CN111269910B - 人depdc1基因的用途及相关产品 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物或者在制备舌鳞癌诊断药物中的用途。本发明经过广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调人DEPDC1基因的表达后可有效地抑制舌鳞癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制舌鳞癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制舌鳞癌细胞的增殖速率、促进舌鳞癌细胞凋亡、抑制舌鳞癌细胞克隆、影响舌鳞癌细胞周期、抑制舌鳞癌生长，从而治疗舌鳞癌，为舌鳞癌治疗开辟新的方向。
Description
技术领域
本发明属于生物医药研究领域，具体涉及人DEPDC1基因的用途及相关产品。
背景技术
DEPDC1(DEP domain containing 1)是一种编码基因，可能作为转录辅助抑制因子参与转录调控。有研究发现DEPDC1在细胞周期过程中发挥重要的作用，在同步化处理的细胞中DEPDC1在细胞周期的有丝分裂期高度表达。免疫荧光检测显示DEPDC1在分裂间期主要定位于细胞核中，在分裂中期核膜破裂后重新分布到整个细胞中。此外敲低DEPDC1的表达可引起显著的有丝分裂停滞。总之，该基因DEPDC1在调节细胞有丝分裂进程中起关键作用(Mi Y,Zhang C,Bu Y,Zhang Y,He L,Li H,Zhu H,Li Y,Lei Y,Zhu J.DEPDC1 is anovel cell cycle related gene that regulates mitotic progression.BMBRep.2015Jul；48(7):413-8.)。
口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部最常见的恶性肿瘤，多起源于舌，其次为口底、颊部及牙龈。舌鳞状细胞癌是口腔鳞状细胞癌(TSCC)的一种典型亚类。近年来，针对TSCC的综合治疗已经取得巨大进展，然而TSCC患者的长期生存率并没有得到很好的改善，舌鳞癌的临床诊治依旧面临巨大的挑战。发现和研究舌鳞癌更有意义的诊治标志物以及更有效的药物靶点，具有重要意义。
目前还未有DEPDC1基因用于舌鳞癌治疗的相关报道。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供人DEPDC1基因的用途及相关产品。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物或者在制备舌鳞癌诊断药物中的用途。
所述人DEPDC1基因作为靶标在制备舌鳞癌治疗药物具体是指：将DEPDC1基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制人DEPDC1基因表达的药物作为舌鳞癌治疗备选药物。如本发明所述的DEPDC1基因小分子干扰RNA(siRNA)即是以人DEPDC1基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制舌鳞癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将DEPDC1基因作为作用对象。
所述将人DEPDC1基因作为靶标用于制备舌鳞癌诊断药物具体是指：将DEPDC1基因表达产物作为一项舌鳞癌诊断指标应用于舌鳞癌诊断药物的制备。
所述舌鳞癌治疗药物为能够特异性抑制DEPDC1基因的转录或翻译，或能够特异性抑制DEPDC1蛋白的表达或活性的分子，从而降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因的表达水平，达到抑制舌鳞癌细胞的增殖、生长、分化和/或存活的目的。
所述通过DEPDC1基因制备获得的舌鳞癌治疗药物或者舌鳞癌诊断药物包括但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述核酸包括但不限于：反义寡核苷酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶III制备的小干扰RNA或者短发夹RNA(shRNA)。
所述舌鳞癌治疗药物的施用量为足够降低人DEPDC1基因的转录或翻译，或者足够降低人DEPDC1蛋白的表达或活性的剂量。以使人DEPDC1基因的表达至少被降低50％、80％、90％、95％或99％。
采用前述舌鳞癌治疗药物治疗舌鳞癌的方法，主要是通过降低人DEPDC1基因的表达水平抑制舌鳞癌细胞的增殖来达到治疗的目的。具体的，治疗时，将能有效降低人DEPDC1基因表达水平的物质给药于患者。
在一种实施方式中，所述DEPDC1基因的靶标序列如SEQ ID NO：1所示。具体为：5’-tatccagtaaggctatcat-3’。
本发明的第二方面，提供DEPDC1抑制剂在制备至少具备以下功效之一的产品中的用途：
治疗舌鳞癌；
抑制舌鳞癌细胞的增殖速率；
促进舌鳞癌细胞凋亡；
抑制舌鳞癌细胞克隆；
影响舌鳞癌细胞周期；
抑制舌鳞癌生长。
所述产品必然包括DEPDC1抑制剂，并以DEPDC1抑制剂作为前述功效的有效成分。
所述产品中，发挥前述功用的有效成分可仅为DEPDC1抑制剂，亦可包含其他可起到前述功用的分子。
亦即，DEPDC1抑制剂为所述产品的唯一有效成分或有效成分之一。
所述产品可以为单成分物质，亦可为多成分物质。
所述产品的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述产品主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
所述产品包括但不限于药物、保健品、食品等。
所述DEPDC1抑制剂可以为核酸分子、抗体、小分子化合物。
如本发明实施例列举的，所述DEPDC1抑制剂可以为降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的核酸分子。具体的，可以是双链RNA或shRNA。
本发明的第三方面，提供了一种治疗舌鳞癌的方法，为向对象施用DEPDC1抑制剂。
所述的对象可以为哺乳动物或哺乳动物的舌鳞癌细胞。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。所述舌鳞癌细胞可以为离体舌鳞癌细胞。
所述对象可以是罹患舌鳞癌的患者或者期待治疗的舌鳞癌的个体。或者所述对象为舌鳞癌患者或者期待治疗舌鳞癌的个体的离体舌鳞癌细胞。
所述DEPDC1抑制剂可以在接受舌鳞癌治疗前、中、后向对象施用。
本发明第四方面公开了一种降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的核酸分子，所述核酸分子包含双链RNA或shRNA。
其中，所述双链RNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列；
所述shRNA中含有能够与DEPDC1基因杂交的核苷酸序列。
进一步的，所述双链RNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与DEPDC1基因中的靶序列基本相同。
所述DEPDC1基因中的靶序列即为核酸分子用于特异性沉默DEPDC1基因表达时，被所述核酸分子识别并沉默的mRNA片段所对应的DEPDC1基因中的片段。
进一步的，所述双链RNA的靶序列如SEQ ID NO：1所示。具体为：5’-tatccagtaaggctatcat-3’。更进一步的，所述双链RNA第一链的序列如SEQ ID NO：2所示。具体为5’-uauccaguaaggcuaucau-3’。
进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(siRNA)。
SEQ ID NO：2为以SEQ ID NO:1所示的序列为RNA干扰靶序列设计的、针对人DEPDC1基因的小干扰RNA的一条链，另一条链即第二链的序列与第一链序列互补，该siRNA可以起到特异性沉默舌鳞癌细胞中内源DEPDC1基因表达的作用。
所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所述正义链片段的序列与DEPDC1基因中的靶序列基本相同。
进一步的，所述sh RNA的靶序列如SEQ ID NO：1所示。
所述shRNA经酶切加工后可成为小干扰RNA(siRNA)进而起到特异性沉默舌鳞癌细胞中内源DEPDC1基因表达的作用。
进一步的，所述shRNA的茎环结构的序列可选自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU和CCACACC。
更进一步的，所述shRNA的序列如SEQ ID NO：3所示。具体为5’-gcuauccaguaaggcuaucaucucgagaugauagccuuacuggauagc-3’。
进一步的，所述DEPDC1基因来源于人。
本发明第五方面，公开了一种DEPDC1基因干扰核酸构建体，含有编码前述核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。
所述的DEPDC1基因干扰核酸构建体可以是将编码前述人DEPDC1基因shRNA的基因片段克隆入已知载体获得。
进一步的，所述DEPDC1基因干扰核酸构建体为DEPDC1基因干扰慢病毒载体。
本发明公开的DEPDC1基因干扰慢病毒载体是将编码前述DEPDC1基因shRNA的DNA片段克隆入已知载体获得，所述已知载体多为慢病毒载体，所述DEPDC1基因干扰慢病毒载体经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒后，感染舌鳞癌细胞，进而转录出本发明所述shRNA，通过酶切加工等步骤，最终获得所述siRNA，用于特异性沉默DEPDC1基因的表达。
进一步的，所述DEPDC1基因干扰慢病毒载体还含有启动子序列和/或编码舌鳞癌细胞中可被检测的标记物的核苷酸序列；较优的，所述可被检测的标记物如绿色荧光蛋白(GFP)。
进一步的，所述慢病毒载体可以选自：pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ中的任一。
本发明实施例具体列举了以pGCSIL-GFP为载体构建的人DEPDC1基因干扰慢病毒载体，命名为pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。
本发明的DEPDC1基因siRNA可用于抑制舌鳞癌细胞的增殖，进一步地可以用作治疗舌鳞癌的药物或制剂。DEPDC1基因干扰慢病毒载体则可用于制备所述DEPDC1基因siRNA。当用作治疗舌鳞癌的药物或制剂时，是将安全有效量的所述核酸分子施用于哺乳动物。具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明第六方面，公开了一种DEPDC1基因干扰慢病毒，由前述DEPDC1基因干扰核酸构建体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。该慢病毒可感染舌鳞癌细胞并产生针对DEPDC1基因的小分子干扰RNA，从而抑制舌鳞癌细胞的增殖。该DEPDC1基因干扰慢病毒可用于制备预防或治疗舌鳞癌的药物。
本发明的第七方面，提供前述核酸分子，或前述DEPDC1基因干扰核酸构建体，或前述DEPDC1基因干扰慢病毒的用途，为：用于制备预防或治疗舌鳞癌的药物，或用于制备降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的试剂盒。
所述预防或治疗舌鳞癌的药物的应用为舌鳞癌的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内舌鳞癌的方法，包括将有效剂量的所述的药物施用于对象中。
进一步的，所述药物用于预防或治疗对象体内舌鳞癌时，需要将有效剂量的所述的药物施用于对象中。采用该方法，所述舌鳞癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述舌鳞癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述方法的对象可以为人。
本发明的第八方面，提供一种用于预防或治疗舌鳞癌的组合物，其有效物质含有：
前述的核酸分子；和/或，前述DEPDC1基因干扰核酸构建体；和/或，前述DEPDC1基因干扰慢病毒，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
所述组合物可以为药物组合物。
当所述组合物用于预防或治疗对象体内舌鳞癌时，需要将有效剂量的所述的组合物施用于对象中。采用该方法，所述舌鳞癌的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述舌鳞癌的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
所述组合物的形式无特殊限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种物质形式。
所述组合物主要针对的对象为哺乳动物。所述哺乳动物优选为啮齿目动物、偶蹄目动物、奇蹄目动物、兔形目动物、灵长目动物等。所述灵长目动物优选为猴、猿或人。
综上所述，本发明设计了针对人DEPDC1基因的RNAi靶点序列，构建相应的DEPDC1RNAi载体，其中RNAi载体pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA能够显著下调DEPDC1基因在mRNA水平和蛋白水平的表达。使用慢病毒(lentivirus，简写为Lv)作为基因操作工具携带RNAi载体pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA能够靶向地将针对DEPDC1基因的RNAi序列高效导入舌鳞癌CAL27细胞，降低DEPDC1基因的表达水平，显著抑制上述肿瘤细胞的增殖能力。因此慢病毒介导的DEPDC1基因沉默是恶性肿瘤潜在的临床非手术治疗方式。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究发现，采用RNAi方法下调人DEPDC1基因的表达后可有效地抑制舌鳞癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，可以有效地控制舌鳞癌的生长进程。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、慢病毒能够特异性抑制舌鳞癌细胞的增殖速率、促进舌鳞癌细胞凋亡、抑制舌鳞癌细胞克隆、影响舌鳞癌细胞周期、抑制舌鳞癌生长，从而治疗舌鳞癌，为舌鳞癌治疗开辟新的方向。
附图说明
图1：RT-PCR检测CAL27细胞mRNA水平靶基因消减效率。
图2：Western Blot检测CAL27细胞靶点降低DEPDC1基因蛋白水平表达情况。
图3：Cellomics细胞自动分析结果揭示DEPDC1基因的消减抑制舌鳞癌细胞的增殖。(细胞系为CAL27细胞，病毒感染后1，2，3，4以及5天分别对细胞数量进行统计)
图4：MTT法检测DEPDC1基因的消减抑制舌鳞癌细胞的增殖。
图5a：流式细胞仪检测shDEPDC1对CAL27细胞周期的影响。(为流式细胞周期图)
图5b：流式细胞仪检测shDEPDC1对CAL27细胞周期的影响。(以细胞百分比平均值±标准差显示)
图6：Annexin V-APC流式细胞凋亡检测shDEPDC1对CAL27细胞凋亡的影响。
(为流式细胞凋亡示意图，右侧柱状结果以细胞百分比平均值±标准差显示。)
柱形图代表三次实验的平均值，误差线表示标准偏差(SD)。
**,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，P<0.01。
*,shCtrl与目的基因shRNA慢病毒处理组相比，0.01≤P<0.05。
具体实施方式
本发明从细胞功能学角度出发证实DEPDC1基因在舌鳞癌发生中的作用。通过构建目的基因shRNA慢病毒后转染舌鳞癌细胞，与转染对照慢病毒做对比，检测两组舌鳞癌细胞系内mRNA及蛋白质水平目的基因的表达情况；随后通过细胞功能学实验进行细胞增殖、凋亡等检测，结果显示shRNA组与对照组对比，shRNA组舌鳞癌细胞增殖抑制程度明显高于对照组，细胞凋亡率增加程度较对照组高。
依据上述研究结果，进一步探索，开发针对该基因的诊断治疗新方法，能给舌鳞癌患者的诊断治疗提供更多选择。
DEPDC1抑制剂
指对于DEPDC1具有抑制效果的分子。对于DEPDC1具有抑制效果包括但不限于：抑制DEPDC1的表达或活性。
抑制DEPDC1活性是指使DEPDC1活力下降。优选地，相比抑制前，DEPDC1活力下降至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，最佳的降低至少90％。
抑制DEPDC1表达具体的可以是抑制DEPDC1基因的转录或翻译，具体的，可以是指：使DEPDC1的基因不转录，或降低DEPDC1的基因的转录活性，或者使DEPDC1的基因不翻译，或降低DEPDC1的基因的翻译水平。
本领域技术人员可以使用常规方法对DEPDC1的基因表达进行调节，如基因敲除、同源重组，干扰RNA等。
DEPDC1的基因表达的抑制可以通过PCR及Western Blot检测表达量验证。
优选地，与野生型相比，DEPDC1基因表达降低至少10％，较佳的降低至少30％，再佳的降低至少50％，更佳的降低至少70％，又佳的降低至少90％，最佳地DEPDC1基因完全没有表达。
小分子化合物
本发明中指由几个或几十个原子组成，分子质量在1000以下的化合物。
制备预防或治疗舌鳞癌的药物
可以利用降低舌鳞癌细胞中DEPDC1基因表达的核酸分子；和/或，DEPDC1基因干扰核酸构建体；和/或，DEPDC1基因干扰慢病毒，作为有效成分，制备预防或治疗舌鳞癌的药物。通常，所述药物中除了有效成分外，根据不同剂型的需要，还会包括一种或多种药学上可接受的载体或辅料。
“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。
“药学上可接受的载体或辅料”应当与所述有效成分相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物的效果。可作为药学上可接受的载体或辅料的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味。
本发明中，除非特别说明，药物剂型并无特别限定，可以被制成针剂、口服液、片剂、胶囊、滴丸、喷剂等剂型，可通过常规方法进行制备。药物剂型的选择应与给药方式相匹配。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。
实施例1针对人DEPDC1基因RNAi慢病毒的制备
1.筛选针对人DEPDC1基因的有效的siRNA靶点
从Genbank调取DEPDC1(NM_017779)基因信息；设计针对DEPDC1基因的有效的siRNA靶点。表1-1列出了筛选出的针对DEPDC1基因的有效siRNA靶点序列。
表1-1靶向于人DEPDC1基因的siRNA靶点序列
| SEQ ID NO | TargetSeq(5’-3’) |
| 1 | tatccagtaaggctatcat |
2.慢病毒载体的制备
针对siRNA靶点(以SEQ ID NO：1为例)合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-2)；以Age I和EcoR I限制性内切酶作用于pGCSIL-GFP载体(上海吉凯基因化学技术有限公司提供)，使其线性化，琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切片段。
表1-2两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
| 5’ | 颈 | 环 | 颈 | 3’ | SEQ | |
| 正义链 | ccgg | gctatccagtaaggctatcat | ctcgag | atgatagccttactggatagc | tttttg | 4 |
| 反义链 | aattcaaaaa | gctatccagtaaggctatcat | ctcgag | atgatagccttactggatagc | 5 |
通过T4 DNA连接酶将双酶切线性化(酶切体系如表1-4所示，37℃，反应1h)的载体DNA和纯化好的双链DNA Oligo连接，在适当的缓冲体系(连接体系如表1-5所示)中于16℃连接过夜，回收连接产物。将连接产物转化氯化钙制备的新鲜的大肠杆菌感受态细胞(转化操作参考：分子克隆实验指南第二版55-56页)。在连接转化产物长出菌克隆表面沾一下，溶于10μl LB培养基，混匀取1μl作为模板；在以慢病毒载体中RNAi序列的上下游，设计通用PCR引物，上游引物序列：5’-cctatttcccatgattccttcata-3’(SEQ ID NO：6)；下游引物序列：5’-gtaatacggttatccacgcg-3’(SEQ ID NO：7)，进行PCR鉴定实验(PCR反应体系如表1-6，反应条件如表1-7)。对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和比对分析，比对正确的克隆即为构建成功的针对SEQ ID NO：1的表达RNAi的载体，命名为pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。
构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒，阴性对照siRNA靶序列为5’-tatccagtaaggctatcat-3’(SEQ ID NO：8)。构建pGCSIL-GFP-Scr-siRNA阴性对照质粒时，针对Scr siRNA靶点合成两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo序列(表1-3)，其余构建方法、鉴定方法及条件均同pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA。
表1-3两端含Age I和EcoR I酶切位点粘端的双链DNA Oligo
表1-4 pGCSIL-GFP质粒酶切反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| pGCSIL-GFP质粒(1μg/μl) | 2.0 |
| 10×buffer | 5.0 |
| 100×BSA | 0.5 |
| Age I(10U/μl) | 1.0 |
| EcoR I(10U/μl) | 1.0 |
| dd H2O | 40.5 |
| Total | 50.0 |
表1-5载体DNA和双链DNA Oligo连接反应体系
| 试剂 | 阳性对照(μl) | 自连对照(μl) | 连接组(μl) |
| 线性化的载体DNA(100ng/μl) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| 退火的双链DNA Oligo(100ng/μl) | 1.0 | - | 1.0 |
| 10×T4噬菌体DNA连接酶缓冲液 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| T4噬菌体DNA连接酶 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| dd H2O | 16.0 | 17.0 | 16.0 |
| Total | 20.0 | 20.0 | 20.0 |
表1-6-1 PCR反应体系
表1-7 PCR反应体系程序设定
3.包装DEPDC1-siRNA慢病毒
以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取RNAi质粒pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA的DNA，配制成100ng/μl储存液。
转染前24h，用胰蛋白酶消化对数生长期的人胚肾细胞293T细胞，以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基调整细胞密度为1.5×105细胞/ml，接种于6孔板，37℃，5％CO2培养箱内培养。待细胞密度达70％-80％时即可用于转染。转染前2h，吸出原有培养基，加入1.5ml新鲜的完全培养基。按照Sigma-aldrich公司的MISSION Lentiviral Packaging Mix试剂盒的说明，向一灭菌离心管中加入Packing Mix(PVM)20μl，PEI 12μl，无血清DMEM培养基400μl，取20μl上述抽提的质粒DNA，加至上述PVM/PEI/DMEM混合液。
将上述转染混和物在室温下孵育15min，转移至人胚肾细胞293T细胞的培养基中，37℃，5％CO2培养箱内培养16h。弃去含有转染混和物的培养介质，PBS溶液洗涤，加入完全培养基2ml，继续培养48h。收集细胞上清液，Centricon Plus-20离心超滤装置(Millipore)纯化和浓缩慢病毒，步骤如下：(1)4℃，4000g离心10min，除去细胞碎片；(2)0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；(3)4000g离心，10-15min，至需要的病毒浓缩体积；(4)离心结束后，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开，将过滤杯倒扣在样品收集杯上，离心2min离心力不超过1000g；(5)把离心杯从样品收集杯上移开，样品收集杯中的即为病毒浓缩液。将病毒浓缩液分装后于-80摄氏度保存。病毒浓缩液中含有的siRNA的第一链的序列如SEQ IDNO:2所示。对照慢病毒的包装过程同DEPDC1-siRNA慢病毒，仅以pGCSIL-GFP-Scr-siRNA载体代替pGCSIL-GFP-DEPDC1-siRNA载体。
实施例2实时荧光定量RT-PCR法检测基因的沉默效率
处于对数生长期的人舌鳞癌CAL27细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数值(MOI，CAL27：10)，加入适宜量的实施例1制备的慢病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集细胞。根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书，抽提总RNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书，将RNA逆转录获得cDNA(逆转录反应体系见表2-1，42℃反应1h，然后在70℃水浴锅中水浴10min使逆转录酶失活)。
采用TP800型Real time PCR仪(TAKARA)进行实时定量检测。DEPDC1基因的引物如下：上游引物5’-atgcgtatgatttcccgaatgag-3’(SEQ ID NO：11)和下游引物5’-cacagcataacacacatcgagaa-3’(SEQ ID NO：12)。以管家基因GAPDH为内参，引物序列如下：上游引物5’-tgacttcaacagcgacaccca-3’(SEQ ID NO：13)和下游引物5’-caccctgttgctgtagccaaa-3’(SEQ ID NO：14)。按表2-2中的比例配置反应体系。
表2-1逆转录反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| 5×RT buffer | 4.0 |
| 10mM dNTPs | 2.0 |
| RNasin | 0.5 |
| M-MLV-RTase | 1.0 |
| DEPC H2O | 3.5 |
| Total | 11.0 |
表2-2 Real-time PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μl) |
| SYBR premix ex taq | 10.0 |
| 上游引物(2.5μM) | 0.5 |
| 下游引物(2.5μM) | 0.5 |
| cDNA | 1.0 |
| ddH2O | 8.0 |
| Total | 20.0 |
设定程序为两步法Real-time PCR：预变性95℃，15s；之后每一步变性95℃，5s；退火延伸60℃，30s；共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。PCR结束后，95℃变性1min，然后冷却至55℃，使DNA双链充分结合。从55℃开始到95℃，每一步增加0.5℃，保持4s,同时读取吸光值，制作熔解曲线。采用2-ΔΔCt分析法计算侵染了DEPDC1 mRNA的表达丰度。侵染对照病毒的细胞作为对照。实验结果如图1所示，表明人舌鳞癌CAL27细胞中DEPDC1mRNA的表达水平下调了67.7％。
实施例3Western Blotting法检测基因的沉默效率
1.细胞总蛋白抽提
1)将对照病毒和针对DEPDC1干扰靶点的DEPDC1-siRNA慢病毒，根据侵染复数值(MOI，CAL27：10)侵染目的细胞。
2)感染5天后，收集细胞样品，取适当量的RIPA裂解液(碧云天，P0013C)，使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
3)加入适当量的RIPA裂解液，冰上裂解10-15min。细胞刮刮下细胞转移入新的EP管中，然后超声破碎细胞(40W共20次，每次1s，间隔2s)。
4)4℃、12000g，离心15min，取上清用BCA Protein Assay Kit(厂家：碧云天，货号：P0010S)测定蛋白浓度。
5)加入新的裂解液将每个样品蛋白浓度调为一致，一般为2μg/μL。然后加入1/5体积的6X lodding buffer混匀，100度金属浴煮10min，短暂离心后-80℃保存备用。
2.SDS-PAGE
1)制胶：根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶，具体体系如表3-1、表3-2、表3-3所示：
表3-1 SDS-PAGE分离胶(8mL体系)
| 分离胶(8mL体系) | 8％ | 9％ | 10％ | 12％ | 13％ | 15％ |
| H2O | 3.7 | 3.4 | 3.1 | 2.6 | 2.3 | 1.8 |
| 30％PAGE | 2.1 | 2.4 | 2.7 | 3.2 | 3.5 | 4 |
| 1.5mol/L Tris(pH 8.8) | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
| 10％SDS | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| 10％APS | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 | 0.08 |
| TEMED | 0.005 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.004 | 0.004 |
表3-2 SDS-PAGE分离胶(10mL体系)
表3-3 SDS-PAGE浓缩胶(不同体系)
| 浓缩胶(5％) | 3mL | 4mL | 5mL |
| H2O | 2.1 | 2.7 | 3.4 |
| 30％PAGE | 0.5 | 0.67 | 0.83 |
| 1.0mol/L Tris(pH6.8) | 0.38 | 0.5 | 0.63 |
| 10％SDS | 0.03 | 0.04 | 0.05 |
| 10％APS | 0.03 | 0.04 | 0.05 |
| TEMED | 0.003 | 0.004 | 0.005 |
2)上样：胶凝固后，拔去梳子，电泳缓冲液清洗上样孔，将准备好的样品上样。
3)电泳：浓缩胶80mA，20min；分离胶120mA，1h。
3.免疫印迹(湿转)
电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。
4.抗体杂交：
(1)封闭：用封闭液(含5％脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h或4℃过夜。
(2)一抗孵育：封闭液稀释抗体[Anti-DEPDC1(abcam)，1：1000；Anti-GAPDH(Santa-Cruz)，1：2000]，然后与封闭好的PVDF膜室温孵育2h或4℃过夜，并用TBST洗膜4次，每次8min。
(3)二抗孵育：用封闭液稀释相应的二抗[Anti-Mouse IgG(CST),1:2000；Anti-Rabbit IgG(CST),1:2000]，室温下孵育PVDF膜1.5h，并用TBST洗膜4次，每次8min。
5.X光显影：
1)采用CST公司20X Reagent and 20X Peroxide#7003试剂盒，将试剂盒中A液和B液按1:1比例混合颠倒混匀，放置数分钟后可使用。
2)将膜取出，吸水纸擦干，平铺入暗盒，滴加适量混匀的ECL发光液，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1s至数分钟(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。
3)取出X光片，放入显影液中，出现条带后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min。
4)取出X光片，晾干，分析。
结果如图2所示，Western Blot实验表明靶点对DEPDC1基因的内源表达有敲减作用，因而是有效靶点。
实施例4检测侵染了DEPDC1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞的增殖能力
a)celigo实验
处于对数生长期的人舌鳞癌CAL27细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，CAL27：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为3000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，每天用Cellomics仪器(Thermo Fisher)检测读板一次，连续检测读板5天。通过调整Cellomics arrayscan的输入参数，准确地计算出每次扫描孔板中的带绿色荧光的细胞的数量，对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线(结果如图3所示)。结果表明，慢病毒侵染组各肿瘤在细胞体外培养5天后，增殖速度显著减缓，远低于对照组肿瘤细胞的增殖速度，活力细胞数目下降了56.7％，表明DEPDC1基因沉默导致人舌鳞癌CAL27细胞增殖能力被抑制。
b)MTT实验
处于对数生长期的人舌鳞癌CAL27细胞进行胰酶消化，制成细胞悬液(细胞数约为5×104/ml)接种于6孔板中，培养至细胞融合度达到约30％。根据侵染复数(MOI，CAL27：10)，加入适宜量的病毒，培养24h后更换培养基，待侵染时间达到5天后，收集处于对数生长期的各实验组细胞。完全培养基重悬成细胞悬液(2×104/ml)，以细胞密度约为2000个/孔，接种96孔板。每组5个复孔，每孔100μl。铺好板后，置37℃、5％CO2培养箱培养。从铺板后第二天开始，培养终止前4h加入20μL 5mg/mL的MTT于孔中，无需换液。4h后完全吸去培养液，注意不要吸掉孔板底部的甲瓒颗粒，加100μl DMSO溶解甲瓒颗粒。振荡器振荡2-5min，酶标仪490nm检测OD值。数据统计分析。对数据进行统计绘图，绘出细胞增殖曲线。
结果如图4所示，可见慢病毒侵染组肿瘤活力细胞数目下降了33.8％，表明DEPDC1基因沉默导致人舌鳞癌CAL27细胞增殖能力被抑制。
实施例5侵染DEPDC1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞周期检测实验
人舌鳞癌CAL27细胞胰酶消化后接种于6孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基，内含5ug/ml polybrene。将DEPDC1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，CAL27：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液，收集细胞于5mL离心管中，每组设三个复孔，1300rmp离心5min，弃上清，4℃预冷的PBS(pH＝7.2～7.4)洗涤细胞沉淀1次。1300rmp、5min离心，4℃预冷的75％乙醇固定细胞至少1h。1300rmp离心5min去固定液，PBS洗涤细胞沉淀一次。1300rmp离心5min，PBS洗涤细胞沉淀一次。细胞染色液配制：40×PI母液(2mg/mL)：100×RNase母液(10mg/mL)：1×PBS＝25：10：1000，细胞染色：根据细胞量，加入一定体积的细胞染色液(0.6-1mL)重悬，使上机时细胞通过率为300～800Cell/s。上流式细胞仪检测，数据分析。
结果如图5a和5b所示，与对照干扰(NC组)相比，RNA干扰降低基因的表达(KD组)后，处于G1期的细胞显著增加，处于G2/M期的细胞增加，处于S期的细胞显著减少。表明基因沉默导致肿瘤细胞周期发生显著变化。
实施例6侵染DEPDC1-siRNA慢病毒的肿瘤细胞凋亡水平检测
人舌鳞癌CAL27细胞胰酶消化后接种于6孔板中，细胞密度为10-15％。第二天换为新鲜的培养基。将DEPDC1-siRNA慢病毒按照侵染复数(MOI，CAL27：10)加入到培养板中，感染12-24h后换新鲜的培养基。感染72h后，荧光显微镜下观察荧光，感染效率达到90％。
将处于对数生长期的细胞胰酶消化后，完全培养基重悬成细胞悬液；接种于96孔板，每孔100ul；置37℃5％CO2培养箱培养；培养36h后，弃培养液，4℃预冷的85％乙醇固定细胞；PBS洗板两次；RNase处理细胞后，PI染色，避光15min。将96孔板在TTP仪器上，使用预设的分析subG1期的template进行扫描分析，得到结果。
结果如图6所示，表明与对照干扰(NC组)相比，RNA干扰降低基因的表达(KD组)后，凋亡肿瘤细胞的数目显著增多；表明基因沉默导致肿瘤细胞凋亡。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学第二附属医院
<120> 人DEPDC1基因的用途及相关产品
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tatccagtaa ggctatcat 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uauccaguaa ggcuaucau 19
<210> 3
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcuauccagu aaggcuauca ucucgagaug auagccuuac uggauagc 48
<210> 4
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgggctatc cagtaaggct atcatctcga gatgatagcc ttactggata gctttttg 58
<210> 5
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aattcaaaaa gctatccagt aaggctatca tctcgagatg atagccttac tggatagc 58
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctatttccc atgattcctt cata 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtaatacggt tatccacgcg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tatccagtaa ggctatcat 19
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggttctcc gaacgtgtca cgtctcgaga cgtgacacgt tcggagaatt tttg 54
<210> 10
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtc tcgagacgtg acacgttcgg agaa 54
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgcgtatga tttcccgaat gag 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cacagcataa cacacatcga gaa 23
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tgacttcaac agcgacaccc a 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caccctgttg ctgtagccaa a 21
Claims (1)
1.DEPDC1抑制剂在制备治疗舌鳞癌产品中的用途；所述DEPDC1抑制剂选自siRNA或shRNA；
所述siRNA或shRNA靶序列如SEQ ID NO：1所示；
所述siRNA包含第一链和第二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，所述第一链的序列如SEQ ID NO：2所示；
所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
Priority Applications (1)
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-
2019
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| DEPDC1 drives hepatocellular carcinoma cell proliferation, invasion and angiogenesis by regulating the CCL20/CCR6 signaling pathway;Wubin Guo等;Oncology Reports;第42卷(第3期);1075-1089 * |
| NM_017779.6;佚名;Genbank;全文 * |
| 沉默 DEPDC1 抑制鼻咽癌细胞 HNE-1 和 CNE-1 侵袭迁移;李红霞等;中国生物化学与分子生物学报;第32卷(第6期);665-671 * |
Also Published As
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