CN110791566B - 人shcbp1基因的用途及相关产品 - Google Patents
人shcbp1基因的用途及相关产品 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110791566B CN110791566B CN201911037854.6A CN201911037854A CN110791566B CN 110791566 B CN110791566 B CN 110791566B CN 201911037854 A CN201911037854 A CN 201911037854A CN 110791566 B CN110791566 B CN 110791566B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- thyroid cancer
- shcbp1
- gene
- cells
- cancer cells
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
- C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及人SHCBP1基因作为靶标在制备甲状腺癌治疗药物或者在制备甲状腺癌诊断药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究发现,采用RNAi方法下调人SHCBP1基因的表达后可有效地抑制甲状腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡,可以有效地控制甲状腺癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制甲状腺癌细胞的增殖能力、抑制甲状腺癌细胞在体内的成瘤能力、促进甲状腺癌细胞凋亡、抑制甲状腺癌细胞克隆、抑制甲状腺癌细胞转移能力、抑制甲状腺癌细胞迁移能力、改变甲状腺癌细胞周期分布,从而治疗甲状腺癌,为甲状腺癌治疗开辟新的方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医药研究领域,具体涉及人SHCBP1基因的用途及相关产品。
背景技术
SHC SH2结构域蛋白1(SHCBP1)是一种重要的连接蛋白,可能参与MAPK-Erk、Jak-Stat信号通路(Genecards,https://www.genecards.org),并且与肺癌、肝细胞癌、胃癌、神经胶质瘤、滑膜肉瘤等的恶性进展相关。SHCBP1与肿瘤细胞的增殖、肿瘤生长和细胞分化等功能活动相关,但其促进癌症发展的机制尚不十分清楚。
通过查阅文献发现SHCBP1在多种肿瘤当中高表达,其促进癌症发生发展的机制也不尽相同。SHCBP1在肺癌中通过调控PTEN的表达抑制肺癌细胞的凋亡,SHCBP1与肺癌的顺铂耐药、侵袭转移能力有关,并与Wnt信号通路密切相关。EGF诱导SHCBP1的核定位并激活β-catenin信号通路,导致非小细胞肺癌的恶性进展。在滑膜肉瘤中,SHCBP1通过TGF-β1/Smad信号通路的调节抑制肿瘤的转移,并与患者预后相关。此外,SHCBP1还参与肝细胞癌、乳腺癌、胃癌、神经胶质瘤等恶性肿瘤的发生发展过程。
在甲状腺癌中,该基因的功能尚未见报道。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题,本发明的目的在于提供人SHCBP1基因的用途及相关产品。
为了实现上述目的以及其他相关目的,本发明采用如下技术方案:
本发明的第一方面,提供人SHCBP1基因作为靶标在制备甲状腺癌治疗药物或者在制备甲状腺癌诊断药物中的用途。
所述人SHCBP1基因作为靶标在制备甲状腺癌治疗药物具体是指:将SHCBP1基因作为作用对象,对药物或制剂进行筛选,以找到可以抑制人SHCBP1基因表达的药物作为甲状腺癌治疗备选药物。如本发明所述的SHCBP1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人SHCBP1基因为作用对象筛选获得的,可用作具有抑制甲状腺癌细胞增殖作用的药物。除此之外,诸如抗体药物,小分子药物等也可将SHCBP1基因作为作用对象。
所述将人SHCBP1基因作为靶标用于制备甲状腺癌诊断药物具体是指:将SHCBP1基因表达产物作为一项甲状腺癌诊断指标应用于甲状腺癌诊断药物的制备。
所述甲状腺癌治疗药物为能够特异性抑制SHCBP1基因的转录或翻译,或能够特异性抑制SHCBP1蛋白的表达或活性的分子,从而降低甲状腺癌细胞中SHCBP1基因的表达水平,达到抑制甲状腺癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过SHCBP1基因制备获得的甲状腺癌治疗药物或者甲状腺癌诊断药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于:反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
所述甲状腺癌治疗药物的施用量为足够降低人SHCBP1基因的转录或翻译,或者足够降低人SHCBP1蛋白的表达或活性的剂量。以使人SHCBP1基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
采用前述甲状腺癌治疗药物治疗甲状腺癌的方法,主要是通过降低人SHCBP1基因的表达水平抑制甲状腺癌细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的,治疗时,将能有效降低人SHCBP1基因表达水平的物质给药于患者。
在一种实施方式中,所述SHCBP1基因的靶标序列如SEQ ID NO:1所示。具体为:5’-TGGTGAAACCTACAATCTT-3’。
本发明的第二方面,提供SHCBP1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
治疗甲状腺癌;
抑制甲状腺癌细胞的增殖能力;
抑制甲状腺癌细胞在体内的成瘤能力;
促进甲状腺癌细胞凋亡;
抑制甲状腺癌细胞克隆;
抑制甲状腺癌细胞转移能力;
抑制甲状腺癌细胞迁移能力;
改变甲状腺癌细胞周期分布。
所述产品必然包括SHCBP1抑制剂,并以SHCBP1抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中,发挥前述功用的有效成分可仅为SHCBP1抑制剂,亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即,SHCBP1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质,亦可为多成分物质。
所述产品的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
所述SHCBP1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的,所述SHCBP1抑制剂可以为降低甲状腺癌细胞中SHCBP1基因表达的核酸分子。具体的,可以是双链RNA或shRNA。
本发明的第三方面,提供了一种治疗甲状腺癌的方法,为向对象施用SHCBP1抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的甲状腺癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述甲状腺癌细胞可以为离体甲状腺癌细胞。
所述对象可以是罹患甲状腺癌的患者或者期待治疗的甲状腺癌的个体。或者所述对象为甲状腺癌患者或者期待治疗甲状腺癌的个体的离体甲状腺癌细胞。
所述SHCBP1抑制剂可以在接受甲状腺癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明第四方面公开了一种降低甲状腺癌细胞中SHCBP1基因表达的核酸分子,所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
其中,所述双链RNA中含有能够与SHCBP1基因杂交的核苷酸序列;
所述shRNA中含有能够与SHCBP1基因杂交的核苷酸序列。
进一步的,所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,并且所述第一链的序列与SHCBP1基因中的靶序列基本相同。
所述SHCBP1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默SHCBP1基因表达时,被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的SHCBP1基因中的片段。
进一步的,所述双链RNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。具体为:5’-TGGTGAAACCTACAATCTT-3’。更进一步的,所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO:2所示。具体为5’-UGGUGAAACCUACAAUCUU-3’。
进一步的,所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
SEQ ID NO:2为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人SHCBP1基因的小干扰RNA的一条链,另一条链即第二链的序列与第一链序列互补,该siRNA可以起到特异性沉默甲状腺癌细胞中内源SHCBP1基因表达的作用。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段,以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构,所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补,并且所述正义链片段的序列与SHCBP1基因中的靶序列基本相同。
进一步的,所述shRNA的靶序列如SEQ ID NO:1所示。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默甲状腺癌细胞中内源SHCBP1基因表达的作用。
进一步的,所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一:UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的,所述shRNA的序列如SEQ ID NO:3所示。具体为5’-CUUGGUGAAACCUACAAUCUUCUCGAGAAGAUUGUAGGUUUCACCAAG-3’。
进一步的,所述SHCBP1基因来源于人。
本发明第五方面,公开了一种SHCBP1基因干扰核酸构建体,含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段,能表达所述shRNA。
所述的SHCBP1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人SHCBP1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的,所述SHCBP1基因干扰核酸构建体为SHCBP1基因干扰慢病毒载体。
本发明公开的SHCBP1基因干扰慢病毒载体是将编码前述SHCBP1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得,所述已知载体多为慢病毒载体,所述SHCBP1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后,感染甲状腺癌细胞,进而转录出本发明所述shRNA,通过酶切加工等步骤,最终获得所述siRNA,用于特异性沉默SHCBP1基因的表达。
进一步的,所述SHCBP1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码甲状腺癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列;较优的,所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
进一步的,所述慢病毒载体可以选自:pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人SHCBP1基因干扰慢病毒载体,命名为pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA。
本发明的SHCBP1基因siRNA可用于抑制甲状腺癌细胞的增殖,进一步地可以用作治疗甲状腺癌的药物或制剂。SHCBP1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述SHCBP1基因siRNA。当用作治疗甲状腺癌的药物或制剂时,是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第六方面,公开了一种SHCBP1基因干扰慢病毒,由前述SHCBP1基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下,经过病毒包装而成。该慢病毒可感染甲状腺癌细胞并产生针对SHCBP1基因的小分子干扰RNA,从而抑制甲状腺癌细胞的增殖。该SHCBP1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗甲状腺癌的药物。
本发明的第七方面,提供前述核酸分子,或前述SHCBP1基因干扰核酸构建体,或前述SHCBP1基因干扰慢病毒的用途,为:用于制备预防或治疗甲状腺癌的药物,或用于制备降低甲状腺癌细胞中SHCBP1基因表达的试剂盒。
所述预防或治疗甲状腺癌的药物的应用为甲状腺癌的治疗提供了一种方法,具体为一种预防或治疗对象体内甲状腺癌的方法,包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
进一步的,所述药物用于预防或治疗对象体内甲状腺癌时,需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法,所述甲状腺癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的,所述甲状腺癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
本发明的第八方面,提供一种用于预防或治疗甲状腺癌的组合物,其有效物质含有:
前述的核酸分子;和/或,前述SHCBP1基因干扰核酸构建体;和/或,前述SHCBP1基因干扰慢病毒,以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于预防或治疗对象体内甲状腺癌时,需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法,所述甲状腺癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的,所述甲状腺癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%的部分被抑制。
所述组合物的形式无特殊限制,可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
综上所述,本发明设计了针对人SHCBP1基因的RNAi靶点序列,构建相应的SHCBP1RNAi载体,其中RNAi载体pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA能够显著下调SHCBP1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus,简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA能够靶向地将针对SHCBP1基因的RNAi序列高效导入甲状腺癌细胞,降低SHCBP1基因的表达水平,显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的SHCBP1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明经过广泛而深入的研究发现,采用RNAi方法下调人SHCBP1基因的表达后可有效地抑制甲状腺癌细胞的增殖、促进细胞凋亡,可以有效地控制甲状腺癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制甲状腺癌细胞的增殖能力、抑制甲状腺癌细胞在体内的成瘤能力、促进甲状腺癌细胞凋亡、抑制甲状腺癌细胞克隆、抑制甲状腺癌细胞转移能力、抑制甲状腺癌细胞迁移能力、改变甲状腺癌细胞周期分布,从而治疗甲状腺癌,为甲状腺癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1:RT-PCR检测TPC-1细胞mRNA水平靶基因消减效率。
图2:RT-PCR检测K1细胞mRNA水平靶基因消减效率。
图3:利用Tecan infinite酶标仪器分析结果揭示SHCBP1基因的消减抑制甲状腺癌细胞TPC-1的增殖。
图4:利用Tecan infinite酶标仪器分析结果揭示SHCBP1基因的消减抑制甲状腺癌细胞K1的增殖。
图5:感染SHCBP1-siRNA慢病毒的小鼠体内的瘤体体积变化情况。
图6:感染SHCBP1-siRNA慢病毒的小鼠体内的肿瘤重量变化情况。
图7:活体成像技术检测肿瘤区域内总荧光表达量(NC:1-10,KD:11-20)。
图8:细胞克隆形成法检测SHCBP1基因对TPC-1细胞增殖能力的影响的数码相机记录图。
图9:细胞克隆形成法检测SHCBP1基因对TPC-1细胞增殖能力的影响图,柱状结果以胞克隆数平均值±标准差显示。
图10:细胞克隆形成法检测SHCBP1基因对K1细胞增殖能力的影响的数码相机记录图。
图11:细胞克隆形成法检测SHCBP1基因对K1细胞增殖能力的影响图,柱状结果以胞克隆数平均值±标准差显示。
图12:Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shSHCBP1对TPC-1细胞凋亡的影响的流式细胞凋亡示意图。
图13:Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shSHCBP1对TPC-1细胞凋亡的影响,柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示。
图14:Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shSHCBP1对K1细胞凋亡的影响的流式细胞凋亡示意图。
图15:Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shSHCBP1对K1细胞凋亡的影响,柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示。
图16:Celigo细胞计数法验证SHCBP1基因对TPC-1细胞增殖影响,Celigo连续5天记录细胞图片。
图17:Celigo细胞计数法验证SHCBP1基因对TPC-1细胞增殖影响,shSHCBP1组与shCtrl对照组细胞数目随时间变化的曲线。
图18:Celigo细胞计数法验证SHCBP1基因对K1细胞增殖影响,Celigo连续5天记录细胞图片。
图19:Celigo细胞计数法验证SHCBP1基因对K1细胞增殖影响,shSHCBP1组与shCtrl对照组细胞数目随时间变化的曲线。
图20:Transwell实验显示SHCBP1消减影响TPC-1细胞的转移能力。
图21:SHCBP1处理组转移细胞数与对照组(shCtrl)转移细胞数比值分析结果(TPC-1细胞)。
图22:Transwell实验显示SHCBP1消减影响K1细胞的转移能力。
图23:SHCBP1处理组转移细胞数与对照组(shCtrl)转移细胞数比值分析结果(K1细胞)。
图24:celigo划痕法验证SHCBP1基因对TPC-1细胞迁移能力的检测,图中分别为0、8、24小时TPC-1肿瘤细胞迁移情况。
图25:celigo划痕法验证SHCBP1基因对TPC-1细胞迁移能力的检测,shSHCBP1组与shCtrl对照组细胞迁移率的变化。
图26:celigo划痕法验证SHCBP1基因对K1细胞迁移能力的检测,图中分别为0、8、24小时TPC-1肿瘤细胞迁移情况。
图27:celigo划痕法验证SHCBP1基因对K1细胞迁移能力的检测,shSHCBP1组与shCtrl对照组细胞迁移率的变化。
图28:shSHCBP1组与对照组(shCtrl)处在G1,S以及G2/M期的细胞占细胞总数的比例对比(TPC-1细胞)。
图29:shSHCBP1组与对照组(shCtrl)处在G1,S以及G2/M期的细胞占细胞总数的比例对比(K1细胞)。
附图中,
柱形图代表三次实验的平均值,误差线表示标准偏差(SD)。
**,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比,P<0.01。
*,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比,0.01≤P<0.05。
具体实施方式
本发明从细胞功能学角度出发证实SHCBP1基因在甲状腺癌发生中的作用。通过构建目的基因shRNA慢病毒后转染甲状腺癌细胞,与转染对照慢病毒做对比,检测两组甲状腺癌细胞系内mRNA及蛋白质水平目的基因的表达情况;随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡等检测,结果显示shRNA组与对照组对比,shRNA组甲状腺癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组,细胞凋亡率增加程度较对照组高。
依据上述研究结果,进一步探索,开发针对该基因的诊断治疗新方法,能给甲状腺癌患者的诊断治疗提供更多选择。
SHCBP1抑制剂
指对于SHCBP1具有抑制效果的分子。对于SHCBP1具有抑制效果包括但不限于:抑制SHCBP1的表达或活性。
抑制SHCBP1活性是指使SHCBP1活力下降。优选地,相比抑制前,SHCBP1活力下降至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,最佳的降低至少90%。
抑制SHCBP1表达具体的可以是抑制SHCBP1基因的转录或翻译,具体的,可以是指:使SHCBP1的基因不转录,或降低SHCBP1的基因的转录活性,或者使SHCBP1的基因不翻译,或降低SHCBP1的基因的翻译水平。
本领域技术人员可以使用常规方法对SHCBP1的基因表达进行调节,如基因敲除、同源重组,干扰RNA等。
SHCBP1的基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地,与野生型相比,SHCBP1基因表达降低至少10%,较佳的降低至少30%,再佳的降低至少50%,更佳的降低至少70%,又佳的降低至少90%,最佳地SHCBP1基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成,分子质量在1000以下的化合物。
制备预防或治疗甲状腺癌的药物
可以利用降低甲状腺癌细胞中SHCBP1基因表达的核酸分子;和/或,SHCBP1基因干扰核酸构建体;和/或,SHCBP1基因干扰慢病毒,作为有效成分,制备预防或治疗甲状腺癌的药物。通常,所述药物中除了有效成分外,根据不同剂型的需要,还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时,它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容,即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类,如乳糖、葡萄糖和蔗糖;淀粉,如玉米淀粉和土豆淀粉;纤维素及其衍生物,如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素;西黄蓍胶粉末;麦芽;明胶;滑石;固体润滑剂,如硬脂酸和硬脂酸镁;硫酸钙;植物油,如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油;多元醇,如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇;海藻酸;乳化剂,如Tween;润湿剂,如月桂基硫酸钠;着色剂;调味剂;压片剂、稳定剂;抗氧化剂;防腐剂;无热原水;等渗盐溶液;和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中,除非特别说明,药物剂型并无特别限定,可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型,可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法,通常按照常规条件,或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时,应理解,除非本发明另有说明,每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义,本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外,根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载,还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1针对人SHCBP1基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人SHCBP1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取SHCBP1(NM_024745)基因信息;设计针对SHCBP1基因的有效的siRNA靶点。表1-1列出了筛选出的针对SHCBP1基因的有效siRNA靶点序列。
表1-1靶向于人SHCBP1基因的siRNA靶点序列
SEQ ID NO | TargetSeq(5’-3’) |
1 | TGGTGAAACCTACAATCTT |
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(以SEQ ID NO:1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-2);以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供),使其线性化,琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表1-2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-4所示,37℃,反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接,在适当的缓冲体系(连接体系如表1-5所示)中于16℃连接过夜,回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化方法:将10μL交换反应产物加入到100μL感受态细胞中,轻弹管壁数下混匀,在冰上放置30min。42℃热激90s,冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基,置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上,在恒温培养箱中倒置培养12-16h)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下,溶于10μl LB培养基,混匀取1μl作为模板;在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游,设计通用PCR引物,上游引物序列:5’-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3’(SEQ ID NO:6);下游引物序列:5’-GTAATACGGTTATCCACGCG-3’(SEQ ID NO:7),进行PCR鉴定实验(配制如表1-6反应体系,震荡混匀,短暂离心。在超净工作台中,用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中,吹打混匀,置于PCR仪中进行反应。反应条件如表1-7)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析,比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ IDNO:1的表达RNAi的载体,命名为pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒,阴性对照siRNA靶序列为5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’(SEQ ID NO:8)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时,针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-3),其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA。
表1-3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
表1-4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
表1-5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
试剂 | 阳性对照(μl) | 自连对照(μl) | 连接组(μl) |
线性化的载体DNA(100ng/μl) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) | 1.0 | - | 1.0 |
10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
T4噬菌体DNA连接酶 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
dd H2O | 16.0 | 17.0 | 16.0 |
Total | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
表1-6-1 PCR反应体系
试剂 | 体积(μl) |
上游引物(10μM) | 0.4 |
下游引物(10μM) | 0.4 |
2×Taq Plus Master Mix | 10 |
ddH2O | 9.2 |
Total | 20.0 |
表1-7 PCR反应体系程序设定
3.包装SHCBP1-siRNA慢病毒
以天根无内毒素质粒小提中量试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA的DNA,配制成100ng/μl储存液。
转染前24h,用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞,以含10%胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×106细胞/15ml,接种于10cm皿中,37℃,5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达70%-80%时即可用于转染。转染前2h,吸出原有培养基,更换为无血清培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明,向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(GV载体质粒20μg、pHelper 1.0载体质粒15μg、pHelper 2.0载体质粒10μg),与相应体积的吉凯转染试剂混合均匀,调整总体积为1ml。
将上述转染混和物在室温下孵育15min,转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中,37℃,5%CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质,PBS溶液洗涤,加入完全培养基2ml,继续培养48h。收集细胞上清液,Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒,步骤如下:(1)4℃,4000g离心10min,除去细胞碎片;(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中;(3)4000g离心,10-15min,至需要的病毒浓缩体积;(4)离心结束后,将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开,将过滤杯倒扣在样品收集杯上,离心2min离心力不超过1000g;(5)把离心杯从样品收集杯上移开,样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ IDNO:2所示。对照慢病毒的包装过程同SHCBP1-siRNA慢病毒,仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-SHCBP1-siRNA载体。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率
处于对数生长期的人甲状腺癌TPC-1细胞、K1细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中,培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数值(MOI,TPC1:20;MOI,K1:20),加入适宜量的实施例1制备的慢病毒,培养24h后更换培养基,待侵染时间达到5天后,收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书,抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书,将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表2-1,42℃反应1h,然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。SHCBP1基因的引物如下:上游引物5’-GCTACCGTGATAAACCAGGTTC-3’(SEQ ID NO:11)和下游引物5’-AGGCTCTGAATCGCTCATAGA-3’(SEQ ID NO:12)。以管家基因GAPDH为内参,引物序列如下:上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’(SEQ ID NO:13)和下游引物5’-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3’(SEQ ID NO:14)。按表2-2中的比例配置反应体系。
表2-1逆转录反应体系
试剂 | 体积(μl) |
5×RT buffer | 4.0 |
10mM dNTPs | 2.0 |
RNasin | 0.4 |
M-MLV-RTase | 1.0 |
DEPC H2O | 2.6 |
Total | 10.0 |
表2-2 Real-time PCR反应体系
试剂 | 体积(μl) |
SYBR premix ex taq | 10.0 |
上游引物(2.5μM | 0.5 |
下游引物(2.5μM) | 0.5 |
cDNA | 1.0 |
ddH2O | 8.0 |
Total | 20.0 |
设定程序为两步法Real-time PCR:预变性95℃,15s;之后每一步变性95℃,5s;退火延伸60℃,30s;共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后,95℃变性1min,然后冷却至55℃,使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持4s,同时读取吸光值,制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了SHCBP1 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒的细胞作为对照。实验结果如图1和图2所示,表明人甲状腺癌TPC-1细胞中SHCBP1 mRNA的表达水平下调了64.20%,人甲状腺癌K1细胞中SHCBP1 mRNA的表达水平下调了53.3%。
实施例3检测侵染了SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
处于对数生长期的人甲状腺癌TPC-1细胞、K1细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液(细胞数约为2×105/ml)接种于6孔板中,培养至细胞融合度达到约30%。根据侵染复数(MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),加入适宜量的病毒,培养16h后更换培养基,待侵染时间达到3天后,收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(1.5×104/ml),以细胞密度约为1500个/孔,接种96孔板。每组3个复孔,每孔100μl。铺好板后,置37℃、5%CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始,每天用Tecan infinite酶标仪器检测读板一次,连续检测读板5天。通过调整Tecan infinite检测490nm处OD值,对数据进行统计绘图,绘出细胞增殖曲线(结果如图3和图4所示)。结果表明,慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后,增殖速度显著减缓,远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度,TPC-1细胞活力细胞数目下降了65.44%,K1细胞活力细胞数目下降了67.60%,表明SHCBP1基因沉默导致人甲状腺癌TPC-1细胞、K1细胞增殖能力被抑制。
实施例4检测侵染了SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞在体内的成瘤能力
处于对数生长期的人甲状腺癌TPC-1细胞进行胰酶消化,制成细胞悬液(细胞数约为1.25×106/ml)接种于10cm皿中,培养至细胞融合度达到约30%。(MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),加入适宜量的病毒,培养12h后更换培养基,待侵染时间达到5天后,收集处于对数生长期的实验组和对照组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液。用一次性注射器将细胞悬液(4×106cells/鼠)注射到4周龄雌性BALB/c裸鼠右侧腋窝。实验组注射感染慢病毒的肿瘤细胞,对照组注射感染对照慢病毒的肿瘤细胞,每组10只裸鼠。注射后饲养裸鼠至肉眼可见瘤体(11天),测量瘤块的大小和重量。Perkin Elmer活体成像仪检测肿瘤区域内总荧光表达量。
结果如图5--图7所示,实验组的肿瘤细胞体内成瘤能力远低于对照组。基于此实验结果,认为试验慢病毒可以在体内抑制肿瘤细胞的增殖。
实施例5侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞克隆形成能力的检测
将人甲状腺癌TPC-1细胞、K1细胞胰酶消化后接种于12孔板中,细胞密度为10-15%。第二天换为新鲜的培养基,内含5ug/ml polybrene。将SHCBP1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20)加入到培养板中,感染16h后换新鲜的培养基。感染72h后,荧光显微镜下观察荧光,感染效率达到90%。
将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液;细胞计数后接种于6孔板中(600个细胞/孔),将接种好的细胞于培养箱中继续培养TPC-1 8天、K1 12天,中途隔3day进行换液并观察细胞状态;实验终止前荧光显微镜下对细胞克隆进行拍照;实验终止时用多聚甲醛固定细胞,PBS洗涤细胞后,Giemsa染色,拍照计数。
人甲状腺癌TPC-1细胞结果如图8-9所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小;表明基因沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。平板克隆形成实验检测降低基因的表达后,肿瘤细胞的克隆形成能力下降。
人甲状腺癌K1细胞结果如图10-11所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,肿瘤细胞形成的克隆斑数目显著减少、克隆斑的体积明显减小;表明基因沉默导致肿瘤细胞形成克隆的能力下降。平板克隆形成实验检测降低基因的表达后,肿瘤细胞的克隆形成能力下降。
实施例6侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞凋亡水平检测
人甲状腺癌TPC-1细胞、K1细胞胰酶消化后接种于6孔板中,细胞密度为10-15%。第二天换为新鲜的培养基。将SHCBP1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20)加入到培养板中,感染16h后换新鲜的培养基。感染72h后,荧光显微镜下观察荧光,感染效率达到90%。
传代后继续培养2天,将处于对数生长期的细胞胰酶消化后,完全培养基重悬成细胞悬液;Annexin V-APC染色,避光15min。将悬液加入至96孔板在Guava流式细胞仪上检测,Guava InCyte软件进行分析,得到结果。
人甲状腺癌TPC-1细胞结果如图12、图13所示,Annexin V-APC法检测降低基因的表达后,肿瘤细胞的早期凋亡细胞比例的变化。发现下调基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与对照(NC组)相比,RNA干扰降低基因的表达(KD组)后,早期凋亡细胞比例显著增多;表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
人甲状腺癌K1细胞结果如图14、图15所示,Annexin V-APC法检测降低基因的表达后,肿瘤细胞的早期凋亡细胞比例的变化。发现下调基因表达后肿瘤细胞的凋亡比例增加。与对照(NC组)相比,RNA干扰降低基因的表达(KD组)后,早期凋亡细胞比例显著增多;表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
实施例7侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞celigo增殖能力的检测
将处于对数生长期的感染病毒后的细胞胰酶消化后(侵染复数MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),完全培养基重悬成细胞悬液,计数;根据细胞生长快慢决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为1500cell/well)。每组3复孔,培养体系为100μL/孔,铺板过程中需确保每孔加入细胞数目一致,37℃、5%CO2;从铺板后第二天开始,每天Celigo(Nexcelom)检测读板一次,连续检测读板5天;培养箱培养;通过调整analysis settings的输入参数,准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量;对数据进行统计绘图,绘出5天的细胞增殖曲线。
人甲状腺癌TPC-1细胞实验结果如图16、图17所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后有绿色荧光的肿瘤细胞的增殖能力降低。
人甲状腺癌K1细胞实验结果如图18、图19所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后有绿色荧光的肿瘤细胞的增殖能力降低。
实施例8侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞transwell转移能力的检测
取出试剂盒,将所需数目的小室置于新的24孔板中,上室加100μL无血清培养基,37℃培养箱中放置1h。制备无血清细胞悬浮液,并计数,细胞数根据预实验调整。小心除去上室中培养基并加入100μL感染病毒后的细胞悬液(TPC-1、K1:100000cell/well)(侵染复数MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),下室内加入600μL 30%FBS培养基。37℃培养箱培养48小时。倒扣小室于吸水纸上以去除培养基,用棉拭子轻轻移去小室内非转移细胞,将小室置于4%多聚甲醛固定液中固定半小时。固定后,将小室捞出,用吸水纸吸干小室表面固定液,滴1-2滴结晶紫染液到膜的下表面染色转移细胞1-3min后,将小室浸泡冲洗数次,空气晾干。显微镜拍照、计数:每个transwell小室,随机选取视野,拍100X照片4张,200X照片9张。200X视野照片计数并统计分析。
人甲状腺癌TPC-1细胞实验结果如图20、图21所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后肿瘤细胞的转移能力降低。
人甲状腺癌K1细胞实验结果如图22、图23所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后肿瘤细胞的转移能力降低。
实施例9侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞celigo划痕迁移能力的检测
将处于对数生长期的感染病毒后的各实验组细胞胰酶消化后(侵染复数MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),完全培养基重悬成细胞悬液,计数;根据细胞大小决定铺板细胞密度(大多数细胞铺板数设定为100000cell/well),以次日细胞达到90%以上汇合度为准。37℃、5%CO2。第二天换低浓度血清培养基,使用划痕仪对准96孔板的下端中央部位,向上轻推形成划痕。培养箱培养,每组3复孔,培养体系为100μL/孔。使用无血清培养基轻轻漂洗2-3遍,加入低浓度血清培养基(如0.5%FBS)。37℃、5%CO2培养,0h、8h、24h各用Celigo扫一次板。最后用Celigo分析迁移率。
人甲状腺癌TPC-1细胞实验结果如图24、图25所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后肿瘤细胞的迁移能力降低。
人甲状腺癌K1细胞实验结果如图26、图27所示,与对照(NC组)相比,RNA干扰降低SHCBP1基因的表达(KD组)后,发现下调SHCBP1基因表达后肿瘤细胞的迁移能力降低。
实施例10侵染SHCBP1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞PI-FACS细胞周期检测
(1)6cm dish培养TPC-1细胞、K1细胞,待慢病毒感染后细胞生长至覆盖率约为80%时(细胞未进入生长平台期,侵染复数MOI,TPC-1:20;MOI,K1:20),胰酶消化,完全培养基重悬成细胞悬液,收集细胞于5mL离心管中,每组设三个复孔(为保证上机细胞数足够,细胞数目≥106/处理)。
(2)适速离心可为1300rmp离心5min,弃上清,4℃预冷的D-Hanks(pH=7.2~7.4)洗涤细胞沉淀1次。
(3)适速离心可为1300rmp、5min离心,4℃预冷的75%乙醇固定细胞至少1h。
(4)适速离心可为1300rmp离心5min去固定液,D-Hanks洗涤细胞沉淀一次,同步骤(2)。
(5)细胞染色液配制:40×PI母液(2mg/mL):100×RNase母液(10mg/mL):1×D-Hanks=25:10:1000
(6)细胞染色:根据细胞量,加入一定体积的细胞染色液(0.6-1mL)重悬,使上机时细胞通过率为300~800Cell/s。
(7)采用流式细胞仪进行检测。
(8)数据分析(使用ModFit软件进行分析)。
人甲状腺癌TPC-1细胞实验结果如图28所示,相比对照组,shSHCBP1组细胞处于G1期的百分比降低(P<0.05),处于S期的细胞百分比降低(P<0.05),处于G2/M期的细胞百分比升高(P<0.05)。
人甲状腺癌K1细胞实验结果如图29所示,相比对照组,shSHCBP1组处于G1期的细胞百分比减少(P<0.05),处于S期的细胞百分比无显著变化(P>0.05),处于G2/M期的细胞百分比增多(P<0.05)。
以上所述,仅为本发明的较佳实施例,并非对本发明任何形式上和实质上的限制,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员,在不脱离本发明方法的前提下,还将可以做出若干改进和补充,这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化,均为本发明的等效实施例;同时,凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变,均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 徐州市中心医院
<120> 人SHCBP1基因的用途及相关产品
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggtgaaacc tacaatctt 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uggugaaacc uacaaucuu 19
<210> 3
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cuuggugaaa ccuacaaucu ucucgagaag auuguagguu ucaccaag 48
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggcttggt gaaacctaca atcttctcga gaagattgta ggtttcacca agtttttg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattcaaaaa cttggtgaaa cctacaatct tctcgagaag attgtaggtt tcaccaag 58
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctatttccc atgattcctt cata 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtaatacggt tatccacgcg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttctccgaac gtgtcacgt 19
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggttctcc gaacgtgtca cgtttcaaga gaacgtgaca cgttcggaga atttttg 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtt ctcttgaaac gtgacacgtt cggagaa 57
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctaccgtga taaaccaggt tc 22
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aggctctgaa tcgctcatag a 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgacttcaac agcgacaccc a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccctgttg ctgtagccaa a 21
Claims (2)
1.SHCBP1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途:
治疗甲状腺癌;
抑制甲状腺癌细胞的增殖能力;
抑制甲状腺癌细胞在体内的成瘤能力;
促进甲状腺癌细胞凋亡;
抑制甲状腺癌细胞克隆;
抑制甲状腺癌细胞转移能力;
抑制甲状腺癌细胞迁移能力;
改变甲状腺癌细胞周期分布;
所述SHCBP1抑制剂选自双链RNA或shRNA;所述shRNA或双链RNA靶序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,还包括以下特征中的一项或多项:
1)所述双链RNA包含第一链和第二链,所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体,所述第一链的序列如SEQ ID NO:2所示;
2)所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911037854.6A CN110791566B (zh) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | 人shcbp1基因的用途及相关产品 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201911037854.6A CN110791566B (zh) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | 人shcbp1基因的用途及相关产品 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110791566A CN110791566A (zh) | 2020-02-14 |
CN110791566B true CN110791566B (zh) | 2023-06-27 |
Family
ID=69441793
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201911037854.6A Active CN110791566B (zh) | 2019-10-29 | 2019-10-29 | 人shcbp1基因的用途及相关产品 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110791566B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111474364B (zh) * | 2020-03-17 | 2022-05-20 | 福建中医药大学 | 人rab22a的用途及相关产品 |
CN117607442B (zh) * | 2024-01-23 | 2024-04-16 | 杭州华得森生物技术有限公司 | 一种预测乳腺癌免疫治疗效果的标志物、试剂盒与应用 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101622348A (zh) * | 2006-12-08 | 2010-01-06 | 奥斯瑞根公司 | 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径 |
CA2742489A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Intelligent Oncotherapeutics, Inc. | Methods for identification of tumor phenotype and treatment |
WO2013091293A1 (zh) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 人nlk基因相关的用途及其相关药物 |
CN103421887A (zh) * | 2012-05-21 | 2013-12-04 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | Cit基因的用途及其相关药物 |
CA2989483A1 (en) * | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer and other cancers |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2686165A1 (en) * | 2007-05-03 | 2008-11-13 | Rosetta Inpharmatics Llc | Compositions comprising mir34 therapeutic agents for treating cancer |
US20130331294A1 (en) * | 2007-11-09 | 2013-12-12 | Fox Chase Cancer Center | Egfr/nedd9/tgf-beta interactome and methods of use thereof for the identification of agents having efficacy in the treatment of hyperproliferative disorders |
CN104694622A (zh) * | 2014-12-17 | 2015-06-10 | 上海长海医院 | 检测K-ras基因突变的探针、引物、试剂盒及方法 |
US20160200804A1 (en) * | 2015-01-09 | 2016-07-14 | Georgia Regents University | Compositions and methods for treating anaplastic thyroid cancer |
EP3516396A1 (en) * | 2016-09-26 | 2019-07-31 | H. Hoffnabb-La Roche Ag | Predicting response to pd-1 axis inhibitors |
-
2019
- 2019-10-29 CN CN201911037854.6A patent/CN110791566B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101622348A (zh) * | 2006-12-08 | 2010-01-06 | 奥斯瑞根公司 | 作为治疗性干预靶标的miR-20调节的基因和途径 |
CA2742489A1 (en) * | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Intelligent Oncotherapeutics, Inc. | Methods for identification of tumor phenotype and treatment |
WO2013091293A1 (zh) * | 2011-12-23 | 2013-06-27 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | 人nlk基因相关的用途及其相关药物 |
CN103421887A (zh) * | 2012-05-21 | 2013-12-04 | 上海吉凯基因化学技术有限公司 | Cit基因的用途及其相关药物 |
CA2989483A1 (en) * | 2015-06-19 | 2016-12-22 | Immatics Biotechnologies Gmbh | Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy and methods for generating scaffolds for the use against pancreatic cancer and other cancers |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110791566A (zh) | 2020-02-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN110656111B (zh) | Pno1抑制剂在制备食管癌治疗药物中的用途 | |
CN110791566B (zh) | 人shcbp1基因的用途及相关产品 | |
CN110917357B (zh) | 人gsdmb基因的用途及相关产品 | |
CN111349701B (zh) | Rsph14基因用途、rsph14抑制剂用途、核酸分子、构建体及组合物 | |
CN110938691B (zh) | 人dus4l基因的用途及相关产品 | |
CN110904104B (zh) | 人hist1h2bk基因的用途及相关产品 | |
CN110904107B (zh) | 人tmeff1基因的用途及相关产品 | |
CN111304327B (zh) | 人grpel2基因的用途及相关产品 | |
CN111073889B (zh) | 人cspg5基因的用途及相关产品 | |
CN110938628B (zh) | 人urb1基因的用途及相关产品 | |
CN110882390B (zh) | 人lsm5基因的用途及相关产品 | |
CN111803633A (zh) | 人psmd7基因的用途及相关产品 | |
CN113917145A (zh) | 人capn7基因的用途及相关产品 | |
CN111041028B (zh) | 人ttll4基因的用途及相关产品 | |
CN111926010A (zh) | 人uap1l1基因的用途及相关产品 | |
CN110938630B (zh) | 人b3gnt5基因的用途及相关产品 | |
CN110819631B (zh) | 人dmbx1基因的用途及相关产品 | |
CN111269910B (zh) | 人depdc1基因的用途及相关产品 | |
CN110938692A (zh) | 人impa2基因的用途及相关产品 | |
CN110863047B (zh) | 人ccdc154基因的用途及相关产品 | |
CN114457075B (zh) | 一种敲低PXYLP1基因表达的shRNA、慢病毒载体及其构建方法和应用 | |
CN111035762B (zh) | 人eddm3a基因的用途及相关产品 | |
CN110863050A (zh) | 人eme1基因的用途及相关产品 | |
CN113917144A (zh) | 人sh2d2a基因的用途及相关产品 | |
CN113913515A (zh) | 人eme1基因的用途及相关产品 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |