CN112725436A - 一种人circMKLN1基因的用途及相关产品 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药研究领域，具体涉及人circMKLN1作为靶标在制备肺纤维化治疗药物或者在制备肺纤维化诊断药物中的用途，circMKLN1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：治疗肺纤维化；抑制circMKLN1表达增加；抑制肺上皮细胞向间质细胞形态转化，所述治疗肺纤维化包括治疗百草枯导致的肺纤维化。本发明确认了circMKLN1在百草枯致肺纤维化中的作用，明确其是通过海绵吸附作用调控miR‑26a/b促进EMT的机制。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制肺上皮细胞向间质细胞转化，从而实现治疗肺纤维化。

Description

一种人circMKLN1基因的用途及相关产品

技术领域

本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及一种人circMKLN1基因的用途及相关产品。

背景技术

肺是百草枯(paraquat，PQ)中毒的主要靶器官，进行性加重的肺纤维化是患者死亡的主要原因。研究证实，上皮细胞在机体中起着分泌、支持等作用，通常情况下，细胞的极性以及细胞间的黏附连接限制了上皮细胞任意迁移的能力。但在特定的生理或病理状况下，上皮细胞可向间质细胞形态转化，导致原有的细胞极性丧失、黏附能力下降、细胞骨架发生变化，从而增强细胞迁移和运动的能力，称为上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT除了在胚胎发育期对器官形成和神经系统分化至关重要之外，在病理状态下，尤其是炎症、器官纤维化和高转移性癌症中，EMT也扮演着重要角色。发明人的前期研究发现，PQ中毒早期(2h)大鼠肺组织内即出现蓝染的胶原纤维沉积，提示肺部已经开始纤维化形成过程，大鼠肺组织上皮标志物ZO-1表达明显下降，间质标志物α-SMA表达显著增加，即发生EMT，提示EMT在PQ致肺纤维化中也发挥重要作用，但其机制仍未明确。因此，深入研究PQ中毒诱导EMT发生的机制，对于阻止PQ致肺纤维化的发生发展具有重要意义。

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类内源性非编码RNA分子，具有封闭的环形结构，主要由外显子和(或)内含子构成，在真核细胞中普遍存在。环状RNA具有高度稳定性、物种保守性以及细胞和组织特异性等特点。研究显示，环状RNA与多种疾病的发生发展有重要关系，包括动脉粥样硬化血管疾病、糖尿病、神经系统疾病和多种恶性肿瘤等。Li等研究发现，hsa_circ_002059作为一种典型的环状RNA，其在胃癌组织中的表达水平明显低于癌旁非肿瘤组织，低表达的hsa_circ_002059与胃癌转移、进展程度、性别及年龄等密切相关，可能作为评价胃癌严重程度等指标之一。有关环状RNA在肺癌、急性呼吸窘迫综合征、肺动脉高压等肺部疾病中的作用研究也越来越。Tan等在非小细胞肺癌中新近研究发现，环状RNA F-circEA可以促进肿瘤细胞的增殖和迁移，且在血浆中检测其表达变化，提示环状RNAF-circEA可作为评估非小细胞肺癌预后的指标之。Li等利用基因芯片检测特发性肺纤维化患者血浆中的环状RNA表达变化，并利用PCR验证，结果显示分别有3个环状RNA(hsa_circRNA_100906、hsa_circRNA_102100、hsa_circRNA_102348)表达升高和3个环状RNA(hsa_circRNA_101225、hsa_circRNA_104780、hsa_circRNA_101242)表达降低，再结合生物信息学分析，发现这些环状RNA可能与TGF-β1、HIF-1、Wnt、NF-κB等调控纤维化形成的关键因子表达有关。因此，环状RNA可能在肺纤维化中起着重要作用。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种人circMKLN1基因的用途及相关产品，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供如下技术方案：

本发明的第一方面，提供人circMKLN1作为靶标在制备肺纤维化治疗药物或者在制备肺纤维化诊断药物中的用途。

本发明第二方面，提供circMKLN1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗肺纤维化；

抑制基因circMKLN1表达；

抑制肺上皮细胞向间质细胞转化。

本发明第三方面，提供一种降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：双链RNA或shRNA，所述双链RNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列，所述shRNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列。其中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同。

本发明第四方面，提供一种circMKLN1基因干扰核酸构建体，含有编码第一方面所述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

本发明第五方面，提供一种circMKLN1基因干扰慢病毒，由第四方面所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

本发明第六方面，提供第三方面所述的核酸分子，或第四方面所述circMKLN1基因干扰核酸构建体，或第五方面所述的circMKLN1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗肺纤维化的药物，或用于制备检测肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的试剂盒。

本发明第七方面，提供一种用于预防或治疗肺纤维化的组合物，其有效物质含有：第三方面所述的核酸分子；和/或，第四方面所述circMKLN1基因干扰核酸构建体；和/或，第五方面所述的circMKLN1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

如上所述，本发明的人circMKLN1基因的用途及相关产品，具有以下有益效果：

本发明经过广泛而深入的研究发现，确认了circMKLN1在百草枯致肺纤维化中的作用，明确其是通过海绵吸附作用调控miR-26a/b促进EMT的机制。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制肺上皮细胞向间质细胞转化，从而实现治疗肺纤维化。

附图说明

图1显示为机理示意图。

图2显示为百草枯染毒肺泡上皮细胞后环状RNA测序图。

图3显示为RT-PCR验证百草枯染毒肺泡上皮细胞环状RNA表达变化图。

图4显示为百草枯(PQ)处理体外肺泡上细胞(A549细胞)24h，qPCR及原位杂交(FISH)实验检测结果。

图5显示为circMKLN1与miR-26a/b及miR-26a/b与其靶基因结合位点。

图6显示为体外肺泡上皮细胞中予以circMKLN1 siRNA敲低circMKLN1表达后，PQ处理24h，Western blot检测结果。

图7显示为体外肺泡上皮细胞中予以circMKLN1质粒过表达circMKLN1后，PQ处理24h，Western blot检测结果。

图8显示为大鼠体内予以circMKLN1 shRNA抑制circMKLN1表达。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

本发明证实了circMKLN1基因在肺纤维化发生中的作用，研究显示，转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是促进肺纤维化进展的重要因子。TGF-β1配体与细胞表面TGF-βⅠ和Ⅱ型受体结合形成异聚体复合物，使TGF-βⅡ型受体磷酸化，后者磷酸化TGF-βⅠ型受体的GS结构域并使之活化，然后磷酸化Smad家族中的Smad2和Smad3，Smad2/3磷酸化后与Co-Smad(Smad4)结合形成异聚体复合物，在一些转录协同或抑制因子的共同作用下调控目的基因的转录，进而诱导EMT等促纤维化过程发生，结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)也是促进肺纤维化中EMT发生的重要调控因子之一，在TGF-β1作用下参与肺纤维化进程。百草枯中毒后，肺泡上皮细胞内circMKLN1表达明显升高，可能通过与细胞内miR-26a/b结合，解除miR-26a/b对下游靶基因Smad4和CTGF表达的抑制，诱导肺泡上皮细胞发生EMT，从而促进肺纤维化的发生发展。

本发明的第一方面，提供人circMKLN1基因作为靶标在制备肺纤维化治疗药物或者在制备肺纤维化诊断药物中的用途。

所述人circMKLN1基因作为靶标在制备肺纤维化治疗药物具体是指：将circMKLN1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人circMKLN1基因表达的药物作为肺纤维化治疗备选药物。如本发明所述的circMKLN1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人circMKLN1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肺纤维化作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将circMKLN1基因作为作用对象。

所述将人circMKLN1基因作为靶标用于制备肺纤维化诊断药物具体是指：将circMKLN1基因表达产物作为一项肺纤维化诊断指标应用于肺纤维化诊断药物的制备。

通过基因芯片检测circMKLN1在百草枯致肺纤维化肺泡上皮细胞模型中和肺正常肺泡上皮细胞的表达水平。本发明确认了circMKLN1在肺纤维化肺泡上皮细胞模型中的表达量显著高于肺正常肺泡上皮细胞。确认circMKLN1基因的表达水平能成为肺纤维化诊断的标志物。

所述肺纤维化治疗药物为能够特异性抑制circMKLN1基因的转录，从而降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因的表达水平，达到抑制肺上皮细胞向间质细胞转化，实现治疗或预防肺纤维化的目的。

所述通过circMKLN1基因制备获得的纤维化治疗药物或者纤维化诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。

所述纤维化治疗药物的施用量为足够降低人circMKLN1基因的转录的剂量。以使人circMKLN1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。

采用前述纤维化治疗药物治疗纤维化的方法，主要是通过降低人circMKLN1基因的表达水平抑制肺泡上皮细胞发生间质转化到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人circMKLN1基因表达水平的物质给药于患者。

本发明第二方面，提供circMKLN1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗肺纤维化；

抑制circMKLN1表达增加；

抑制肺上皮细胞向间质细胞转化。

circMKLN1抑制剂是指对于circMKLN1具有抑制效果的分子。对于circMKLN1具有抑制效果包括但不限于：抑制circMKLN1的表达或活性。

抑制circMKLN1活性是指使circMKLN1活力下降。优选地，相比抑制前，circMKLN1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。

抑制circMKLN1表达具体的可以是抑制circMKLN1基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使circMKLN1的基因不转录，或降低circMKLN1的基因的转录活性，或者使circMKLN1的基因不翻译，或降低circMKLN1的基因的翻译水平。

本领域技术人员可以使用常规方法对circMKLN1的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。

circMKLN1的基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。

优选地，与野生型相比，circMKLN1基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地circMKLN1基因完全没有表达。

在一实施例中，所述治疗肺纤维化包括治疗百草枯导致的肺纤维化。百草枯中毒后致使肺泡上皮细胞中的circMKLN1基因表达升高，诱导肺泡上皮细胞向间质细胞形态转化，导致肺纤维化。本发明中的circMKLN1抑制剂可以实现抑制circMKLN1的活性，可有效防止肺泡上皮细胞向间质细胞形态转化，减缓肺纤维化进展。

所述产品必然包括circMKLN1抑制剂，并以circMKLN1抑制剂作为前述功效的有效成分。

所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为circMKLN1抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。

亦即，circMKLN1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。

所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。

所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。

所述circMKLN1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。

如本发明实施例列举的，所述circMKLN1抑制剂可以为降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链RNA或shRNA。

本发明第三方面，提供一种降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：双链RNA或shRNA。所述双链RNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列，所述shRNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列。

所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同。

在一实施例中，所述circMKLN1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默circMKLN1基因，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的circMKLN1基因中的片段。

优选地，所述双链RNA的靶序列如SEQ ID NO：1所示。具体为，5'-3'：AAAUAGGAACAUUUUAGUGTT。

更优选地，所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO：2所示，具体为，5'-3'：AAAUAGGAACAUUUUAGUGTT。所述双链RNA第二链的序列如SEQ ID NO：3所示，具体为，5'-3'：CACUAAAAUGUUCCUAUUUTT。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。

SEQ ID NO：2为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人circMKLN1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肺上皮细胞中circMKLN1基因表达的作用。

所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同。

优选地，所述shRNA的靶序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：5'-3'：AAAUAGGAACAUUUUAGUGTT。

所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默肺上皮细胞中内源circMKLN1基因表达的作用。

优选地，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

更优选地，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：4所示，具体为CTGGATGGGACTTATAGCAGAGCTCGTTTAGTGACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGACTCTACTAGAACCGGTGCGGCCGCGAATTCCACTAAAATGTTCCAATTTCTCGAGAAATTGGAACATTTTAGTGGGATCCAAGGATCTGCGATCGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACGGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGCTGAAGCTTCGAGGGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTACACTAGTGCCACCATGGCCCAGTCCAAGCACGGCCTGACCAAGGAGATGACCATGAAGTACCGCATGGAGGGCTGCGTGGACGGCCACAAGTTCGTGATCACCGGCGAGGGCATCGGCTACCCCTTCAAGGGCAAGCAGGCCATCAACCTGTGCGTGGTGGAGGGCGGCCCCTTGCCCTTCGCCGAGGACATCTTGTCCGCCGCCTTCATGTACGGCAACCGCGTGTTCACCGAGTACCCCCAGGACATCGTCGACTACTTCAAGAACTCCTGCCCCGCCGGCT。

优选地，所述circMKLN1基因来源于人。

本发明第四方面，提供一种circMKLN1基因干扰核酸构建体，含有编码第一方面所述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

所述circMKLN1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人circMKLN1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。

进一步的，所述circMKLN1基因干扰核酸构建体为circMKLN1基因干扰慢病毒载体。

本发明公开的circMKLN1基因干扰慢病毒载体是将编码前述circMKLN1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述circMKLN1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肺泡上皮细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默circMKLN1基因的表达。

进一步的，所述circMKLN1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肺泡上皮细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一种。

本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人circMKLN1基因干扰慢病毒载体，命名为PGMLV-SC5和PGMAAV-10261。

本发明的circMKLN1基因siRNA可用于抑制肺泡上皮细胞向间质细胞转化，进一步地可以用作治疗肺泡上皮细胞向间质细胞转化和肺纤维化的药物或制剂。circMKLN1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述circMKLN1基因的siRNA，当用作治疗肺泡上皮细胞向间质细胞转化的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第五方面，提供一种circMKLN1基因干扰慢病毒，由第四方面所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

该慢病毒可感染肺泡上皮细胞并产生针对circMKLN1基因的小分子干扰RNA，从而抑制肺泡上皮细胞向间质细胞形态转化。该circMKLN1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肺纤维化的药物。

本发明第六方面，提供第三方面所述的核酸分子，或第四方面所述circMKLN1基因干扰核酸构建体，或第五方面所述的circMKLN1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗肺纤维化的药物，或用于制备检测肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的试剂盒。

所述预防或治疗肺纤维化的药物的应用为肺纤维化的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肺纤维化的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。

进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内肺泡上皮细胞时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述肺泡上皮细胞抑制circMKLN1基因表达。进一步的，所述肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％被抑制。

所述方法的对象可以为人。

本发明第七方面，提供一种用于预防或治疗肺纤维化的组合物，其有效物质含有：第三方面所述的核酸分子；和/或，第四方面所述circMKLN1基因干扰核酸构建体；和/或，第五方面所述的circMKLN1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

所述组合物可以为药物组合物。

本发明实施例具体列举了利用脂质体包装siRNA，转染肺上皮细胞抑制circMKLN1基因的表达。

当所述组合物用于预防或治疗对象体内肺泡上皮细胞时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，抑制所述肺泡上皮细胞的circMKLN1基因表达。进一步的，所述肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％被抑制。

所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。

所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。

综上所述，本发明设计了针对人circMKLN1基因的RNAi靶点序列，构建相应的circMKLN1的RNAi载体，其中RNAi载体(构建的抑制表达质粒)能够显著下调circMKLN1基因对circMKLN1的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体(构建的抑制表达质粒)能够靶向地将针对circMKLN1基因的RNAi序列高效导入肺泡上皮细胞，降低circMKLN1基因的表达水平。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1

相应浓度的PQ染毒处理肺泡上皮细胞(A549细胞)24h，提取细胞内总RNA，利用高通量测序技术检测细胞内环状RNA的表达变化。结果显示如图所示，(A)PQ处理A549细胞后环状RNA 测序结果热图。(B)PQ处理A549细胞后环状RNA测序结果火山图，选择表达2倍以上的环状RNA，A549细胞内表达明显升高和降低的分别有310和670个。

实施例2

将A549细胞内所有环状RNA在大鼠种属中做同源性分析，共筛选到24个环状RNA，并结合表达量的高低、成环的可靠程度等因素，拟选择PQ组表达量升高的前5个环状RNA(circMKLN1、circUBAP2L、circNUFIP2、circUBE2D2、circPAPOLA)进一步验证、筛选(表1)。

表1. A549细胞内所有环状RNA在大鼠种属中的同源性分析结果

junction数越大，表示环状RNA成环的可靠性越高。

实施例3

建立PQ染毒大鼠模型：健康清洁级成年雄性Spragne-Dawley(SD)大鼠，体重(250±30)g，随机分为正常对照组：生理盐水1ml一次性灌胃；PQ中毒组：按50mg/kg将20％PQ用生理盐水稀释到1ml一次性灌胃。观察指标：以出现食欲下降、反应迟钝、毛蓬松、鼠尾紫绀、呼吸困难、不能支持体重、易捕捉等标准选择染毒组模型动物，剔除中毒症状不明显的动物。

提取PQ染毒后的肺泡上皮细胞和大鼠肺组织的总RNA，实时荧光定量PCR(RT-PCR)验证环状RNA表达变化，并将产物进行Sanger测序。结合表达量的高低、成环的可靠程度等因素，我们选择PQ组表达量最高的前5个环状RNA(circMKLN1、circUBAP2L、circNUFIP2、circUBE2D2、circPAPOLA)进一步行RT-PCR验证。

结果如图所示，(图A)，PQ组中circMKLN1的表达量和成环可靠性均为最高，PQ处理后RLE-6TN细胞内circMKLN1表达也明显升高(图B)，PQ处理大鼠肺组织12h后circMKLN1也显著升高，24h时达到高峰(图C)，Sanger测序结果显示接头位点与circBase中接头处序列一致(图D)。

实施例4

a.建立PQ染毒大鼠模型：建立方法与实施例3相同。

b.建立PQ染毒肺泡上皮细胞模型：体外培养人肺泡上皮细胞(A549)，用不同浓度的PQ刺激不同时间，观察细胞形态变化，检测EMT相关标志物(Ecadherin、α-SMA、Vimentin)表达，观察PQ是否可以引起肺泡上皮细胞获得成纤维细胞表型，即发生EMT变化(A549细胞表型转化模型已建立成功)。

c.RNA原位杂交法定位检测circMKLN1：构建circMKLN1 FISH探针，在肺组织及细胞内原位检测circMKLN1表达变化。

结果如图4所示，百草枯(PQ)处理体外肺泡上细胞(A549细胞)24h，qPCR及原位杂交(FISH)实验检测结果，显示circNKLN1表达明显升高(A和C)。在PQ染毒大鼠肺组织中，7d和14d两个时间点，circNKLN1表达均显著升高，且在7d最为显著(B)，FISH实验检测显示PQ染毒后大鼠肺组织circNKLN1表达明显升高(D)。以上提示，PQ中毒可明显促进circMKLN1升高。

实施例5

利用生物信息学技术，分别在miRanda、pita、RNAhybrid三个数据库中筛选人和大鼠种属中与circMKLN1相结合的miRNA，再取其交集，共得到5个miRNA(miR-26a、miR-26b、miR-30b、miR-612和miR-1261)，其中miR-26家族的miR-26a和miR-26b(简写为miR-26a/b)均可与Smad4和CTGF mRNA 3’UTR结合。Interactome、microRNA.org数据库中搜索circMKLN1与miR-26a/b及miR-26a/b与其靶基因结合位点。

结果如图1和图5所示，circMKLN1与miR-26a/b及miR-26a/b与其靶基因结合位点。(A)miRanda、pita、RNAhybrid三个数据库中筛选人和大鼠种属中与circMKLN1相结合的miRNA，并取交集。(B)circMKLN1与miR-26a/b结合位点示意图。(C和D)miR-26a/b与Smad4及CTGF结合位点示意图。

实施例6

a.体外实验：构建circMKLN1 siRNA或过表达质粒，利用脂质体进行体外肺泡上皮细胞(A549)转染48h，抑制或过表达circMKLN1，PQ染毒处理24h，免疫荧光、Western blot等检测肺组织collagen 1a1(简写为Col-1)、Ecadherin、α-SMA、Vimentin等指标变化。

结果如图6所示，体外肺泡上皮细胞中予以circMKLN1 siRNA敲低circMKLN1表达后，PQ处理24h，Western blot检测结果显示，抑制circMKLN1后，上皮标志物E-cadherin表达较NC+PQ(转染了混杂序列，再用PQ处理的实验组)组明显增加，而间质标志物α-SMA和Vimentin表达显著下降，Ⅰ型胶原蛋白表达也明显下降(A)。免疫荧光结果同样证明抑制circMKLN1后可显著减轻PQ诱导的EMT(B)。以上体外实验提示，抑制circMKLN1后改善PQ诱导的EMT及胶原蛋白的合成。

如图7所示，体外肺泡上皮细胞中予以circMKLN1质粒过表达circMKLN1后，PQ处理24h，Western blot检测结果显示，过表达circMKLN1后，上皮标志物E-cadherin表达较NC+PQ(转染了混杂序列，再用PQ处理的实验组)组进一步下降，而间质标志物α-SMA和Vimentin表达进一步增加，Ⅰ型胶原蛋白表达也明显增加。以上体外实验提示，过表达circMKLN1后可加重PQ诱导的EMT及胶原蛋白的合成。

b.体内实验：构建circMKLN1慢病毒shRNA，首先利用滴鼻法滴入circMKLN1shRNA，在肺组织内抑制circMKLN1表达。然后利用上述方法在PQ染毒大鼠模型中抑制circMKLN1，肺组织Masson染色，Western blot等检测肺组织Col-1、Ecadherin、α-SMA、Vimentin等指标变化。

结果如图8所示，大鼠体内予以circMKLN1 shRNA抑制circMKLN1表达，PQ处理7天后，masson染色检测肺组织胶原蛋白沉积变化，结果显示，体内抑制circMKLN1后，肺组织蓝染的胶原纤维明显减少，提示抑制circMKLN1后可改善PQ诱导的肺纤维化(图8A)。大鼠体内予以circMKLN1 shRNA抑制circMKLN1表达，PQ处理7天后，Western blot检测结果显示，抑制circMKLN1后，上皮标志物E-cadherin表达较NC+PQ(转染了混杂序列，再用PQ处理的实验组)组明显增加，而间质标志物α-SMA和Vimentin表达显著下降，Ⅰ型胶原蛋白表达也明显下降，以上在体内实验说明抑制circMKLN1后改善PQ诱导的EMT及纤维化(图8B)。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 一种人circMKLN1基因的用途及相关产品

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaauaggaac auuuuagugt t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaauaggaac auuuuagugt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cacuaaaaug uuccuauuut t 21

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctggatggga cttatagcag agctcgttta gtgaccgtca gatcgcctgg agacgccatc 60

cacgctgttt tgacctccat agaagacacc gactctacta gaaccggtgc ggccgcgaat 120

tccactaaaa tgttccaatt tctcgagaaa ttggaacatt ttagtgggat ccaaggatct 180

gcgatcgctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc gcccacagtc cccgagaagt 240

tgggggaggg gtcggcaatt gaacgggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga 300

aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag 360

tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacagctgaa 420

gcttcgaggg gctcgcatct ctccttcacg cgcccgccgc cctacctgag gccgccatcc 480

acgccggttg agtcgcgttc tgccgcctcc cgcctgtggt gcctcctgaa ctgcgtccgc 540

cgtctaggta agtttaaagc tcaggtcgag accgggcctt tgtccggcgc tcccttggag 600

cctacctaga ctcagccggc tctccacgct ttgcctgacc ctgcttgctc aactctacgt 660

ctttgtttcg ttttctgttc tgcgccgtta cagatccaag ctgtgaccgg cgcctacact 720

agtgccacca tggcccagtc caagcacggc ctgaccaagg agatgaccat gaagtaccgc 780

atggagggct gcgtggacgg ccacaagttc gtgatcaccg gcgagggcat cggctacccc 840

ttcaagggca agcaggccat caacctgtgc gtggtggagg gcggcccctt gcccttcgcc 900

gaggacatct tgtccgccgc cttcatgtac ggcaaccgcg tgttcaccga gtacccccag 960

gacatcgtcg actacttcaa gaactcctgc cccgccggct 1000

Claims (11)

1.人circMKLN1作为靶标在制备肺纤维化治疗药物或者在制备肺纤维化诊断药物中的用途。

2.circMKLN1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：

治疗肺纤维化；

抑制circMKLN1表达增加；

抑制肺上皮细胞向间质细胞形态转化。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述治疗肺纤维化包括治疗百草枯导致的肺纤维化。

4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述circMKLN1抑制剂是指对circMKLN1基因表达具有抑制效果的分子；

2)所述circMKLN1抑制剂为产品的唯一有效成分或有效成分之一；

3)所述circMKLN1抑制剂选自双链RNA、shRNA、抗体或小分子化合物。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述shRNA或所述双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1所示；

2)所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，所述第一链的序列如SEQ ID NO：2所示；

3)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

6.一种降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含：双链RNA或shRNA，所述双链RNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列，所述shRNA中含有能够与circMKLN1基因杂交的核苷酸序列；

其中，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与circMKLN1基因中的靶序列基本相同。

7.根据权利要求6所述的降低肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的核酸分子，其特征在于，还包括以下特征中的一项或多项：

1)所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO：1所示；

2)所述双链RNA为siRNA，所述siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO：2所示；

所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

8.一种circMKLN1基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求6-7任一权利要求所述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。

9.一种circMKLN1基因干扰慢病毒，由权利要求8所述干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

10.根据权利要求6-7任一权利要求所述的核酸分子，或权利要求8所述circMKLN1基因干扰核酸构建体，或权利要求9所述的circMKLN1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗肺纤维化的药物，或用于制备检测肺泡上皮细胞中circMKLN1基因表达的试剂盒。

11.一种用于预防或治疗肺纤维化的组合物，其有效物质含有：权利要求6-7任一权利要求所述的核酸分子；和/或，权利要求8所述circMKLN1基因干扰核酸构建体；和/或，权利要求9所述的circMKLN1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

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