689B1 (en) Composition for modulating immune responses by use of immune cell gene signature
CN106279434B (zh) 工程化cd20靶向性的nkt细胞及其制备方法和应用
CN108409840B (zh) 抗cd123单链抗体及其组合的嵌合抗原受体和应用
EP3998278A1 (en) Mnd promoter chimeric antigen receptors
WO2017120996A1 (zh) 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和免疫检查点抑制分子的转基因淋巴细胞及其用途
EA018966B1 (ru) Способ усиления иммунореактивности
WO2018006880A1 (zh) 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
CN110257429A (zh) 重组表达载体、靶向性的t细胞及它们的应用
CN107523569B (zh) Pdcd1基因的用途及其相关药物
CN107699591A (zh) 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用
CN114317607A (zh) 融合一代靶向cd7 car和二代靶向bcma的双靶点通用car-t细胞及制备方法
CN108753774A (zh) 干扰il-6表达的cd19-car-t细胞及其应用
WO2023123195A1 (zh) 一种目的基因可调控的工程化免疫细胞及其制备方法和应用
CN108753773A (zh) 干扰IFN-gama表达的CD19-CAR-T细胞及其应用
CN111154791A (zh) 重组cd6基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用
WO2022171196A1 (zh) 抗cd87抗体及其特异性嵌合抗原受体
WO2022012531A1 (zh) 一种经修饰的免疫细胞的制备方法
CN107058230A (zh) 一种沉默t细胞抗原受体的t淋巴细胞的制备方法
CN104630221B (zh) 抑制肿瘤细胞生长的shRNA及其重组载体与应用
CN109266684B (zh) 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法
CN102056631B (zh) 细胞凋亡诱导物
US20200102563A1 (en) Exosome loaded therapeutics for treating sickle cell disease
CN112996802A (zh) 用于制备抗肿瘤沙粒病毒的方法以及沙粒病毒突变体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant