CN109266684B

CN109266684B - 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法

Info

Publication number: CN109266684B
Application number: CN201811213830.7A
Authority: CN
Inventors: 向志光; 佟巍; 徐艳峰; 郭智; 李欣悦
Original assignee: Institute of Laboratory Animal Science of CAMS
Current assignee: BEIJING HFK BIOSCIENCE Co.,Ltd.
Priority date: 2018-10-18
Filing date: 2018-10-18
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-10-18
Also published as: CN109266684A

Abstract

本发明属于实验动物及医学研究领域，公开了一种构建病原感染敏感性动物模型的方法，通过基因沉默技术抑制动物Ager基因的表达。该方法利用基因沉默技术，建立了固有免疫受体Ager基因表达下调的动物模型，可利用该模型进行病原感染实验，提高了动物对病原的易感性，同时对于一般免疫指标没有显著影响。从而有助于感染性疾病感染机制研究及药物开发。

Description

一种构建病原感染敏感性动物模型的方法

技术领域

本发明属于实验动物及医学研究领域，具体涉及一种构建动物模型的方法，尤其是涉及一种构建病原感染敏感性动物模型的方法。

背景技术

实验动物是医学研究的重要载体，特别是感染性疾病的研究。建立各类病原的实验动物感染动物模型是进行感染性疾病致病机理研究以及药物开发的重要过程。这其中小鼠作为遗传背景等较为清楚的模式动物，因而成为多种病原感染研究的首选动物。然而人类或是其他动物，他们与小鼠相比，由于进化距离等差异，其免疫系统各自进化而产生进化距离。免疫系统的差异造成小鼠对一些病原不易感。这种现象限制了小鼠动物模型的开发。

针对小鼠的基因工程操作可以改变小鼠的免疫状态，从而导致小鼠对于不同病原的敏感性发生变化。但在进行系统性基因工程操作时，动物本身的免疫系统改变重大，有可能影响动物模型的基本指标。因此开发一种短时间的基因调控技术，较少的改变动物的免疫机能，同时提高小鼠对病原的敏感性的技术十分重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术存在的问题，提供一种构建病原感染敏感性动物模型的方法，该方法既可以提高动物对病原的敏感性，又可以保证对动物的免疫机能改变的较少。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种构建病原感染敏感性动物模型的方法，通过基因沉默技术抑制动物Ager基因的表达。

本发明所述方法利用基因沉默技术，针对动物的固有免疫系统的一个受体基因Ager，通过下调该基因的表达水平，建立病原敏感性的动物模型，同时对于一般免疫指标没有显著影响。

在一些实施方案中，本发明所述方法中所述基因沉默的沉默机制为shRNA。shRNA是short hairpin RNA的缩写译为短发夹RNA。shRNA包括两个短反向重复序列。克隆到shRNA表达载体中的shRNA包括两个短反向重复序列(正义链和反义链)，可加工成siRNA，也可通过目标mRNA互补结合序列特异性地实现mRNA降解。

进一步的，在一些实施方案中，本发明所述方法中所述基因沉默具体方法为构建Ager基因的shRNA载体，转染动物。

在一些实施方案中，本发明针对Ager基因筛选合适的沉默位点，在体外细胞水平进行转染研究，筛选具有较高沉默效率的靶点进行体内研究。

作为优选，本发明所述方法中所述Ager基因的沉默位点的序列如SEQ ID NO:1(aggcgagggaaggaggtca)或SEQ ID NO:3(acagccagtgtccctaata)所示。

进一步的，本发明所述方法中，所述SEQ ID NO:1所示Ager基因的沉默位点的干扰序列如SEQ ID NO:2(ggaggcgagggaaggaggtcactcgagtgacctccttccctcgcctttttt)所示；所述SEQ ID NO:3所示Ager基因的沉默位点的干扰序列如SEQ ID NO:4(ggacagccagtgtccctaatactcgagtattagggacactggctgtttttt)所示。

本发明所述方法中，所述转染具体为shRNA载体包装病毒，将包装好的病毒液接种于动物体内。其中所述病毒可以为腺病毒、逆转录病毒或慢病毒。

在一些实施方案中，所述病毒为慢病毒。慢病毒载体是以HIV-1(人类免疫缺陷I型病毒)为基础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。构建表达沉默序列的慢病毒载体，并对病毒载体进行纯化，去除内毒素等，使之可应用于体内动物实验。

作为优选，所述病毒为慢病毒时，所述包装好的慢病毒的病毒滴度＞1×10⁸pfu/mL。

作为优选，所述动物为小鼠。

作为优选，所述病毒液接种剂量100μL。

进一步的，在一些实施方案中，还包括将包装好的病毒液与转染辅助试剂Polybrene混合形成混合液的步骤。Polybrene是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率。其中所述转染辅助试剂Polybrene的终浓度为5μg/mL。

作为优选，本发明所述方法中，所述病原敏感性的病原包括但不限于呼吸道病原、消化道病原。

在某一具体实施例中，本发明选择合适的感染剂量，在小鼠体内通过血行感染途径进行基因沉默操作。在感染后3-10天对感染动物肺脏组织中Ager基因的表达水平进行测定。基因沉默效率到达50％以上，而其他固有免疫受体TLR4的表达未见明显变化。

在某一具体实施例中，本发明应用Ager基因沉默动物进行感染研究，与对照小鼠相比，在接种感染PVM病毒一周时间段，Ager基因沉默的小鼠的肺组织损伤严重，且病毒的复制滴度高于对照组，表明本发明所述方法可显著提高小鼠对于呼吸道病原的敏感性。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种构建病原感染敏感性动物模型的方法，通过基因沉默技术抑制动物Ager基因的表达。该方法利用基因沉默技术，建立了固有免疫受体Ager基因表达下调的动物模型，可利用该模型进行病原感染实验，提高了动物对病原的易感性，同时对于一般免疫指标没有显著影响。从而有助于感染性疾病感染机制研究及药物开发。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示实施例1基因沉默载体图；

图2针对小鼠Ager基因不同位点设计基因沉默载体，在NIH 3T3细胞体外转染，验证基因沉默效率结果图；其中纵坐标为以野生型未经转染的3T3细胞中Ager的转录水平设定为1，其他组与之比较的结果；

图3对小鼠做Ager基因沉默操作，在小鼠肺组织中Ager的表达水平统计结果图；其中纵坐标为以肺脏组织GAPDH内参基因的转录水平设定为1，Ager在各组的转录水平；

图4对小鼠做Ager基因沉默操作，在小鼠肺组织中其他固有免疫受体TLR4的表达水平统计结果图；其中纵坐标为以肺脏组织GAPDH内参基因的转录水平设定为1，Ager在各组的转录水平；

图5Ager沉默小鼠在感染PVM之后的病理检测结果；

图6对照小鼠在感染PVM之后的病理检测结果。

具体实施方式

本发明公开了一种构建病原感染敏感性动物模型的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。

实施例1

构建针对Ager基因的基因沉默载体，沉默靶点包括如下表1所示位置。针对各序列设计合成颈环序列，然后克隆入shRNA表达载体。

表1沉默靶点

针对上述序列进行DNA合成，并合成双链DNA，使用酶切克隆载体，连入基因沉默载体，该载体信息如图1所示。载体经测序正确，提纯质粒用于后续转染以及病毒的包装。

培养NIH 3T3细胞至单层密度达到80％，更换转染用培养基。将带有转染质粒的转染试剂加入细胞培养物中做瞬时转染。使用荧光质粒评估转染效率。和内参基因GAPDH相比较，分析Ager的RNA表达水平变化。结果见图2。

结果显示，和无关对照质粒以及空转染质粒相比，针对第6以及第7个位点的序列的RNA基因沉默效率较高，可以到达60-75％。当将针对6和7的沉默质粒等比例混合后进行转染，Ager基因在RNA水平的沉默效率达到81％。因此这两个位点可以作为沉默用位点进行体内实验。

实施例2

以实施例1中获得沉默效率较高的第6和第7个位点等比例混合后的沉默质粒进行体内实验。包装慢病毒，包装载体为慢病毒背景的缺陷病毒载体(pLV[shRNA]-EGFP，VectorBuilder)，并与辅助质粒pVSV-G共同转染包装细胞HEK293T细胞，在细胞内病毒得以包装。收集72h细胞培养物，经-80℃至37℃5次冻融，获取病毒，病毒液经5000rpm-30000rpm的差速离心，去除细胞组分，富集病毒，使得病毒的滴度达到1×10⁸pfu/mL以上。将包装好的病毒液调整浓度至5×10⁷pfu/mL，并加入阳离子转染辅助试剂Polybrene，其终浓度为5μg/mL，进行小鼠的尾静脉注射，注射的剂量为100μL。

在转染动物2-7天的时间检测小鼠肺组织中Ager的RNA表达水平，结果可见小鼠肺组织中Ager的表达水平得到下调(图3)。同时参考Hosseini S等方法(Am J ReprodImmunol.78-5)对其他固有免疫受体TLR4进行分析，TLR4受体的表达未见明显变化(图4)。其他免疫因子监测，如T淋巴细胞等亦无明显变化。

实施例3

利用上述建造的Ager肺组织表达下调的BALB/c小鼠与相同年龄、相同性别、相同品系的未经基因沉默操作的对照小鼠同时感染一定量的PVM病毒，动物滴鼻感染，接种病毒浓度为10⁴pfu/mL，接种的病毒体积为30μL。

在动物感染5-7天的时间明显可见Ager基因下调的小鼠活跃度降低，小鼠存在一定的竖毛现象。对此阶段的各组小鼠肺组织取材进行病理检测，评价病变程度，具体参考Martinez的方法(Antiviral Research 135：108-119)。结果如图5，图6所示。

结果显示，对照小鼠在感染PVM之后病理改变不明显，Ager基因沉默动物肺脏组织充血严重，组织病理可见其病程较对照小鼠为严重。

提取100mg小鼠肺组织RNA，溶于50μL去离子水中，应用实时定量荧光PCR对PVM病毒在肺组织中的载量进行分析，在对照小鼠肺组织中病毒的平均载量为5.32×10²copy/μl，而Ager基因沉默小鼠的病毒载量为2.34×10³copy/μl。可见Ager基因沉默小鼠的病毒载量明显高于对照小鼠。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国医学科学院医学实验动物研究所

<120> 一种构建病原感染敏感性动物模型的方法

<130> MP1819472

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aggcgaggga aggaggtca 19

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaggcgagg gaaggaggtc actcgagtga cctccttccc tcgccttttt t 51

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acagccagtg tccctaata 19

<210> 4

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggacagccag tgtccctaat actcgagtat tagggacact ggctgttttt t 51

Claims

1.一种构建PVM病毒感染敏感性动物模型的方法，通过基因沉默技术抑制动物Ager基因的表达；

所述Ager基因的沉默位点的序列如SEQ ID NO:1或3所示；

所述SEQ ID NO:1所示Ager基因的沉默位点的干扰序列如SEQ ID NO:2所示；所述SEQID NO:3所示Ager基因的沉默位点的干扰序列如SEQ ID NO:4所示。

2.根据权利要求1所述的方法，所述基因沉默的沉默机制为shRNA。

3.根据权利要求2所述的方法，所述基因沉默具体方法为构建Ager基因的shRNA载体，转染动物。

4.根据权利要求3所述的方法，所述转染具体为shRNA载体包装病毒，将包装好的病毒液接种于动物体内。

5.根据权利要求4所述的方法，所述病毒为慢病毒。

6.根据权利要求5所述的方法，所述包装好的慢病毒的病毒滴度＞1×10⁸pfu/mL；所述动物为小鼠；所述病毒液接种剂量100μL。

7.根据权利要求5所述的方法，还包括将包装好的病毒液与转染辅助试剂Polybrene混合形成混合液的步骤。