CN104225618B - 人nlk基因和egfr基因治疗肿瘤的用途及其相关药物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了单独的人NLK基因；以及人NLK基因与人EGFR基因作为协同施药靶标，在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。本发明还进一步构建了NLK基因小干扰RNA、NLK基因干扰慢病毒载体、NLK基因干扰慢病毒，并公开了他们在与EGFR基因协同治疗肿瘤中的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的慢病毒载体、慢病毒能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表达，尤其是慢病毒，本发明的NLK基因干扰慢病毒能单独、或者与EGFR基因干扰慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

人NLK基因和EGFR基因治疗肿瘤的用途及其相关药物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及单独的人NLK基因；以及人NLK基因和人EGFR基因协同治疗肿瘤的用途及其相关药物。

背景技术

目前肿瘤的基因治疗已经取得了蓬勃快速的发展，但是迄今为止，仍然存在很多需要解决的问题。目前用于肿瘤基因治疗的基因太少，能抑制肿瘤生长的基因为数不多，急需提供更多可利用的基因。另外，由于肿瘤的发生、发展、转移等过程是一个多基因参与、涉及多条信号通路的复杂网络系统，因此单个基因治疗或单一治疗方法往往疗效有限。因此，未来基因治疗发展的重点将在于挖掘并鉴定在临床上有重要价值的基因，探索多个具有不同抗肿瘤作用机理的基因联合治疗以及将多基因靶向药物联合治疗等。

Nemo样激酶（Nemo-like kinase,NLK）定位于细胞核，是一种属于脯氨酸介导的蛋白激酶超家族中保守的丝氨酸-苏氨酸激酶，最初认为与果蝇的眼细胞的极化及脊椎动物多种发育过程有关（Choi KW,Benzer S.Rotation of photoreceptor clusters in thedeveloping Drosophila eye requires the Nemo gene.Cell.1994;78:125-36.VerheyenEM,Mirkovic I,MacLean SJ,Langmann C,Andrews BC,MacKinnon C.The tissuepolarity gene Nemo carries out multiple roles in patterning during Drosophiladevelopment.Mech Dev.2001;101:119-32.）。近年来的研究认为NLK可调节、磷酸化转录因子，并通过多种信号途径参与细胞的凋亡过程（Brott BK,Pinsky BA,Erikson RL.Nlk isa murine protein kinase related to Erk/MAP kinases and localized in thenucleus.Proc Natl Acad Sci U S A.1998;95:963-8.Mirkovic I,Charish K,GorskiSM,McKnight K,Verheyen EM.Drosophila Nemo is an essential gene involved inthe regulation of programmed cell death.Mech Dev.2002;119:9-20.）。

关于NLK在肿瘤中的研究已有在结直肠癌、前列腺癌和肝癌中的报道。NLK被认为是结肠癌Wnt/β-catenin信号通路的抑癌基因。野生型的NLK在结直肠癌中被诱导表达，通过磷酸化TCF/LEF抑制细胞生长，促进p53非依赖的细胞凋亡，但不影响细胞周期（YasudaJ,Tsuchiya A,Yamada T,Sakamoto M,Sekiya T,Hirohashi S.Nemo-like kinaseinduces apoptosis in DLD-1human colon cancer cells.Biochem Biophys ResCommun2003;308:227-33.）。在前列腺癌中，NKL负调节雄性激素受体信号转导途径。NLK过表达可显著诱导雄性激素受体阳性表达的前列腺癌细胞发生细胞凋亡。进一步的研究发现，NLK能够通过与雄激素受体形成复合物的方式抑制雄激素受体对靶基因的转录活性，且在转录水平抑制雄激素受体mRNA的表达（Emami KH,Brown LG,Pitts TE,Sun X,VessellaRL,Corey E.Nemo-like kinase induces apoptosis and inhibits androgen receptorsignaling in prostate cancer cells.Prostate.2009;69:1481-92.）。而在人肝癌细胞系中，敲除NLK的表达可以抑制细胞生长，同时发现，G1-S期细胞增加，细胞周期相关蛋白cyclin D1、CDK2的表达也明显降低，说明NLK在肝癌形成中可能具有通过作用cyclin D1、CDK2而发挥促有丝分裂的作用（Jung KH,Kim JK,Noh JH,Eun JW,Bae HJ,Xie HJ,Ahn YM,Park WS,Lee JY,Nam SW.Targeted disruption of Nemo-like kinase inhibits tumorcell growth by simultaneous suppression of cyclin D1and CDK2in humanhepatocellular carcinoma.J Cell Biochem.2010;110:687-96.）。综上，NLK在不同肿瘤的发生发展中可能发挥不同的生物学功能。

表皮生长因子受体（epidermalgrowth factor receptor,EGFR）EGFR是一种跨膜蛋白质，属于ErbB受体家族成员，其配体(EGF、TGF-α等)与EGFR胞外段结合使之二聚化，由此导致胞内段酪氨酸激酶活化以及一系列信号转导的级联反应，促进细胞增殖，血管生成，转移并抑制细胞凋亡（梁后杰,邹岚.EGFR靶向药物治疗晚期结直肠癌最新进展.中国处方药2009;84:58-61.），从而导致肿瘤的发生。大量研究发现EGFR基因在多种肿瘤组织中过表达或异常活化，从而使肿瘤细胞增殖、侵袭和转移能力增强。EGFR已成为经临床验证的多种类型肿瘤的治疗靶点（Ciardiello F,Tortora G.EGFR antagonists in cancertreatment.N Engl J Med2008;358:1160-1174.）。

RNAi是利用双链RNA介导的序列特异性的转录后基因沉默现象，已成为研究基因功能的一种新兴的有效手段，并有望成为肿瘤等疾病基因治疗的工具（Izquierdo M.Shortinterfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.Cancer Gene Ther.2005;12(3):217-27.）。慢病毒（lentivirus）载体是高效的基因转导工具，主要用于感染对常规方法转染效率较低的细胞，如原代细胞等。慢病毒颗粒可同时感染增殖和非增殖的细胞，且感染比较稳定、持久。运用慢病毒载体,可实现特定基因的高表达，也可以表达发夹结构RNA（short hairpin RNA,shRNA）以RNA干扰（RNA interference，RNAi）方式下调某基因的表达。本发明拟采用慢病毒介导的RNAi技术研究NLK基因在与EGFR基因协同抑制肿瘤细胞增殖中的功能，为恶性肿瘤的非手术临床治疗提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于公开了NLK基因作为癌症治疗的靶标，治疗肿瘤的用途及其相关药物；以及将NLK基因和EGFR基因共同作为癌症治疗的靶标，通过同时沉默NLK基因和EGFR基因的表达，实现协同治疗肿瘤的用途，及其肿瘤治疗药物。

本发明以RNA干扰为手段，研究了单独的NLK基因在肿瘤发生和发展中的作用，以及，NLK基因与EGFR基因在肿瘤发生和发展中的协同作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制NLK基因和/或EGFR基因的转录、翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白和/或EGFR蛋白表达的活性的物质，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化或存活。

本发明第一方面，公开了分离的人NLK基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人NLK基因的表达相关的任意一种肿瘤；更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：结肠癌。

本发明中，所述人NLK基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用靶标为RNA干扰作用靶标。

所述将分离的人NLK基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。

所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物具体是指：将NLK基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而提高或降低肿瘤细胞内NLK基因的表达水平。

所述将NLK基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物具体是指：将NLK基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人NLK基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的NLK基因小分子干扰RNA（siRNA）即是以人NLK基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将NLK基因及其蛋白作为作用对象。

所述将NLK基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将NLK基因表达产物作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。

所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制NLK基因的转录或翻译，或能够特异性抑制NLK蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中NLK基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。

本发明第一方面，还公开了分离的人NLK基因和人EGFR基因在制备或筛选肿瘤治疗药物，或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。

所述的肿瘤可以为其肿瘤细胞的增殖与人NLK基因和人EGFR基因的表达相关的任一种肿瘤；更进一步的，为一种恶性肿瘤，例如选自：肺癌或结肠癌。

本发明中，所述人NLK基因和人EGFR基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备或筛选肿瘤治疗药物，或者制备肿瘤诊断药物。进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用靶标为RNA干扰作用靶标。

所述将分离的人NLK基因和人EGFR基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物。

所述将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物具体是指：将NLK基因和人EGFR基因共同作为RNA干扰作用的靶标，研制能同时针对两种基因的肿瘤治疗药物或制剂，从而提高或降低肿瘤细胞内NLK基因和人EGFR基因的表达水平；或者，将NLK基因和人EGFR基因分别作为RNA干扰作用的靶标，来研制分别针对两种基因的肿瘤治疗药物，从而获得能提高或降低肿瘤细胞内NLK基因和人EGFR基因表达水平的肿瘤治疗药物或制剂。

所述将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物具体是指：将人NLK基因和人EGFR基因同时作为作用对象，对药物进行筛选，以找到可以分别影响（抑制或促进）人NLK基因表达的药物和影响（抑制或促进）人EGFR基因表达的药物，然后作为肿瘤治疗备选组合物药物；或者找到可以同时影响（抑制或促进）人NLK基因和人EGFR基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的NLK基因小分子干扰RNA（siRNA）、基因干扰核酸构建体、慢病毒，以及EGFR基因小分子干扰RNA（siRNA）、基因干扰核酸构建体、慢病毒，均是以NLK基因和EGFR基因分别为作用对象筛选获得的；当它们共同使用时，存在协同作用的效果，比单一一种物质的使用效果更好；可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将人NLK基因和人EGFR基因及其蛋白作为作用对象。

所述将人NLK基因和人EGFR基因用于制备肿瘤诊断药物，是指将NLK基因表达产物和人EGFR基因表达产物作为肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断试剂的制备。

本发明的所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的转录或翻译，或能够特异性抑制人NLK基因和/或人EGFR基因的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞人NLK基因和/或人EGFR基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化、存活的目的。

本发明制备或筛选的肿瘤治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药（例如抑制剂）、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。

所述核酸分子包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA（dsRNA）、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA（esiRNA）或者短发夹RNA（shRNA）。

所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人NLK基因和人EGFR基因的转录或翻译，或者足够降低人NLK蛋白和人EGFR蛋白的表达或活性的剂量。以使人NLK基因和人EGFR基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。

本发明中，当人NLK基因和人EGFR基因作为协同施药靶标进行肿瘤治疗和药物筛选时，是通过RNA干扰的方法，以人NLK基因和EGFR基因作为RAN干扰的靶基因，降低这两个基因的表达水平。

采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法是通过单独降低人NLK基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的，或者通过同时降低人NLK基因和人EGFR基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人NLK基因表达水平的物质；或者，将能有效降低人NLK基因和人EGFR基因表达水平的物质给药于患者。

本发明第二方面公开了一种治疗肿瘤的核酸分子药物，其有效成分含有降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子，以及降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子；所述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子包含：

a)NLK基因双链RNA，所述NLK基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；或者

b)NLK基因shRNA，所述NLK基因shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；

所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子包含：

A.EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交的核苷酸序列；或者

B.EGFR基因shRNA，所述EGFR基因shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交的核苷酸序列。

进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。

较优的，所述NLK基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与NLK基因的靶序列基本相同。

较优的，所述EGFR基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。

较优的，所述NLK基因shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NLK基因的靶序列基本相同。

较优的，所述EGFR基因shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与EGFR基因的靶序列基本相同。

更优的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。

更优的，所述NLK基因的靶序列，为SEQ ID NO:1所示序列；所述EGFR基因的靶序列，为SEQ ID NO:2所示序列。

所述NLK基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默NLK基因表达时，与所述siRNA互补结合的mRNA片段所对应的NLK基因中的片段。同理，所述EGFR基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默EGFR基因表达时，与所述siRNA互补结合的mRNA片段所对应的EGFR基因中的片段。

所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。

进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA（siRNA）。

最优的，NLK基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：9所示，具体为5’-GCAGCCGUCAUUACAGCAA-3’。SEQ ID NO：9所示的NLK基因siRNA的第一链为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人NLK基因的小干扰RNA中的一条链，该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源NLK基因表达的作用。

最优的，EGFR基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：10所示，具体为5’-GGCUGGUUAUGUCCUCAUU-3’。SEQ ID NO：10所示的EGFR基因siRNA的第一链为以SEQ ID NO:2所示的序列为RNA干扰靶序列设计的针对人EGFR基因的小干扰RNA中的一条链，该第一链与第二链组成的siRNA能够起到特异性沉默肿瘤细胞中内源EGFR基因表达的作用。

最优的，所述NLK基因shRNA的序列如SEQ ID NO:11所示，具体为：5’-GCAGCCGUCAUUACAGCAA CUCGAG UUGCUGUAAUGACGGCUGC-3’。

最优的，所述EGFR基因shRNA的序列如SEQ ID NO:12所示，具体为：5’-GUGGCUGGUUAUGUCCUCAUUCUCGAG AAUGAGGACAUAACCAGCCAC-3’。

当用作治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的双链RNA或shRNA施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明第三方面，公开了一种治疗肿瘤的慢病毒载体药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒载体和EGFR基因干扰慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体含有编码前述NLK基因shRNA的基因片段，所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编码前述EGFR基因shRNA的基因片段。

进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。

所述NLK基因干扰慢病毒载体是将编码前述NLK基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述NLK基因小干扰RNA，用于特异性沉默NLK基因的表达。EGFR基因干扰慢病毒载体同NLK基因。

编码所述NLK基因shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO:1所示序列及其互补序列。编码所述EGFR基因shRNA基因片段的DNA序列含有SEQ ID NO:2所示序列及其互补序列。

进一步的，本发明所述基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白（GFP）。

进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。

本发明第四方面，公开了一种治疗肿瘤的慢病毒药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒，所述NLK基因干扰慢病毒由前述NLK基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成；所述EGFR基因干扰慢病毒由前述EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

进一步的，所述肿瘤为肺癌或结肠癌。

本发明的慢病毒可感染肿瘤细胞并产生分别针对NLK基因或EGFR基因的小分子干扰RNA，从而抑制肿瘤细胞的增殖。该NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。

本发明第五方面，公开了一种用于治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其组成含有前述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子、NLK基因干扰慢病毒载体、NLK基因干扰慢病毒中的至少一种；以及，前述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子、EGFR基因干扰慢病毒载体、EGFR基因干扰慢病毒中的至少一种。

优选的，上述成分为治疗肺癌或结肠癌的药物组合物的药效成分。

当用作治疗肿瘤的药物时，是将安全有效量的双链RNA、shRNA、或慢病毒施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的药物组合物中，特异性沉默NLK基因表达，以及特异性沉默EGFR基因表达的有效成分发挥了协同治疗的作用；本发明实施例记载，双基因敲减后的癌细胞生长抑制率明显大于单基因敲减组的加和，表明特异性沉默NLK基因表达的物质与特异性沉默EGFR基因表达的物质协同抑制肿瘤细胞的增殖。

进一步的，本发明所述药物或药物组合物含有1～99wt%所述小干扰RNA、shRNA、基因干扰核酸构建体和/或基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

制备药物时，通常将有效成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

本发明的有益效果为：本发明提供的siRNA或者包含该小干扰RNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人NLK基因的表达，尤其是慢病毒，能单独，或者与EGFR靶向慢病毒协同抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。本发明中的NLK基因即可以作为单独的肿瘤治疗靶标，也可以作为EGFR基因协同治疗靶标，在肿瘤治疗中具有重要意义。

附图说明

图1：GV115质粒DNA图谱

图2：GV113质粒DNA图谱

图3：NLK shRNA质粒鉴定图

1#：阴性对照（ddH2O）；2#：阴性对照（空载自连对照组）

3#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

4#～8#：NLK shRNA1-5号转化子鉴定

图4：EGFR shRNA质粒鉴定图

1#：阴性对照（ddH2O）

2#：阴性对照（空载自连对照组）

3#：Marker自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp

4#～8#：EGFR shRNA1-5号转化子鉴定

图5：NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人肺癌H1299细胞4天后，显著抑制细胞增殖

图6：表示NLK shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒同时浸染人结肠癌RKO细胞4天后，显著抑制细胞增殖

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件，如［美］Sambrook.J等著；黄培堂等译。分子克隆试验指南，第三版。北京：科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1针对人NLK基因和EGFR基因RNAi慢病毒的制备

1.构建慢病毒载体

1）构建针对人NLK基因和EGFR基因的慢病毒载体

从Genbank调取NLK（NM_016231）和EGFR基因（NM_201282）信息；利用上海吉凯基因化学技术有限公司的设计软件Genechem设计针对NLK基因和EGFR基因的有效的siRNA靶点。初步筛选得到具有明显抑制NLK基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ IDNO.1）和明显抑制EGFR基因表达功能的siRNA靶点序列（SEQ ID NO.2）。通过Genbank数据库进行BLAST分析，确定其不对任何其它基因产生干扰作用。

表1 siRNA靶点序列

SEQ ID NO.	TargetSeq	起始位点	靶向基因
				1	GCAGCCGTCATTACAGCAA	1153	NLK
2	GGCTGGTTATGTCCTCATT	499	EGFR

针对siRNA靶点（SEQ ID NO：1）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表2）；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV115载体（载体带绿色荧光标记，上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图1），使其线性化。

针对siRNA靶点（SEQ ID NO：2）合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列（表3）。以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于GV113载体（载体带红色荧光标记，上海吉凯基因化学技术有限公司提供，图2），使其线性化。

表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo

通过T4DNA连接酶将双酶切线性化（酶切体系如表4所示，37℃，反应1h）的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系（连接体系如表5所示）中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞（转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页）。

在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’（SEQ ID NO：7）；下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’（SEQ ID NO：8），进行PCR鉴定实验（PCR反应体系如表6，反应条件如表7）。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，PCR鉴定结果见图3和图4。比对正确的克隆即为构建成功的含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的RNAi载体，分别命名为NLK-shRNA-plasmid和EGFR-shRNA-plasmid。

2）构建GV115阴性对照质粒

阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’（SEQ ID NO：13）。构建阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNAOligo序列（表8）,其余构建方法、鉴定方法及条件均同NLK-shRNA-plasmid和EGFR-shRNA-plasmid。

表4载体质粒酶切反应体系

试剂	体积(μl)
		载体质粒(1μg/μl)	2.0
10×buffer	5.0
		100×BSA	0.5
Age I(10U/μl)	1.0
		EcoR I(10U/μl)	1.0
dd H2O	40.5
		Total	50.0

表5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系

试剂	阳性对照(μl)	自连对照(μl)	连接组(μl)
				线性化的载体DNA (100 ng/μl)	1.0	1.0	1.0
退火的双链DNA Oligo (100 ng/μl)	1.0	-	1.0
				10 ×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液	1.0	1.0	1.0
T4噬菌体DNA连接酶	1.0	1.0	1.0
				dd H2O	16.0	17.0	16.0
Total	20.0	20.0	20.0

表6 PCR反应体系

试剂	体积 (μl)
		10×buffer	2.0
dNTPs (2.5 mM)	0.8
		上游引物	0.4
下游引物	0.4
		Taq聚合酶	0.2
模板	1.0
		ddH2O	15.2
Total	20.0

表7PCR反应体系程序设定

表8两端含Age I和EcoR I 酶切位点粘端的双链DNA Oligo

编号

5’

颈

环

颈

3’

14

正义链

CCGG

TTCTCCGAACGTGTCACGT

CTCGAG

ACGTGACACGTTCGGAGAA

TTTTTG

15

反义链

AATTCAAAAA

TTCTCCGAACGTGTCACGT

CTCGAG

ACGTGACACGTTCGGAGAA

2.包装获得NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒

1）NLK基因干扰慢病毒

以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒NLK-shRNA-plasmid配制成100ng/μl储存液。转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×10⁵细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5%CO₂培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。

按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix（PVM）20μl，PEI12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5%CO₂培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。

收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置（Millipore）纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：（1）4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；（2）0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；（3）4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；（4）离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；（5）把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为NLK基因干扰慢病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。

2）EGFR基因干扰慢病毒的包装过程同NLK基因干扰慢病毒。

3）阴性对照慢病毒包装过程同CIT基因干扰慢病毒。

实施例2NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的肿瘤治疗协同作用

1.实验方法

分别对处于对数生长期的人肺癌H1299细胞和结肠癌RKO细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液（细胞数约为5×10⁴/ml）接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30%。根据感染复数（H1299MOI为5，RKO的MOI为5），同时设置实验组和对照组，实验组以0.03uLuL的滴度为5×10⁸TU/mL的NLK基因干扰慢病毒和0.03uL uL的滴度为5×10⁸TU/mL的EGFR基因干扰慢病毒加入到癌细胞培养液中，对照组以0.03uL的滴度为5×10⁸TU/mL的对照病毒加入到癌细胞培养液中。

培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液（2×10⁴/ml），以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5%CO₂培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics ArrayScan VTI高内涵筛选分析仪（Thermo Fisher）检测读板一次，连续检测读板4天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出各实验组和对照组中每次扫描孔板中的同时带绿色荧光和红色荧光的细胞的数量（同时感染NKL基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒的细胞），单独带绿色荧光细胞的数量（仅感染NKL基因干扰慢病毒的细胞），单独带红色荧光的细胞的数量（仅感染EGFR基因干扰慢病毒的细胞），对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线。

细胞增殖曲线的结果见图5-6，结果表明：同时感染上NKL shRNA慢病毒和EGFRshRNA慢病毒的人肺癌H1299细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比下降了67.4%，单独感染上EGFR shRNA慢病毒的H1299细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了13.9%，单独感染上NLK shRNA慢病毒的H1299细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了39.7%。

同时感染上NKL shRNA慢病毒和EGFR shRNA慢病毒的人结肠癌RKO细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比下降了78.49%，单独感染上EGFR shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了47.48%，单独感染上NLK shRNA慢病毒的RKO细胞在体外培养4天后，活力细胞增殖倍数与对照组相比较下降了11.29%。

上述实验结果表明，双基因敲减后的细胞生长抑制率明显大于单基因敲减组的加和，表明NLK基因shRNA慢病毒能与EGFR基因shRNA慢病毒协同抑制肿瘤细胞的增殖。

Claims (6)

1.分离的人NLK基因和人EGFR基因作为针对肿瘤细胞的RNA干扰作用靶标在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途；所述肿瘤选自肺癌或结肠癌；将分离的人NLK基因和人EGFR基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物；其二，将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物；将人NLK基因和人EGFR基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物具体是指：将NLK基因和人EGFR基因共同作为RNA干扰作用的靶标，研制能同时针对两种基因的肿瘤治疗药物或制剂，从而降低肿瘤细胞内NLK基因和人EGFR基因的表达水平；或者，将NLK基因和人EGFR基因分别作为RNA干扰作用的靶标，来研制分别针对两种基因的肿瘤治疗药物，从而获得能降低肿瘤细胞内NLK基因和人EGFR基因表达水平的肿瘤治疗药物或制剂；所述NLK基因的靶序列，为SEQ ID NO:1所示序列；所述EGFR基因的靶序列，为SEQ ID NO:2所示序列。

2.一种治疗肿瘤的核酸分子药物，其有效成分含有降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子，以及降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子；

所述降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子包含：

a)NLK基因双链RNA，所述NLK基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；所述NLK基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与NLK基因的靶序列基本相同；或者

b)NLK基因shRNA，所述NLK基因shRNA中含有能够在严紧条件下与NLK基因杂交的核苷酸序列；所述NLK基因shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与NLK基因的靶序列基本相同；所述NLK基因的靶序列，为SEQ ID NO:1所示序列；

所述降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子包含：

A.EGFR基因双链RNA，所述EGFR基因双链RNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交的核苷酸序列；所述EGFR基因双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与EGFR基因的靶序列基本相同；或者

B.EGFR基因shRNA，所述EGFR基因shRNA中含有能够在严紧条件下与EGFR基因杂交的核苷酸序列；所述EGFR基因shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与EGFR基因的靶序列基本相同；所述EGFR基因的靶序列，为SEQ ID NO:2所示序列。

3.如权利要求2所述的核酸分子药物，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA，并且NLK基因小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：9所示；EGFR基因小干扰RNA第一链的序列如SEQID NO：10所示；所述NLK基因shRNA的序列如SEQ ID NO:11所示；所述EGFR基因shRNA的序列如SEQ ID NO:12所示。

4.一种治疗肿瘤的慢病毒载体药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒载体和EGFR基因干扰慢病毒载体，所述NLK基因干扰慢病毒载体含有编码权利要求2-3任一权利要求所述核酸分子药物中的NLK基因shRNA的基因片段；所述EGFR基因干扰慢病毒载体含有编码权利要求2-3任一权利要求所述核酸分子药物中的EGFR基因shRNA的基因片段。

5.一种治疗肿瘤的慢病毒药物，其有效成分含有NLK基因干扰慢病毒和EGFR基因干扰慢病毒，所述NLK基因干扰慢病毒由权利要求4所述慢病毒载体药物中的NLK基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成；所述EGFR基因干扰慢病毒由权利要求4所述慢病毒载体药物中的EGFR基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。

6.一种治疗肺癌或结肠癌的药物组合物，其组成含有权利要求2-3任一权利要求所述核酸分子药物中的降低肿瘤细胞中NLK基因表达的分离的核酸分子、权利要求4所述慢病毒载体药物中的NLK基因干扰慢病毒载体、权利要求5所述慢病毒药物中的NLK基因干扰慢病毒中的至少一种；以及权利要求2-3任一权利要求所述核酸分子药物中的降低肿瘤细胞中EGFR基因表达的分离的核酸分子、权利要求4所述慢病毒载体药物中的EGFR基因干扰慢病毒载体、权利要求5所述慢病毒药物中的EGFR基因干扰慢病毒中的至少一种。