CN116803424B - Slc17a5基因抑制剂及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及SLC17A5基因抑制剂及其用途。本发明提供SLC17A5基因抑制剂在制备肾癌治疗产品中的用途。本发明提供的SLC17A5基因抑制剂，针对目的基因设计了合适的RNAi靶点序列和oligo DNA双链序列，并构建了包含上述oligoDNA双链序列的慢病毒载体质粒和最终形成的慢病毒；慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因SLC17A5的mRNA表达量，敲减作用非常明显，对肾癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，可用于治疗肾癌的药物中，并且本发明可高通量操作、可重复性高。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及SLC17A5基因抑制剂及其用途。
背景技术
肾癌是发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤之一，对患者健康造成了严重威胁。近十几年来，肾癌的发病率逐年上升；虽然对肾癌的早期诊断水平和治疗措施已经得到了很大提高，但晚期肾癌患者愈后仍然会有复发的危险，因此对肾癌的治疗一直是医疗工作者的研究焦点。目前，Solute Carrier Family 17 Member 5（SLC17A5，NCBI ReferenceSequence：NM-001382629.1）基因被证实对肾癌细胞的发展密切相关；确定肾癌的特异性基因，明确其表达状态，并针对该基因研制和开发药物制剂，有效的提高肾癌的治疗效率，减少药物的毒副作用，具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种SLC17A5基因抑制剂及其用途，用于解决现有技术中针对SLC17A5基因研制和开发药物制剂少的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供SLC17A5基因抑制剂在制备肿瘤治疗产品中的用途。
优选地，所述肿瘤为肾癌。
本发明还提供一种降低肾癌细胞中SLC17A5基因表达的核酸分子，所述核酸分子为双链RNA包含核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6任一所示的RNA；或，编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示的DNA。
本发明还提供一种SLC17A5基因干扰核酸构建体，所述核酸构建体含有编码前述核酸分子中的双链RNA的基因片段或编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示的DNA的基因片段。
本发明还提供一种SLC17A5基因干扰慢病毒，由前述SLC17A5基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
本发明还提供一种细胞系所述细胞系为经前述基因干扰慢病毒感染的细胞系。
本发明提供一种用于治疗肾癌的组合物，其有效物质含有：前述核酸分子；和/或，前述SLC17A5基因干扰核酸构建体；和/或，前述SLC17A5基因干扰慢病毒；和/或，前述细胞系；和/或，肾癌化疗药物以及药学上可接受的载体或辅料。
如上所述，本发明的SLC17A5基因抑制剂及其用途，具有以下有益效果：
本发明针对肾癌提供了一种SLC17A5基因抑制剂，针对目的基因设计了合适的RNAi靶点序列和oligo DNA双链序列，并构建了包含上述oligoDNA双链序列的慢病毒载体质粒和最终形成的慢病毒；慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因SLC17A5的mRNA表达量，敲减作用非常明显，对肾癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，可用于治疗肾癌的药物中，并且本发明可同时或同批次去感染不同的肾癌细胞系，均可以获得很好的敲减和治疗效果，可重复性高。
附图说明
图1显示为本发明中RT-PCR方法检测在不同细胞（786-O、ACHN、A498）中SLC17A5基因的本底表达水平。
图2显示为本发明中RT-PCR方法检测基因SLC17A5在感染实施例1的慢病毒的786-O细胞中的表达水平。
图3显示为本发明中细胞计数法测量感染实施例1的慢病毒后细胞786-O在第1天至第5天的细胞生长数量变化的倍数。
图4显示为本发明中细胞Transwell实验测量感染实施例1的慢病毒后细胞786-O在培育16h后的迁移细胞数。
具体实施方式
本发明提供SLC17A5基因抑制剂在制备肿瘤治疗产品中的用途。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤为肾癌。
本发明中，基因抑制剂指对于基因具有抑制效果的分子。对于基因具有抑制效果包括但不限于：抑制基因的表达或活性。以SLC17A5基因为例，SLC17A5基因抑制剂指对于SLC17A5具有抑制效果的分子，即SLC17A5基因抑制剂的目标基因为SLC17A5。对于SLC17A5具有抑制效果包括但不限于：抑制SLC17A5的表达或活性。
抑制基因活性是指使基因活力下降，降低基因的生物学功能。优选地，相比抑制前基因活力下降至少10%，例如至少降低30%、50%、70%或90%。
抑制基因表达可以是抑制基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使基因不转录，或降低基因的转录活性，或者使基因不翻译，或降低基因的翻译水平。
本领域技术人员可以使用常规方法对基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，基因表达降低至少10%，较佳的降低至少30%，再佳的降低至少50%，更佳的降低至少70%，又佳的降低至少90%，最佳地基因完全没有表达。
所述肿瘤治疗产品必然包括基因抑制剂，并以基因抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为基因抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即，基因抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述肿瘤治疗产品为肿瘤治疗药物，或为肿瘤化疗药物的增强剂。所述产品为药品。所述药品的剂型不做具体限定，例如为口服制剂、针剂。所述药品可以是缓释制剂。
所述基因抑制剂可以为核酸分子、多肽、蛋白、小分子物质、病毒。
在一种实施方式中，所述基因抑制剂可以为降低肾癌细胞中基因表达的核酸分子。
所述核酸分子选自反义寡核苷酸、RNA适体、针对基因或其受体多肽的核酶、核酸构建体、双链RNA（dsRNA）或者短发夹RNA（shRNA）中的任一种或多种。
所述双链RNA中含有能够与基因杂交的核苷酸序列。
所述shRNA中含有能够与基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与目标基因（例如SLC17A5基因）中的靶序列基本相同。
所述目标基因中的靶序列即为被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的目标基因中的片段。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。
进一步的，作为SLC17A5基因抑制剂的双链RNA的靶序列如SEQ ID NO：1-3任一所示，具体为：SEQ ID NO.1：AGGTTCAATGTTCAAGAGAAT，SEQ ID NO.2：TTCGCCAAAGGTGAAGTACAA，SEQ ID NO.3：GTGAATCTGAGTGTTGCGTTA。更进一步的，所述双链RNA包含核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6任一所示的RNA，具体为SEQ ID NO.4：AGGUUCAAUGUUCAAGAGAAU，SEQ ID NO.5：UUCGCCAAAGGUGAAGUACAA，SEQ ID NO.6：GUGAAUCUGAGUGUUGCGUUA。更进一步的，编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与目标基因（例如SLC17A5基因）中的靶序列基本相同。
进一步的，作为SLC17A5抑制剂的shRNA的靶序列如SEQ ID NO：1-3所示。
所述shRNA经酶切加工后可成为siRNA进而起到特异性沉默肾癌细胞中内源目标基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU或CCACACC。
进一步的，所述SLC17A5基因来源于人。
在一些具体实施方式中，所述蛋白可以是抗SLC17A5抗体。
在一些具体实施方式中，所述病毒选自慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
所述慢病毒由各基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肾癌细胞并产生针对相应基因（例如SLC17A5）的小分子干扰RNA，从而抑制肾癌细胞的增殖。
本发明的肿癌治疗产品通过抑制肾癌细胞的增殖速率和/或抑制肾癌细胞迁移治疗肿癌。
本发明经细胞实验证实，基因抑制剂在24h就能够明显减慢肾癌细胞的增殖速度，并且这种趋势随着时间的延长而逐渐显著。
本发明还提供一种降低肿瘤细胞中目标基因表达的核酸分子，所述核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6任一所示的双链RNA；或，所述核酸分子为shRNA，编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示。所述目标基因选自SLC17A5基因。
在一些具体实施方式中，所述肿瘤细胞为肾癌细胞。
本发明还提供一种SLC17A5基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的双链RNA、shRNA或编码shRNA的DNA的基因片段，能表达所述双链RNA、shRNA或编码shRNA的DNA。
所述的SLC17A5基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人目标基因双链RNA、shRNA或编码shRNA的DNA的基因片段克隆入已知载体获得。以SLC17A5基因干扰核酸构建体为例，所述的SLC17A5基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人SLC17A5基因双链RNA、shRNA或编码shRNA的DNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的，所述SLC17A5基因干扰核酸构建体为SLC17A5基因干扰慢病毒载体。
进一步的，所述SLC17A5基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肾癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：BR-V108、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP中的任一。
本发明的siRNA可单独或和其他药物共同用于抑制肾癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肾癌的药物或制剂。当用作治疗肾癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明还提供一种SLC17A5基因干扰慢病毒，由前述SLC17A5基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肾癌细胞并产生针对目标基因的小分子干扰RNA，从而抑制肾癌细胞的增殖。
本发明还提供一种细胞系，所述细胞系为经所述的SLC17A5基因干扰慢病毒感染的细胞系。
在一些具体实施方式中，所述细胞系选自293、293T、786-O、ACHN、A498中的一种或多种。
本发明还提供一种用于治疗肿瘤的组合物，其有效物质含有：
前述的核酸分子；和/或，前述SLC17A5基因干扰核酸构建体；和/或，前述SLC17A5基因干扰慢病毒，和/或，所述细胞系，和/或肿瘤化疗药物以及药学上可接受的载体或辅料。
所述治疗肿瘤的组合物为治疗肾癌的组合物。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于预防或治疗对象体内肾癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述肾癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肾癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%~30%、30%~50%、50%~70%、70%~90%、90%~100%的部分被抑制。
所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
本发明还提供一种肾癌治疗的方法，包括将有效剂量的所述肿瘤治疗产品施用于对象中。
在一种实施方式中，所述肿瘤为肾癌。所述肿瘤治疗产品为肾癌治疗产品。进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内肾癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述肾癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肾癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%~30%、30%~50%、50%~70%、70%~90%、90%~100%的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
实施例1 慢病毒制备
本实施例提供了用于肾癌的慢病毒，所述慢病毒的RNAi靶点序列，其片段编码序列为：SEQ ID NO.1：AGGTTCAATGTTCAAGAGAAT，SEQ ID NO.2：TTCGCCAAAGGTGAAGTACAA，SEQID NO.3：GTGAATCTGAGTGTTGCGTTA。
其次，将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，构建慢病毒的载体质粒，制备步骤包括：
选择工具载体，获取目的基因片段；
选择BR-V108作为工具载体（购自上海懿贝瑞生物医药科技有限公司），核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述目的基因片段的核心序列如SEQ ID NO.1-3所示。
合成单链引物和oligo DNA；
所述步骤（2）中，单链引物包含以下三组序列：
I）SEQ ID NO.7 ：5’-ccggAGGTTCAATGTTCAAGAGAATctcgagATTCTCTTGAACATTGAACCTtttttg-3’和 SEQ ID NO.8 5’-aattcaaaaaAGGTTCAATGTTCAAGAGAATctcgagATTCTCTTGAACATTGAACCT-3’；
II）SEQ ID NO.9 5’-ccggTTCGCCAAAGGTGAAGTACAActcgagTTGTACTTCACCTTTGGCGAAtttttg-3’和 SEQ ID NO.10 5’- AATTCAAAAATTCGCCAAAGGTGAAGTACAACTCGAGTTGTACTTCACCTTTGGCGAA；
III）SEQ ID NO.11 5’-ccggGTGAATCTGAGTGTTGCGTTActcgagTAACGCAACACTCAGATTCACtttttg-3’和 SEQ ID NO.12 5’-aattcaaaaaGTGAATCTGAGTGTTGCGTTActcgagTAACGCAACACTCAGATTCAC-3’。
上述各组引物退火形成oligo DNA。
退火体系为：2.5μL 上游链（10μmol/L）+2.5μL 下游链（10μmol/L）+5μL退火缓冲液+10μL超纯水；退火温度为：在PCR仪中95℃ 5min；95℃ 40s；每40s降低0.7℃，循环99次；25℃ 3min ；8℃下保存。
将oligo DNA和线性化的工具载体连接后转化；
先对工具载体进行酶切，酶切位点为EcoR I和Age I；酶切体系为16μL超纯水+30μL10×CutSmart Buffer（厂家：NEB 组分货号：B6004SVIA）+12μL 纯化的质粒DNA（1μg/μL）+1μL Age Ⅰ（10U/μL）+1μL EcoR Ⅰ（10U/μL）；在37℃中反应3h，酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段。
将酶切后的工具载体与oligo DNA在反应体系中于22℃下反应1h，反应体系为：
1、50ng酶切后的工具载体
2、2ul oligo DNA
3、0.5μL T4 DNA ligase（EL0011，ThermoFisher）
4、2μL 10×T4 DNA ligase Buffer （EL0011，ThermoFisher）
5、超纯水（至体系为20μL）
冰上融化感受态TOP10感受态细胞（酶康GTC，GTC-BC-G001），将10μL连接产物加入至100μL感受态细胞中，冰上放置1min；42℃水浴锅中热激40s，冰上放置2min；加入200 µL无抗性的LB液体培养基，在200rpm下于37℃摇床震荡培养1h；取150µL菌液均匀涂在含有氨苄（Amp）抗性的LB固体培养基上，于37℃培养箱中培养14h。
（4）菌落PCR鉴定、测序、质粒抽提；
所述菌落PCR鉴定中，鉴定引物-F序列为SEQ ID NO.13:CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA，鉴定引物-R序列为列为SEQ ID NO.14:GTAATACGGTTATCCACGCG；PCR反应体系为：10ul 2×Hieff UNICON® HotStart PCR MasterMix(With Dye)； 厂家：翌圣 货号：10732ES03+0.4μL鉴定引物-F+0.4μL鉴定引物-R+超纯水（至体系为20μL），PCR扩增条件为：94℃ 3min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 30s，22 次循环；72℃ 5min；PCR 结束后，取5μL产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测条带（电泳上样：空白对照以超纯水为模板；阴性对照以以未插入目的基因的空载体为模板）。
将鉴定出的阳性克隆转化子接种于含相应抗性的LB液体培养基中，于37℃培养14h，菌落PCR鉴定后送样测序。
将测序正确的菌液转接于150 ml 含Amp抗性的LB液体培养基中，37℃摇床震荡培养过夜，收集菌液采用天根无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒：
1、菌体富集：取10mL菌液，8000rpm离心4min，收集菌体；2、菌液裂解：加入1 mL的GP1 Buffer 重悬菌体，并转移至2.0 mL离心管；3、裂解终止：0.5 mL 的 GP2 Buffer，轻轻翻转混匀，静置1min，12000 rpm离心1min；取上一步上清液0.7 mL加入活化的吸附柱GP，3000 rpm离心1 min；除去收集管中废液；4、洗涤：加入0.5mL的GPW Buffer，12000 rpm离心1 min；5、回收：更换收集管，向吸附柱加入0.2 mL 的GP3 Buffer，静置1min，12000 rpm离心1min；6、稳定：装有回收液的离心管置于37℃恒温培养箱放置15 min。
所述慢病毒由上述慢病毒载体质粒、psPAX2 载体质粒核苷酸序列如SEQ IDNO.18所示和 pMD2.G 载体核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示三质粒质粒共转染 293T 细胞制成。
所述慢病毒的制备步骤为：（1）转染前12-18h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞（ATCC ACS-4500），用含10% FBS的培养基调整细胞密度约5×106/15mL，重新接种于10cm细胞培养皿中，在37℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达 70%～80%时即可用于转染；
（2）转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；
（3）在500μLOpti-MEM R1 培养基中加入DNA 溶液（慢病毒载体质粒10μg、pMD2.G载体质粒7.5μg、pSPAX2 载体质粒5μg），室温静置5min；在另一500μLOpti-MEM R1 培养基中加入对应质量的转染试剂Polybrene（厂家：Santa Cruz Biotechnology 货号：sc-134220A），室温静置5min；将两者轻柔混匀并在室温下静置20min。
（4）混合液滴加至293T细胞培养液中，轻轻混匀，放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；6h后更换10mL的10%FBS培养基，在37℃、5% CO2培养箱内继续培养60h。
（5）收集转染后48h、72h的细胞上清液。
实施例2 慢病毒降低SLC17A5表达
shCtrl：感染阴性对照慢病毒的正常目的细胞组（对照组）；
shSLC17A5-1、shSLC17A5-2、shSLC17A5-3分别对应感染实施例1-3中RNAi慢病毒的正常目的细胞组（实验组）。
1.real-time qPCR检测目的基因SLC17A5的表达水平：根据sigma公司的Trizol操作进行总RNA抽提后，将4XgDNA wiper mix和1.0μg total RNA 加入到PCR水管中，补充RNase-Free H2O至8μL，混匀后离心，42℃温浴2min；加入5X qPCR supermix，于55℃15min，85℃2min程序下进行逆转录；将得到的cDNA置于-80℃保存备用。real-time qPCR反应体系为：5.0μLSYBR Green mastermixs + 0.25μL上游引物（10μmol/L，序列为SEQ ID NO.15：GTGATTATTCTTTGGCCGTTGC）+ 0.25μL下游引物（10μmol/L，序列为SEQ ID NO.16：TATTTGTGATGCCCAGGAGG）+ 0.2μL Dye2（启衡星，FS-Q1001）+ 2.3μL RNase-Free H2O；通过2－△△Ct法分析mRNA的表达水平；基因SLC17A5在不同细胞中的表达结果见图1：SLC17A5基因在细胞786-O、ACHN、A498中均具有较高的表达水平。实施例1中制备在786-O细胞中对SLC17A5表达的影响结果见图2。
如图2，786-O 细胞中，感染慢病毒后，相对于shCtrl组， shSLC17A5-1组即实施例1中含I)组核苷酸序列的载体所制备的病毒的SLC17A5基因敲减效率达到81.0% (p<0.05)；shSLC17A5-2组即实施例1中含有II)组核苷酸序列的载体所制备的病毒的SLC17A5基因敲减效率达到60.8% (p<0.05)； shSLC17A5-3组即实施例1中含有III)组核苷酸序列的载体所制备的病毒的SLC17A5基因敲减效率达到69.0% (p<0.05)。
实施例3 慢病毒降低肾癌细胞生长速度
细胞计数检测生长：将786-O细胞传代培养后，对处于对数生长期的786-O细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液；将细胞悬液（细胞数约为1500-2500）接种于96-well中，37℃、5% CO2培养箱培养待细胞融合度达到约20-30%；根据细胞 MOI 值，加入适宜量的病毒；12h 后观察细胞状态，更换培养基；感染 2-3 天后观察慢病毒上报告基因 GFP 的表达情况，荧光率达到 80%左右，将细胞继续培养至融合度为70%-90%，收集细胞；将处于对数生长期的各实验组细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，计数；根据细胞大小决定铺板细胞密度（细胞铺板数设定为2000 cell/well），37℃、5%CO2 培养箱培养，每组3复孔，培养体系为100μL/孔，铺板中保证每孔加入细胞数目一致；第二天开始每天Celigo检测读板一次，连续检测读板5天；通过调整analysis settings的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量；对数据进行统计绘图，绘出5天的细胞增殖曲线。经慢病毒感染目的细胞5天后，实施例1与对照组细胞数量的变化倍数随时间变化的曲线结果见图3。
从图3中看出：慢病毒感染后，相比shCtrl组，实施例1中shSLC17A5-1组细胞增殖抑制明显，倍数改变值为-2.0 (p<0.05)。
实施例4 肾癌细胞侵袭实验
细胞Transwell体外侵袭实验：（1）取所需数量小室于一空24孔板中，加100µL无血清培养基到小室内，培养箱放置 1~2h；（2）准备细胞悬液：胰酶消化处于对数生长期的各组786-O细胞，用低血清培养基重悬，制成细胞悬液；血球计数板对细胞悬液进行细胞计数，（3）在步骤（1）完成后，从小室内小心移去培养基，加 600µL含30%FBS培养基到下室中，用无血清培养基按一定比例稀释细胞，加该细胞悬液（含100000~200000 cell）100 uL到每个小室中；用镊子将小室转移入含30%FBS培养基的下室中，在组织培养箱中培养20 hours，倒扣小室于吸水纸上以去除培养基，用棉拭子轻轻移去非转移细胞，加400µL染色液到24孔板的空孔中，将小室浸泡在染色液中5min，在膜的下表面染色转移细胞，浸泡小室在一个大的水杯中，冲洗数次，空气中晾干，显微镜拍照膜。实施例1的实验组与对照组在Transwell小室内孵育16h后的转移细胞数对比结果见图4。
从图4中可知：慢病毒感染后，相比shCtrl组，实施例1中shSLC17A5-1组Transwell转移率降低17% (p<0.05)。
以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。
Claims (7)
1.SLC17A5基因抑制剂在制备肾癌治疗产品中的用途；
所述肾癌治疗产品为肿瘤治疗药物，或为肿瘤化疗药物的增强剂；所述SLC17A5基因抑制剂为核酸分子或含有前述核酸分子的核酸构建体包装的病毒；
所述核酸分子选自siRNA或者shRNA中的任一种或多种；
所述siRNA的靶序列如SEQ ID NO：1-3任一所示；
所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6任一所示的RNA；
编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示；
所述病毒为慢病毒、腺病毒或腺相关病毒。
2.一种降低肾癌细胞中SLC17A5基因表达的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6任一所示的siRNA；或，所述核酸分子为shRNA，编码所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.7-12任一所示。
3.一种SLC17A5基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述SLC17A5基因干扰核酸构建体含有编码权利要求2中所述siRNA的序列或权利要求2中编码所述shRNA的序列。
4.一种SLC17A5基因干扰慢病毒，其特征在于，由权利要求3所述的SLC17A5基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
5.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系为经权利要求4所述的SLC17A5基因干扰慢病毒感染的细胞系。
6.根据权利要求5所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系选自293、293T、786-O、ACHN、A498中的一种或多种。
7.一种用于治疗肾癌的组合物，其特征在于，其有效物质含有：权利要求2所述的核酸分子；和/或，权利要求3所述的SLC17A5基因干扰核酸构建体；和/或，权利要求4所述的SLC17A5基因干扰慢病毒；和/或，权利要求5或6所述的细胞系；和/或，肾癌化疗药物以及药学上可接受的载体或辅料。
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