CN108342389A - Plekho1基因的用途及其相关药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源PLEKHO1基因的用途及其相关药物，公开了人PLEKHO1基因在肿瘤治疗及药物制备中的用途。本发明进一步构建了人PLEKHO1基因小分子干扰RNA、人PLEKHO1基因干扰核酸构建体、人PLEKHO1基因干扰慢病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人PLEKHO1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PLEKHO1基因的表达，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。

Description

PLEKHO1基因的用途及其相关药物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及PLEKHO1基因的用途及其相关药物。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)即用核苷酸组成的短的双链RNA(dsRNA)进行转录后基因沉默。它可高效、特异地阻断体内特定基因的表达，导致其降解，从而引起生物体内特异基因的沉默，使细胞表现出某种基因表型的缺失，是近年来新兴的一种常用的研究基因功能、寻找疾病治疗方法的实验室技术。研究表明，长度为21-23nt的双链RNA能够在转录和转录后水平特异性的引起RNAi(Tuschl T,Zamore PD,Sharp PA,Bartel DP.RNAi:double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23nucleotide intervals.Cell 2000；101:25-33.)。肿瘤患者虽经化疗、放疗和综合治疗，但五年生存率仍很低，如能对肿瘤发病和进展有关的基因进行干预，将能为肿瘤的治疗开辟新途径。近年来，RNAi已成为肿瘤的基因治疗的有效策略。利用RNAi技术可以抑制原癌基因、突变的抑癌基因、细胞周期相关基因、抗凋亡相关基因等的表达来抑制肿瘤进程(Uprichard,Susan L.The therapeutic potential of RNA interference.FEBS Letters2005；579:5996-6007.)。
PLEKHO-1(又名CKIP-1)，一个新的含有普列克底物蛋白同源结构域的蛋白，是在研究CK2的过程中发现的。它是CK2的一种非酶活性的间接调控因子，通过调控CK2的亚细胞定位发挥对CK2功能调控作用(Bosc DG,Graham KC,Saulnier RB,Zhang C,et al，Identification and characterization of CKIP-1,a novel pleckstrin homologydomain-containing protein that interacts with protein kinase CK2，2000May 12；275(19):14295-30)。PLEKHO-1可以通过其N端的PH结构域与CK2的HIKE结构域相互作用，从而引导CK2从细胞核定位到质膜上以后与其膜结合的底物相互作用，包括血影蛋白、胰岛素受体、小窝蛋白、IGF-Ⅱ、发动蛋白、IRS-1和CD5等(Olsten ME,Canton DA,Zhang C,WaltonPA et al，The Pleckstrin homology domain of CK2 interacting protein-1 isrequired for interactions and recruitment of protein kinase CK2 to the plasmamembrane.2004Oct 1；279(40):42114-27)。表明PLEKHO-1和CK2在质膜相关的细胞学过程中起着重要的作用：在调节膜受体介导的细胞信号转导、细胞内膜泡运输以及细胞骨架的组织中起作用。PLEKHO-1在细胞信号转导中起着支架蛋白的作用，它可以将CK2相关的信号通路中的分子与其他信号通路中的分子级联起来，形成一个复杂的信号转导体，引起特定的细胞行为。此外，PLEKHO-1还可以作为一种接头蛋白介导CK2与其他蛋白，如细胞骨架相关蛋白、膜泡运输相关蛋白等)的相互作用，调节一系列重要的细胞学过程(Olsten ME,Weber JE,Litchfield DW et al，CK2 interacting proteins:emerging paradigms forCK2 regulation，2005 Jun；274(1-2):115-24)。此外，还发现RNA干扰PLEKHO-1可以刺激骨生成(Guo B,Zhang B,Zheng L,Tang T et al，Therapeutic RNA interferencetargeting CKIP-1 with a cross-species sequence to stimulate bone formation，2014 Feb；59:76-88.doi:10.1016/j.bone.)。
然而，现有技术中PLEKHO1基因与肿瘤之间的关系尚未见报道。
发明内容
鉴于以上问题，本发明以RNA干扰(RNAi)为手段研究PLEKHO1基因在肿瘤细胞的存活和凋亡过程中的作用，公开了与人PLEKHO1基因相关的治疗方法及药物。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明第一方面，以RNA干扰为手段，研究了PLEKHO1基因在肿瘤发生和发展中的作用，公开了一种抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法，该方法包括：向肿瘤细胞施用一种能够特异性抑制PLEKHO1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PLEKHO1蛋白的表达或活性的分子，以此来抑制肿瘤细胞的生长、增殖、分化和/或存活。
所述肿瘤细胞选自其生长与PLEKHO1蛋白的表达或活性相关的肿瘤细胞。
优选的，所述肿瘤细胞选自肺癌或胶质瘤。
所述抑制或降低肿瘤细胞生长、增殖、分化和/或存活的方法中，所述分子的施用量为足够降低PLEKHO1基因的转录或翻译或者足够降低PLEKHO1蛋白的表达或活性的剂量。进一步的，所述PLEKHO1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
所述分子可选自但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。所述双链RNA、核酶、esiRNA或者shRNA含有PLEKHO1基因的启动子序列或PLEKHO1基因的信息序列。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。所述小干扰RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PLEKHO1基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合靶序列所编码的mRNA片段，并特异性沉默人PLEKHO1基因的表达。
进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同。较优的，所述PLEKHO1基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列。
所述PLEKHO1基因中的靶序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默PLEKHO1基因表达时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的PLEKHO1基因中的片段。
优选的，所述PLEKHO1基因来源于人。
本发明的第一方面还公开了一种分离的人PLEKHO1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。进一步的，所述肿瘤选自肺癌或胶质瘤之任一。
所述将分离的PLEKHO1基因用于制备或筛选肿瘤治疗药物包括两方面的内容：其一，将PLEKHO1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂；其二，将PLEKHO1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂。
进一步的，所述针对肿瘤细胞的作用靶标为RNA干扰作用靶标。
所述将PLEKHO1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将PLEKHO1基因作为RNA干扰作用的靶标，来研制针对肿瘤细胞的药物或制剂，从而能降低肿瘤细胞内PLEKHO1基因的表达水平。
所述将PLEKHO1基因作为药物或制剂针对肿瘤细胞的作用靶标应用于筛选肿瘤治疗药物或制剂具体是指：将PLEKHO1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制或促进人PLEKHO1基因表达的药物作为肿瘤治疗备选药物。如本发明所述的PLEKHO1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人PLEKHO1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制肿瘤细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将PLEKHO1基因及其蛋白作为作用对象。
所述肿瘤治疗药物为能够特异性抑制PLEKHO1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制PLEKHO1蛋白的表达或活性的分子，从而降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因的表达水平，达到抑制肿瘤细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过分离的PLEKHO1基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(shRNA)。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够降低人PLEKHO1基因的转录或翻译，或者足够降低人PLEKHO1蛋白的表达或活性的剂量。以使人PLEKHO1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法，主要是通过降低人PLEKHO1基因的表达水平抑制肿瘤细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人PLEKHO1基因表达水平的物质给药于患者。
本发明第二方面公开了一种降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含：
双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与PLEKHO1基因杂交的核苷酸序列；shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与PLEKHO1基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PLEKHO1基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。优选的，所述第一链的序列与PLEKHO1基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述第一链的序列与PLEKHO1基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
更进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同。
所述双链RNA第一链和第二链的长度均为15-27个核苷酸；较佳的，长度均为19-23个核苷酸；最佳的，长度均为19、20或者21个核苷酸。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)，更进一步的，所述小干扰RNA第一链的序列如SEQ ID NO：9所示，具体为5’-gagcugagagaccuguacaga-3’。
SEQ ID NO：9所示的siRNA为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人PLEKHO1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默肿瘤细胞中内源PLEKHO1基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PLEKHO1基因中15-27个连续的核苷酸序列基本相同。所述shRNA经加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源PLEKHO1基因表达的作用。
更一步的，所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同。
优选的，所述正义链片段与PLEKHO1基因中19-23个连续的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正义链片段与PLEKHO1基因中19、20或者21个连续的核苷酸序列基本相同。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO:14所示，具体为：5’-gagcugagagaccuguacaga uucaagagaucuguacaggucucucagcuc-3’。
shRNA经酶切加工后可成为siRNA，进而起到特异性沉默肿瘤细胞中内源性人PLEKHO1基因表达的作用。
编码本发明所述shRNA的基因片段的干扰慢病毒载体含有SEQ ID NO:1所示序列及其互补序列。
所述双链RNA的第一链或所述shRNA的正义链片段与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同，所述PLEKHO1基因的靶序列即为siRNA用于特异性沉默PLEKHO1基因表达时，被所述siRNA识别并沉默的mRNA片段所对应的PLEKHO1基因中的片段。
优选的，所述PLEKHO1基因中的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列。
进一步的，所述PLEKHO1基因来源于人。
本发明第三方面，公开了一种PLEKHO1基因干扰核酸构建体，含有编码本发明所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
所述的人PLEKHO1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人PLEKHO1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。进一步的，所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体为PLEKHO1基因干扰慢病毒载体。
本发明的PLEKHO1基因干扰慢病毒载体是将编码前述PLEKHO1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述PLEKHO1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染肿瘤细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默PLEKHO1基因的表达。
进一步的，所述PLEKHO1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码肿瘤细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；优选的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白GFP。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人PLEKHO1基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA。
本发明分离的核酸分子可用于制备预防或治疗肿瘤的药物，所述肿瘤为肺癌或胶质瘤之任一。
本发明的PLEKHO1基因siRNA可用于抑制肿瘤细胞的增殖，进一步地可以用作治疗肿瘤的药物或制剂。PLEKHO1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述PLEKHO1基因siRNA。当用作治疗肿瘤的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第四方面，公开了一种PLEKHO1基因干扰慢病毒，由前述PLEKHO1基因干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染肿瘤细胞并产生针对PLEKHO1基因的小分子干扰RNA，从而抑制肺癌或胶质瘤的增殖。该PLEKHO1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗肿瘤的药物。
本发明第五方面，公开了一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有前述的分离的核酸分子，PLEKHO1基因干扰核酸构建体或PLEKHO1基因干扰慢病毒中的一种或多种的组合。
进一步的，所述药物组合物含有1～99wt％所述双链RNA、shRNA、PLEKHO1基因干扰核酸构建体或PLEKHO1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
本发明还公开了所述药物组合物在制备治疗肺癌或胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。进一步的，所述肿瘤选自肺癌或胶质瘤之任一。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。所述方法的对象可以为人。
本发明第六方面，公开了一种用于降低肿瘤细胞中的PLEKHO1基因表达的试剂盒，所述试剂盒包括：存在于容器中的所述分离的核酸分子，PLEKHO1基因干扰核酸构建体，和/或所述的PLEKHO1基因干扰慢病毒。
本发明的优点和有益效果在于：针对人PLEKHO1基因的1个RNAi靶点序列，构建相应的PLEKHO1RNAi载体，其中编码序列SEQ ID NO:9的RNAi载体pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA能够显著下调PLEKHO1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA能够靶向地将针对PLEKHO1基因的RNAi序列高效导入肺癌或胶质瘤细胞，降低PLEKHO1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的PLEKHO1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制人PLEKHO1基因的表达，尤其是慢病毒，能够高效侵染靶细胞，高效率地抑制靶细胞中PLEKHO1基因的表达，促进细胞凋亡、降低肿瘤细胞的侵袭和转移能力等，进而抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞凋亡，在肿瘤治疗中具有重要意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：pGCSIL-GFP质粒DNA图谱。
图2：人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞侵染PLEKHO1-siRNA慢病毒3天后，人肺癌H1299细胞mRNA的表达水平下调了49.3％；胶质瘤U87细胞mRNA的表达水平下调了77.2％。
图3：慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，人肺癌H1299细胞活力细胞数目下降了50.8％，人胶质瘤U87细胞活力细胞数目下降了69.2％，表明PLEKHO1基因沉默导致人肺癌细胞和胶质瘤细胞增殖能力被抑制。
图4：克隆形成实验检测肿瘤细胞感染PLEKHO1-siRNA慢病毒后克隆形成能力结果示意图，以人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞为例，与未干扰(control)及对照干扰(NC组)相比，RNA干扰降低PLEKHO1基因的表达(KD组)后，肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小；表明PLEKHO1基因沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。
图5：PI染色-TTP法检测降低基因的表达后，肿瘤细胞的细胞凋亡小体(subG1期)比例的变化；发现下调基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与未干扰(control)相比，RNA干扰降低基因的表达(PLEKHO1-siRNA组)后，凋亡肿瘤细胞产生的凋亡小体的数目显著增多；表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
图6：BrdU检测肿瘤细胞感染慢病毒后实验组、对照组的增殖情况，与未干扰(control)相比，RNA干扰降低基因的表达(PLEKHO1-siRNA组)后，细胞增殖减缓。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1.针对人PLEKHO1基因RNAi慢病毒的制备
1)筛选针对人PLEKHO1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取PLEKHO1(NM_015904)基因信息；设计针对PLEKHO1基因的有效的siRNA靶点。表1列出了其中1条针对PLEKHO1基因的有效siRNA靶点序列。
表1靶向于人PLEKHO1基因的siRNA靶点序列
SEQ ID NO TargetSeq
1 gagctgagagacctgtacaga
2)慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(SEQ ID NO:1)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列，如表2；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体，如图1所示，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，酶切体系如表4所示，37℃，反应1h。在适当的缓冲体系中于16℃连接过夜，回收连接产物，连接体系如表5所示。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，
上游引物序列：5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO:4)；
下游引物序列：5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO:5)。
进行PCR鉴定实验，PCR反应体系如表6-1，反应条件如表6-2。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO:1的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO:6)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列，如表3所示，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA。
表3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4DNA连接酶将双酶切线性化的载体，酶切体系如表4所示，37℃，反应1h。
表4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
试剂 体积(μl)
pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) 2.0
10×buffer 5.0
100×BSA 0.5
Age I(10U/μl) 1.0
EcoR I(10U/μl) 1.0
dd H2O 40.5
Total 50.0
表5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 阳性对照(μl) 自连对照(μl) 连接组(μl)
线性化的载体DNA(100ng/μl) 1.0 1.0 1.0
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) 1.0 - 1.0
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 1.0 1.0 1.0
T4噬菌体DNA连接酶 1.0 1.0 1.0
dd H2O 16.0 17.0 16.0
Total 20.0 20.0 20.0
表6-1 PCR反应体系
试剂 体积(μl)
10×buffer 2.0
dNTPs(2.5mM) 0.8
上游引物 0.4
下游引物 0.4
Taq聚合酶 0.2
模板 1.0
ddH2O 15.2
Total 20.0
表6-2 PCR反应体系程序设定
3)包装PLEKHO1-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80℃保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ ID NO:9所示。对照慢病毒的包装过程同PLEKHO1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-PLEKHO1-siRNA载体。
实施例2.实时荧光定量RT-PCR法检测PLEKHO1基因的沉默效率
处于对数生长期的人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为2×105/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，H1299:20，U87:20)值，加入适宜量的实施例1制备的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到3d后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA，逆转录反应体系见表7，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。PLEKHO1基因的引物如下：
上游引物5’-GCCAAATAATCACCAACA-3’(SEQ ID NO：10)；
下游引物5’-CTGGTTCTGAGCAGGTTC-3’(SEQ ID NO：11)。
以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：
上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO：12)；
下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO：13)。
按表8中的比例配置Real-time PCR反应体系。
表7逆转录反应体系
试剂 体积(μl)
5×RT buffer 4.0
10mM dNTPs 2.0
RNasin 0.4
M-MLV-RTase 1.0
DEPC H2O 2.6
Total 10.0
表8 Real-time PCR反应体系
试剂 体积(μl)
SYBR premix ex taq: 10.0
上游引物(2.5μM)： 0.5
下游引物(2.5μM)： 0.5
cDNA 1.0
ddH2O 8.0
Total 20.0
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s，同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了PLEKHO1mRNA的表达丰度。侵染对照病毒(Lv-Scr-siRNA)的细胞作为对照。实验结果如图2表明，人肺癌H1299细胞mRNA的表达水平下调了49.3％；胶质瘤U87细胞mRNA的表达水平下调了77.2％。此外，还检测了结肠癌RKO细胞和胶质瘤U87细胞(MOI，RKO:20，U87:20)在侵染PLEKHO1-siRNA慢病毒后，mRNA表达下调水平，结果结肠癌RKO细胞中mRNA的表达水平下调了23％；胶质瘤U87细胞中mRNA水平下调了77.2％
实施例3.检测侵染了PLEKHO1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，H1299:20，U87:20)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5d后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组3-5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5d。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线，实验结果如图3所示，结果表明，慢病毒侵染各肿瘤在细胞体外培养5d后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，人肺癌H1299细胞活力细胞数目下降了50.8％，人胶质瘤U87细胞活力细胞数目下降了69.2％，表明PLEKHO1基因沉默导致人肺癌细胞和胶质瘤细胞增殖能力被抑制。
此外，还通过实验验证了，慢病毒侵染结肠癌RKO细胞和胶质瘤U87细胞(MOI，RKO:20，U87:20)后，结肠癌RKO细胞活力细胞数目下降了10.0％，人胶质瘤U87细胞活力细胞数目下降了69.2％。
实施例4.侵染慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测
将人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将PLEKHO1-siRNA慢病毒按照MOI，H1299:20，U87:20加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；细胞计数后接种于6孔板中(800个细胞/孔，每个实验组设置3个复孔)，将接种好的细胞于培养箱中继续培养到14d或绝大多数单个克隆中细胞数大于50为止，中途隔3d进行换液并观察细胞状态；实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照；实验终止时用PBS洗涤细胞1次，多聚甲醛固定细胞30～60min，PBS洗涤细胞1次，每孔加入洁净、无杂质GIEMSA染液500μL，染细胞20min，ddH2O洗细胞数次，直至洗净板上背景，晾干，显微镜下拍照单克隆，数码相机拍照整张板，克隆计数。
结果如图4所示，克隆形成实验检测肿瘤细胞感染PLEKHO1-siRNA慢病毒后克隆形成能力结果示意图，以人肺癌H1299细胞、胶质瘤U87细胞为例，与未干扰(control)及对照干扰(NC组)相比，RNA干扰降低PLEKHO1基因的表达(KD组)后，肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小；表明PLEKHO1基因沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。
实施例5.侵染慢病毒的肿瘤细胞细胞凋亡水平检测
人胶质瘤U87细胞、肺癌H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将PLEKHO1-siRNA慢病毒按照MOI，H1299:20，U87:20加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
收集感染后各实验组细胞培养上清于5ml离心管中，D-Hanks洗涤细胞一次，胰酶消化细胞，培养上清终止化，收集细胞于同一5ml离心管中。每组设三个复孔；1500rmp 5min离心，弃去上清；PBS洗涤细胞沉淀一次，1500rmp5min离心，收集细胞；1×binding buffer洗涤细胞沉淀一次，1500rmp 5min离心，收集细胞；1ml(根据细胞沉淀量决定加入染色缓冲液体积，使细胞悬液最终密度为1×106-1×107cell/ml)1×staining buffer重悬细胞沉淀；取细胞悬液100ul(1×105-1×106细胞)，加入5ul annexin V-APC染色，室温避光10-15min；转移至流式上机管中，上机检测。
结果如图5所示，PI染色-TTP(FACS)法检测降低基因的表达后，肿瘤细胞的细胞凋亡小体(subG1期)比例的变化。发现下调基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与未干扰(control)相比，RNA干扰降低基因的表达(PLEKHO1-siRNA组)后，凋亡肿瘤细胞产生的凋亡小体的数目显著增多；表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
实施例6.BrdU法检测侵染慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
人胶质瘤U87细胞、肺癌H1299细胞胰酶消化后接种于12孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将PLEKHO1-siRNA慢病毒按照MOI，H1299:20，U87:20加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
对照组设计：空白对照组：只有培养基，没有细胞，实验时加入BrdU；背景对照：含有细胞，实验时不加入BrdU；对于任何处理的细胞都需要设置背景对照；操作步骤如下：
接种：于96孔板中接种合适密度的待测细胞；
加入BrdU：在检测前2-24h内加入BrdU试剂。BrdU在使用前用培养基1:100稀释，加入稀释后的BrdU 10μL/well，继续培养到前面确定的时间。固定：BrdU作用后，吸干培养基，加入200μL FixDenat(Bottle 2)200μL/well，在室温下暗室中放置30min。封闭：吸弃固定液，加入5-10％的BSA室温暗室中封闭半小时，吸弃封闭液。加入抗体：Anti-BrdU-POD储存液：用双蒸水1.1mL稀释Anti-BrdU-POD(bottle3)10min，充分混匀。
Anti-BrdU-POD工作液：用antibody dilution solution(bottle 4)1:100稀释Anti-BrdU-POD储存液。加入Anti-BrdU-POD工作液100μL/well，室温下暗室中反应90min。洗板：用无菌双蒸水1:10稀释washing buffer concentrate(bottle 5)，加入稀释后的washing Buffer 200-300μL/well，洗板三次，拍干。最后再在一个空的细胞板外盒中加入无菌水，将待测的培养板放入其中，无菌水没过培养孔，拍干，擦干。加入Substratesolution(bottle 6)100μL/well，室温下暗室中反应5-30min，直到反应溶液变为蓝色。显色：在培养孔中加入50μL/well 10％H2SO4，上机检测。读板：在450nm，630nm单波长检测读板。数据统计分析。
结果如图6所示，BrdU检测肿瘤细胞感染慢病毒后实验组、对照组的增殖情况，与未干扰(control)相比，RNA干扰降低基因的表达(PLEKHO1-siRNA组)后，细胞增殖减缓。
本研究发现，利用慢病毒介导的RNAi方法，在降低PLEKHO1基因在肿瘤细胞中的表达后，可以有效抑制肿瘤细胞的增殖。本研究表明，PLEKHO1基因是一个原癌基因，可促进肿瘤细胞增殖，在肿瘤发生和发展中具有重要的生物学功能，PLEKHO1基因可以为肿瘤治疗的靶标，慢病毒介导的PLEKHO1基因特异性沉默可作为肿瘤治疗的一种新手段。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的分离的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与PLEKHO1基因杂交的核苷酸序列；所述shRNA中含有能够在严紧条件下与PLEKHO1基因杂交的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的一种降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与PLEKHO1基因中的靶序列基本相同。
3.如权利要求2所述的一种降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的分离的核酸分子，其特征在于，所述PLEKHO1基因的靶序列含有SEQ ID NO:1所示序列；所述双链RNA为小干扰RNA，所述小干扰RNA第一链的序列为SEQ ID NO:9所示序列；所述shRNA的序列为SEQ ID NO:14所示序列。
4.一种PLEKHO1基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求1-3任一权利要求所述分离的核酸分子中的shRNA的基因片段，并能表达shRNA。
5.如权利要求4所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体为干扰慢病毒载体。
6.如权利要求5所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述干扰慢病毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入慢病毒载体后获得，所述慢病毒载体选自：
pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
7.一种PLEKHO1基因干扰慢病毒，由权利要求5-6任一权利要求所述干扰慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。
8.一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，其有效物质含有权利要求1-3任一权利要求所述的降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的分离的核酸分子，权利要求4-6任一权利要求所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体和/或权利要求7所述的PLEKHO1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
9.如权利要求8所述的一种用于预防或治疗肿瘤的药物组合物，在制备治疗肺癌或胶质瘤的肿瘤治疗药物中的应用；PLEKHO1基因在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。
10.一种用于降低肿瘤细胞中PLEKHO1基因表达的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：存在于容器中的，权利要求1-3任一权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求4-6任一权利要求所述PLEKHO1基因干扰核酸构建体和/或权利要求7所述的PLEKHO1基因干扰慢病毒。
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