CN107779453A - 人trip13 基因的用途及其相关药物 - Google Patents
人trip13 基因的用途及其相关药物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107779453A CN107779453A CN201610784591.5A CN201610784591A CN107779453A CN 107779453 A CN107779453 A CN 107779453A CN 201610784591 A CN201610784591 A CN 201610784591A CN 107779453 A CN107779453 A CN 107779453A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- trip13
- genes
- plko
- slow virus
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 101001098930 Homo sapiens Pachytene checkpoint protein 2 homolog Proteins 0.000 title claims abstract description 113
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 51
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 37
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 claims abstract description 36
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims abstract description 34
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 101150068317 Trip13 gene Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 24
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 claims description 28
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 claims description 27
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 claims description 16
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 claims description 16
- 102100038993 Pachytene checkpoint protein 2 homolog Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 14
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 12
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 4
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 3
- 101100352418 Caenorhabditis elegans plp-1 gene Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 13
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 abstract description 9
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 abstract description 4
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 39
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 238000012228 RNA interference-mediated gene silencing Methods 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 108091062183 EsiRNA Proteins 0.000 description 5
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 102100030011 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 208000002154 non-small cell lung carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 208000029729 tumor suppressor gene on chromosome 11 Diseases 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 108010005054 Deoxyribonuclease BamHI Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 206010061309 Neoplasm progression Diseases 0.000 description 1
- QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N Propyl levulinate Chemical compound CCCOC(=O)CCC(C)=O QOSMNYMQXIVWKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010064390 Tumour invasion Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125644 antibody drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009400 cancer invasion Effects 0.000 description 1
- 239000012830 cancer therapeutic Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 1
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008676 import Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000021121 meiosis Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000003340 mental effect Effects 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000012858 packaging process Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000032361 posttranscriptional gene silencing Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 229940126586 small molecule drug Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- -1 sorbierite Chemical compound 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 102000004217 thyroid hormone receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000721 thyroid hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005751 tumor progression Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了人TRIP13基因的用途及其相关药物。本发明公开了人TRIP13基因在肿瘤治疗药物制备中的用途。本发明还进一步构建了人TRIP13基因小分子干扰RNA、人TRIP13基因干扰核酸构建体、人TRIP13基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TRIP13基因的表达,尤其是慢病毒,能够高效侵染靶细胞,高效率地抑制靶细胞中TRIP13基因的表达,进而抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡,在肿瘤治疗中具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,更具体地涉及人TRIP13基因的用途及其相关药物。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达,导致其降解,从而引起生物体内特异基因的沉默,使细胞表现出某种基因表型的缺失,是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明,长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(Tuschl T,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21to23nucleotide intervals.Cell 2000;101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗,但五年生存率仍很低,如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预,将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来,RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005;579:5996-6007.)。
TRIP13基因编码的蛋白可与甲状腺激素受体相互作用,该基因在减数分裂中染色体重组过程有关键作用。已有相关报道发现,TRIP13基因在非小细胞肺癌的早期发挥作用(Kang JU,Koo SH,Kwon KC,Park JW,Kim JM.Gain at chromosomal region 5p15.33,containing TERT,is the most frequent genetic event in early stages of non-small cell lung cancer.Cancer Genet Cytogenet.2008,182(1):1-11.)。通过全基因组关联研究,确定了TRIP13所在的染色体5p15.33区域是胰腺癌的易感基因位点(Wolpin BM,Rizzato C,Kraft P,et al.Genome-wide association study identifies multiplesusceptibility loci for pancreatic cancer.Nat Genet.2014,46(9):994-1000.)。
目前,关于TRIP13基因在肿瘤相关领域的报道很少。
发明内容
本发明的目的在于公开与人TRIP13基因相关的治疗方法及药物,以RNA干扰(RNAi)为手段研究TRIP13基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用。
本发明第一方面,以RNA干扰为手段,研究了TRIP13基因在肿瘤发生和发展中的作用,公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法,该方法包括:向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制TRIP13基因的转录或翻译,或能够特异性抑制TRIP13蛋白的表达或活性的分子,以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
所述肿瘤细胞选自其生长与TRIP13蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。较优的,所述肿瘤细胞选自乳腺癌。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中,所述分子的施用量为足够降低TRIP13基因的转录或翻译,或者足够降低TRIP13蛋白的表达或活性的剂量。进一步的,所述TRIP13基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
所述分子可选自但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有TRIP13基因的启动子序列或TRIP13基因的信息序列。
进一步的,所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与TRIP13基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段,并特异性沉默人TRIP13基因的表达。
进一步的,所述小干扰RNA的第一链序列与TRIP13基因中的靶序列基本相同。较优的,所述TRIP13基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列。
所述TRIP13基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默TRIP13基因表达时,与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的TRIP13基因中的片段。
较佳的,所述TRIP13基因来源于人。
本发明第一方面还公开了一种分离的人TRIP13基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。
进一步的,所述肿瘤选自乳腺癌。
所述将分离的TRIP13基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容:其一,将TRIP13基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂;其二,将TRIP13基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
所述将TRIP13基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将TRIP13基因作为RNA干扰作用的靶标,来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂,从而能降低肿瘤细胞内TRIP13基因的表达水平。
所述将TRIP13基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指:将TRIP13基因作为作用对象,对药物或制剂进行筛选,以找到可以抑制或促进人TRIP13基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的TRIP13基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人TRIP13基因为作用对象筛选获得的,可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外,诸如抗体药物,小分子药物等也可将TRIP13基因及其蛋白作为作用对象。
所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制TRIP13基因的转录或翻译,或能够特异性抑制TRIP13蛋白的表达或活性的分子,从而降低肿瘤细胞中TRIP13基因的表达水平,达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过分离的TRIP13基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人TRIP13基因的转录或翻译,或者足够降低人TRIP13蛋白的表达或活性的剂量。以使人TRIP13基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法,主要是通过降低人TRIP13基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的,治疗时,将能有效降低人TRIP13基因表达水平的物质给药于患者。
本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中TRIP13基因表达的分离的核酸分子,所述核酸分子包含:
a)双链RNA,所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与TRIP13基因杂交的核苷酸序列;或者
b)shRNA,所述shRNA中含有能够在严紧条件下与TRIP13基因杂交的核苷酸序列。
进一步的,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与TRIP13基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。较佳的,所述第一链的序列与TRIP13基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同;更佳的,所述第一链的序列与TRIP13基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
更进一步的,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与TRIP13基因中的靶序列基本相同。
所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸;较佳的,长度均为19-23个核苷酸;最佳的,长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的,所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。更进一步的,所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO:13所示,具体为5’-gcuacucaacagacauaauau-3’。
SEQ ID NO:13所示的siRNA为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人TRIP13基因的小干扰RNA的一条链,另一条链即第二链的序列与第一链序列互补,该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源TRIP13基因表达的作用。
进一步的,所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与TRIP13基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源TRIP13基因表达的作用。
更一步的,所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与TRIP13基因中的靶序列基本相同。
较佳的,所述正义链片段与TRIP13基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同;更佳的,所述正义链片段与TRIP13基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
进一步的,所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的,所述shRNA的序列如SEQ ID NO:14所示,具体为:5’-gcuacucaacagacauaauaucucgagauauuaugucuguugaguagc-3’。
shRNA经酶切加工后可成为siRNA,进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人TRIP13基因表达的作用。
编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO:1所示序列及其互补序列。
所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与TRIP13基因中的靶序列基本相同,所述TRIP13基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默TRIP13基因表达时,被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的TRIP13基因中的片段。
较佳的,所述TRIP13基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列。
进一步的,所述TRIP13基因来源于人。
本发明第三方面,公开了一种TRIP13基因干扰核酸构建体,含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
所述的人TRIP13基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人TRIP13基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的,所述TRIP13基因干扰核酸构建体为TRIP13基因干扰慢病毒载体。
本发明的TRIP13基因干扰慢病毒载体是将编码前述TRIP13基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得,所述已知载体多为慢病毒载体,所述TRIP13基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后,感染肿瘤细胞,进而转录出本发明所述shRNA,通过酶切加工等步骤,最终获得所述siRNA,用于特异性沉默TRIP13基因的表达。
进一步的,所述TRIP13基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列;较优的,所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
进一步的,所述慢病毒载体可以选自:pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人TRIP13基因干扰慢病毒载体,命名为pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA。
本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物,所述肿瘤为乳腺癌。
本发明的TRIP13基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖,进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。TRIP13基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述TRIP13基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时,是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第四方面,公开了一种TRIP13基因干扰慢病毒,由前述TRIP13基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对TRIP13基因的小分子干扰RNA,从而抑制乳腺癌细胞的增殖。该TRIP13基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明第五方面,公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物,其有效物质含有前述的分离的核酸分子,TRIP13基因干扰核酸构建体或TRIP13基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。
进一步的,所述药物组合物含有1~99wt%所述双链RNA、shRNA、TRIP13基因干扰核酸构建体或TRIP13基因干扰慢病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
在制备这些组合物时,通常将活性成分与赋形剂混合,或用赋形剂稀释,或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时,它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此,组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗乳腺癌的肿瘤治疗药物中的应用。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法,具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法,包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的,所述肿瘤选自乳腺癌。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时,需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法,所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的,所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
本发明第六方面,公开了一种用于降低肿瘤细胞中的TRIP13基因表达的试剂盒,所述试剂盒包括:存在于容器中的所述分离的核酸分子,TRIP13基因干扰核酸构建体,和/或所述的TRIP13基因干扰慢病毒。
综上所述,本发明设计了针对人TRIP13基因的RNAi靶点序列,构建相应的TRIP13RNAi载体,其中编码序列SEQ ID NO:1的RNAi载体pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA能够显著下调TRIP13基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus,简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA能够靶向地将针对TRIP13基因的RNAi序列高效导入人乳腺癌细胞,降低TRIP13基因的表达水平,显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的TRIP13基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人TRIP13基因的表达,尤其是慢病毒,能够高效侵染靶细胞,高效率地抑制靶细胞中TRIP13基因的表达,促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等,进而抑制肿瘤细胞的生长,促进肿瘤细胞凋亡,在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
图1:pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。
图2:TRIP13-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后,TRIP13mRNA的表达水平显著降低。
图3:TRIP13-RNAi慢病毒侵染人乳腺癌MCF-7细胞5天后,引起细胞增殖抑制。
具体实施方式
本发明的发明人经过广泛而深入的研究发现,在人乳腺癌肿瘤组织中,TRIP13基因显著高表达。发明人发现,采用RNAi方法下调人TRIP13基因的表达后可有效地抑制肿瘤细胞的增殖、可以有效地控制肿瘤的生长进程,这一研究成果表明TRIP13基因是原癌基因,可作为肿瘤治疗的靶点。发明人进一步合成和测试了多种针对TRIP13基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列、RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒。选取人TRIP13mRNA编码区序列作为siRNA的靶位点,根据靶位点中连续的10-30(优选15-27,更优选19-23)个碱基序列设计siRNA靶点序列。通过基因克隆,构建表达上述siRNA的核酸构建体,包装表达上述siRNA的慢病毒。细胞实验证明,上述siRNA序列能够特异性沉默人肿瘤细胞中内源TRIP13基因的表达。从而,筛选出了可有效抑制TRIP13的表达进而抑制人乳腺癌MCF-7细胞增殖和生长的siRNA,在此基础上完成了本发明。
下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解,实施例仅用于说明本发明,而非限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件,如[美]Sambrook.J等著;黄培堂等译。分子克隆试验指南,第三版。北京:科学出版社2002中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。
实施例1针对人TRIP13基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人TRIP13基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取TRIP13(NM_004237)基因信息;设计针对TRIP13基因的有效的siRNA靶点。表1列出了其中针对TRIP13基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人TRIP13基因的siRNA靶点序列
SEQ ID NO | Target Seq |
1 | gctactcaacagacataatat |
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(以SEQ ID NO:1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表2);以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供,图1),使其线性化,琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示,37℃,反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接,在适当的缓冲体系(连接体系如表5所示)中于16℃连接过夜,回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考:分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下,溶于10μlLB培养基,混匀取1μl作为模板;在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游,设计通用PCR引物,上游引物序列:5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO:6);下游引物序列:5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO:7),进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表6-1,反应条件如表6-2)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO:1的表达RNAi的载体,命名为pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒,阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO:8)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时,针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表3),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA。
表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表4所示,37℃,反应1h)的载体
表4pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
表5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 | 阳性对照(μl) | 自连对照(μl) | 连接组(μl) |
线性化的载体DNA(100ng/μl) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) | 1.0 | - | 1.0 |
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
T4噬菌体DNA连接酶 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
dd H2O | 16.0 | 17.0 | 16.0 |
Total | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
表6-1PCR反应体系
试剂 | 体积(μl) |
10×buffer | 2.0 |
dNTPs(2.5mM) | 0.8 |
上游引物 | 0.4 |
下游引物 | 0.4 |
Taq聚合酶 | 0.2 |
模板 | 1.0 |
ddH2O | 15.2 |
Total | 20.0 |
表6-2PCR反应体系程序设定
3.包装TRIP13-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA的DNA,配制成100ng/μl储存液。
转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞,以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml,接种于6孔板,37℃,5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h,吸出原有培养基,加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明,向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl,PEI 12μl,无血清DMEM培养基400μl,取20μl上述抽提的质粒DNA,加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min,转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中,37℃,5%CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质,PBS溶液洗涤,加入完全培养基2ml,继续培养48h。收集细胞上清液,Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒,步骤如下:(1)4℃,4000g离心10min,除去细胞碎片;(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中;(3)4000g离心,10-15min,至需要的病毒浓缩体积;(4)离心结束后,将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开,将过滤杯倒扣在样品收集杯上,离心2min离心力不超过1000g;(5)把离心杯从样品收集杯上移开,样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ IDNO:13所示。对照慢病毒的包装过程同TRIP13-siRNA慢病毒,仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-TRIP13-siRNA载体。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测TRIP13基因的沉默效率
处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中,培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数(MOI,MCF-7:20)值,加入适宜量的实施例1制备的病毒,培养24h后更换培养基,待侵染时间达到5天后,收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书,抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书,将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表7,42℃反应1h,然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。TRIP13基因的引物如下:上游引物5’-ACTGTTGCACTTCACATTTTCCA-3’(SEQ ID NO:9)和下游引物5’-TCGAGGAGATGGGATTTGACT-3’(SEQ ID NO:10)。以管家基因GAPDH为内参,引物序列如下:上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO:11)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO:12)。按表8中的比例配置反应体系。
表7逆转录反应体系
试剂 | 体积(μl) |
5×RT buffer | 4.0 |
10mM dNTPs | 2.0 |
RNasin | 0.5 |
M-MLV-RTase | 1.0 |
DEPC H2O | 3.5 |
Total | 11.0 |
表8Real-time PCR反应体系
设定程序为两步法Real-time PCR:预变性95℃,15s;之后每一步变性95℃,5s;退火延伸60℃,30s;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后,95℃变性1min,然后冷却至55℃,使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持4s,同时读取吸光值,制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了TRIP13mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果(图2)表明,人乳腺癌MCF-7细胞mRNA的表达水平下调了84.5%。
实施例3检测侵染了TRIP13-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人乳腺癌MCF-7细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中,培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数(MOI,MCF-7:20),加入适宜量的病毒,培养24h后更换培养基,待侵染时间达到5天后,收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml),以细胞密度约为2000个/孔,接种96孔板。每组5个复孔,每孔100μl。铺好板后,置37℃、5%CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始,每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次,连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量,对数据进行统计绘图,绘出细胞增殖曲线(结果如图3)。结果表明,慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后,增殖速度显著减缓,实验组MCF-7细胞的增殖速率受到显著抑制,远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度,活力细胞数目分别下降了49.9%,表明TRIP13基因沉默导致肿瘤细胞增殖能力被抑制,提示目的基因与MCF-7细胞的增殖能力显著相关。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
Claims (14)
1.一种分离的人TRIP13基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。
2.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述肿瘤选自乳腺癌。
3.一种降低肿瘤细胞中TRIP13基因表达的分离的核酸分子,所述核酸分子包含:
a)双链RNA,所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与TRIP13基因杂交的核苷酸序列;或者
b)shRNA,所述shRNA中含有能够在严紧条件下与TRIP13基因杂交的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的分离的核酸分子,其特征在于,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与TRIP13基因中的靶序列基本相同;所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与TRIP13基因中的靶序列基本相同。
5.如权利要求3或4所述分离的核酸分子,其特征在于,所述TRIP13基因的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列。
6.如权利要求3或4所述分离的核酸分子,其特征在于,所述双链RNA为小干扰RNA,该小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO:13所示。
7.如权利要求3或4所述分离的核酸分子,其特征在于,所述shRNA的序列如SEQ ID NO:14所示。
8.一种TRIP13基因干扰核酸构建体,含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
9.如权利要求8所述TRIP13基因干扰核酸构建体,其特征在于,所述TRIP13基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。
10.如权利要求9所述TRIP13基因干扰核酸构建体,其特征在于,所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得,所述慢病毒载体选自:
pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
11.一种TRIP13基因干扰慢病毒,由权利要求9-10任一权利要求所述干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。
12.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物,其有效物质含有权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子,权利要求8-10任一权利要求所述TRIP13基因干扰核酸构建体,和/或权利要求11所述的TRIP13基因干扰慢病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
13.如权利要求12所述药物组合物在制备治疗乳腺癌的肿瘤治疗药物中的应用。
14.一种用于降低肿瘤细胞中TRIP13基因表达的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括:存在于容器中的,权利要求3-7任一权利要求所述的分离的核酸分子,权利要求8-10任一权利要求所述TRIP13基因干扰核酸构建体,和/或权利要求11所述的TRIP13基因干扰慢病毒。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610784591.5A CN107779453A (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 人trip13 基因的用途及其相关药物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201610784591.5A CN107779453A (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 人trip13 基因的用途及其相关药物 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107779453A true CN107779453A (zh) | 2018-03-09 |
Family
ID=61450910
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201610784591.5A Pending CN107779453A (zh) | 2016-08-30 | 2016-08-30 | 人trip13 基因的用途及其相关药物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107779453A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110882390A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-03-17 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | 人lsm5基因的用途及相关产品 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060134622A1 (en) * | 2002-12-20 | 2006-06-22 | Meena Augustus | Amplified cancer target genes useful in diagnosis and thereapeutic screening |
EP2669682A1 (en) * | 2012-05-31 | 2013-12-04 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Novel prognostic and predictive biomarkers (tumor markers) for human breast cancer |
CN104894223A (zh) * | 2014-03-07 | 2015-09-09 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 人copb2基因的用途及其相关药物 |
-
2016
- 2016-08-30 CN CN201610784591.5A patent/CN107779453A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20060134622A1 (en) * | 2002-12-20 | 2006-06-22 | Meena Augustus | Amplified cancer target genes useful in diagnosis and thereapeutic screening |
EP2669682A1 (en) * | 2012-05-31 | 2013-12-04 | Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf | Novel prognostic and predictive biomarkers (tumor markers) for human breast cancer |
CN104894223A (zh) * | 2014-03-07 | 2015-09-09 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 人copb2基因的用途及其相关药物 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
WANG ET AL.: "Thyroid hormone receptor interacting protein 13 (TRIP13) AAA-ATPase is a novel mitotic checkpoint-silencing protein", 《J BIOL CHEM》 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110882390A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-03-17 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | 人lsm5基因的用途及相关产品 |
CN110882390B (zh) * | 2019-11-15 | 2022-03-15 | 西安交通大学医学院第一附属医院 | 人lsm5基因的用途及相关产品 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN104225617B (zh) | 人aurka基因治疗肿瘤的用途及其相关药物 | |
CN105586391A (zh) | 人gtpbp4基因的用途及其相关药物 | |
CN104894223B (zh) | 人copb2基因的用途及其相关药物 | |
CN103305596B (zh) | 人rnf138基因的用途及其相关药物 | |
CN105779576A (zh) | 人tnfrsf12a基因的用途及其相关药物 | |
CN107779453A (zh) | 人trip13 基因的用途及其相关药物 | |
CN103656674A (zh) | 人eIF5B基因的用途及其相关药物 | |
CN103667422B (zh) | 人cul4b基因的用途及其相关药物 | |
CN103421884B (zh) | 人fzr1基因的用途及其相关药物 | |
CN103623427B (zh) | 人usp14基因的用途及其相关药物 | |
CN104225619B (zh) | 人ilk基因治疗肿瘤的用途及其相关药物 | |
CN103667430B (zh) | 一种八聚核苷酸结合蛋白表达基因的用途及其相关药物 | |
CN102552937B (zh) | 人pak7基因的用途及其相关药物 | |
CN103157115B (zh) | 人rhbdd1基因的用途及其相关药物 | |
CN105779575A (zh) | 人eif3a基因的用途及其相关药物 | |
CN103656673B (zh) | 人ywhaq基因的用途及其相关药物 | |
CN103667431B (zh) | 一种人ccch型锌指蛋白表达基因的用途及其相关药物 | |
CN104894224A (zh) | 人ckip1基因的用途及其相关药物 | |
CN104928353A (zh) | 人dgkz基因的用途及其相关药物 | |
CN103301474B (zh) | 人rnf40基因的用途及其相关药物 | |
CN108342389A (zh) | Plekho1基因的用途及其相关药物 | |
CN103623426B (zh) | 人ppp5c基因的用途及其相关药物 | |
CN104225618B (zh) | 人nlk基因和egfr基因治疗肿瘤的用途及其相关药物 | |
CN107794299A (zh) | Rps15a基因的用途及其相关药物 | |
CN104774928B (zh) | 人rrs1基因的应用以及抑制剂 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
CB02 | Change of applicant information | ||
CB02 | Change of applicant information |
Address after: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District Applicant after: Shanghai Jikai gene Medical Technology Co.,Ltd. Address before: 200233, room 680, 619-21 Guiping Road, Shanghai, Xuhui District Applicant before: SHANGHAI GENECHEM Co.,Ltd. |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180309 |