CN116716302B - 一种用于降低食管癌细胞中nek2基因表达的核酸分子 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。本发明采用RNAi方法获得的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒，下调人NEK2基因的表达后可有效地抑制食管癌细胞的增殖和迁移，因此本发明的核酸分子可用于制备治疗食管癌的药物中，从而治疗食管癌，为食管癌治疗开辟新的方向。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种用于降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子。
背景技术
食管癌是发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤之一，对患者健康造成了严重威胁。虽然目前对食管癌的早期诊断水平和治疗措施已经得到了很大提高，但晚期食管癌患者愈后仍然会有复发的危险，因此对食管癌的治疗一直是医疗工作者的研究焦点。因此确定食管癌的特异性基因，明确其表达状态，并针对特异性基因研制和开发药物制剂，有效的提高食管癌的治疗效率，减少药物的毒副作用，具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供NEK2抑制剂在制备治疗食管癌产品中的用途，用于解决现有技术中的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且编码所述第一链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、6、9所示。
进一步的，所述双链RNA或shRNA的靶序列如SEQ ID NO：1、6、9所示。
本发明还提供了一种NEK2基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的siRNA的基因片段，能表达所述siRNA。
本发明还提供所述NEK2基因干扰核酸构建体的制备方法，所述制备方法包括下述步骤：
（1）线性化工具慢病毒载体；
（2）单链引物退火形成oligo DNA；
（3）将oligo DNA和线性化的工具慢病毒载体连接后转化菌落；
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提后获得所述NEK2基因干扰核酸构建体。
本发明还提供了一种NEK2基因干扰慢病毒，由前述NEK2基因干扰核酸构建体在慢病毒辅助质粒、宿主细胞的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明还提供前述核酸分子，或前述NEK2基因干扰核酸构建体，或前述NEK2基因干扰慢病毒的用途，所述用途为：用于制备治疗食管癌的药物，或用于制备降低食管癌细胞中NEK2基因表达的试剂盒。
本发明还提供一种用于预防或治疗食管癌的组合物，其有效物质含有：
前述的核酸分子；和/或，前述NEK2基因干扰核酸构建体；和/或，前述NEK2基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体或辅料。
如上所述，本发明的NEK2抑制剂在制备治疗食管癌产品中的用途，具有以下有益效果：针对目的基因设计了合适的RNAi靶点序列和oligo DNA双链序列，并构建了包含上述oligoDNA双链序列的慢病毒载体质粒和最终形成的慢病毒；慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因NEK2的mRNA表达量，敲减作用非常明显，对食管癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，可用于治疗食管癌的药物中，并且本发明可高通量操作、可重复性高。
附图说明
图1为real-time qPCR方法检测在不同细胞（EC-9706、KYSE450、Eca-109、TE-1）中NEK2基因的本底表达水平；
图2为real-time qPCR方法检测基因NEK2在感染实施例1-3的慢病毒的TE-1细胞中的表达水平；
图3为细胞计数法测量感染实施例3的慢病毒后细胞TE-1在第1天至第5天的细胞生长数量变化的倍数；
图4为划痕实验检测感染实施例3的慢病毒后细胞TE-1的细胞迁移率；
图5为细胞Transwell实验测量感染实施例3的慢病毒后细胞TE-1在培育16h后的迁移细胞数。
具体实施方式
本发明提供人NEK2基因作为靶标在制备食管癌治疗药物中的用途。
NEK2基因即NIMA Related Kinase 2，NCBI Reference Sequence：NM-001204182.2。
所述人NEK2基因作为靶标在制备食管癌治疗药物具体是指：将NEK2基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人NEK2基因表达的药物作为食管癌治疗备选药物。如本发明所述的NEK2基因慢病毒即是以人NEK2基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制食管癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物等也可将NEK2基因作为作用对象。
所述食管癌治疗药物为能够特异性抑制NEK2基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NEK2蛋白的表达或活性的分子，从而降低食管癌细胞中NEK2基因的表达水平，达到抑制食管癌细胞的增殖、迁移的目的。
所述通过NEK2基因制备获得的食管癌治疗药物或者食管癌诊断药物包括但不限于：核酸分子、抗体药、多肽、蛋白或病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA（shRNA）。
所述病毒选自慢病毒、逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。
所述食管癌治疗药物的施用量为足够降低人NEK2基因的转录或翻译，或者足够降低人NEK2蛋白的表达或活性的剂量。以使人NEK2基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
采用前述食管癌治疗药物治疗食管癌的方法，主要是通过降低人NEK2基因的表达水平抑制食管癌细胞的增殖或迁移来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人NEK2基因表达水平的物质给药于患者。
在一种实施方式中，所述靶标的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、6、9所示。具体为：GAGAGAAGAGGGCGACAATTA（SEQ ID NO.1）
CATGACAGAAGCTGAGAAACA（SEQ ID NO.6）
CAGAAAGAACTCGCTGGGAAA（SEQ ID NO.9）。
本发明还提供NEK2抑制剂在制备至少具备以下任一产品中的用途：
治疗食管癌；
抑制食管癌细胞的增殖速率；
抑制食管癌生长；
抑制食管癌细胞迁移。
所述产品必然包括NEK2抑制剂，并以NEK2抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为NEK2抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即，NEK2抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品为药物。
所述NEK2抑制剂可以为核酸分子、抗体、病毒。
在本发明的某些实施例中，所述NEK2抑制剂可以为降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子。具体的，所述核酸分子可以是双链RNA或shRNA。
在本发明的某些实施方式中，所述NEK2抑制剂为慢病毒。所述慢病毒的靶序列如SEQ ID NO.1、6、9中的任一所示。
本发明还提供了一种治疗食管癌的方法，为向对象施用治疗有效量的NEK2抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的食管癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述食管癌细胞可以为离体食管癌细胞。
所述对象可以是罹患食管癌的患者或者期待治疗的食管癌的个体。或者所述对象为食管癌患者或者期待治疗食管癌的个体的离体食管癌细胞。
所述NEK2抑制剂可以在接受食管癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明中的“治疗有效量”或“有效剂量”是指，某种药物有效治疗疾病的剂量或浓度。例如，对于本发明中公开的慢病毒来说，治疗有效量是在该剂量或浓度下，该慢病毒可以清除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌状态的细胞的生长或繁殖、抑制肿瘤细胞转移、减轻任何与肿瘤或癌状态相关的症状或标记，预防或延缓肿瘤或癌状态的发展，或以上的某些组合。
本发明还公开了一种降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA，其中，所述双链RNA中含有能够与NEK2基因杂交的核苷酸序列；所述shRNA中含有能够与NEK2基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与NEK2基因中的靶序列基本相同。优选的，编码所述第一链的核苷酸序列如SEQ ID NO：1、6、9所示。
所述NEK2基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默NEK2基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的NEK2基因中的片段。
进一步的，所述双链RNA或shRNA的靶序列如SEQ ID NO：1、6、9所示。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。
所述双链RNA的一条链即第一链为以SEQ ID NO:1、6或9所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人NEK2基因的小干扰RNA，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默食管癌细胞中内源NEK2基因表达的作用。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NEK2基因中的靶序列基本相同。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA（siRNA）进而起到特异性沉默食管癌细胞中内源NEK2基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
进一步的，所述shRNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2~3或SEQ ID NO.7~8或SEQID NO.10~11所示。
进一步的，所述NEK2基因来源于人。
本发明还提供了一种NEK2基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的siRNA的基因片段，能表达所述siRNA。
所述的NEK2基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人NEK2基因siRNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的，所述NEK2基因干扰核酸构建体为NEK2基因干扰慢病毒载体。
所述NEK2基因干扰核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.15~17所示。
本发明公开的NEK2基因干扰慢病毒载体是将编码前述NEK2基因siRNA的DNA片段克隆入已知载体获得。所述已知载体多为慢病毒载体，所述NEK2基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染食管癌细胞，进而获得所述siRNA，用于特异性沉默NEK2基因的表达。
进一步的，所述NEK2基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码食管癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；例如，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：BR-V108、pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明的NEK2基因干扰核酸构建体的制备方法包括下述步骤：
线性化工具慢病毒载体并获取目的基因靶标片段；
（2）单链引物退火形成oligo DNA；
（3）将oligo DNA和线性化的工具慢病毒载体连接后转化菌落；
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提获得所述NEK2基因干扰核酸构建体；
步骤（1）中，选择BR-V108作为工具慢病毒载体，所述目的基因靶标片段的序列包括SEQ ID NO:1、6或9。
所述步骤（2）中，单链引物包含如下所示的序列：SEQ ID NO.2~3或SEQ ID NO.7~8或SEQ ID NO.10~11。
所述引物退火形成oligo DNA，所述oligo DNA包含如下所示的上游序列：SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.10，以及如下所示的下游链：SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.11。
所述制备步骤（3）中需对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I，将酶切后的工具载体与oligo DNA在反应体系中反应1-3h后，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中进行转化。
所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物-F序列为CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA，鉴定引物-R序列为GTAATACGGTTATCCACGCG。
本发明还提供了一种NEK2基因干扰慢病毒，由前述NEK2基因干扰核酸构建体在慢病毒辅助质粒、宿主细胞的辅助下，经过病毒包装而成。
在本发明的某些实施方式中，所述慢病毒辅助质粒包括pMD2.G载体质粒（例如Addgene，Plasmid #12259）、pSPAX2 载体质粒(例如Addgene，Plasmid #12260)。
病毒包装过程为本领域的常规技术，本发明不做特别限定。
在本发明的某些实施方式中，病毒包装过程如下：
（1）转染前12-18h，消化宿主细胞，调整细胞密度约（4.5-6）×106/15ml，重新接种于细胞培养容器中培养。待细胞密度达 70%～80%时即可用于转染；
（2）转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
（3）在Opti-MEM R1 培养基中加入NEK2基因干扰核酸构建体、慢病毒辅助质粒溶液，室温静置；在另一Opti-MEM R1 培养基中加入对应质量的转染试剂，室温静置；将两者轻柔混匀并在室温下静置；
（4）混合液滴加至宿主细胞培养液中，培养细胞；
（5）收集转染后48h、72h的细胞上清液，分离获得所述慢病毒。
所述质粒的质量比例为NEK2基因干扰核酸构建体：pMD2.G载体质粒：pSPAX2 载体质粒=（8-12）：（6-9）：（3-7）。
所述宿主细胞可选择为293T细胞。
该慢病毒可感染食管癌细胞并产生针对NEK2基因的小分子干扰RNA，从而抑制食管癌细胞的增殖。该NEK2基因干扰慢病毒可用于制备治疗食管癌的药物。
本发明还提供前述核酸分子，或前述NEK2基因干扰核酸构建体，或前述NEK2基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备治疗食管癌的药物，或用于制备降低食管癌细胞中NEK2基因表达的试剂盒。
所述方法的对象可以为人。
本发明的NEK2基因siRNA或慢病毒可用于抑制食管癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗食管癌的药物或制剂。当用作治疗食管癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供一种用于预防或治疗食管癌的组合物，其有效物质含有：
前述的核酸分子；和/或，前述NEK2基因干扰核酸构建体；和/或，前述NEK2基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂;防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于预防或治疗对象体内食管癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述食管癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述食管癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1
本实施例提供了一种用于食管癌的慢病毒，所述慢病毒的RNAi靶点片段的编码序列为：GAGAGAAGAGGGCGACAATTA（SEQ ID NO.1）。
其次，将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，构建慢病毒的载体质粒，制备步骤包括：
选择工具载体，获取目的基因片段；
选择BR-V108作为工具载体，核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示：
gcttaagcggtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgcgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagactcgagcggccgcccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggtCCGCAGGTATGCACGCGTgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcagacgagtcggatctccctttgggccgcctccccgca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ID NO：14）
所述目的基因片段的核心序列为GAGAGAAGAGGGCGACAATTA。
合成单链引物和oligo DNA；
所述步骤（2）中，单链引物包含以下序列：
5’-ccggGAGAGAAGAGGGCGACAATTActcgagTAATTGTCGCCCTCTTCTCTCtttttg-3’（SEQID NO.2）
5’-aattcaaaaaGAGAGAAGAGGGCGACAATTActcgagTAATTGTCGCCCTCTTCTCTC-3’（SEQID NO.3）。
所述引物退火形成oligo DNA，所述oligo DNA包含以下序列：
上游链：5’-ccggGAGAGAAGAGGGCGACAATTActcgagTAATTGTCGCCCTCTTCTCTCtttttg-3’（SEQ ID NO.2）；
下游链：5’-aattcaaaaaGAGAGAAGAGGGCGACAATTActcgagTAATTGTCGCCCTCTTCTCTC-3’（SEQ ID NO.3）。
退火体系为：2.5μL 上游链（10μmol/L）+2.5μL 下游链（10μmol/L）+5μL退火缓冲液+10μL超纯水；退火温度为：在PCR仪中95℃ 5min；95℃ 50s、25℃3min，循环99次；8℃下保存。
将oligo DNA和线性化的工具载体连接后转化；
先对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I；酶切体系为16μL超纯水+30μL 10×CutSmart Buffer（厂家：NEB 组分货号：B6004SVIAL）+12μL 纯化的质粒DNA（1μg/μL）+1μL Age Ⅰ（10U/μL）+1μL EcoR Ⅰ（10U/μL）；在37℃中反应3h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
将酶切后的工具载体与oligo DNA在反应体系中于22℃下反应1h，反应体系为：50ng酶切后的工具载体+2μL oligo DNA（100ng/μL）+2μL 10×T4DNA ligase Buffer（EL0011，ThermoFisher）+0.5μL T4 DNA ligase（EL0016，Fermentas）+超纯水（至体系为20μL）。
冰上融化感受态TOP10感受态细胞（酶康GTC，GTC-BC-G001），将10μL连接产物加入至100μL感受态细胞中，冰上放置1min；42℃水浴锅中热激40s，冰上放置2min；加入200 µL无抗性的LB液体培养基，在200rpm下于37℃摇床震荡培养1h；取150µL菌液均匀涂在含有氨苄（Amp）抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中培养14h。
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；
所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物-F序列为CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA（SEQ IDNO.4），鉴定引物-R序列为GTAATACGGTTATCCACGCG（SEQ ID NO.5）；PCR反应体系为：10μl 2×Hieff UNICON® HotStart PCR Master Mix(With Dye)；（厂家：翌圣 货号：10732ES03）0.4μL鉴定引物-F+0.4μL鉴定引物-R+超纯水（至体系为20μL），PCR扩增条件为：94℃ 3min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，22 次循环；72℃ 5min；PCR 结束后，取5μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带（电泳上样：空白对照以超纯水为模板；阴性对照以以未插入目的基因的空载体为模板）。
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗性的LB液体培养基中，于37℃培养14h，菌落PCR鉴定后送样测序。
将测序正确的菌液转接于150 ml 含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，收集菌液采用天根无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒：
1、菌体富集：取10mL菌液，8000rpm离心4min，收集菌体；2、菌液裂解：加入1 mL的GP1 Buffer 重悬菌体，并转移至2.0 mL离心管；3、裂解终止：0.5 mL 的 GP2 Buffer，轻轻翻转混匀，静置1min，12000 rpm离心1min；取上一步上清液0.7 mL加入活化的吸附柱GP，3000 rpm离心1 min；除去收集管中废液；4、洗涤：加入0.5mL的GPW Buffer，12000 rpm离心1 min；5、回收：更换收集管，向吸附柱加入0.2 mL 的GP3 Buffer，静置1min，12000 rpm离心1min；6、稳定：装有回收液的离心管置于37℃恒温培养箱放置15 min。
慢病毒载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO :15所示：
gcttaagcggtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgcgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagactcgagcggccgcccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggGAGAGAAGAGGGCGACAATTActcgagTAATTGTCGCCCTCTTCTCTCtttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcaga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ID NO :15）
所述慢病毒由上述慢病毒载体质粒、psPAX2 载体质粒和 pMD2.G 载体三质粒共转染293T细胞制成。
所述慢病毒的制备步骤为：（1）转染前16h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞（ATCC ACS-4500），用含10% FBS的培养基调整细胞密度约5×106/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达 70%～80%时即可用于转染；
（2）转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
（3）在500μLOpti-MEM R1 培养基中加入DNA 溶液（慢病毒载体质粒10μg、pMD2.G载体质粒7.5μg、pSPAX2 载体质粒5μg），室温静置5min；在另一500μLOpti-MEM R1 培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂DYB3893，室温静置5min；将两者轻柔混匀并在室温下静置20min。
（4）混合液滴加至293T细胞培养液中，轻轻混匀，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；6h后更换10mL的10%FBS培养基，在37℃、5% CO2培养箱内继续培养60h。
（5）收集转染后48h、72h的细胞上清液，分离即获得慢病毒。
实施例2
本实施例提供了一种用于食管癌的慢病毒，所述慢病毒的RNAi靶点序列，其片段编码序列为：CATGACAGAAGCTGAGAAACA（SEQ ID NO.6）。
其次，将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，构建慢病毒的载体质粒，制备步骤包括：
（1）选择工具载体，获取目的基因片段；
选择BR-V108作为工具载体，所述目的基因片段的核心序列为CATGACAGAAGCTGAGAAACA。
（2）合成单链引物和oligo DNA；
所述步骤（2）中，单链引物包含以下序列：
5’-ccggCATGACAGAAGCTGAGAAACActcgagTGTTTCTCAGCTTCTGTCATGtttttg-3’（SEQID NO.7）
5’-aattcaaaaaCATGACAGAAGCTGAGAAACActcgagTGTTTCTCAGCTTCTGTCATG-3’（SEQID NO.8）。
所述引物退火形成oligo DNA，所述oligo DNA包含以下序列：
上游链：5’-ccggCATGACAGAAGCTGAGAAACActcgagTGTTTCTCAGCTTCTGTCATGtttttg-3’（SEQ ID NO.7）；
下游链：5’-aattcaaaaaCATGACAGAAGCTGAGAAACActcgagTGTTTCTCAGCTTCTGTCATG-3’（SEQ ID NO.8）。
退火体系同实施例1。
（3）将oligo DNA和线性化的工具载体连接后转化；
先对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I；酶切体系为255μL超纯水+30μL10×CutSmart Buffer+12μL 纯化的质粒DNA（1μg/μL）+1μL Age Ⅰ（10U/μL）+1μL EcoR Ⅰ（10U/μL）；在37℃中反应2h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
将酶切后的工具载体与oligo DNA在反应体系中于16℃下反应3h，反应体系为：1μL Linearized Vector（100ng/μL）+1μL Insert（100ng/μL）+2μL 10×T4DNA ligaseBuffer +1μL T4 DNA ligase+超纯水（至体系为20μL）。
冰上融化感受态TOP10感受态细胞，将20μL连接产物加入至200μL感受态细胞中，冰上放置1min；42℃水浴锅中热激40s，冰上放置5min；加入200 µL无抗性的LB液体培养基，在200rpm下于37℃摇床震荡培养1h；取150µL菌液均匀涂在含有Amp抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中培养16h。
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；
所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物-F序列为CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA（SEQ IDNO.4），鉴定引物-R序列为GTAATACGGTTATCCACGCG（SEQ ID NO.5）；PCR反应体系为：0.2μLTaq Plus DNA Polymerase+2μL10×Buffer+0.4μL鉴定引物-F+0.4μL鉴定引物-R+超纯水（至体系为20μL），PCR扩增条件为：94℃ 3min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，22 次循环；72℃ 5min；PCR 结束后，取5μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带（电泳上样：空白对照：以超纯水为模板；阴性对照以以未插入目的基因的空载体为模板）。
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗性的LB液体培养基中，于37℃培养14h，菌落PCR鉴定后送样测序。
将测序正确的菌液转接于150 ml 含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，收集菌液采用天根无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒（步骤同实施例1），慢病毒载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO :16所示：
gcttaagcggtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgcgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagactcgagcggccgcccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggCATGACAGAAGCTGAGAAACActcgagTGTTTCTCAGCTTCTGTCATGtttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcaga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ID NO:16）
所述慢病毒由上述慢病毒载体质粒、psPAX2 载体质粒和 pMD2.G 载体三质粒共转染 293T 细胞制成。
所述慢病毒的制备步骤为：（1）转染前18h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，用含10% FBS的培养基调整细胞密度约4.5×106/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达80%时即可用于转染；
（2）转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
（3）在500μLOpti-MEM R1 培养基中加入DNA 溶液（慢病毒载体质粒12μg、pMD2.G载体质粒9μg、pSPAX2 载体质粒7μg），室温静置5min；在另一500μLOpti-MEM R1 培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂DYB3893，室温静置5min；将两者轻柔混匀并在室温下静置20min。
（4）混合液滴加至293T细胞培养液中，轻轻混匀，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；6h后更换10mL的10%FBS培养基，在37℃、5% CO2培养箱内继续培养60h。
（5）收集转染后48h、72h的细胞上清液，分离即获得慢病毒。
实施例3
本实施例提供了一种用于食管癌的慢病毒，所述慢病毒的RNAi靶点序列，其片段编码序列为：CAGAAAGAACTCGCTGGGAAA（SEQ ID NO.9）。
其次，将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，构建慢病毒的载体质粒，制备步骤包括：
（1）选择工具载体，获取目的基因片段；
选择BR-V108作为工具载体，所述目的基因片段的核心序列为CAGAAAGAACTCGCTGGGAAA。
（2）合成单链引物和oligo DNA；
所述步骤（2）中，单链引物包含以下序列：
5’-ccggCAGAAAGAACTCGCTGGGAAActcgagTTTCCCAGCGAGTTCTTTCTGtttttg-3’（SEQID NO.10）
5’-aattcaaaaaCAGAAAGAACTCGCTGGGAAActcgagTTTCCCAGCGAGTTCTTTCTG-3’（SEQID NO.11）。
所述引物退火形成oligo DNA，所述oligo DNA包含以下序列：
上游链：5’-ccggCAGAAAGAACTCGCTGGGAAActcgagTTTCCCAGCGAGTTCTTTCTGtttttg-3’（SEQ ID NO.10）；
下游链：5’-aattcaaaaaCAGAAAGAACTCGCTGGGAAActcgagTTTCCCAGCGAGTTCTTTCTG-3’（SEQ ID NO.11）。
退火体系同实施例1。
（3）将oligo DNA和线性化的工具载体连接后转化；
先对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I；酶切体系为255μL超纯水+30μL10×CutSmart Buffer+12μL 纯化的质粒DNA（1μg/μL）+1μL Age Ⅰ（10U/μL）+1μL EcoR Ⅰ（10U/μL）；在37℃中反应2h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
将酶切后的载体质粒与oligo DNA在反应体系中于16℃下反应1h，反应体系为：1μL Linearized Vector（100ng/μL）+1μL Insert（100ng/μL）+2μL 10×T4DNA ligaseBuffer +1μL T4 DNA ligase+超纯水（至体系为20μL）。
冰上融化感受态TOP10感受态细胞，将20μL连接产物加入至200μL感受态细胞中，冰上放置1min；42℃水浴锅中热激40s，冰上放置2min；加入200 µL无抗性的LB液体培养基，在200rpm下于37℃摇床震荡培养45min；取150µL菌液均匀涂在含有Amp抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中培养12h。
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；
所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物-F序列为CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA（SEQ IDNO.4），鉴定引物-R序列为GTAATACGGTTATCCACGCG（SEQ ID NO.5）；PCR反应体系为：0.2μLTaq Plus DNA Polymerase+2μL10×Buffer+0.4μL鉴定引物-F+0.4μL鉴定引物-R+超纯水（至体系为20μL），PCR扩增条件为：94℃ 3min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，22 次循环；72℃ 5min；PCR 结束后，取5μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带（电泳上样：空白对照：以超纯水为模板；阴性对照以未插入目的基因的空载体为模板）。
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗性的LB液体培养基中，于37℃培养14h，菌落PCR鉴定后送样测序。
将测序正确的菌液转接于150 ml 含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，收集菌液采用天根无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒（步骤同实施例1），慢病毒载体质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO :17所示：
gcttaagcggtcgacggatcgggagatctcccgatcccctatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagcgcgttttgcctgtactgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacttgaaagcgaaagggaaaccagaggagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccggccgcgctgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtgggaataggagctttgttccttgggttcttgggagcagcaggaagcactatgggcgcagcgtcaatgacgctgacggtacaggccagacaattattgtctggtatagtgcagcagcagaacaatttgctgagggctattgaggcgcaacagcatctgttgcaactcacagtctggggcatcaagcagctccaggcaagaatcctggctgtggaaagatacctaaaggatcaacagctcctggggatttggggttgctctggaaaactcatttgcaccactgctgtgccttggaatgctagttggagtaataaatctctggaacagatttggaatcacacgacctggatggagtgggacagagaaattaacaattacacaagcttaatacactccttaattgaagaatcgcaaaaccagcaagaaaagaatgaacaagaattattggaattagataaatgggcaagtttgtggaattggtttaacataacaaattggctgtggtatataaaattattcataatgatagtaggaggcttggtaggtttaagaatagtttttgctgtactttctatagtgaatagagttaggcagggatattcaccattatcgtttcagacccacctcccaaccccgaggggacccgacaggcccgaaggaatagaagaagaaggtggagagagagacagagacagatccattcgattagtgaacggatcggcactgcgtgcgccaattctgcagacaaatggcagtattcatccacaattttaaaagaaaaggggggattggggggtacagtgcaggggaaagaatagtagacataatagcaacagacatacaaactaaagaattacaaaaacaaattacaaaaattcaaaattttcgggtttattacagggacagcagagatccagtttggttagtaccgggcccgctctagactcgagcggccgcccccttcaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccggCAGAAAGAACTCGCTGGGAAActcgagTTTCCCAGCGAGTTCTTTCTGtttttgaattcggatccattaggcggccgcgtggataaccgtattaccgccatgcattagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctggtttagtgaaccgtcagatccgctagcgctaccggacgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaacgtcgagggacctaataacttcgtatagcatacattatacgaagttatacatgtttaagggttccggttccactaggtacaattcgatatcaagcttatcgataatcaacctctggattacaaaatttgtgaaagattgactggtattcttaactatgttgctccttttacgctatgtggatacgctgctttaatgcctttgtatcatgctattgcttcccgtatggctttcattttctcctccttgtataaatcctggttgctgtctctttatgaggagttgtggcccgttgtcaggcaacgtggcgtggtgtgcactgtgtttgctgacgcaacccccactggttggggcattgccaccacctgtcagctcctttccgggactttcgctttccccctccctattgccacggcggaactcatcgccgcctgccttgcccgctgctggacaggggctcggctgttgggcactgacaattccgtggtgttgtcggggaaatcatcgtcctttccttggctgctcgcctgtgttgccacctggattctgcgcgggacgtccttctgctacgtcccttcggccctcaatccagcggaccttccttcccgcggcctgctgccggctctgcggcctcttccgcgtcttcgccttcgccctcaga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ID NO :17）
所述慢病毒由上述慢病毒载体质粒、psPAX2 载体质粒和 pMD2.G 载体三质粒共转染 293T 细胞制成。
所述慢病毒的制备步骤为：
（1）转染前12h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，用含10% FBS的培养基调整细胞密度约6×106/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%时即可用于转染；
（2）转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
（3）在500μLOpti-MEM R1 培养基中加入DNA 溶液（慢病毒载体质粒10μg、pMD2.G载体质粒8μg、pSPAX2 载体质粒6μg），室温静置5min；在另一500μLOpti-MEM R1 培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂DYB3893，室温静置5min；将两者轻柔混匀并在室温下静置20min。
（4）混合液滴加至293T细胞培养液中，轻轻混匀，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；6h后更换10mL的10%FBS培养基，在37℃、5%CO2培养箱内继续培养48h。
（5）收集转染后48h、72h的细胞上清液，分离即获得慢病毒。
以下几个实施例是对实施例1-3获得的慢病毒进行性能测试，其中shCtrl代表感染阴性对照慢病毒的正常目的细胞组（对照组）；shNEK2-1、shNEK2-2、shNEK2-3分别对应感染实施例1-3中RNAi慢病毒的正常目的细胞组（实验组）。对照组的制备方法和实验组相同，不同之处在于对照的靶序列如SEQ ID NO :18所示：
tTCTCCGAACGTGTCACGT（SEQ ID NO :18）；
单链引物正向链序列如SEQ ID NO :19所示：ccggtTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAATTTTTg（SEQ ID NO :19）
单链引物反向链序列如SEQ ID NO :20所示：AATTCAAAAATTCTCCGAACGTGTCACGTCTCGAGACGTGACACGTTCGGAGAA（SEQ ID NO :20）。
实施例4 real-time qPCR检测目的基因NEK2的表达水平
首先对三种细胞感染慢病毒之前的NEK表达水平进行检测：根据sigma公司的Trizol操作进行总RNA抽提后，将4XgDNA wiper mix和1.0μg total RNA 加入到PCR水管中，补充 RNase-Free H2O至8μL，混匀后离心，42℃温浴2min；加入5X qPCR supermix，于55℃15min，85℃2min程序下进行逆转录；将得到的cDNA置于-80℃保存备用。real-time qPCR反应体系为：5.0μLSYBR Green master mixs + 0.25μL上游引物（10μmol/L，序列为TGCTTCGTGAACTGAAACATCC（SEQ ID NO.12）+ 0.25μL下游引物（10μmol/L，序列为CCAGAGTCAACTGAGTCATCACT（SEQ ID NO.13）+ 0.2μL Dye2（启衡星，FS-Q1001）+ 2.3μLRNase-Free H2O；通过 2－△△Ct法分析mRNA的表达水平；基因NEK2在不同细胞中的表达结果见图1。从图1中看出：NEK2基因在不同食管癌细胞中具有较高的本底表达水平。
按照以下步骤利用慢病毒感染细胞：将TE-1细胞传代培养后，对处于对数生长期的TE-1细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；将适量的细胞悬液接种于96-well中，37℃、5%CO2培养箱培养待细胞融合度达到约70%；根据细胞 MOI 值，加入制备的病毒；12 h 后观察细胞状态，更换培养基；感染 2-3 天后，对于带 GFP 报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测 GFP 荧光强度；对于携带 Puromycin 抗性基因的病毒，换上含适当浓度Puromycin完全培养液筛选出稳定表达的细胞株。按照前述方法提取总RNA进行检测。实施例1-3中制备的慢病毒感染TE-1细胞后，对NEK2表达的影响结果见图2；
从图2中看出：TE-1 细胞中，感染慢病毒后，相对于shCtrl组，实施例1即shNEK2-1组NEK2基因敲减效率达到37.5% (p<0.05)；实施例2即shNEK2-2组NEK2基因敲减效率达到26.7% (p<0.05)；实施例3即shNEK2-3组NEK2基因敲减效率达到96.4% (p<0.05)。
实施例5 细胞计数检测生长
将处于对数生长期的TE-1细胞（包括shCtrl组和shNEK2组）胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞大小决定铺板细胞密度（细胞铺板数设定为2000 cell/well），37℃、5%CO2 培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板中保证每孔加入细胞数目一致；第二天开始每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysissettings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。经慢病毒感染目的细胞5天后，实施例3与对照组细胞数量的变化倍数随时间变化的曲线结果见图3。结果显示，慢病毒感染后，相比shCtrl组，实施例3即shNEK2组细胞增殖抑制明显，倍数改变值为- 4.32 (p<0.05)。
实施例6 划痕实验测定细胞迁移率
将处于对数生长期的TE-1细胞（包括shCtrl组和shNEK2组）胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞大小决定铺板细胞密度（细胞铺板数设定为50000cell/well），以次日细胞达到90%以上汇合度为准；37℃、5%CO2 培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔；第二天换低浓度血清培养基，使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位，向上轻推形成划痕；使用无血清培养基轻轻漂洗2遍，加入低浓度血清培养基（0.5% FBS），0h拍照；37℃、5% CO2培养箱培养，根据愈合程度选择合适时间用cellomics扫板，并用cellomics分析迁移面积。实施例3的测试结果见图4。从图4中看出：慢病毒感染后，相比shCtrl组，实施例3即shNEK2组8 h细胞迁移率降低77.3% (p<0.05)。
实施例7 细胞Transwell实验
（1）取所需数量小室于一空24孔板中，加100µL无血清培养基到小室内，培养箱放置 1~2h；
（2）准备细胞悬液：胰酶消化处于对数生长期的各组TE-1细胞（包括shCtrl组和shNEK2组），用低血清培养基重悬，制成细胞悬液；血球计数板对细胞悬液进行细胞计数，
（3）在步骤（1）完成后，从小室内小心移去培养基，加 600µL含30%FBS培养基到下室中，用无血清培养基按一定比例稀释细胞，加该细胞悬液（含100000~200000 cell）100 μL到每个小室中；用镊子将小室转移入含30%FBS培养基的下室中，在组织培养箱中培养20hours，倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去非转移细胞，加400µL染色液到24孔板的空孔中，将小室浸泡在染色液中5min，在膜的下表面染色转移细胞，浸泡小室在一个大的水杯中，冲洗数次，空气中晾干，显微镜拍照膜。实施例3的实验组与对照组在Transwell小室内孵育16h后的转移细胞数对比结果见图5。从图5中看出：慢病毒感染后，相比shCtrl组，实施例3即shNEK2组Transwell转移率降低93% (p<0.05)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (8)
1.一种用于降低食管癌细胞中NEK2基因表达的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA，其中，所述双链RNA中含有能够与NEK2基因杂交的核苷酸序列，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与NEK2基因中的靶序列相同；所述shRNA中含有能够与NEK2基因杂交的核苷酸序列，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NEK2基因中的靶序列相同，所述双链RNA中编码所述第一链的核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示，所述shRNA的编码核苷酸序列如SEQ ID NO.10~11所示；所述双链RNA或shRNA的靶序列如SEQ ID NO：9所示。
2.根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为siRNA。
3.一种NEK2基因干扰核酸构建体，其特征在于，含有编码权利要求1-2任一所述核酸分子中的siRNA的基因片段，能表达所述siRNA，所述NEK2基因干扰核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO.17任一所示。
4.权利要求3所述的NEK2基因干扰核酸构建体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括下述步骤：
（1）线性化工具慢病毒载体；
（2）单链引物退火形成oligo DNA，单链引物包含如SEQ ID NO.10~11所示的序列；
（3）将oligo DNA和线性化的工具慢病毒载体连接后转化菌落；
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提后获得所述NEK2基因干扰核酸构建体。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括以下特征中的任一项或多项：
A）步骤（1）中，工具慢病毒载体为BR-V108；
B）所述oligo DNA包含如SEQ ID NO.10所示的上游链和如SEQ ID NO.11所示的下游链。
6.一种NEK2基因干扰慢病毒，其特征在于，由权利要求3所述的NEK2基因干扰核酸构建体在慢病毒辅助质粒、宿主细胞的辅助下，经过病毒包装而成。
7.权利要求1-2任一所述的核酸分子，或权利要求3所述的NEK2基因干扰核酸构建体，或权利要求6所述的NEK2基因干扰慢病毒的用途，所述的用途为：用于制备治疗食管癌的药物，或用于制备降低食管癌细胞中NEK2基因表达的试剂盒。
8.一种用于预防或治疗食管癌的组合物，其特征在于，其有效物质含有：
权利要求1-2任一所述的核酸分子；和/或，权利要求3所述的NEK2基因干扰核酸构建体；和/或，权利要求6所述的NEK2基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体或辅料。
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