WO2013091293A1

WO2013091293A1 - 人nlk基因相关的用途及其相关药物

Info

Publication number: WO2013091293A1
Application number: PCT/CN2012/070537
Authority: WO
Inventors: 韩海雄; 朱向莹; 孙琴; 顾雪峰; 谢胜华; 李杨; 金杨晟; 瞿红花; 曹跃琼
Original assignee: 上海吉凯基因化学技术有限公司
Priority date: 2011-12-23
Filing date: 2012-01-18
Publication date: 2013-06-27
Also published as: US20150005370A1; CN103173529B; US9334502B2; CN103173529A

Abstract

提供了NLK基因的用途及其相关药物。还提供了NLK基因在肿瘤治疗、肿瘤诊断及药物制备中的用途。进一步构建了可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的分子、含有该分离的分子的细胞及NLK基因干扰慢病毒。可降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的分子或者NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，能够用于肿瘤治疗。

Description

人 NLK基因相关的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及人 NLK基因相关的用途及其相关药物。背景技术

Nemo样激酶（Nemo-like kinase, NLK) 定位于细胞核，是一种属于脯氨酸介导的蛋白激酶超家族中保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，最初认为与果蝇的眼细胞的极化及脊椎动物多种发育过禾呈有关 ( Choi KW, Benzer S. Rotation of photoreceptor clusters in the developing Drosophila eye requires the Nemo gene. Cell. 1994; 78: 125-36. Verheyen EM, Mirkovic I, MacLean SJ, Langmann C, Andrews BC, MacKinnon C. The tissue polarity gene Nemo carries out multiple roles in patterning during Drosophila development. Mech Dev. 2001 ; 101 : 119-32. )。近年来的研究认为 NLK可调节、磷酸化转录因子，并通过多种信号途径参与细胞的凋亡过禾呈 ( Brott BK, Pinsky BA， Erikson RL. Nik is a murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and localized in the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95: 963-8. Mirkovic I， Charish K， Gorski SM， McKnight K, Verheyen EM. Drosophila Nemo is an essential gene involved in the regulation of programmed cell death. Mech Dev. 2002; 119: 9-20. )。

Wnt信号传导通路包括：细胞外因子 (Wnt)、跨膜受体 (Frizzled, Fz)、胞质蛋白 (Dsh， β -catenin/APC/Axin复合体等)及核内转录因子 (TCF/LEF),与多种肿瘤的发生发展密切相关 ( Bienz M, Clevers H. Linking colorectal cancer to Wnt signaling. Cell 2000; 103: 311-20. )。 NLK是 Wnt/p-catenin信号通路的负调节因子，可使 TCF/LEF磷酸化，抑制 β -catenin/TCF 复合体的转录活性。 c-myb原癌基因表达物 c-Myb蛋白作为转录因子可调控下游多种基因转录，影响造血干细胞的增殖与凋亡。 Wnt-1 通过转化生长因子 β激活性激酶 TAK1 诱导 NLK直接结合并磷酸化 c-Myb蛋白多个位点，后续发生遍在蛋白化及蛋白酶依赖的降解，可能造成细胞周期 G1期的阻滞，然而对 Myb家族另一成员 a-Myb的调控则主要表现为磷酸化并抑制其与 DNA结合区结合而发挥作用（Kanei-Ishii C, Ninomiya-Tsuji J, Tanikawa J， Nomura T, Ishitani T, Kishida S, Kokura K, Kurahashi T, Ichikawa-Iwata E, Kim Y， Matsumoto K. Ishii S. Wnt-1 signal induces phosphorylation and degradation of c-Myb protein via TAK1, HIPK2, and NLK. Genes Dev. 2004; 18: 816-29.)。另夕卜，研究发现， TAK1-NLK通路可磷酸化具有影响细胞凋亡、应激、 DNA损伤 /修复、肿瘤发生的转录因子 FOX01 ,并促使 FOX01 从胞核至胞质的移位，而抑制 FOX01的转录功能（Kim S, Kim Y， Lee J， Chung J. Regulation ofFOXOl by TAK1 -Nemo-like kinase pathway. J Biol Chem. 2010; 285: 8122-9.)。进一步研究发现， NLK还可通过磷酸化转录共激活因子 CBP/P300的 C-末端区域而影响转录因子如 NF- B、 AP-1、 Smad等的转录活性的方式参与细胞凋亡过程（Yasuda J， Yokoo H， Yamada T, Kitabayashi I, Sekiya T, Ichikawa H. Nemo-like kinase suppresses a wide range of transcription factors, including nuclear factor-kappaB. Cancer Sci. 2004; 95: 52-7. Shi Y， Ye K, Wu H, Sun Y, Shi H, Huo K. Human SMAD4 is phosphorylated at Thr9 and Serl38 by interacting with NLK. Mol Cell Biochem. 2010; 333: 293-8.)。

关于 NLK在肿瘤中的研究已有在结直肠癌、前列腺癌和肝癌中的报道。 NLK被认为是结肠癌 Wnt/p-catenin信号通路的抑癌基因。野生型的 NLK在结直肠癌中被诱导表达，通过磷酸化 TCF/LEF抑制细胞生长，促进 p53非依赖的细胞凋亡，但不影响细胞周期（Yasuda J， Tsuchiya A, Yamada T, Sakamoto M， Sekiya T, Hirohashi S. Nemo-like kinase induces apoptosis in DLD-1 human colon cancer cells. Biochem Biophys Res Commun 2003; 308: 227-33. )。在前列腺癌中， NKL负调节雄性激素受体信号转导途径。 NLK过表达可显著诱导雄性激素受体阳性表达的前列腺癌细胞发生细胞凋亡。进一步的研究发现， NLK能够通过与雄激素受体形成复合物的方式抑制雄激素受体对靶基因的转录活性，且在转录水平抑制雄激素受体 mRNA的表达（Emami KH, Brown LG, Pitts TE， Sun X, Vessella RL, Corey E. Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptor signaling in prostate cancer cells. Prostate. 2009; 69: 1481-92.)。而在人肝癌细胞系中，敲除 NLK的表达可以抑制细胞生长，同时发现， G1-S 期细胞增加，细胞周期相关蛋白 cyclin Dl、 CDK2的表达也明显降低，说明 NLK在肝癌形成中可能具有通过作用 cyclin Dl、 CDK2而发挥促有丝分裂的作用（Jung KH, Kim JK, Noh JH， Eun JW, Bae HJ， Xie HJ， Ahn YM， Park WS, Lee JY， Nam SW. Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumor cell growth by simultaneous suppression of cyclin Dl and CDK2 in human hepatocellular carcinoma. J Cell Biochem. 2010; 110: 687-96.)。综上， NLK在不同肿瘤的发生发展中可能发挥不同的生物学功能。

R A干扰（RNA interference, RNAi) 即用核苷酸组成的短的双链 RNA (dsR A)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为 21-23 nt的双链 RNA 能够在转录和转录后水平特异性的引起 RNAi (Tuschl T， Zamore PD, Sharp PA, Bartel DP. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell 2000; 101 : 25-33. ) o 肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来， RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用 RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程 (Uprichard, Susan L. The therapeutic potential of R A interference. FEBS Letters 2005; 579: 5996-6007. )。

为了深入研究 NLK在肿瘤发生中的调节功能，本发明选取肺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞模型，以 RNAi为手段研究 NLK在肺癌、乳腺癌和前列腺癌发生和发展中的作用。发明内容

本发明的目的在于公开与人 NLK (Nemo-like kinase) 基因相关的治疗方法及药物。本发明第一方面，以 R A干扰为手段，研究了 NLK基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和 /或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制 NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制 NLK蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和 /或存活。

所述肿瘤细胞选自其生长与 NLK蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。如肺癌细胞、肝癌细胞和乳腺癌细胞之任一。

所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和 /或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低 NLK基因的转录或翻译，或者足够降低 NLK蛋白的表达或活性的剂量。以使 NLK 基因的表达至少被降低 50%、 80%、 90%、 95%或 99%。

所述分子包括：核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽。

所述核酸包括：反义寡核苷酸、双链 RNA ( dsRNA) 、核酶、核糖核酸内切酶 I I I制备的小干扰 RNA ( esiRNA) 或者短发夹 RNA ( shRNA) 。

所述双链■、核酶、 esiRNA或者 shRNA含有 NLK基因的启动子序列或 NLK基因的信息序列。

进一步的，所述双链 RNA为小干扰 RNA ( siRNA) 。所述小干扰 RNA包含正义链和反义链，所述正义链含有与 NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同的核苷酸序列，且所述正义链和反义链共同形成■二聚体。所述小分子干扰■能特异性结合靶序列所编码的 mRNA片段，并特异性沉默人 NLK基因的表达。

进一步的，所述小干扰 R A的正义链与 NLK基因中的靶序列基本相同，所述 NLK基因中的靶序列含有 SEQ ID NO : 1-39中之任一序列。

所述 NLK基因中的靶序列即为所述小分子干扰 RNA特异性沉默 NLK基因表达时，与所述的小分子干扰 RNA互补结合的 mRNA片段所对应的 NLK基因中的片段。

所述 shRNA可经载体表达，如将可转录该的 shRNA的 DNA片段克隆入慢病毒载体后表达。

较佳的，所述 NLK基因来源于人。

本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中 NLK基因表达的分离的分子，所述分子为：

1 ) 双链 R A，所述双链 R A中含有能够在严紧条件下与 NLK基因杂交的核苷酸序列，或者

2) shRNA, 所述 shRNA中含有能够在严紧条件下与 NLK基因杂交的核苷酸序列，或者

3) 干扰慢病毒载体，为含有编码 2)中所述 shRNA的基因片段的慢病毒载体，能表达所述 shRNA。

所述双链 RNA包含第一链和第二链，所述第一链与 NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补。较佳的，所述第一链与 NLK基因中 19-23 个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述第一链与 NLK基因中 19、 20或者 21个连续的核苷酸基本相同。

进一步的，所述双链 R A为小干扰 R A。

所述 shRNA包含正义 R A片段和反义 R A片段，所述正义 R A片段与 NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义 R A片段与正义 R A片段基本互补，且所述正义 R A片段和反义 R A片段中间由茎环片段分隔。所述 shRNA经酶切后可成为小干扰 R A进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源 NLK基因的表达的作用。较佳的，所述正义 R A 片段与 NLK基因中 19-23个连续的核苷酸基本相同；更佳的，所述正义 R A片段与 NLK 基因中 19、 20或者 21个连续的核苷酸基本相同。

所述 shRNA的茎环片段的序列可选自以下任一： UUCAAGAGA、 AUG、 CCC、 UUCG、 CCACC、 CTCGAG、 AAGCUU禾 B CCAC ACC。

所述双链 RNA的第一链或所述 shRNA的正义 RNA片段与 NLK基因中的靶序列基本相同。

较佳的，所述 NLK基因中的靶序列含有 SEQ ID NO: l-39中之任一序列。

较佳的，所述 NLK基因来源于人。

如本发明的实施例列举的，所述 shRNA的序列含有 SEQ ID NO: 40。所述 NLK基因干扰慢病毒载体可由将编码所述 shR A的 DNA片段克隆入慢病毒载体后获得。

所述 NLK基因干扰慢病毒载体可经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，并进而转录出所述 shRNA。

所述 NLK基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和 /或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列。所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP) 。

进一步的，所述慢病毒载体可选自以下任一： pLK0.1-puro、 pLK0.1-CMV-tGFP、 pLKO.1 -puro-CMV-tGFP pLK0.1-CMV-Neo pLK0.1-Neo、 pLKO.1 -Neo-CMV-tGFP pLKO.1 -puro-CMV-TagCFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagYFP、 pLKO.l -puro-CMV-TagRFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagFP635、 pLKO.l -puro-UbC-TurboGFP、 pLKO.l -puro-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG- 1 xLacO pLKO-puro-IPTG-3xLacO pLPl、 pLP2、 pLP/VSV-G、 pENTR/U6 pLenti6/BLOCK-iT-DEST pLenti6-GW/U6-laminshrna pcDNAl .2/V5-GW/lacZ

pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、 pGCSIL-GFP和 Lenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

所述分离的分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的双链 R A或 shRNA施用于哺乳动物。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第三方面，公开了一种分离的靶标寡核苷酸片段，为所述降低肿瘤细胞中 NLK 基因表达的分离的分子的靶标寡核苷酸片段，所述寡核苷酸序列含有选自 SEQ ID N0 1-39 之任一的序列。

所述靶标寡核苷酸片段可应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。

具体的，可将所述靶标寡核苷酸片段作为作用对象对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人 NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如筛选获得小分子干扰 R A, 将之用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。诸如抗体药物，小分子药物等也可所述靶标寡核苷酸片段作为作用对象。

本发明第四方面，公开了一种 NLK基因干扰慢病毒，为将能够在肿瘤细胞中经转录成为所述 shRNA的核苷酸片段克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生特异性沉默 NLK基因的所述小分子干扰 R A，从而抑制肿瘤细胞的增殖。所述 NLK基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。进一步的，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物中含有所述的能够降低 NLK基因表达的分离的分子或 NLK基因干扰慢病毒。

所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体或赋形剂。

在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂 (如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明第六方面，公开了一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述肿瘤可选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任一。

采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和 /或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和 /或转移的至少 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%或 99%的部分被抑制。

进一步的，采用该方法的对象为人。

本发明第七方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的 NLK基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的分子或所述的 NLK基因干扰慢病毒。

本发明设计了针对人 NLK基因的 39个 R Ai靶点序列，构建相应的 NLK RNAi载体，其中编码序列 SEQ ID NO 20的 RNAi载体 pGCSIL-GFP-siNLK能够显著下调 NLK基因在 mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒（lentivirus, 简写为 Lv) 作为基因操作工具携带 RNAi载体 pGCSIL-GFP-siNLK能够靶向地将针对 NLK基因的 RNAi序列高效导入人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和前列腺癌 PC-3细胞，降低 NLK基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖。因此慢病毒介导的 NLK基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。

本发明提供的可降低肿瘤细胞中 NLK基因表达的分离的分子或者 NLK基因干扰慢病毒能够特异性抑制人 NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中 NLK基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，在肿瘤治疗中具有重要意义。附图说明

图 1表示 pGCSIL-GFP质粒 DNA图谱。

图 2表示 Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和前列腺癌 PC-3 细胞 5天后， NLK mRNA的表达水平显著降低。

图 3表示 Lv-siNLK慢病毒侵染人肺癌 H1299细胞 5天后，引起细胞增殖抑制。

图 4表示 Lv-siNLK慢病毒侵染人乳腺癌 MCF-7细胞 5天后，引起细胞增殖抑制。图 5表示 Lv-siNLK慢病毒侵染人前列腺癌 PC-3细胞 5天后，引起细胞增殖抑制。

图 6使用 NLK抗体在肿瘤组织样本上的免疫组化检测结果

a为乳腺癌， b、 c、 d为肺癌

图 7 浸染 Lv-s iNLK慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力检测结果

a瘤体体积 b 瘤体大小

具体实施方式

发明人发现，采用 R Ai方法下调人 NLK基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖，表明 NLK基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对 NLK基因的 siRNA, 筛选出了可有效抑制 NLK的表达进而抑制人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和前列腺癌 PC-3细胞增殖和生长的 siRNA, 在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一系列干扰人 NLK基因的小干扰 R A ( siRNA)序列，构建了可特异性沉默 NLK基因表达的慢病毒。本发明研究发现，针对人 NLK基因设计的小干扰 R A及 RNAi慢病毒，稳定并特异地下调 NLK基因的表达，并有效地抑制人肿瘤细胞的增殖。本发明表明 NLK基因可促进肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤早期诊断和治疗的靶点。而且，通过 RNAi方式沉默 NLK基因的表达，可作为抑制肿瘤发展的有效手段。

本发明的设计思路为：

本发明通过如下方法来筛选获得一种人 NLK基因 RNAi慢病毒：从 Genbank中调取人 NLK基因编码区序列，预测 siRNA位点，设计针对 NLK基因的有效的 siRNA序列，合成靶序列的 Oligo DNA, 退火形成双链 DNA， ^Age mEcoR /限制性内切酶酶切的慢病毒载体连接产生短发卡 R A慢病毒质粒；将筛选得到的有效的短发卡 RNA慢病毒质粒与慢病毒包装所需的辅助载体（Packing Mix, Sigma-aldrich公司）共转染 293T细胞，包装表达 NLK基因的重组慢病毒颗粒。收集细胞培养上清中的慢病毒颗粒，纯化浓縮，即制得纯净、稳定表达 NLK siR A的慢病毒（Lv-siNLK)。

基于上述方法，本发明提供了 39个干扰 NLK基因的有效靶点（具体如 SEQ ID NO 1-39 所示），构建了特异干扰人 NLK基因的慢病毒。

同时本发明还公开一种针对人 NLK基因的 RNAi慢病毒及其制备与应用。

本研究发现，利用慢病毒介导的 RNAi方法，在降低 NLK基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长。本研究表明， NLK基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能， NLK基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的 NLK基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如 [美] SambrookJ等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社 2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例 1：针对人 NLK基因 RNAi慢病毒的制备

1. 构建针对人 NLK基因的 RNAi慢病毒质粒

从 Genbank调取 NLK (NM_016231 )基因信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件 Genechem设计针对 NLK基因的有效的 siR A靶点。在 NLK基因的编码序列 ( CDS ) 区域内，每隔一个碱基起始获得 19-21个碱基的序列，表 1列出了其中 39条针对 NLK基因的有效 siRNA靶点序列。

表 1 靶向于人 NLK基因的 siRNA靶点序列

14 GCTCAGATCATGTCAAAGTTT 38.10%

15 TATCTCCATTCAGCTGGCATT 42.86%

16 GCAACTGTGTTCTAAAGATTT 33.33%

17 AACTGTGTTCTAAAGATTTGT 28.57%

18 CAGGAAGTTGTTACTCAGTAT 38.10%

19 AGGAAGTTGTTACTCAGTATT 33.33%

20 GCAGCCGTCATTACAGCAA 52.63%

21 TGCAGAACTACTAGGACGAAG 47.62%

22 AGAACTACTAGGACGAAGAAT 38.10%

23 GAACTACTAGGACGAAGAATA 38.10%

24 AACTACTAGGACGAAGAATAT 33.33%

25 CACACCATCACTGGAAGCAAT 47.62%

26 TGAAGGCGCTAAGGCACATAT 47.62%

27 GAAGGCGCTAAGGCACATATA 47.62%

28 AACAGCCATCTCTTCCTGTAC 47.62%

29 CAGGCTACACATGAAGCTGTT 47.62%

30 AAGCTGTTCATCTCCTTTGCA 42.86%

31 CTTTGCAGGATGTTGGTCTTT 42.86%

32 TGCAGGATGTTGGTCTTTGAT 42.86%

33 GACTTTGAGCCTGTCACCAAT 47.62%

34 GAGCCTGTCACCAATCCCAAA 52.38%

35 AAGAGCTTTATTAGTTCCACT 33.33%

36 GAGCTTTATTAGTTCCACTGT 38.10%

37 CTTTATTAGTTCCACTGTTGC 38.10%

38 GTGGGTAGAGAGAATGAGTTT 42.86%

39 GTGTGTGTTATGGACAATTAA 33.33% 针对 siRNA靶点（以 SEQ ID NO 20为例）合成单链 DNA Oligo序列，退火形成两端含 I和 EcoR I酶切位点粘端的双链 DNA Oligo (表 2 )；以 Age /禾 B EcoR I限制性内切酶作用于 pGCSIL-GFP载体（上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图 1 )，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。

表 2 两端含 Age I和 EcoR I酶切位点粘端的双链 DNA Oligo

通过 I和 EcoR I限制性内切酶将 pGCSIL-GFP质粒酶切，使其线性化，反应体系如表 3所示，反应条件： 37°C，

表 3 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系

通过 T4 DNA连接酶将载体 DNA和纯化好的双链 DNA Oligo在适当的缓冲体系中连接，反应体系如表 4所示，反应条件： 16°C， 12 ho

表 4 连接反应体系

将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版 55-56 页）。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于 ΙΟ μΙ Ι^Β培养基，混匀取 Ι μΐ作为模板；在以慢病毒载体中 RNAi序列的上下游，设计通用 PCR 引物（上游弓 I 物序歹 lj ： 5 '-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3 ' ；下字弓 I 物序歹 U ： 5'-GTAATACGGTTATCCACGCG-3' ), 进行 PCR扩增实验，反应体系如表 5所示，循环条件如表 6所示。

表 5 PCR反应体系

上游引物 0.4

下游引物 0.4

Taq聚合酶 0.2

模板 1

ddH₂0 15.2

Total 20

表 6 PCR反应 ί盾环条件

1 Cycle 30 Cycles 1 Cycle

94 °C 94 °C 55 。C 72 。C 72 。C

30 s 30 s 30 s 30 s 6 min

PCR扩增产物以琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定为阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的含有 NLK-siR A-20 (表 1中 SEQ ID NO 20 ) 序列的 R Ai载体，命名为 pGCSIL-GFP-siNLK。

构建 pGCSIL-GFP-siScr 阴性对照质粒， RNAi 阴性对照 siR A 靶序列为 5 ' -TTCTCCG AACGTGTC ACGT-3 ' , 经在 GenBank比对，不与人基因组任一段序列同源。构建 pGCSIL-GFP-siScr阴性对照质粒时，针对 Scr ( scramble) siRNA靶点合成两端含 Age / 7E_COR /酶切位点粘端的双链 DNA Oligo序列（表 7 ) ，其余构建方法、鉴定方法及条件均同 pGCSIL-GFP-siNLK。

表 7 两端含 Age I和 EcoR I酶切位点粘端的双链 DNA Oligo

2. 包装针对人 NLK基因的 RNAi慢病毒（Lv-siNLK)

以 Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取 RNAi质粒 pGCSIL-GFP-siNLK的 DNA，配制成 100 ng/μΐ储存液。转染前 24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的 293T细胞，以含 10%胎牛血清的 DMEM完全培养基调整细胞密度为 1.5X 10⁵ 细胞 /ml，接种于 6孔板， 37 V， 5% C0₂ 培养箱内培养。待细胞密度达 70%-80%时即可用于转染。转染前 2 h，吸出原有培养基，加入 1.5 ml 新鲜的完全培养基。按照 Sigma-aldrich公司的 MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入 Packing Mix (PVM) 20 μΐ, ΡΕΙ 12 μΐ, 无血清 DMEM培养基 400 μ1，取 20 μΐ 上述抽提的质粒 DNA，加至上述 PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育 15 min，转移至 293T细胞的培养基中， 37 V， 5% C0₂ 培养箱内培养 16 h。弃去含有转染混和物的培养介质， PBS溶液洗涤，加入完全培养基 2 ml，继续培养 48 h。收集细胞上清液， Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore)纯化和浓縮慢病毒，步骤如下：（1 ) 4 V , 4000 g 离心 10 min，除去细胞碎片；（2) 0.45 μηι滤器过滤上清液于 40 ml超速离心管中；（3 ) 4000 g离心， 10-15 min，至需要的病毒浓縮体积；（4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心 2 min离心力不超过 1000 g;

( 5 )把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为慢病毒 Lv-siNLK浓縮液。测定慢病毒浓縮液的滴度，分装后于 -80度保存。同时制备阴性对照 RNAi慢病毒（Lv-siScr), 包装和纯化方法同 Lv-siNLK慢病毒，仅以 pGCSIL-GFP-siScr载体代替 pGCSIL-GFP-siNLK载体。实施例 2: 实时荧光定量 RT-PCR法检测 NLK基因的沉默效率

处于对数生长期的人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和前列腺癌 PC-3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5x l0⁴/ml)接种于 6孔板中，培养至细胞融合度达到约 30%。根据侵染复数（MOI)值，加入适宜量的病毒（H1299的 MOI=10， PC-3和 MCF-7 MOI=20)，培养 24 h后更换培养基，待侵染时间达到 5天后，收集细胞。根据 Invitrogen公司的 Trizol操作说明书，抽提总 R A。根据 Promega公司的 M-MLV操作说明书，将 R A逆转录获得 cDNA，反应体系见表 7，反应条件： 42°C反应 l h，然后在 70°C水浴锅中水浴 10 min，使逆转录酶失活。

表 7 逆转录反应体系

NLK基因的引物序列：上游弓 I物为 5'-ATCATCAGCACTCGCATCATC-3'，下游引物为 5'-GACCAGACAACACCAAAGGC-3'。以管家基因 GAPDH为内参，引物序列：上游引物为 5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3' , T¾l¾ l J¾5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3O 采用 TP800型 Real time PCR仪 ( TAKARA) 进行定量检测，反应体系见表 8。反应程序为：预变性 95 °C， 15 s; 之后每一步变性 95 °C， 5 s; 退火延伸 60°C， 30 s; 共进行 45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

表 8 Real-time PCR反应体系

PCR结束后， 95 °C变性 l min，然后冷却至 55 °C，使 DNA双链充分结合。从 55 °C开始到 95 °C，每一步增加 0.5 °C，保持 4 s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用 2-^ΔΔΩ分析法计算侵染了 NLK mR A的表达丰度。与侵染对照慢病毒（Lv-siScr) 的细胞比较，实验组中人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和前列腺 PC-3细胞的 NLK mR A表达水平分别下降了 50.8%、 83.4%和 82.1% (图 2)。实施例 3 : 检测侵染 Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力

处于对数生长期的人肺癌 H1299细胞、乳腺癌 MCF-7细胞和人前列腺癌 PC-3细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5x l0⁴/ml) 接种于 6孔板中，培养至细胞融合度达到约 30%。根据侵染复数（MOI) 值，加入适宜量的病毒（H1299 的 MOI=10， MCF-7 的 MOI=20， PC-3的 MOI=20)，培养 24 h后更换培养基，待侵染时间达到 5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2x l0⁴/ml)，以细胞密度约为 2000个 /孔，接种 96孔板。每组 5个复孔，每孔 100 μ1。铺好板后，置 37°C、 5%C0₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用 Cellomics ArrayScan VTI 高内涵筛选分析仪（Thermo Scientific) 检测读板一次，连续检测读板 5天。通过调整 Cellomics仪的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线（结果如图 3-图 5所示）。结果表明， Lv-siNLK慢病毒侵染的人肺癌 H1299细胞和乳腺癌 MCF-7细胞和人前列腺癌 PC-3细胞在体外培养 5天后，活力细胞数分别下降了， 84.4%、 91.0%和 88.5%，表明 NLK基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制。

实施例 4 肿瘤细胞中 NLK基因过表达的试验

组织样本：人乳腺癌，肺癌的组织样本

NLK抗体：购自 Sigma公司

试验方法：

取出组织芯片，将组织芯片在 60°C恒温箱中烘烤 30分钟。然后对组织芯片脱蜡，脱蜡过程为：二甲苯 15分钟，二甲苯：乙醇 =1 :1混液中，无水乙醇中， 95%乙醇中， 85%乙醇中， 75%乙醇中，蒸馏水中依次浸泡 10分钟；然后用蒸馏水或 PBS配置新鲜的 3%¾0₂，室温封闭 10分钟；抗原修复在微波炉里高火加热 0.01M柠檬酸钠缓冲溶液（pH6.0) 至沸腾后将组织芯片放入，低火维持 20分钟；自然冷却至室温后，置入蒸馏水中浸泡 10分钟； 10% 血清（TBS配制）封闭 30分钟；吸弃血清，勿洗加入 NLK抗体（1 : 100稀释）孵育过夜； TBS洗 2遍，每次 5分钟；加入 HRP标记的羊抗兔二抗，室温孵育 60分钟； TBS洗 4遍，每次 5分钟；加入 DAB染色，直到显浅黄色为止，放入蒸馏水中终止反应；用苏木浸 30 秒，清水漂洗 7-8遍；脱水封片，于 75%乙醇， 85%乙醇， 95%乙醇，无水乙醇，二甲苯：乙醇 =1 :1混液，二甲苯中，依次浸置 5分钟；取出后，滴加 30ul中性树胶，用盖玻片封片，晾干，观察结果，拍照。（结果如图 6)

结果表明：

使用 NLK抗体对不同肿瘤组织进行免疫组化表达检测，结果发现，在人乳腺癌，肺癌的组织样本中，都能发现 nlk基因编码蛋白的高表达。图中深灰色代表表达阳性。基于此实验结果，认为可通过检测组织细胞 nlk基因的表达来辅助诊断癌症。实施例 5: 浸染 Lv-siNLK慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力

处于对数生长期的人乳腺癌 MCF-7 细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为 5xl0⁴/ml) 接种于 6孔板中，培养至细胞融合度达到约 30%。根据侵染复数（MOI: 20)，加入适宜量的病毒，培养 24 h后更换培养基，待侵染时间达到 5天后，收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液。用一次性注射器将细胞悬液（2 X 10⁶cells/鼠）注射到 5-6周龄雌性 BALB/c裸鼠右侧腋窝。实验组注射感染 Lv-siNLK慢病毒的 MCF-7细胞，对照组注射感染 Lv-siScr慢病毒的 MCF-7细胞，每组 6只裸鼠。注射后伺养裸鼠至肉眼可见瘤体（一周），然后用 NightOWL ll 983 发光成像系统（ Berthold Technologies) 测量瘤块的体积（如图 7a) 和重量（如图 7b)。结果表明：实验组的肿瘤细胞体内成瘤能力远低于对照组。基于此实验结果，认为 Lv-_S1NLK可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。

Claims

权利要求书

1. 一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和 /或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制 NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制 NLK蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和 /或存活。

2. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述分子包括：核酸、碳水化合物、脂类、小分子、多肽或肽。

3. 如权利要求 2所述的方法，其特征在于，所述核酸包括：反义寡核苷酸、双链 RNA、核酶、 esiRNA或者 shRNA。

4. 如权利要求 3所述的方法，其特征在于，所述双链 RNA、核酶、 esiRNA或者 shRNA含有 NLK基因的启动子序列或 NLK基因的信息序列。

5. 如权利要求 4所述的方法，其特征在于，所述双链 RNA为小干扰 RNA。

6. 如权利要求 5所述的方法，其特征在于，所述小干扰 RNA包含正义链和反义链，所述正义链含有与 NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同的核苷酸序列，且所述正义链和反义链共同形成■二聚体。

7. 如权利要求 6所述的方法，其特征在于，所述小干扰 RNA的正义链与 NLK基因中的靶序列基本相同，所述 NLK基因中的靶序列含有 SEQ ID NO : 1-39中之任一序列。

8. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述 NLK基因来源于人。

9. 如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自其生长与 NLK蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。

10.如权利要求 9所述的方法，其特征在于，所述肿瘤细胞选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌细胞之任一。

11.如权利要求 1所述的方法，其特征在于，所述分子的施用量为足够降低 NLK基因的转录或翻译，或者足够降低 NLK蛋白的表达或活性的剂量。

12.如权利要求 11中所述的方法，其特征在于，所述 NLK基因的表达至少被降低 50%、 80%、

90%、 95%或 99%。

13.一种降低肿瘤细胞中 NLK基因表达的分离的分子，所述分子为：

a) 双链 RNA，所述双链 RNA中含有能够在严紧条件下与 NLK基因杂交的核苷酸序列；或者

b) shRNA, 所述 shRNA中含有能够在严紧条件下与 NLK基因杂交的核苷酸序列；或者 c) 干扰慢病毒载体，为含有编码 b)中所述 shRNA的基因片段的慢病毒载体，能表达所述 shRNA。

如权利要求 13所述的分子，其特征在于：

所述双链 RNA包含第一链和第二链，且所述第一链与 NLK基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述第二链与第一链基本互补；

所述 shRNA包含正义 RNA片段和反义 RNA片段，所述正义 RNA片段与 NLK 基因中 15-27个连续的核苷酸基本相同，而所述反义 RNA片段与正义 RNA片段基本互补，且所述正义 RNA片段和反义 RNA片段中间由茎环片段分隔。

如权利要求 14所述的分子，其特征在于，所述 NLK基因来源于人。

如权利要求 14所述的分子，其特征在于，所述茎环片段的序列选自以下任一： UUCAAGAGA、 AUG、 CCC、 UUCG、 CCACC、 CTCGAG、 AAGCUU禾 B CCACACC。如权利要求 14所述的分子，其特征在于，所述所述双链 RNA的第一链或所述 shRNA 的正义 RNA片段与 NLK基因中的靶序列基本相同，所述 NLK基因中的靶序列含有 SEQ ID ΝΟ:1-39中之任一的序列。

如权利要求 14所述的分子，其特征在于，所述 shRNA的序列含有 SEQ ID NO: 40。如权利要求 14所述的分子，其特征在于，所述慢病毒载体选自以下任一： pLKO.l-puro, pLK0.1-CMV-tGFP pLKO.1 -puro-CMV-tGFP pLK0.1-CMV-Neo pLK0.1-Neo pLKO.1 -Neo-CMV-tGFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagCFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagYFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagRFP、 pLKO.1 -puro-CMV-TagFP635、

pLKO.1 -puro-UbC-TurboGFP、 pLKO.1 -puro-UbC-TagFP635、 pLKO-puro-IPTG- lxLacO、 pLKO-puro-IPTG-3xLacO pLPl、 pLP2、 pLP/VSV-G pENTR/U6、

pLenti6/BLOCK-iT-DEST、 pLenti6-GW/U6-laminshrna pcDNA 1.2/V5-GW/lacZ pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST pGCSIL-GFP和 Lenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。

一种分离的权利要求 13所述的分子的靶标寡核苷酸片段，所述寡核苷酸片段包含 NLK 基因的片段，全长 NLK基因的核苷酸片段除外。

如权利要求 20所述的分离的寡核苷酸片段，其特征在于，所述寡核苷酸序列与全长 NLK 基因的核苷酸序列中至少 10个、 15个、 20个、 25个、 30个、 35个、 40个、 45个或 50个连续的核苷酸基本相同。

如权利要求 20所述的分离的寡核苷酸片段，其特征在于，所述寡核苷酸序列含有选自 SEQ ID NO 1-39之任一的序列。一种 NLK基因干扰慢病毒，为将任一权利要求 13-19所述的分子中的所述干扰慢病毒载体克隆入慢病毒载体后，在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，所述药物组合物含有：

( 1 ) 任一权利要求 13-19所述的分子，或者

( 2) 权利要求 23所述的 NLK基因干扰慢病毒。

—种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，所述方法包括：将有效剂量的如权利要求 24所述的药物组合物施用于对象中。

如权利要求 25所述的方法，其特征在于，所述肿瘤选自肺癌、乳腺癌和前列腺癌之任如权利要求 25所述的方法，其特征在于，所述肿瘤的生长、增殖、复发和 /或转移被抑制。

如权利要求 25所述的方法，其特征在于，所述对象为人。

—种用于降低肿瘤细胞中的 NLK基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自以下方案中的任一种：

( 1 ) 包括：存在于容器中的，根据权利要求 13-19中任一所述的分子，或者

( 2) 包括：存在于容器中的，根据权利要求 23所述的 NLK基因干扰慢病毒。